Manual de laboratorio 2008 - Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias

Transcripción

1
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8
Recopilado y revisado por:
ALEJANDRO MARTINEZ M.
GLORIA AMPARO VALENCIA P.
NORA JIMENEZ U.
MONICA MESA
ELKIN GALEANO J.
Medellín, Mayo de 2008
2
PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y
FITOQUÍMICA 200 8
Objetivo general
♦ Al finalizar el curso el estudiante estará en capacidad de evaluar, extraer,
aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biológico.
Temas del curso
1. INTRODUCCIÓN. Duración: 6 Horas
♦ Presentación del curso
♦ Entrega de Equipos
♦ Normas de laboratorio
2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA
VEGETAL. PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN.
Duración: 6 Horas
3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duración: 6 Horas
4. TECNICAS
GENERALES
DE
AISLAMIENTO,
SEPARACIÓN
Y
PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA).
Duración: 12 Horas
5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES
(OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duración: 6 Horas
6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES
APROBADAS EN COLOMBIA. Duración: 6 Horas
7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duración: 12 Horas
8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIÓN Y VALORACION DE UNA
DROGA Duración: 12 Horas
9. MARCHA FITOQUIMICA. Duración: 18 Horas
3
10. PRACTICA ESPECIAL. Duración: 60 Horas
♦ Revisión bibliográfica y elaboración de un anteproyecto. Duración: 12 Horas
♦ Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duración: 36 Horas
♦ Póster: Elaboración 6 Horas, Presentación: 6 Horas
♦ Contenido: Elaboración de un fitofármaco. Aislamiento y caracterización de
metabolitos secundarios.
PRESENTACIÓN
Este MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y
FITOQUÍMCA 200 8, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo
de 2003 (ISBN 958 -655-682-4).
CONTENIDO
Pág.
PRACTICA
No. 1
PRACTICA
No. 2
PRACTICA
No. 3
PRACTICA
No. 4
PRACTICA
No. 5
RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA,
TAXONOMÍA VEGETAL, PRESENTACIÓN DE UN
EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN
RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS
TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN
Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN
COLUMNA)
RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O
FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE
DROGAS PULVERIZADAS)
RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS
MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA
RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA
19
5
22
38
38
38
39
40
40
41
42
43
4
PRACTICA
No. 6
PRACTICA
No. 7
PRACTICA
No. 8
PRACTICA
No. 9
MATRICARIA
RECONOCIMIENTO PO R CCF DEL ROMERO
RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA
RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO
RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL
RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA
FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES)
43
44
45
45
46
47
TÉCNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACIÓN
DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL
TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE
ANETOL
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MARCHA FITOQUÍMICA
68
PRACTICA ESPECIAL
-
Pautas para la elaborac ión del informe de laboratorio
80
5
PRACTICA N° 2
RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS
OBJETIVO
Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido
vegetal por medio de pruebas químicas de coloración y precipitación.
Consultar:
Domínguez, X.
1973.Capítulo 3.
A.,
“Métodos
de
Investigación
Fitoquímica”,
Ed.Limusa,México,
MARCO TEÓRICO
Metabolitos Primarios:
Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo
vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos
nucleicos.
Metabolitos Secundarios:
Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas
metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro
de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución
restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su
ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos,
predadores, cambios térmicos o l umínicos, deficiencias nutricionales o presencia
de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una
característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto
resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como
un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un
papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos
secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad
enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho
de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con
pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de
cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas,
terpenoides, esteroides y alcaloides.
Reconocimientos de Metabolitos:
El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas
fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización
consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la
6
estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo
funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un ad ucto o un
complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de
un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos
indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.
•
Reconocimiento de Alcaloides:
Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo
heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica
limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido org ánico.
N
CH3
N
Nicotina
Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la
base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales
solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos.
•
Reconocimiento de Flavonoides:
(+)-Catequina
O
OH
Los Flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono,
cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de
tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 –
C3 – C6.
•
Reconocimiento de Cardiotónicos:
Una aglicona cardiotónica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular
esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C–18 y C-19,
7
un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico
carbonos unido al carbono 17 del núcleo esteroidal.
α-β insaturado de cuatro
O
O
Digoxin
H3 C
H
OH
CH3
O
O
CH3
3
OH
OH
O
Estas agliconas toman el nombre de cardenólidas por presentar acti vidad
estimulante sobre el músculo cardiaco, cuando están en forma de glicósidos.
•
Reconocimiento de Saponinas:
Las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen la
propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial d el agua,
formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis se desdoblan en
carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.
CH3
O
H3C
CH3
O
CH3
Diosgenina
HO
La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno
pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado
sistema espirostanal. El en lace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del
carbono 3.
8
•
Reconocimiento de Cumarinas:
Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólic os y tienen en
común la estructura química de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque
presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.
O
•
O
Reconocimiento de Taninos:
Los taninos son productos de excreción de muc has plantas, involucrados en
mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se
encuentran más comúnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza.
Químicamente los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso
molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en:
Taninos Hidrosolubles o Pirogálicos: Son ésteres fácilmente hidrolizables
formados por una molécula de azúcar (en general glucosa) unida a un número
variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido
elágico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledóneas.
OH
OH
COOH
O
OH
HO
Ác. Gálico
O
Leucoantocinidina
HO
OH
OH
Ác. Elágico
OH
HO
O
OH
OH
Flavan 3,4-diol
Leucopelargonidin
OH
Taninos no Hidrosolubles ó Condensados : Tienen una estructura química similar a
la de los flavonoides. Por hidrólisis dan azúcar y ácido elági co, algunos taninos
condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrólisis ácida
producen antocinidinas y leucoantocinidinas.
9
•
Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
Ergosterol
HO
Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del
ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical
lineal en el carbono 17.
•
Reconocimiento de Quinonas:
Las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas que por reducción se convi erten
en polifenoles, siendo reversible esta reacción. Las quinonas derivan su nombre
del miembro más simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por
Woskresensky, como producto de oxidación del ácido quínico.
O
O
Antraquinona
Las quinonas, por el sistema aromático que dan al reducirse se pueden clasificar
en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las más numerosas) y
Fenantroquinonas (las menos numerosas).
•
Reconocimiento de Antocianinas:
Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores
ácido – base debido al proceso:
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Pelargonidina
HO
O
HO
+
HO
O
HOOH
OH
pH < 3
Catión cianina
O
O
OH
O
HO-
H+
OH
OH
pH 8.5
Base cianina
-
H+
O
OH
pH > 11
Anión cianina
Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su
solubilidad en agua y la fácil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran
en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos
en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado
pro otros pigmentos, como la clorofila.
Procedimiento Experimental
1. Recolectar y preparar las muestras frescas
2. Reconocimiento de alcaloides
Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos
en un erlenmeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la
muestra esté en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño
maría durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar.
Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas
de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se
observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la
muestra contiene alcaloides.
Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un
estándar de quinina en solución ácida.
3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotónicos
En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada.
Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la muestra y le
confiera fluidez. Calentar al baño maría durante unos 5 minutos, con agita ción.
Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual
de solución de acetato de plomo al 4% que contenga ácido acético al 0.5 %,
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agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de
reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos.
a) Ensayo para flavonoides
Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2 ml del
filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl
concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba
positiva para la existencia de flavonoides en la muestra.
Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un
estándar de rutina o quercetina en solución acuo -alcohólica.
b) Ensayo para Leucoantocianidinas
Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos.
La aparición de
coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la
muestra.
c) Ensayo para Cardiotónicos
En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde
(mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo
antes de
su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la
existencia de cardiotónicos en la muestra.
4) Ensayo para saponinas
Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de
unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de
filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma
abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la
muestra.
5) Ensayo para taninos
Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de
unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de
ensayo. añadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado,
centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver
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el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Añadir 2 -3 gotas de solución de cloruro
férrico al 10%.
La formación de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparición de
colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia
de taninos en la muestra.
6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides
Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o
diclorometano y extraer por agitación. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene
humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de
ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgánico. Añadir 1 ml
de anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar resbalar
1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de colores azules, violetas,
rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o
Triterpenoides.
7) Ensayo para Quinonas
Ensayo con una fracción :
Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de
peróxido de hidrógeno al 20% y 1 ml de ácido sulfúrico al 50%. Calentar la mezcla
en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Añadir 5 ml de tolueno.
Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase toluénica. Trasvasar 2 ml fase toluénica a
un tubo de ensayo. Añadirle 1 ml de una solución de NaOH al 5% con amoniaco al
2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloración rosada a roja
intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.
Ensayo directo:
Colocar 5 g de muestra fresca (ó 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de
reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el
filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fracción
acuosa.
8. Reconocimiento de Antocianinas
En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada.
Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos 5 minutos. Filtrar.
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Ensayo
En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Añadir 1 ml de NaOH diluido.
Observar el color formado.
En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Añadir unas 6 gotas de un
ácido mineral diluido. Observar el color formado. Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH.
9. Reconociemiento de Cumarinas.
En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y
agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal.
Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas
pinzas para tubo de ensayo o con una banda elástica. Agregarle unas gotas de
NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar
hasta ebullición el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro.
Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente
que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro.
Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz
ultravioleta de 365 nm.
Plantas con alcaloides:
Datura sp. (borrachero), hojas y flores.
Catharantus roseus (cortejo), hojas.
Hojas de tabaco, té.
Plantas con flavonoides: Pétalos de rosas rojas y amarillas.
Pétalos de lirio africano.
Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sábila).
Fruto de Solanum quitoense (lulo).
Cáscara de Dioscorea ssp. (ñame).
Plantas con taninos:
Hojas de plantago (llantén). Hojas de guayaba
Té (Thea sinensis ), hojas.
Uvas (Vitis vinifera ).
Plátano o guineo (Musa ssp.).
Agallas de alepo ( Querquis ssp. ).
Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ).
Plantas con esteroides:
Semillas de Glicine max (soya).
Aceite de oliva (Olea europeae ).
Plantas con cardiotónicos: Azuceno de la habana, hoj as.
Plantas con antocianinas: Repollo morado.
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Plantas con quinonas:
Hojas de guardaparque.
Moras.
Uvas sin hollejo.
Ruibarbo (rizomas)
6.
Reactivos y materiales necesarios por grupo
150 ml HCl al 5%
1 ml peróxido de hidrógeno al 20%
50 ml Acetato de plomo al 4% con ácido acético al 0.5%
2 ml Urea 10M
gotas de FeCl 3 al 10%
2 ml de ácido sulfúrico al 50%
2 ml de solución NaOH al 5% con amoniaco al 2%
R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio.
R. gelatina-sal
R. Kedde solucione s A y B
200 ml etanol
50 ml diclorometano
5 ml benceno
2 ml anhídrido acético
Acido sulfúrico concentrado
Acido clorhídrico concentrado
5 papeles de filtro
limaduras de magnesio
sulfato de sodio anhidro
centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos
cuchillo.
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Práctica 3
TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN
(CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)
OBJETIVOS
• Seleccionar de una serie eluotrópica el eluente que mejor separe los
carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales.
• Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de
carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos
de coloración, cromatográficos y espectrales.
• Identificar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para
análisis.
BASE DEL MÉTODO
La muestra aplicada en la fase estacionaria es adsorbida en la superficie del
material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals,
puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc.) y para su posterior liberación de
acuerdo a la constante de afinidad de por los constituyentes de la muestra por la
fase móvil.
MARCO TEÓRICO
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue
inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswe tt.
Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas
de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de
cromatografía de capa fina. Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de
capa fina, estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a
esta técnica simple, económica y eficiente.
TERMINOLOGÍA
• Fase Estacionaria (Adsorbente)
Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un
sólido, un gel o un lí quido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el
cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también
estar químicamente unido al sólido (Fase Ligada) o inmovilizado sobre él (Fase
Inmovilizada). Los adsorbentes má s utilizados son
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• Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
• Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
• Tierra Silícea ó Kieselguhr
• Celulosa (Nativa o micro -cristalina)
• Poliamidas.
Estos sorbentes varian en tamaño de partícula, día metro del poro, homogeneidad
y pureza.
• Fase Móvil (eluente)
Es el fluido (solvente o mezcla de solventes) que se filtra a través o a lo largo del
lecho estacionario (fase estacionaria), en una dirección definida. Puede ser un
líquido (Cromatografía Líquid a), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido
supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). Cuando se utiliza un líquido
como fase móvil mediante una serie eluotrópica (Tabla 1) se escoge la mejor
combinación de solventes miscibles para una buena separación cromatográfica de
una muestra en sus componentes.
Tabla 1. Serie eluotrópica de solventes
Hidrocarburos «ligeros» (éter de petróleo, hexano, heptano. etc.)
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tricloroetileno
Tolueno
Benceno
Diclorometano
Cloroformo
Eter etílico
Acetato de etilo
Acetona
n-Propanol
Etanol
Metanol
Agua
• Muestra
Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se
pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
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• Componentes de la Muestra
Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos
por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir,
eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.
CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA
Clasificación de acuerdo a la forma del lecho cromatográfico
§ Cromatografía en Columna
§ Cromatografía Plana
Clasificación de acuerdo al estado físico de la fase móvil
§ Cromatografía de Gases (GC)
§ Cromatografía Líquida (LC)
§ Cromatografía co n Fluido Supercrítico (SFC)
Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación
§ Cromatografía de Adsorción
§ Cromatografía de Reparto
§ Cromatografía de Intercambio Iónico
§ Cromatografía de Exclusión
§ Cromatografía de Afinidad
Técnicas especiales
§ Cromatografía con Fase Invertida
§ Cromatografía con Fase Normal
§ Análisis Isocrático
§ Elusión con Gradiente
§ Cromatografía Bidimensional
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC)
Es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro
de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada líquida o sólida (adsorbida por
fase la estacionaria). Posteriormente se agrega el eluente por la parte superior del
tubo cromatográfico y se recogen volúmenes definidos por el analista de eluente
luego de ser eluí do por el tubo cromatográfico, separando una muestra en sus
componentes como se ilustra en la figura 1:
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Recolector
de fracciones
Figura 1. Diagrama de una cromatografía en columna.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)
Es la técnica de separación en la qu e la fase estacionaria está sobre un plano
formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una
placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es
aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser e luída dentro de un
tanque cromatográfico como se ilustra en la figura 2.
Marca de
fin
Marca de
inicio
Muestra
Eluente
Figura 2. Diagrama de una cromatografía en capa fina
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Si los componentes de la muestra (manchas) no son coloreados, se requiere de
métodos que nos permitan visualizarlos componente
presentes. Este
procedimiento también se conoce este como “revelado de la placa”.
El revelado de las placas se puede realizar mediante dos métodos:
• Método químico (por inmersión o rociado de reactivos coloreantes). Se
obtienen derivados coloreados o fluo rescentes de los componentes de la
muestra.
• Método físico (ópticos). Generalmente se utiliza mediante la radiación con
luz UV a la placa cromatográfica a 254nm y/o 365nm.
La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo, siempre
requiere contar con un estándar de referencia para comparar su valor de factor de
retardo (Rf) y el color de la mancha del estándar al ser revelada con agentes
químicos, con los datos experimentales obtenidos.
El factor de retardo (Rf) es un valor relativo par a cada sustancia y depende de las
condiciones cromatográficas con que se haya trabajado (fase móvil, fase
estacionaria, eluente y el tiempo de saturación). Se define como el cociente entre
la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia re corrida
simultáneamente por la fase móvil como se ilustra en la figura 3.
c
Distancia
recorrida por
la fase móvil
(X)
b
a
Destancia recorrida
por cada muestra
Figura 3. Factor de retardo de una muestra.
Rf para la mancha 1 = a / X
Rf para la mancha 2 = b / X
Rf para la mancha 3 = c / X
Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).
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CAROTENOIDES
Los tetraterpenoides más conocidos son los pigmentos liposolubles amarillos -rojos
denominados carotenoides, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en
el reino vegetal y en diversos tipos de tejidos. Se conocen al go más de 400
carotenoides. A los pigmentos hidrocarbonados se les denomina CAROTENOS, y
a los oxigenados XANTOFILAS. Se conocen también tetraterpenos incoloros
como el fitoeno y el fitoflueno, pero han sido menos estudiados que los
carotenoides. La única diferencia estructural entre los tetraterpenoides coloreados
e incoloros es el mayor número de enlaces dobles conjugados en los primeros.
Los tetraterpenoides, a diferencia de otras clases de terpenoides, no poseen
sistemas anulares complejos y son acíclic os, mono- o biciclicos. Los miembros
acíclicos contienen básicamente el siguiente esqueleto:
Debe notarse que la molécula es simétrica a cada lado de la línea punteada y
puede racionalizarse como la unión de dos radicales diterpénicos tipo fitilo. Las
variaciones se introducen por enlaces dobles y grupos funcionales tales como
hidroxilos, epóxidos, carboxilos, etc. A medida que se aumenta el número de
enlaces dobles se incrementa la posibilidad de isomerismo CIS-TRANS, y muchos
de los problemas de la q uímica de los carotenoides proviene de la dificultad para
distinguir y separar isómeros geométricos de este tipo. La mayoría de los
carotenoides nativos son todo trans, y al nombrarlos se asume por defecto que
tienen la configuración trans a menos que se c ite la geometría cis.
La ciclización puede ser a uno o ambos lados de la cadena. Cuando solo hay
ciclización en uno de los extremos se les denomina carotenoides del tipo IONONA:
21
Algunos pigmentos como la bixina y la crocetina tienen menos de 40 carbono s
pero se clasifican como carotenoides porque las peculiaridades de su estructura
sugieren que se derivan de la degradación de carotenoides, en lugar de producirse
a partir de unidades más pequeñas. Los apo -carotenoides son compuestos C -27 o
C-30 derivados probablemente de la degradación de Xantofilas.
Hasta el momento no ha sido asignada ninguna función general a los
carotenoides.
Existen indicios de que son receptores de luz para el fototropismo. Como los
pigmentos florales podrían participar en la atracc ión de insectos, pero
principalmente se cree que funcionan como pigmentos de cloroplastos de las
hojas. Hasta cierto grado la luz absorbida por los carotenoides puede transferirse
a la ferredoxina o la clorofila, donde es usada para la fotosíntesis. Tambié n se
tienen evidencias de que los carotenoides protegen a la clorofila contra la
fotodestrucción por luz de corta longitud de onda p. ej: Longitudes de onda
cercanas a 400 nm donde tanto las clorofilas como los carotenoides absorben
intensamente. Las plant as albinas carecen de carotenoides y clorofilas bajo
condiciones normales de crecimiento, pero bajo luz débil son capaces de acumular
clorofila. En condiciones normales de luz la clorofila se destruye rápidamente
porque los carotenoides no están presentes para protegerla.
El carotenoide más ampliamente distribuido es el ? -caroteno, el cual constituye
casi el 0.1% de las hojas verdes secas. La luteína es la xantofila más importante
de hojas y puede encontrarse en mayores concentraciones que el ? -caroteno. La
mayoría de carotenoides tienen la misma cadena central del ? -caroteno y difieren
solamente en las porciones correspondientes a los dos anillos.
22
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO
• 30g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo,
Pimentón verde -rojo, zanahor ia, Pimentón rojo, ahuyama, mango cáscara roja,
pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Erlenmeyer 250 ml
Sílica gel para columna
1 columna de cromatografía
n-hexano puro (ó éter de petróleo)
Acetato de etilo puro
Metanol ó etanol para extraer
(destilado)
Algodón o gasa
Papel filtro
Sulfato de sodio anhidro 15g.
Capilares
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Tubos de ensayo limpios
Lápiz de grafito
Tanque para cromatografía
Baño María
Rotaevaporador
Mortero con pistilo
Licuadora
Espectrofotómetro UV -Visible
Etanol puro 50mL.
NOTA= Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para
esta práctica y su color antes de ir a la sección de clase.
OBJETIVOS
• Seleccionar de una serie eluotrópica , el eluente que mejor separe los
carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales.
• Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de
carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por métodos
de coloración, cromatográficos y espectrales.
• Conocer otros sist emas cromatográficos para la separación de
carotenoides.
a. Deshidratación
En un erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente
en un mortero. Se añade un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra
la muestra. Se cal ienta a ebullición sobre un baño maría durante 5 minutos. Se
23
filtra en caliente con un algodón, procurando que la masa semisólida quede libre
del solvente.
b. Extracción
A la masa semisólida se adiciona un volumen suficiente de diclorometano
(también pued e usarse cloroformo) en una campana de extracción y se remueve
con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides .
Debe tenerse precaución con el manejo de estos solventes pues son bastante
volátiles y algunos son muy tóxicos.
El extracto se filtra. El residuo sólido se puede reextraer varias veces con el fin de
obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se
trasvasan a un embudo de separación y se añade si es necesario un volumen de
solución de NaCl satur ada. La fase orgánica se recupera, se seca con sulfato de
sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un
volumen aproximado de 5 ml, mediante aplicación de calor suave (40 -50 °C) y
vacío. El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para
protegerlo de la luz, la humedad, el calor y el aire.
c. Selección de otra fase móvil El extracto de carotenoides se a nalizar por CCF
con la serie eluotrópica siguiente:
•
•
•
•
•
•
n-Hexano
n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1
Acetato de etilo
Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más
precisamente posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores,
fluorescencia, manchas :
•
•
•
•
A simple vista
Luz UV 254 nm
Luz UV 366 nm
Vapores de yodo
d. Fraccionamiento cromatográfico y análisis espectral Con el mejor eluente
seleccionado previamente , proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor
24
del extracto por cromato grafía en columna CC ó cromatografía en capa
preparativa CCP. Las fracciones coloreadas se recogen (ó se raspan en el caso
de la CCP), se enumeran y se les determina su espectro visible en el rango de 3 50
a 550 nm. Es importante tener en cuenta que para de terminar el espectro cada
compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes.
La Tabla 2 muestra los Rf y los máximos de absorción (en éter de petróleo) de
varios carotenoides comunes. La figura 2 muestra el espectro visible d el licopeno
obtenido de una muestra de tomate rojo.
25
Tabla 2. Valores Rf y máximos de absorción de varios carotenoides
CAROTENOIDE
Rf
SISTEMA 1
MÁXIM0S
ABSORCIÓN (nm)
0.80
1
422, 444, 473
α-Caroteno
0.74
1
425h, 451, 482
β-Caroteno
0.41
1
437, 462, 494
γ-Caroteno
0.84
1
419, 444, 475
ε-Caroteno
Licopeno
0.13
1
446, 472, 505
Luteína
0.35
2
420, 447, 477
Zeaxantina
0.24
2
423, 451, 483
Violaxantina
0.21
2
443, 472
Criptoxantina
0.75
2
425, 451, 483
Capsantina
0.16
2
---------------Neoxantina
415, 437, 466
Rubixantina
432, 462, 494
Fucoxantina
425, 450, 478
Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo
1
Sistema 1: Benceno/Eter de petróleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1
26
INFORME
Debe incluir nombre vulgar y científico de la muestra analizada, parte de la planta
analizada, familia vegetal, análisis de los valores Rf y los espectros visible
comparándolos con los reportados en la literatura. Informar cuáles carotenoides se
logró identificar.
Reactivos y materiales necesarios por grupo
Muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo, pimentón verde rojo, zanahoria, pimentón rojo, ahuyama, mango, pasta de tomate, salsa de
tomate, etc.)
Erlenmeyer 250 ml
Sílica gel para columna
1 columna de cromatografía
N-hexano puro (ó éter de petróleo)
Acetato de etilo puro
Etanol para deshidratar
Algodón
Papel filtro
Sulfato de sodio anhidro 15 g.
Capilares
Tubos de ensayo limpios y secos reactivo de Carr —Price
Lápiz de grafito
Frasco para cromatografía
Rotavapor
Mortero con pistilo
Licuadora
Espectrofotómetro UV -Vísible
Bibliografía
1. Robinson T., "The Organic Constituents of Higher Plants", 5th. ed., Cordus
Press, North Amherst MA U.S.A., 1983. Pp. 162 -5.
2. Harborne J.B., "Phytochemical Methods", Chapman & Hall, 1973, 119 -128 pp.
3. Stahl E., “Thin layer Chromatog raphy, 1969.
1.Merck Co. Inc., Reactivos de coloración para cromatografía en capa fina y en
papel.
27
2. Dalmases, P., Bonet, J. J., “Técnicas de Cromatografía Líquido -Sólido en
Columna”, Afinidad 111 -126 (1984).
Cromatograma CCF de un extracto de carotenoide s del pimentón
(sílica gel, n-hexano/acetato de etilo 4:1)
28
Práctica 4
RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES
(OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS)
El planteamiento sistemático de la identificación de drogas en polvo puede
realizarse por var ios caminos; sin embargo, cuando se trata de drogas
organizadas, todos los métodos dependen del reconocimiento microscópico de los
tipos celulares característicos, así como de los contenidos de las células. Cuando
se trata de una mezcla de drogas es impres cindible una mayor experiencia y
práctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificación, deben llevarse a
cabo posteriores observaciones y ensayos químicos confirmativos; la mayoría de
las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su
reconocimiento mediante cromatografía de capa fina (CCF).
ENSAYOS PRELIMINARES:
1. ANOTAR EL COLOR.
Blanco: gomas arábiga, tragacanto.
Amarillo: regaliz, jengibre, escila.
Marrón claro: Ipecacuana, nuez vomica, opio, hinojo, genciana, cilantro,
cardamomo, lino.
Castaño canela: canela.
Castaño oscuro: clavo, sábila.
Rojo: quina.
Anaranjado: ruibarbo
Verde: sen, digital, estramonio.
2. ANOTAR EL OLOR.
Los siguientes son especialmente característicos:
Jengibre, hinojo, ge nciana, opio, cilantro, cardamomo, canela, clavo, nuez
moscada.
3. ANOTAR EL SABOR:
Aromático: Cilantro. cardamomo, canela, clavo.
Aromático y picante: Jengibre.
29
Amargo: cuasia, genciana, áloes, quina, escila.
Dulce: regaliz.
Astringente: catecú.
4. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con unas gotas de agua y abandonarlo
un tiempo. Los extractos acuosos y jugos concentrados como el aloe se
disuelven casi completamente, mientras se pone de manifiesto la naturaleza
gomosa o mucilaginosa de drogas como l a goma arábiga, tragacanto y semillas
de lino.
5. Mezclar una pequeña cantidad de polvo con ácido sulfúrico diluido, si existe
carbonato cálcico (tiza) tiene lugar una efervescencia seguida de disolución.
6. Comprimir una pequeña cantidad de polvo entre pa pel de filtro. Una mancha
oleosa, que se extiende pero que persiste cuando el papel es calentado en una
estufa aparece cuando los polvos contienen aceite fijo (Ej.: lino, maní, etc).
El aceite esencial desaparece por calentamiento en estufa. (todos los
aromáticos)
7. Agitar una pequeña cantidad de polvo en un tubo de ensayo lleno de agua
hasta la mitad y si aparece espuma abundante sospechar la presencia de
drogas saponinas como el clavo, nuez moscada; hervir suavemente y advertir
el olor si hay desprendimi ento de aceite esencial. Filtrar y dividir en dos
porciones que pueden ser ensayadas respecto a taninos y derivados
antraquinónicos de la siguiente manera:
a) Ensayo de taninos:
Se agregan gotas de FeCl 3 muy diluido, se producen coloraciones que van
desde el azul oscuro hasta el negro pasando por el verde oscuro.
También se puede realizar la prueba de la gelatina; en la que precipitan los
taninos al agregar una solución de gelatina al 1% que contenga 10% de cloruro
sódico.
Ausencia de taninos: pimienta, j engibre, cuasia, estrofanto.
Presencia de taninos: borraja. salvia, ratania, canela, quina, clavo y ruibarbo.
b) Ensayo de antraquinonas:
Mediante la agitación del extracto acuoso con HCl diluido, y calentamiento para
producir la hidrólisis, las antraqui nonas liberadas se extraen con tolueno y dan
un color rosa-rojo cuando la solución se agita con amoniaco diluido.
Positivo para: áloes. ruibarbo, cáscara sagrada, sen.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
30
Si los ensayos preliminares han demostrado que la droga se d isuelve en agua,
deben realizarse ensayos con otros líquidos, como alcohol, aceite de oliva, hasta
que se encuentre uno en el que la droga sea insoluble.
En la mayoría de los casos, sin embargo, puede adoptarse el siguiente
procedimiento:
1. OBSERVACION DE ALMIDON
Montar placa en agua, observar y dibujar cualquier gránulo que se observe y
ensayar si se trata de almidón o no mediante adición de agua de yodo.
2. OBSERVACIÓN DE TRICOMAS EPIDERMICOS Y OXALATO DE CALCIO
Montar en hidrato de cloral (disuelve almidón, proteínas, clorofila,, resinas,
aceites esenciales y produce la expansión de células retraídas), hervir
suavemente hasta que clarifique y observar. Para estar seguro de que el
oxalato cálcico, no ha pasado inadvertido, debe utilizarse luz polariza da.
OBSERVACIÓN DE LIGNINA
Humedecer el polvo con una solución alcohólica de floroglucina (1% en etanol del
90%) y dejarlo hasta que casi se seque. Añadir HCl concentrado, poner
cubreobjetos y observar. Adviértase la presencia o ausencia de vasos lignific ados,
fibras, parénquima, esclereidas, pelos. Si los vasos o fibras no se tiñen de rojizo,
sospechar presencia de jengibre o ruibarbo.
De los ensayos preliminares y de los tres montajes anteriores se obtendrá una
considerable información. El examen puede c ontinuarse mediante la aplicación de
otros ensayos microquímicos:
Cloro yoduro de cinc (Reactivo de Schultze); ensayo para paredes de celulosa.
Por lo general es conveniente desengrasar los polvos grasos, decolorar los
fuertemente coloreados y preparar una fibra bruta cuando contienen mucho
almidón.
La aplicación de los conocimientos de anatomía de los órganos vegetales en que
se presentan las drogas hará posible el reconocimiento. Esto deberá ampliarse
con la utilización de referencias o tablas de caracter es diagnósticos de drogas en
polvo.
La identidad de un polvo no ha de considerarse como establecida hasta que haya
sido comparada con uno de reconocida autenticidad.
TABLAS RECOMENDADAS:
• Wallis y Mirimanoff.
31
• Jacksori Snowcson; Powered Vegetable Drugs. Londres: Thornes (1968)
DROGA
Aloé
CARACTERÍSTICAS
Presencia: Montado en lactofenol, muestra fragmentos
amarillentos o cristales aciculares. Parcialmente soluble en
agua y completamente soluble en alcohol al 60%. Confirmar
con ensayos químicos.
Ausencia: T ejido vegetal, almidón, Oxalato de Calcio.
Lino
Presencia: Células epidérmicas isodiamétricas . colénquima,
esclerénquima lignificado, células pigmentadas poligonales
con contenido pardo -rojizo, abundancia de aceite y granos de
aleurona 3-18 microgramos.
Ausencias almidón, vasos y súber
Presencia de Oxalato de Calcio y ausencia de almidón y pelos epidérmicos:
• clavo
• cilantro
• alcaravea
• escila
• cáscara de naranja y limón.
Presencia de pelos epidérmicos, ausencia de almidón y oxalato de calcio:
• nuez vómica
• hoja de digital
• catecú
• lobelia
• azafrán
Presencia de almidón, ausencia de oxalato de calcio y pelos epidérmicos.
• tragacanto
• nuez moscada
• jengibre
• valeriana
Presencia de pelos y oxalato de calcio, ausencia de almidón.
• hojas de sen
• estramonio
• beleño
• anís
• hammamelis
32
• manzanilla romana
Presencia de oxalato de Calcio y almidón, ausencia de pelos epidérmicos.
a) Detección de vasos lignificados con floroglucina y HCl si los hay.
• cuasia
• regaliz
• jalapa
si no los hay
• ruibarbo
• cardamomo
• canela
b) Presencia de esencias en c ardamomo y canela. En general:
• semillas de cardamomo
• cuasia
• ruibarbo
• regaliz
• rawolfia
• ipecacuana
• genciana
• canela
•
•
•
•
•
•
•
cáscara sagrada
quina
podofilo
cerezo
quilaya
ratania
jalapa
BIBLIOGRAFIA:
1. Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamerica na
McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991.
2. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de
drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.
33
Análisis microscópico de algunas drogas
Observaciones:
•
•
•
Las fotografías son tomadas a placas montadas con fluoroglucina/HCl,
vistas con ocular 6.3X
Solo para montar la placa de lino: presionar con el cubreobjetos hasta
lograr que el material quede como una delgada capa
La observación de diferentes estructuras de una mis ma planta algunas
veces requiere el montaje de varias placas.
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38
39
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41
42
43
44
Bibliografía
•
•
•
Deyson, G. Caractères analytiques des poudres végétales. Paris, CDU et
SEDES réunis, 1976
Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana
McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogotá, 1991.
Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el análisis de
drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.
45
Práctica 4b
CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES
ANALISIS MACRO Y MICROSCÓPICO DE MATERIAL VEGETAL
OBJETIVO
• Identificar los diferentes marcadores taxonómicos descritos en las
farmacopeas para el control de calidad de un material vegetal como materia
prima para productos fitoterapéuticos utilizando agentes químicos de
tinción.
• Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus
características organolépticas, macro y microscópicas.
BASE DEL MÉTODO
El análisis histoquímica del material vegetal en polvo ayuda en el proceso de
control de calidad, evi denciándose la presencia de material extraño (arena),
adulteraciones o falsificaciones. Este análisis es de apoyo a los demás análisis
farmacopéicos.
MARCO TEÓRICO
El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus características sensoriales,
macroscópicas y microscópicas. Un examen para determinar estas características
es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para
después llevarse a cabo posteriores análisis. Siempre que sea posible, patrones
del material o muestras d e calidad farmacopeica debe de estar disponible como
referencia.
Una inspección visual provee una simple y rápida medida para identificar el
material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser
significativamente diferente, en términ os de color, consistencia, olor o textura, de
las especificaciones, se considera una NO conformidad de los requerimientos. Sin
embargo, los juicios deben ser cautelosos con relación al olor y la textura, debido
a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes
tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la
experiencia.
La identificación macroscópica de una planta medicinal está basada en la forma,
tamaño, color, características superficiales, textur a, características al quebrarla y
apariencia superficial de un corte. Sin embargo, mientras esas cualidades son
juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy
46
parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en anál isis
microscópicos y/o fisicoquímicos.
La inspección microscópica del material vegetal es indispensable por la
identificación del material quebrado o en polvo; el material debe de ser tratado con
reactivos químicos. Un examen microscópico solo NUNCA prove e una completa
identificación. Solo cuando esta asociado con otros métodos analíticos que
frecuentemente suplen invaluable evidencia.
Si la comparación con material de referencia revela algunas características no
descritas en los requerimientos, estos pue den ser atribuidos a material extraño,
antes que un constituyente normal.
REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO
• 10g de muestra vegetal fresca o seca en polvo.
• 3 Porta objetos
• Tamiz malla #20.
• 3 Cubre objetos
• Reactivos de coloración
• 1 microscópico por cada 3 gru pos
A cada grupo de estudiante se le asignará una monografía farmacopéica, la cuál
deberán de analizar para el posterior desarrollo en el laboratorio de las técnicas macro y
microscópicas descritas.
1. Pruebas o rganolépticas: Anotar el color, olor y sabor de la muestra asignada.
2. Con base en la monografía asignada y el material vegetal entregado, encontrar todos
los tejidos descritos dentro de la monografía siguiendo cuidadosamente el
procedimiento descrito de coloración o limpieza. Dibujar cada una de las características
visualizadas al microscopio.
3. Comparar el material vegetal problema asignado con las monografías disponibles,
visualizar los marcadores taxonómicos descritos y concluir.
DETECCIÓN HISTOQUÍ MICA DE TEJIDO VEGETAL Y SU CONTENIDO
1. Hidrato de cloral: Una solución de hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20
mL de agua) se utiliza como agente clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en
polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material
Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoquímica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff
47
vegetal y calentar suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y
sustancias extracelular (granos de almidón, granos de aleurona) y permite una mejor
visualización de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de
oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen.
2. Glicerol: Se utiliza como medio para la visualizar material vegetal al microscopio y
para prevenir el secado de soluciones acuosas o de hidrato de cloral. Se agregan 2
ó 3 gotas a la muestra en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos.
3. Detección de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de
oxalato de calcio: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 ó 3 gotas de ácido clorhídr ico 2M, con la precaución de que el reactivo esté
en íntimo contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y
observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio
está indicada por la aparición de burbujas . Los cristales de oxalato de calcio, que en
general tardan más tiempo en disolverse, no desprenden burbujas.
4. Detección de almidón: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de Solución de Lugol diluida (1:5) en agua . Colocar
el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidón se
colorean de azul -violáceo intenso. (Esta reacción en reversible al ser calentado el
portaobjetos)
5. Detección de lípidos y aceites esenciales: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo
sobre un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III (0.5 g Sudan III
calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 ó 3
minutos. Escurrir el líquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubr eobjetos y
observar al microscopio a 10x y 40x. Los lípidos aparecen como gotas de color rojo.
6. Detección de taninos: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de cloruro férrico al 5 %. Colocar el
cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se
traduce en la aparición de masas oscuras de color pardo, azul o negro.
7. Detección de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un
portaobjetos. Verter 1 ó 2 gotas de solució n de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g
de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2
minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuos, remover el
exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H 2SO 4 60%.
Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se
observan en colores desde el azul al violeta.
8. Detección de vasos lignificados (esclereidas, vasos, fibras, parenquima):
Colocar 2 a 3 mg de la d roga en polvo sobre un portaobjetos y mezclarlos con un
pequeño volumen de floroglucinol, dejar reposar hasta casi sequedad, agregar 1
48
gota de HCl 25%. Cubrir con un porta objeto y observar los vasos lignificados en
colores desde el rosado hasta el color c ereza (rojo carmin).
9. Detección de suber: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos.
Verter 2 ó 3 gotas de solución de Sudan III y dejar actuar durante 2 ó 3 minutos o
calentar suavemente. Los vasos suberizados o cuticulizados se observ al de color
rojo al rojo-naranja.
10. Detección de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre
un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas de solución de yodo/etanol. Los granos de
aleurona se observan amarillentos café o café. Agregar luego unas 2 ó 3 gotas de
trinitrofenol en etanol y los granos de tornarán amarillos.
11. Detección universal: Solución A – Diluir 20 mL de una solución saturada de Sudan
III en ácido láctico con 30 mL de ácido láctico. Solución B – Disolver 0.55 g de
sulfato de anilin a en 35 mL de agua. Solución C – Disolver 0.55 g de yoduro de
potasio y 0.05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de etanol.
Procedimiento – Combinar la solución A, solución B y la Solución C y agregar 2.5
mL de HCl con agitación (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre
un portaobjetos. Verter 2 ó 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con un
porta objeto y observar los elementos lignificados de amarillo, súber de marrón,
lípidos de color rojo y almidón de color azul -violeta.
12. Detección de estomas: Los estomas son unas aberturas que regulan la entrada y
salida de gases. Estas aberturas están rodeadas por células especializadas
llamadas oclusivas que al cambiar de tamaño y forma, modifican el diámetro de la
abertura estomátic a y de este modo regulan el intercambio gaseoso.
49
Imagen tomada de: British pharmacopoeia, Appendix XI H. Stomata. 2003.
1- Anomocíticos (irregulares): Los estomas están rodeados por un número variado de
células.
2 - Anisocíticos (desiguales): Los est omas están rodeados por tres células, de las
cuáles una es marcadamente más pequeña que las otras.
3 - Diacíticos (Atravesando): Los estomas están incrustados entre dos células vecinas.
4 - Paracíticos (Paralelos): Los estomas tienen paralelamente a ello s una o más células
vecinas.
BIBLIOGRAFÍA
1. British Pharmacopoeia, 2003.
2. USP 27, NF 22. 2003.
3. Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998
50
Práctica 5
RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES
APROBADAS EN COLOMBIA
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae
Introducción
La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios
amargos (Absinthina y anabsinthina), mientras que las flores cont ienen un 0.15%.
Extracción
1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60°C
sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen
aprox. de 2 ml
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Rf
0.3-0.4
Sílica gel 60F -254
Cloroformo:Metanol 95:5
Liebermann-Burchard/UV 365 nm
SUSTANCIA
Absinthina
COLOR
amarillo ocre
DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae
Introducción
El bulbo o diente contiene cisteína, cistina, sulfóxido de metionina, cicloaliína, aliína (=
Sulfóxido de S -alilcisteína), y deoxialiína (=S -alil-cisteína), junto con otros aminoácidos
azufrados y sulfóxidos de cisteína.
Extracción
25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en frío (con ayuda de
hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografía
en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina.
Fase estacion aria:
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
n-Butanol : n -Propanol : Acido acético glacial : Agua
30
: 10
:
10
: 10
Ninhidrina
Rf
0.5
SUSTANCIA
Alicina
COLOR
Naranja
0.7
Aliína
Azul-violeta
51
RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Introducción
La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como
cinaropicrina, grossheimina y cinarina; ácidos fenolcarboxilicos como 1,3 dicafeoilquínico, clorog énico y neoclorogénico; y luteolina -7-O-glucósido, un flavonoide.
Extracción
1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol sobre un
baño de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml
Fase estaciona ria:
Fase móvil:
Revelador:
Acetato de etilo:Acido fórmico:Acido acético:Agua
100
:
11
:
11 : 27
Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm
Rf
0.7
SIJSTANCIA
Cinarina
COLOR
Azul fluorescente
0.6
Luteolina-7-0-gluc.
Amarillo
0.45
Acido clorogénico
Azul fluorescente
0.4
Rutina
Amarillo
52
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA
ALBAHACA, Ocimum basilicum , Lamiaceae
Introducción
La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1 -0.45% de aceite esencial. El
aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool.
Extracción
a) Por arrastre con vapor de agua
Método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62.
b) Con Diclorometano
1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 10 ml de
diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1
ml de Tolueno, y se aplican 50 -100 µL. en la placa crom atográfica.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7
Vainillina- Acido sulfúrico
Rf
0.3
SUSTANCIA
Linalool
COLOR
Azul intenso
0.9
Metilchavicol
Rojo violeta
RECONOCIMIEN TO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE
LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae
Introducción
La droga la constituyen las hojas y ramas jóvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite
esencial. El aceite contiene principalmente L -Carvona 42 -67%, mentol, ac etato de
dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminílico, pineno, limoneno y felandreno.
53
Extracción
1) Destilación por arrastre con vapor de agua
Se utiliza el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62 con 50 g de muestra,
500 ml de agua, 2 horas d e destilación a un flujo de 3 -3.5 ml /min.
2) Extracción con diclorometano
Como se describió para la albahaca
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
Vain illina-Acido sulfúrico
Rf
0.25
SUSTANCIA
Alcohol dihidrocumínico
COLOR
Azul intenso
0.46
Carvona
Rojo-Violeta
0.7
Acetato de dehidrocarveol
Azul intenso
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE
HINOJO, Foeniculum vulgare , Apiaceae
Introducción
La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2 -7% de aceite esencial. El
aceite esencial contiene principalmente anetol (50 -80% en la variedad dulce, 60 -80% en
la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehído y fenchona (0.4 -0.8% en la
variedad dulce, 12 -22% en la variedad vulgare).
Extracción
1) Destilación por arrastre con vapor de agua
Según el método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62, utilizando 10 g. de
muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilación a una rat a de 2-3 ml /min.
2) Extracción con diclorometano
Tal como se describió para la albahaca.
Fase estacionaria :
Sílica gel 60
Fase móvil:
Reveladores :
1.Vainillina -Acido sulfúrico
2. PMA-Permanganato de potasio
3. Acido sulfúrico concentrado
Rf
0.6
SUSTANCIA
Fenchona
REVELADOR
3
COLOR
Azul oscuro
0.9
Anetol
1
2
3
Rojo-Violeta
Rojo-Pardo
Azul oscuro
54
Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el anís, lo que permite
diferenciar las dos plantas.
DE LA MALVA, Malva sylvestris , Malvaceae
Introducción
La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color característico.
Extracción
1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 6 ml de
Metanol:Acido Clorhídrico (9 partes de metanol, 1 parte de ácido al 25%). Se utilizan 25
µl del filtrado para la cromatografía.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Reveladores :
Rf
0.4
n -Butanol : Acido acético glacial : Agua
40
:
10
: 20
Ninguno
SUSTANCIA
Malvina (=Malvidin -3,5-diglucósido
COLOR
Violáceo
DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla , Asteraceae
Introducción
La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El
aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10 -25%, bisabolol
óxidos A y B (ambos 10 -25%), poliínas 1 -40%, farneseno 15%.
55
Extracción
a) Destilación por arrastre con vapor de agua
Según método oficial de la F. Eur. III pág. 62 con:
50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solución de cloruro de sodio al 1%, 4
horas de destilación a 3 -4 ml/minuto.
b) Extracción con Díclorometano
Tal como se ha descrito para la albahaca.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
T olueno : Acetato de Etilo 93 : 7
Vainillina -Acido sulfúrico
Rf
0.2
SUSTANCIA
Oxidos A y B de bisabolol
COLOR
Amarillo/Verde
0.25
Alcohol terpenoide
Violeta
0.35
Bisabolol
Violeta
0.5-0.6
Poliínas
Pardo
0.95
Azuleno
Rojo violeta
0.99
Farneseno
Azul-Violeta
DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae
Introducción
Las hojas contienen 1 -2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 -cineol
15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno.
Extracción
a) Destilación por arrastre con vapor de agua
Según método oficial de la Farm. Eur. III pág. 62.
b) Extracción con diclorometano
Tal como se describió para la albahaca.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
Vainillina -Acido sulfúrico
Rf
0.25
SUSTANCIA
Borneol
COLOR
Azul oscuro
0.45
Cineol
Azul intenso
0.7
Acetato de bornil o
Azul intenso
0.99
Alfa- y beta-pineno
Violeta
DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae
Introducción
La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14 -28% de
principios antracénicos tal es como aloína, aloesinas A y B, aloinósidos A y B, etc.
Extracción
0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5
minutos sobre un baño de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa
cromatográfica.
Fase estacionaria:
Fase móvil:
Acetato de etilo : Metanol : Agua
100
: 13.5 : 10
Reveladores :
1) Hidróxido de potasio/ UV 365 nm
2) Poiietilénglicol PN/UV 365 nm
Rf
0.3
SUSTANCIA
Aloinósidos A y B
REVELADOR
1y2
COLOR
Amarillo
0.47
Aloína
1y2
Amarillo
0.95
Aloé-emodina
1
Rojo
---
1
Aloesinas A y B
Azul fluorescente
56
57
DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra , Caprifoliaceae
Introducción
La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicósidos de quercetina 1.5 -3%
como hiperósido, isoquercitrina y rutina.
Extracción
1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un
baño de agua a aproximadamente 60 °C. El filtrado se utiliza para la cromatografía.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Acetato de etilo : Acido fórmico : Acido acético : Agua
100
:
11
:
11
: 27
Reveladores :
1) R. productos naturales/UV 365 nm
2) Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm
Rf
0.4
SUSTANCIA
Rutina
COLOR
Amarillo
0.7
Isoquercitrina
Amarillo
0.9
Acido cafeico
Azul fluorescente
DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis , Lamiaceae
Introducción
Las hojas contienen 0.01 -0.25% de aceite esencial, el cual está constituido
principalmente de Citronelal 39%, Citral 30%, citronelol, linal ool, geraniol y cariofileno.
Extracción
a) Por arrastre con vapor de agua
Según el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62, con:
40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2 -3 ml/min durante
2 horas.
b) Extracción con Diclorometano
Como se describió para la albahaca.
Fase estacionaria :
Sílica gel 60
Fase móvil:
Cloroformo
Revelador:
Anisaldehído/Acido sulfúrico
Rf
SUSTANCIA
0.7
Citronelal
58
COLOR
Azul intenso
0.45
Citral
Azul violáceo
0.25-0.4
Geraniol, linalool y
Citronelol
Azul violáceo
DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis , Valerianaceae
Introducción
La droga la constituyen las raíces o rizomas que contienen los valepotriatos como:
valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentración
cambia de una variedad a otra. Además contiene 0.25% de aceite esencial en los
rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y ácido valerénico.
Extracción
0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a
unos 60 0C con agitación ocasional. El residuo de la filtración se lava con otros 2 ml de
diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo d e
disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de
esta solución.
Fase estacionaria :
Fase móvil:
Revelador:
Sílica gel 60
Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25
HCl concentrado : Acido acético glacial 2:8
Rf
0.73
SUSTANCIA
Valtrato/Isovaltrato
COLOR
Azul
0.65
Didrovaltrato
Pardo
0.55
Acevaltrato
Azul
0.4
IVDH-Valtrato
Azul
<0.4
Valtrahidrinas
Azul
Origen
Productos de degradación
59
Práctica 6
ACEITES ES ENCIALES
INTRODUCCIÓN
El característico olor, aroma, de ciertas plantas es debido al aceite esencial o volátil allí
presente y usado desde la antigüedad como fuente natural de fragancias y perfumes.
Actualmente los aceites esenciales son usado en la perfu mería, en la industria
alimenticia o como fuente de materias primas. Algunos con propiedades adicionales son
usados como carminativos, aromatizantes, anestésicos locales y últimamente otros con
propiedades antieméticas e insecticidas.
Los aceites esencial es o esencias vegetales son mezclas de un numero variables de
sustancias olorosas. En un aceite esencial pueden encontrarse hidrocarburos alicíclicos
y aromáticos , así como sus derivados oxigenados, alcoholes, aldehídos, cetonas,
ésteres, sustancias azuf radas y nitrogenadas. Los componentes mas frecuentes se
derivan del ácido mevalónico; se les cataloga como monoterpenos de 10 unidades de
carbono y sesquiterpenoides con 15 unidades de carbono.
Todos los aceites esenciales oficinales se extraen por destila ción, con excepción del de
limón y el de cade. La destilación de las esencias por medio de agua o vapor se ha
practicado durante mucho tiempo, pero las modernas plantas industriales poseen
muchas ventajas sobre las antiguas destilerías, en las que con frec uencia se producía
la carbonización y descomposición de la esencia. En la moderna destilería de aceites
esenciales, la materia prima esta contenida en cestos o bandejas perforados. El
destilador contiene agua en el fondo, la cual se calienta mediante ser pentines por los
que circula vapor, o también haciendo pasar a su través vapor de agua a presión.
Algunas esencias como las de cayeput, alcaravea, trementina y de leño sándalo
australiano, son rectificadas. Esta consiste, generalmente en una segunda desti lación
en corriente de vapor, que libera la esencia de resinas y otras impurezas. La luz y el
oxigeno atmosférico parecen ejercer un efecto adverso sobre la mayoría de los aceites
esenciales, por lo que deben de seguirse estrictamente las directrices ofici ales respecto
del almacenamiento.
Las esencias utilizadas en perfumería, se pueden extraer por arrastre con vapor, como
se describió anteriormente. Pero algunos requieren de otro tipo de tratamiento, como
son el enflorado, digestión en grasas calientes, mé todos neumáticos o por medio de
disolventes.
El rendimiento de esencia obtenido de una planta varía de unas cuantas milésimas por
ciento del peso vegetal hasta 1 -3%. La composición del aceite puede cambiar con la
época de la recolección, el lugar geográfic o o pequeños cambios genéticos. En
gimnospermas y angiospermas es donde aparecen las principales especies que
contienen aceites esenciales, distribuyéndose entre unas 60 familias. Son
particularmente ricas en esencias las pináceas, lauráceas, mirtáceas, l abiáceas,
umbelíferas, rutáceas, y compuestas.
60
2. Destilacion Por Arrastre Con Vapor De Aceites Esenciales
OBJETIVO
Separar los aceites esenciales de: Comino, clavos de olor. corteza de canela, anís,
eucalipto, etc. y tratar de caracterizar sus const ituyentes, después de aislarlos por
cromatografía de columna y/o capa fina.
PROCEDIMIENTO
El mas antiguo y sencillo método para obtener aceites esenciales es la destilación por
arrastre con vapor, a partir de material vegetal, lo más fresco posible. Usand o matraces
de 1 a 6 litros, en el laboratorio se pueden destilar por arrastre con vapor continuo 100 a
500 g. de planta fresca, con buena recuperación de la esencia.
2
3
1
4
5
6
7
4
3
8
3
2
9
2
1
11
10
5
6
7
8
9
1
10
Fig. 1. Equipo para extraer aceites esenciales por arrastre con vapor
En el matraz 1 co locar suficiente agua (mas o menos 1 litro por cada Kg de material
vegetal) y unos núcleos de ebullición; si se cuenta con un equipo generador de vapor,
como una olla a presión la cual a través del conducto de la válvula se puede conducir el
vapor hacia el compartimento donde se encuentra el material vegetal. En el
compartimento 2 se ubica la muestra picada en pequeños trozos.
El agua se somete a calentamiento, logrando así la generación de vapor, que a medida
que asciende y atraviesa el material vegetal v a extrayendo el aceite esencial. En el
embudo de separación 3, se recoge el destilado; este se puede recoger sobre una
61
solución saturada de cloruro de sodio, con el fin de disminuir la formación de la
emulsión aceite en agua. También es de utilidad el ad icionarle un poco de éter etílico o
diclorometano al embudo, con el fin de observar mas fácilmente las dos fases y así
favorecer la separación.
Nota: la unión entre el embudo de separación y el condensador, debe permitir la
liberación de presión, de lo co ntrario el equipo puede romperse por exceso de presión.
Una vez cese la destilación, separe las dos fases. La fase etérea se seca con sulfato de
sodio anhidro y se concentra a 40 -45ºC ( no es necesaria la presión reducida). Una vez
el aceite este libre de solvente, pese y calcule el rendimiento con base en el material
vegetal de partida.
2. Extracción de aceites esenciales con solventes
OBJETIVO
Separar los aceites esenciales con solventes no polares y caracterizar sus
componentes por métodos espectrofo tométricos.
PROCEDIMIENTO
Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen
suficiente de éter de petróleo. Las fases etéreas se juntan, se filtran, se secan con
Na 2SO 4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a sequedad con calentamiento
suave. El residuo de evaporación debe tener el olor característico de la muestra antes
de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su
rendimiento.
62
ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES PRINCIPALES
EXTRACCIÓN.
Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen
suficiente de éter de petróleo. Las fases etéreas se juntan, se filtran, se secan con
Na 2SO 4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a seq uedad con calentamiento
suave. El residuo de evaporación debe tener el olor característico de la muestra antes
de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su
rendimiento.
ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
El AEC se redisuelve en unos ml de éter de petróleo o cloroformo y se analiza por CCF
con sílica gel y c/u de los siguientes eluentes:
a) Diclorometano
b) Tolueno: acetato de etilo 93:7
Para revelar cada una de las cromatoplacas se utilizan los siguientes revelad ores:
a)
b)
c)
d)
e)
Luz ultravioleta (254 y 375 nm)
Olfato
Vapores de yodo
2,4- Dinitrofenilhidrazina (0.4 g. en 100 ml HCl 2 N)
Vainillina/ácido sulfúrico
NOTA: De acuerdo con los resultados de este análisis se escoge el sistema
cromatográfico en el cual el componente principal del aceite se observe bien separado
de los demás componentes.
FRACCIONAMIENTO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
El AEC se aplica disuelto en un pequeño volumen del eluente escogido y se aplica a
una placa cromatográfica de sílica gel. Se eluye con el eluente escogido. Los
componentes mayoritarios pueden reconocerse por revelado con luz ultravioleta de 254
nm (compuestos con enlaces dobles conjugados), o cortando una tira lateral de la placa
y revelándola con alguno de los revelado res c, d ó e, citados arriba.
EXTRACCION DE LOS COMPONENTES POR CCF
Los componentes mayoritarios se raspan con la ayuda de la lámpara UV ó el revelador,
se extraen con una mezcla 1:1 de alcohol:cloroformo. Se filtra y se lleva a sequedad. El
residuo debe ser el componente puro o con algunas impurezas. En el caso que se
observe que el compuesto está muy impuro puede purificársele por otra CCF
preparativa.
63
ANALISIS DEL COMPONENTE PURO.
a) Ensayos de coloración.
Si se obtiene una buena cantidad del compuest o puro se pueden realizar ensayos para
fenoles, aldehídos y cetonas, alcoholes, etc.
b) Análisis Espectral.
Al componente puro se le determinan los espectros infrarrojo, ultravioleta, etc.
64
PRACTICA 7.
TECNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACION DE U NA DROGA
a. Valoración de alcaloides del tropano
El término alcaloide (de álcali), fue propuesto por el farmacéutico W. Meissner en 1819,
se aplicó a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas, este carácter
básico es debido a la presenci a de nitrógeno amínico en su estructura.
No existe una definición exacta para el termino alcaloide s, pero se pueden considerar
como compuestos orgánicos de origen natural ( vegetal: familias Lauraceae,
Ranunculaceae, Magnoliaceae, Annonaceae, Menispermacea e, Papaveraceae,
Fumariaceae, Rutaceae, Apocynaceaae, Loganiaceae, Solanaceae , Rubiaceae;
animal: ranas de la familia Mantellidae quienes presentan alcaloides tóxicos en piel ;
bacteriano: la Pseudomona aeruginosa produce la Piocianina , hongos: el Psilocybe
produce Psilocyna y Psilocybina, etc.), nitrogenados, derivados generalmente de
aminoácidos, mas o menos básico, de distribución restringida, con propiedades
farmacológicas importantes a dosis bajas (gran variedad de actividad sobre SNC y
SNA) y que presentan gran diversidad estructural .
N
N
N
pirrolidina piperidina
piridina
N
N
N
indolicidina
quinolicidina
tetrahidro
isoquinoleina
O
N
N
N
tropano
quinoleina
N
imidazol
N
O
indol
N
N
N
N
purina
N
N
N
O
N
N
N
diterpénico
esteroidal
espermidina
Figura 1. Algunos ejemplos de variabilidad estructural de los alcaloides
Para su estudio, algunos autores dividen los alcaloides en cuatro clases (figura 2):
1. Alcaloides Verdaderos : los cuales cumple n estrictamente con las características
de la definición de alcaloide: tienen siempre un nitrógeno heterocíclico, son de
carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal,
biológicamente son formados a partir de aminoácidos.
65
2. Protoalcaloides: son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico
y que son productos del metabolismo de los aminoácidos.
3. Pseudoalcaloides : presentan todas las características de la definición de alcaloide
pero no son derivados de aminoácidos.
4. Alcaloides imperfectos : se derivan de bases púricas y no precipitan con los
reactivos específicos para alcaloides. No son alcaloides los aminoácidos, las
betalaínas, los péptidos, los amino azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las
porfirinas, algunas bases c omo la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos
y los alkil aminas de bajo peso molecular.
Los alcaloides se han clasificado en función de su estructura (heterocíclica y no
heterocíclica), actualmente existen varias formas de clasificarlos 1,6 según sus
propiedades farmacológicas, distribución botánica ó de acuerdo a su origen biosintético .
Acetil CoA
Malonil CoA
Proteinas
N2 Aminoacidos
Aminoácidos
Mevalonato
Policetidos
Aminoácidos
modificados
- CO2
Alcaloides
Imperfectos
No
cíclicas
Aminas
NH3
Protoalcaloides
Cíclicas
Isoprenoides
Aminados
Policetidos
Aminados
Alcaloides
Verdaderos
Pseudoalcaloides
figura 2. Aspectos biogenéticos para la clasificación de los alcaloides
EL NITROGENO es necesario para la construcción de aminoá cidos que posteriormente
se convertirán en proteínas, y de nucleotidos que harán parte de los ácidos nucleicos,
en las plantas l a función de los alcaloides no es aun clara, se ha sugerido que estas
sustancias pueden actuar en los v egetales como:
66
•
•
•
Fuente de almacenamiento del nitrógeno sobrante
Productos de desecho del nitrógeno sobrante
Protectores por su sabor amargo evitan el ataque de insectos, los alcaloides
generalmente se localizan en los tejidos periféricos de los órganos de la planta
(recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raíz o fruto, epidermis de la hoja) .
•
Rreguladores del crecimiento se ha demostrado que los alcaloides derivados
de la putrescina se incrementan notablemente en algunas plantas cuando se
encuentran en suelos deficientes de potasio 2,3, no obstante la pérdida de alcaloides en
el vástago de plantas que normalmente los acumulan en las partes aéreas, ( Nicotiana y
Daturas) no ha impedido el desarrollo, lo cual sugiere que los alcaloides no son
esenciales para los vegetales.
Los alcaloides se reconocen en el laboratorio por su capacidad de combinarse con el
yodo o los metales pesados (bismuto, mercurio, tunsgteno) cuando se encuentran en
forma de sal en extractos ácidos formando precipitados; en la práctica, se utilizan los
siguientes reactivos para su detección: yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner),
mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio
(reactivo de Dragendorff), solución de ácido pícrico (reactivo de Hager), ácido sílico
túngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich);
reacción de Vitali-Morin (para alcaloides en estado base). La extracción y aislamiento se
fundamentan en la diferencia de solubilidad que presentan los alcaloides según se
encuentren en forma de sal (sales de ácidos orgánicos y combinaciones con otras
sustancias solubles en solvente polares: agua, soluciones ácidas e hidroalcoholicas ) ó
de base (solubles en solventes orgánicos no polares: diclorometano, acetato de etilo ),
generalmente son incoloros, pero las conjugaciones en la molécula producen
coloraciones que van desde el amarillo hasta el rojo , además la mayoría son sólidos a
temperatura ambiente, pero hay excepciones (la nicotina que es líquida).
..
R 3N
Alcaloide base
+
H X
+
R 3 NH X
-
Alcaloide sal
La extracción puede realizarse mediante métodos generales como :
1. Extracción en medio alcalino : en donde una solución alcalina desplaza los
alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases liberadas son solubilizadas en
un solvente orgánico medianamente polar
2. Extracción en medio ácido : Extracción de los alcaloides en forma de sales con
agua acidulada, alcohol o solución hidroalcohólica acidulada, seguido de una
alcalinización y extracción de los alcaloides base con un solvente orgánico no
67
miscible (alcaloides y compuestos nitrogenados. Universidad de Antioquia, G. J. Arango
2000)
EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES EN MEDIO ALCALINO (FIGURA 3)
DROGA SECA Y DESENGRASADA
1. Alcalinización
2. Extracción con solvente orgánico apolar
Marco libre de alcaloides
Mayer (-)
Solución de alcaloides bases (+ impurezas)
extracción con ácido diluido
Solución ácida
(alcaloides sales)
Solución orgánica
(libre de alcaloides)
1. Alcalinización
2. Extracción solvente org. no polar
Fase acuosa alcalina
Fase orgánica
(alcaloides bases)
deshidratación evaporación en vacío
Alcaloides Totales (AT)
68
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 2008
69
DROGA EN POLVO, SECA Y DESENGRASADA
1. Maceración en alcohol al 70%
2. Concentración del macerado
Solución acuosa
(alcaloides sales)
1. Alcalinización
2. Ext. con solvente organico medianamente apolar
Fase acuosa
(alcalina)
Fase orgánica
(alcaloides bases)
Ext. con sol. ácida dil.
Fase acuosa
(Alcaloides sales)
Fase orgánica
(impurezas)
1. alcalinización
2. extracción con solvente organico inmisible
Fase acuosa alcalina
(impurezas)
Fase orgánica
(alcaloides bases)
evaporación
Alcaloides totales
VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO
(Flores y hojas de Datura sp.)
La hioscina (escopolamina) y la hiosciamina son los alcaloides principales de las
especies de Datura (Solanaceae), pertenecen al grupo de los alcaloides tropán icos de
70
conocida actividad farmacológica, estos alcaloides se encuentran en algunos géneros
de la familia Solanáceas : Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus, Mandragora,
Scopolia, etc. Además se encuentran en otros géneros de familias como el
Erythroxylum (Erythroxylaceae).
CH 3
N
CH3
N
CH3
O
COOMe
N
O
O
O
Ph
O
C 6 H5
Ph
OH
OH
OH
O
L-Hiosciamina : Atropina
Ester del acido trópico
con la tropina
ACITIVIDAD BIOLOGICA
La Atropina ( l(-)-hiosciamina) se encuentra en Atropa belladona , Datura stramonium y
la escopolamina ( l(-)hioscina) en Hyosciamus n iger, los isómeros l(-) de ambos
alcaloides son 100 veces mas potente s que los isómeros d (+). Se absorben bien en el
intestino y a través de la conjuntiva alcanzando el sistema nervioso central en un lapso
de tiempo entre 30 – 60 minutos, en donde provocan bloqueo competitivo reversible de
las acciones de los colinomim éticos (acetilcolina y análogos) en los receptores
muscarínicos (farmacología básica y clínica de B. G. Katzung 1999)
Efecto en los organos
Sistema Nervioso Central: Estimulan o deprimen dependiendo de la dosis empleada,
a dosis tóxicas estimulan con ap arición de irritabilidad inquietud, desorientación,
alucinaciones y delirio, si la dosis incrementa el esta de intoxicación pro gresa hacia la
depresión profunda, coma, parálisi s respiratoria depresión cadiovascular y
eventualmente la muerte .
Gastrointesti nales: reducen la secreción salival .
Cardiovasculares: producen boqueo colin érgico en el nódulo sinusal el cu al genera
taquicardia y cuya intensidad depende la dosis .
Efectos oculares : bloquea la acción parasimpátic a en las fibras circulares del iris y el
músculo ciliar produciendo midriasis (pupila dilatada) y cicloplej ía (desenfoque para
visión lejana e incremento de la presión intraocular) ( Fundamento s de farmacología en
terapéutica C.A. Isaza 1992).
Extracción de alcalo ides por el método ácido .
En un erlenmeyer de 250 ml se colocan 10 g de material vegetal seco y molido con
suficiente cantidad de etanol del 95% (v/v) que cubra la muestra (aproximadamente
100 ml), se macera a temperatura ambiente por 24 horas, también pu ede realizarse un
71
reflujo durante 2 horas si no se dispone del tiempo para la maceración a temperatura
ambiente. El extracto etan ólico se filtra, el residuo sólido se lava con 3 porciones de
etanol de 10-15 ml y se descarta, la reunión de los filtrados se concentra a un pequeño
volumen o se evapora a sequedad, luego se le adicionan 15 ml de H 2SO 4 0.5 N y 10 ml
de agua destilada. La fase acuosa ácida se extrae con tres porciones de 10 ml de
hexano para desengrasar, la fase orgánica hex ánica se descarta y las acuosas ácidas
se alcalinizan con NH 4OH al 25% hasta obtener un pH entre 10 y 11, posteriormente se
extraen con tres porciones de 10 ml de diclorometano. Los extractos dicloromet ánicos
reunidos son secados sobre sulfato de sodio anhidro y llevados a seque dad en
rotaevaporador, el residuo alcalo ídico se redisuelve en 3 – 5 gotas de etanol y 5.0 ml
de H 2SO 4 0.02N (medidos exactamente con pipeta volumétrica), se adicionan 15 ml de
agua destilada y 2 -3 gotas del indicador rojo de metilo (viraje de pH entre 4. 2 - 6.3).
Esta solución ácida (color rosa) es valorada por retroceso, por adición de una solución
de NaOH 0.01 N desde una bureta hasta que el color de la solución cambie a amarillo.
72
DIAGRAMA DE FLUJO
VALORACIÓN DE ALCALOIDES DEL TROPANO
Base del método: extracción de alcaloides en medio ácido
Material vegetal Seco y Molido (10 g)
Extraer ETOH al 95 % (100 ml) por 24 horas a 25 C ó reflujo de 2h
Filtrar, Lavar con ETOH (porciones de 10 ml)
FILTRADO
RESIDUO SOLIDO
Concentrar, Adicionar 15 ml H2SO4 0.5 N y 10 ml H2O
Filtrar si es necesario
Extraer con 15 ml Hexano (3 porciones)
DESECHAR
FASE ORGANICA (hexano)
DESECHAR
FASE ACUOSA
Alcalinizar con NH4OH 25% (pH: 10 -11)
Extraer con 15 ml CH2Cl2 (3 porciones)
FASE ACUOSA
FASE ORGANICA (CH2Cl2) inferior
DESECHAR
Filtrar sobre Na2SO4
LLevar a sequedad en RVP balon pequeño
Redisolver en gotas de ETOH y 5.0 ml H2SO4 0.02 N
Agregar 15 ml H2O
Agregar 2 - 3 gotas Indicador Rojo de Metilo (pH: 4.2 - 6.3)
Retrovaloración: Sln NaOH 0.01 N
Punto final: cambio a color amarillo
Nota:
1. Si al agregar el indicador rojo de metilo no se observa cambio de color a rojo y la
solución permanece de color amarillo, debe agregarse mayor cantidad de ácido ya
que los alcaloides de la mues tra han consumido todo el ácido agregado, y es
necesario establecer el medio ácido para proceder con la retrovaloración.
2. Según el libro Farmacognosia de Trease and Evans 13 edición, Editorial
Interamericana Mc Graw -Hill 1991 página 606, el Estramonio pu ede contener entre
0.2 y 0.45% de alcaloides siendo los principales la hiosciamina y la hioscina
(escopolamina), la droga BP contiene no menos de 0.25% de alcaloide.
73
Cálculos
Tener en cuenta que:
1. Asumir el punto final de la titulación como el punto d e equivalencia para tomar el
volumen de base utilizada en el proceso de neutralización.
2. Calcular el volumen de Volumen de H 2SO 4 0.02N neutralizado por el alcaloide base
3. El H 2SO 4 es un ácido diprótico, entonces por cada meq de ácido reaccionan 2
equivalentes de base NaOH.
4. Cada 1 ml. de ácido o de base 0.01 N es equivalente a 2.892 mg. del alcaloide
calculado como L - hiosciamina. PM = 289.2 g/n
En el punto de equivalencia:
1 Meq de Acido = 2 Meq de base
N H2SO4 x V H2SO4 = 2 (N NaOH x V NaOH)
V H2SO4 libre (exceso) = 2 (N NaOH x V NaOH )
N H2SO4
V H2SO4 que reacciona con el alcaloide base = 5.0 ml - V H2SO4 libre (exceso)
% Alcaloides en la muestra
=
2 (5.0 ml - ((V NaOH x N
NaOH )/
N
H2SO4 ))
x 2.892 mg/ml x 100
Peso de muestra (mg)
Datos:
N H2SO4 = 0.02
N NaOH = 0.01
V H2SO4 = 5.0 ml
V NaOH = ?
b. Cuantificación de rutina en flores de saúco y en partes aéreas de pensamiento
Introducción
La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampl iamente distribuido en
plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en
su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la
espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el
74
reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus
materias primas vegetales correspondientes.
Procedimiento
• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm
• Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre
200 y 400 nm.
• Seleccionar la longitud de onda de trabajo.
• Para obtener la curva de calibración, tomar alícuotas de la solución estándar y
llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbanc ias de cada solución a la
longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs.
Concentración en ppm.
Alícuota (ml)
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
Volumen final
(ml)
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
Absorbancia a
360 nm
Concentración de rutina
(ppm)
La gráfica muestra una curva de calibración obtenida experimentalmente con alícuotas
tomadas a partir de una solución estándar de rutina de concentración aproximada a
100 ppm.
Curva de calibración de estándar de rutina
0,9
Absorbancia a 360 nm
0,8
0,7
y = 0,0352x + 0,037
R2 = 0,9906
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
Concentración en metanol (ppm)
20
25
75
2. Extracción de la droga
• 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima
de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en
baño de agua a 60 °C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con
10 ml de metanol (preferiblemente cali ente), evaporar a sequedad y pesar el
extracto obtenido.
3. Separación mediante CCF
• Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una
cromatoplaca de sílica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa),
colocando al lado una apl icación del estándar de rutina disuelto en metanol.
Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia
el peso de extracto sembrado en CCF.
• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua
100:11:11:2.7.
• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo.
• Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y
analizarla con una lámpara UV a 254 nm.
• Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer
con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se
concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con
exactitud. Ayudarse con una pipeta Pasteur para evitar pérdidas.
4. Lectura espectrofotométri ca y cuantificación
• Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación
con la curva de calibración.
• Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado
para muestras auténticas.
c. Cuantificación de r utina en un jarabe de saúco
Introducción
La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en
plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en
su detección a nivel de laboratorio median te la cromatografía en capa fina (CCF) y la
espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el
reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus
materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un método de
cuantificación en un jarabe.
76
Procedimiento
• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm
200 y 400 nm.
llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la
longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia v s.
Concentración en ppm.
Alícuota (ml)
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
Volumen final
(ml)
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
Absorbancia a
360 nm
Concentración
de rutina (ppm)
• A partir de la información dada en la etiqueta por el fab ricante tomar un volumen
equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material
volumétrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vacío y calentando a 60°C. El
residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en baño
de agua a 60°C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml
de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo
obtenido.
• Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una
colocando al lado una aplicación del estándar de rutina disuelto en metanol.
• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua
100:11:11:2.7.
• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo.
analizarla con una lámpara UV a 254 nm.
• Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspa r y extraer
con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se
concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con
exactitud.
77
4. Lectura espectrofotométrica y cuantificación
Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol
d. Cuantificación de anetol en semillas de anís e hinojo
Introducción
El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varia s plantas aromáticas.
Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio
mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la
hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el con trol de calidad de
productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales
correspondientes.
Procedimiento
• Preparar una solución estándar de anetol en metanol de concentración 100 ppm
200 y 400 nm.
llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la
longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a
78
0.8, si no es así se deberán preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3,
0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en
ppm.
Alícuota (ml)
Volumen final
(ml)
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
Absorbancia a
360 nm
Concentración de rutina
(ppm)
• 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima
de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitación, durante 15
minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar
a sequedad y pesar el extracto obtenido.
• Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una
colocando al lado una aplicación del estándar de anetol disuelto en tolueno ó
diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar.
Por diferencia determinar el peso de ext racto sembrado.
• Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7.
analizarla con una lámpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf
aproximado de 0.95.
• Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con
diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a
sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.
4. Lectura espectrofotométrica y cuanti ficación
• Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado
para muestras auténticas.
Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol
79
80
Práctica 8
MARCHA FITOQUÍMICA
OBJETIVO
Efectuar el estudio químico sistemático de las plantas con el fin de detectar varias
clases de sustancias vegetales presentes en ellas como son los alcaloides, los
flavonoides, las quinonas, las sapon inas, los taninos, los compuestos fenólicos, los
triterpenoides, los esteroides, los cardiotónicos y las leucoantocianidinas , las que con
mayor frecuencia se ha comprobado están relacionadas con actividades biológicas
específicas, o se utilizan como materi as primas para el desarrollo de productos
farmacéuticos comerciales .
Para propósitos de la presentación de los resultados se deben utilizar las siguientes
convenciones:
Resultado
Negativo
Dudoso
Positivo
Francamente positivo
No determinado
Asignación
+/+
++
ND
81
MUESTRA SECA Y PULVERIZADA (50 g)
FRACCIÓN A (AA, CF, TA, FL, TE, QU, CA, AL, LE)
H2O
HCl diluido
Ensayar FL, LE, CF, AA, TA
INSOLUBLES (FRACCIÓN B)
SOLUBLES
Alcalinizar, Partición con
CHCl 3 ó CH 2Cl 2
FASE CHCl 3 (FRACCIÓN C)
FASE ACUOSA BÁSICA
1. Salado ("Salti ng out")
2. Partición con CHCl 3
Ensayar CA, TE
Ensayar AL (en
medio ácido)
FASE CHCl 3 (FRACCIÓN D)
Ensayar FL, LE,
CA, TE, AL
FASE ACUOSA (FRACCIÓN E)
Ensayar AL, FL,
CF, TA
CONVENCIONES
AA = AMINOACIDOS
CF..= COMPUESTOS FENOLICOS
TA = TANINOS
FL = FLAVONOIDES
TE = TRITERPENOIDES Y/O EST EROIDES
QU = QUINONAS
CA = CARDIOTONICOS
AL = ALCALOIDES
LE = LEUCOANTOCIANINAS
82
83
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LA FACCIÓN A
DROGA O MUESTRA (50 g) SECA Y PULVERIZADA
1. Macerar con etanol 70%, 24 horas
2. Reflujar 1 hora
3. Filtrar caliente
FILTRADO (FRACCIÓN A)
Residuo, lavarlo con alcohol
1 ml
40 ml
Ensayar
AA
RESIDUO
Llevar a
sequedad
FRACCIÓN A
RESIDUAL
*
FILTRADO
Redisolver en 20 ml de agua
caliente y filtrar
DESECHAR
RESIDUO
DESECHAR
FILTRADO ACUOSO
10 ml (caliente)
10 ml
Ensayar FL y LE
Filtrar en frío
RESIDUO
FILTRADO ACUOSO
* NOTA: Para llevar a sequedad utilice
calentamiento con temp eratura no mayor de 50 °C.
DESECHAR
Ensayar CF y TA
84
ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES A RESIDUAL Y B
FRACCIÓN A RESIDUAL
Llevar a sequedad
Añadir 30 ml de HCl 5%.
Calentar a 60 °C durante 15 minutos.
Filtrar en caliente.
RESIDUO INSO LUBLE
FILTRADO ACUOSO
ACIDO I
Lavar con 20 ml de HCl 5% y filtrar
RESIDUO
FILTRADO
Disolver con 30 ml de cloroformo o diclorometano
Deshidratar con Na 2SO 4 anhidro y filtrar
FILTRADO (FRACCIÓN B)
Ensayar TE, CA, QU, FL.
RESIDUO
DESECHAR
85
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LA FACCIÓN C
FILTRADO ACUOSO ACIDO I
Alcalinizar con gotas de NH 4OH conc. (pH 10 -11)
Partición con 2x15 ml de cloroformo (o diclorometano)
FASE orgánica
FASE ACUOSA
BÁSICA
Lavar c on 10 ml de H 2O
FASE orgánica
FASE ACUOSA
FILTRADO (FRACCIÓN C)
RESIDUO
5 ml
Resto
DESECHAR
Llevar a sequedad
Redisolver en 10 ml de HCl 5% con calor y filtrar
Ensayar CA y TE.
FILTRADO
RESIDUO
Ensayar AL.
DESECHAR
86
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES D Y E
FASE ACUOSA BÁSICA
Hacer partición con 2x15 ml de CHCl 3 ó CH 2Cl 2
FASE orgánica
FASE ACUOSA
(FRACCIÓN E)
Lavar con 20 ml de solución semisaturada de NaCl
FASE orgánica
Neutralizar con HCl y ensayar FL, LE,
AL (en medio ácido), CF (pH
ligeramente ácido) y TA (pH neutro).
FASE ACUOSA
FILTRADO (FRACCIÓN D)
RESIDUO
Redisolver D1 en 4 ml de etanol y ensayar FL, CA, LE.
DESECHAR
Repartir en tres porciones iguales
de 5 ml c/u: D1, D2 y D3. L levar a
sequedad.
Redisolver D2 en 1 ml de CHCl 3 y ensayar TE.
Redisolver D3 en 5 ml de HCl 1% y ensayar AL.
FIN
87
88
ENSAYOS SOBRE LAS FRACCIONES A -E
1.
ENSAYO DE SHINODA (O DE LA CIANIDINA) PARA FLAVONOIDES Y OTRAS
SUSTANCIAS CON EL NUCLEO γ-BENZOPIRONA.
Precaución 1: Antes de realizar el ensayo, si se trata de muestras que contienen
demasiadas clorofilas, estas se deben eliminar precipitándolas co n acetato de plomo
en solución.
Precaución 2: Si la muestra está en solución clorofórmica o diclorometánica, se debe
evaporar para eliminar el solvente y redisolverla en 1 ml de alcohol.
Precaución 3: Realizar la prueba en la campana de extracción de gas es y sujetando el
tubo de ensayo con una pinza.
Ensayo: Tomar 1 ml de solución en un tubo de ensayo limpio. Añadir algunas li maduras
de Mg. sujetar el tubo con una pinza. Añadir cuidadosamente por la pared del tubo,
unas gotas de HCl concentrado (37%).
La aparición de coloraciones naranja a violeta es prueba positiva para la presencia de
flavonoides.
Para fines de comparación realizar la prueba con 0.5 ml de una solución patrón de
morina.
2. ENSAYO DE ROSENHEIM (PARA LEUCOANTOCIANIDINAS):
Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa en un tubo de ensayo limpio. Añadir 0.5 ml
de HCl concentrado. Mezclar. Calentar durante 10 minutos a 100 0C y enfriar. Pasar a
un tubo de ensayo de 10 x 75 mm. Añadir 0.4 ml de alcohol amílico y agi tar. Dejar
separar las fases. La prueba se considera positiva si aparece coloración en la fase
amílica que vaya desde el carmesí oscuro al rosado débil.
3. ENSAYO DEL FeCl 3 (PARA COMPUESTOS CON HIDROXILOS FENOLICOS):
Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa o alcohólica en un tubo d e ensayo limpio.
Añadir 1 gota de FeCl 3 al 1% acuoso o alcohólico. Mezclar. La aparición de
coloraciones violeta, verdes, azules u oscuras se considera prueba positiva.
Para fines de comparación realizar la prueba con 0.5 ml de solución pa trón de ácido
tánico.
4.
89
ENSAYO DE LA GELATINA -SAL (PARA TANINOS):
Ensayo: Tomar 1.0 ml de solución acuosa neutra en un tubo de ensayo limpio. Aña dir
1.0 ml de solución de gelatina -sal. La formación de un precipitado se considera prueba
positiva. Centrifugar si es ne cesario para observar el precipitado.
Precaución: Algunas otras sustancias también producen precipitados con este
reactivo, para eliminar tales interferencias, es recomendable uti lizar el procedimiento de
Sanabria, Pág. 73.
5.
ENSAYO DE LIEBERMANN -BURCHARD (PARA TRITERPENOIDES Y/O
ESTEROIDES CON GRUPOS DIENO CONJUGADOS REALES O
POTENCIALES):
Precaución 1: El ensayo se realiza con muestras disueltas en cloroformo ó
Diclorometano únicamente.
Precaución 2: Al adicionar el ácido sulfúrico hacerlo en la ca mpana de extracción. La
reacción libera calor, utilizar pinza para tubo de ensayo. Si la solución ó el tubo de
ensayo no están completamente secos puede haber salpicaduras.
Ensayo: Tomar 0.5 ml de solución clorofórmica anhidra en un tubo de ensayo limpio y
seco. Añadir 0.5 ml de Anhídrido acético. Añadir cuidadosamente por la pared del tubo,
una gota de Acido sulfúrico concentrado. Observar y anotar los cambios de coloración.
Se considera positiva la prue ba cuando aparecen coloraciones violeta, verde o az ul.
6.
ENSAYO DE BORNTRANGER (PARA NAFTO - Y ANTRAQUINONAS)
Precaución: Realizar esta prueba en la campana de extracción ya que el benceno y el
tolueno son sustancias muy tóxicas.
Ensayo: Tomar 3 ml de solución clorofórmica y llevarlos a sequedad. Rediso lver en 5
ml de alcohol: H 20 (1:7). Añadir 1 ml de agua oxigenada de 20 volú menes, 1 ml de
ácido sulfúrico al 50% y calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 -15
minutos. Dejar enfriar y extraer en un embu do de separación con 5 ml de benc eno ó
tolueno.
Retirar 2 ml de la fase orgánica y agitarla en otro tubo con 1.0 ml de solución de NaOH
al 5% en NH 4OH al 2%. La prueba se considera positiva cuando aparecen coloraciones
que van del rosado al rojo intenso en la ca pa alcalina.
90
7. ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS)
Precaución: La formación del color violáceo no dura sino algunos pocos segundos.
Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgánica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml de
alcohol. Añadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recién prepa rado (Mezcla de partes iguales
de las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloración
púrpura o violácea. Como referencia se puede compa rar con el color producido con 1
ml de KOH al 5% en alcohol.
8. ENSAYOS PARA ALCALOIDES
Precaución 1: Todos los ensayos deben hacerse siempre con la muestra disuelta o
redisuelta en HCl 5% acuoso.
Precaución 2: La solución acuosa ácida debe estar libre de turbiedades y precipitados
antes de hacer los ensayos para alcaloides.
Precaución 3: Luego de realizados los ensayos, se deben desechar las muestras en un
frasco dispuesto para ello en el laboratorio, esto con el fin de no contaminar el
ambiente con metales pesados.
Ensayos: Tomar 0.5 ml de solución acuosa ácida en 4 tubos de ensayo limpios. Añadir
a cada tubo 1 gota de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de
amonio. Se considera prueba positiva cuando aparecen preci pitados en por lo menos 3
tubos.
Para fines de comparación realizar el ensayo con 0.5 ml de una solución p atrón de
sulfato de quinina.
9. ENSAYO DE NINHIDRINA (PARA AMINOACIDOS).
Ensayo: Colocar 1 gota de solución, en una tirilla de papel filtro. Secar. Añadir 1 gota
de reactivo de ninhidrina (Solución al 0.002% en alcohol). Calentar sobre una plancha
de calentamiento a 105 0C. El desarrollo de coloraciones violeta, azul o rosada se
considera prueba positiva.
91
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
1.
SANABRIA G. Antonio: “Análisis Fitoquímico Preliminar”, Departamen to
Farmacia, Universidad Nacional, Bogotá, 198 3.
de
2.
ARANGO A. Gabriel J. QUIJANO T. Jairo: “Marcha Fitoquímica Semicuantitativa”,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medellín.
3.
DOMINGUEZ X.A., “Métodos de Investigación Fitoquímica”, Ed. Limusa, México,
1979.
92
PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME DE LABORATORIO
El informe de laboratorio incluirá el desarrollo y presentación de cada uno de los
siguientes puntos:
TITULO
El titulo debe describir en forma somera el alcance del expe rimento realizado
procurando q ue no sea excesivamente largo y detallado como tampoco que sea
muy corto y demasiado general.
Cuando un experimento se trabaje con una determinada especie vegetal o animal,
el titulo debe incluir el nombre científico de la misma, de acuerdo con las normas
universales estableci das; además el nombre vulgar, y la familia a la cual
pertenece la muestra. En este caso, también debe incluirse el nombre de la parte
de la especie analizada (por ejemplo: raíz, fruto, hojas, partes aéreas, etc.).
Por otro lado, el titulo debe incluir los nombres de las prin cipales técnicas de
laboratorio empleadas (ejemplo “Purificación por cromatografía en columna de . .
.”, “... identificación por espectroscopia ultravioleta de . . . “, etc.) .
Un modelo de título es:
“Aislamiento y caracterización del componente principal del aceite esencial de
hojas de ajenjo, Artemisia absinthium , Compositae, mediante cromatografía en
capa fina y técnicas espectrales”
En este título se reconocen las siguientes partes:
Los logros alcanza dos: Aislamiento y caracterización de una sustancia.
La parte de la planta analizada : Las hojas
El nombre común de la planta : El ajenjo
El nombre científico de la planta : Artemisia absinthium ( en itálicas)
La familia vegetal : Compositae (en inglés), ó Compuestas (en español)
La técnica de aislamiento : Cromatografía en capa fina .
La técnica de caracterización : Métodos espectrales .
DATOS
En esta parte del informe deben incluirse todas las medicio nes y observaciones
realizadas en el laboratorio y que permiten hacer un análisis e interpretación de
los fenómenos observados. Por ejemplo, los dibujos de las cromatoplacas
obtenidas en un análisis por cromatografía en capa fina con sus manchas y
colores correspondientes ; los valores de absorbancia o transmitancia de un
pigmento carotenoide al analizarlo por espectroscopia ultravioleta, los espectros
93
infrarrojo o ultravioleta determinados; los resultados de reacciones coloreadas
para reconocer algún metabolito secun dario, etc.
ANALISIS DE RESULTADO S
En este ítem se incluirá la forma como se interpretaron los resultados obtenidos
por comparación con datos obtenidos con patrones o reportados en la literatura
científica, citando como una nota
al pié la referencia bibliográfica
correspondiente.
Al citarse un dato u observación de los reportados en la li teratura, debe siempre
citarse la correspondiente referencia, la cual debe aparecer en el ítem Bibliografía,
y en el texto debe señalarse dicha referencia, por ejemplo:
“ANALISIS DE RESULTADOS
La sustancia aislada mostró un máximo de absorción en su es pectro ultravioleta
en 206 nm, lo cual esta de acuerdo con lo reportado por Silverstein (1978) para
sustancias con enlaces dobles aislados....”
″.... De acuerdo con este análisis la sustancia mas pro bable es el B —caroteno,
ya que se necesitaría determinarle por lo menos el correspondiente espectro de
masas para confirmar este hecho....”
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En este ítem se debe incluir solamente aquellos hechos demos trados en la
observación experimental de cada práctica, y las sugerencias que se considere
de interés sobre las conclusio nes obtenidas.
Las conclusiones no deben ir reseñadas bibliográficamente, puesto que son
inherentes a la interpretación que dé el es tudiante al experimen to realizado.
Por ejemplo unas conclusiones pueden ser:
“...el principal componente del aceite de clavo el eugenol”.
“De acuerdo con los sistemas utilizados en la práctica el mejor sistema eluente
para separar por cromatografía en capa fina los caroteno ides de la zanahoria
(Daucus caraota ) es la mezcla diclorometano/éter de petróleo 50:50...”.
Las conclusiones no deben incluir eventos tales como cortes de energía, falta
de recursos, daño de aparatos, excusas mé dicas, etc.
94
BIBLIOGRAFIA
Este ítem debe relacionar en el orden alfabético (por apelli dos del primer autor)
solamente aquellos documentos, libros, revistas, folletos, comunicaciones
personales, etc. que sean inherentes al informe, es decir los que efectivamente
fueron consultados por el es tudiante para la elaboración del informe.
Por otro lado, si el estudiante encuentra un mismo dato re portado en varias
fuentes bibliográficas, debe reportar solo aquella que considere más
conveniente de acuerdo con su criterio. Por ejemplo, si encontró en el libro A
que el fruto del tomate maduro contiene licopeno, y en otro libro B encontró que
el mismo contiene β-caroteno (pigmento amarillo) y licopeno (pigmento rojo)
junto con otros pigmentos carotenoides... etc. , debe reportar solo el libro que le
informe más sobre lo reali zado en la práctica, es decir el B, en este caso. Si no
es posible discernir entre uno y otro, siempre debe reportarse el más reciente
en su publicación.
Para propósitos de presentar las referencias bibliográficas en cada informe s e
deben tomar los siguientes modelos:
Para libros:
Autor(es); “Título”, volumen, Editor o Editorial, Número de edición,
ciudad, año, paginas consultadas.
Ejemplo:
HARBORNE J.B.: “PHYTOCHEMICAL METHODS”, Chapman and
Hall Ltd., New York, 1973, pp 119 —120.
Para revistas:
Autor(es); título del artículo (en minúsculas), nombre de la revista (en
may4sculas), volumen, número, paginas consultadas, (año).
Por ejemplo el siguiente modelo:
95
Garg V.K., Nes W.R.; “Codisterol and other ∆5-Sterols in the see ds of Cucurbita
maxima “ PHYTOCHEMISTRY 23 (12), 2925 —2929 (1974).
Para documentos publicados en Universidades:
Autor(es), título, Facultad o Departamento, Universi dad, ciudad, año, páginas
consultadas.
Por ejemplo:
Martínez M. A.; “Manual de practi cas para el laborato rio de Fitoquímica”,
Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín, 1988,
pp. 15—18.
Para referencias bibliográficas de Internet:
Se deben citar solamente páginas web de entidades académicas y científicas
reconocidas, acompañadas de la primera página impresa con la
correspondiente dirección http y la fecha de consulta.
No se aceptan como referencias bibliográficas las comunicaciones personales,
excepto las impresas enviadas por correo electrónico.
Nota: Cuando se reporten referencias bibliográficas incompletas ó que se
compruebe que no son consistentes con lo escrito en el informe, este se
calificará sobre una base del 70% de la calificación máxima.
Evaluación:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Práctica 1: Informe al profesor, 5%
Práctica 2: Informe 7%, quiz 3%
Práctica 3: Informe 7% y quiz 3%
Práctica 6: Informe, 10%
Práctica 7: Informe, 10%
Práctica 8: Informe 7% y quiz 3%
Práctica especial: Anteproyecto 5%, Póster 20%.
96
Bibliografía
1. Domínguez, X. A., Métodos de Investigación Fitoquímica, Edit. Limusa, Mexico,
1973.
2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer
Chromatography Atlas, Springer -Verlag, Berlin -Heidelberg -New York-Tokyo, 1984.
3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease -Evans, 13 edic., Interamericana McGraw -Hill,
Madrid-Auckland-Bogotá, 1991.
4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant
Analysis, Chapman & Hall, London -Weinheim-New York, 1998.
5. Gattuso, M. A., Ga ttuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas
en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999.
6. Ramírez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia,
Universidad de Antioquia, Medellín, 1999.
7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html
8. http://farmacia.udea.edu.co/~ff
9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez
10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography
11. Martínez, A., Farmacognosia y Fitoquímica Experimental, Universidad de Antioquia,
Medellín, 1991.
12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natur al
Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc.
13. Bases de datos: Napralert
14. República de Colombia, Ministerio de Salud, Decreto ley Nº 677, Ley del
medicamento de 1994.
15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Org anization,
Geneva, 1998.
16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapeúticos, Roberto
Pinzón ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo,
Cyted, Santafé de Bogotá D. C., 2000.
17. CD Farmacognosia y Fitoquímica, versión 2.0, Alejandro Martínez , Universidad de
Antioquia, Medellín, 200 5.

Manual de laboratorio 2008 - Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias

Transcripción

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