Determinación de Herpesvirus en Chelonia mydas agassizii y

Determinación de Herpesvirus en Chelonia mydas agassizii y

Determinación de Herpesvirus en Chelonia mydas
agassizii y Lepidochelys olivacea del Pacífico de Costa
Rica y Nicaragua
La Fibropapilomatosis (FP) es una enfermedad neoplásica global de las tortugas
marinas. Fue descrita por primera vez hace más de 50 años en tortugas verdes
(Chelonia mydas) por Luckes y Coates. La enfermedad fue inicialmente descrita en
la familia Chelonidae, especialmente en la tortuga verde (Chelonia mydas)
(Quackenbush et al. 1998), pero también se ha referenciado en Caretta caretta
(Herbst 1994), Lepidochelys olivacea (Aguirre et al. 1999), Eretmochelys imbricata y
Natator depressus (Harshbarger 1991), afectando a las tortugas marinas alrededor
de todo el mundo (Herbst 1994, Work y Balaz 2013). Estudios recientes muestran
que la prevalencia de FP ha ido declinando en las poblaciones de tortugas verdes
de Hawaii, sin embargo la prevalencia en tortuga verde de Florida y otras regiones
se ha mantenido estable o en incremento (Chaloupka et al. 2009; Foley et al. 2005).
Estas tortugas se enlistas como vulnerables, en peligro o en peligro crítico (UICN,
2014), y por lo tanto la FP es una amenaza para su supervivencia.
La FP en tortugas marinas se
caracteriza por la aparición de
múltiples tumores cutáneos de
naturaleza fibroepitelial en cuello,
extremidades,
cola,
regiones
axilares e inguinales, caparazón y
plastrón, mostrándose en casos
avanzados caquécticas, débiles y
anémicas (Jacobson et al. 1989).
Los fibropapilomas oculares tienen
su origen en párpado, conjuntiva,
limbo y córnea, conllevando la
ceguera
de
los
ejemplares
afectados en la mayoría de los
casos (Brooks et al. 1994). También
se han descrito fibromas en órganos internos (Herbst, 1994).
En Costa Rica el primer reporte sospecho de FP se dio en una tortuga lora (L.
olivacea) en el Refugio de Vida Silvestre (RVS) de Ostional en 1982 (Cornelius and
Robinson 1983), subsecuentemente en 1987 (Orrego y Morales 2002).
Posteriormente, Aguirre et al. (1999), llevaron a cabo un estudio en el RVS Ostional
y describieron, por primera vez en el país, la histopatología de masas de piel en
tortugas loras y determinaron la presencia de fibropapilomas. En el caso de las
costas nicaragüenses, se reportó lesiones similares a la FP en tortugas verdes (C.
mydas) en el Atlántico de Nicaragua (Lagueux, 1998). En Costa Rica no existen
datos de esta enfermedad para C. mydas agassizii y ni en Nicaragua para L.
olivacea.
Chelonia herpesvirus asociado a fibropapiloma (CFPHV – por sus siglas en inglés),
es un alfaherpesvirus que mayormente ha sido asociado como agente etiológico de
la FP (Arthur et al. 2008a; Greenblatt et al. 2005; Lackovich et al. 1999;
Quackenbush et al. 1998). La determinación de CFPHV genómico es un factor
constante en animales afectados (Ene et al., 2005 and Herbst et al., 2004), sin
embargo, el ADN viral pueden también estar presente en la piel de animales
asintomáticos, debido a que la piel parece ser el sitio principal en donde se
encuentra CFPHV, por lo que en infecciones tempranas o latentes se puede
determinar la presencia de ADN de CFPHV (Quackenbush et al. 2001).
Esta investigación tuvo como objetivo determinar la presencia de CFPHV de
tortugas marinas, Ch. mydas agassizii y L. olivacea, que desovan y forrajean en dos
países de América Central, Nicaragua, Refugio Nacional de Vida Silvestre (RNVS)
la Flor y RNVS Chacocente y en Costa Rica, RNVS Ostional, Parque Nacional
Santa Rosa (PN): Playa Naranjo y Playa Nancite y en el Golfo Dulce de Puerto
Jiménez.
Metodología
Examen clínico y toma de muestras:
Entre los años 2010 al 2012, C. mydas agassizii fue muestreada en un sitio de
forrageo, Golfo Dulce y dos sitios de anidación, playa Naranjo y playa Nancite. L.
olivacea en el RVS Ostional, Costa Rica y en el RVS La Flor y RVS Chacocente en
Nicaragua (Figura 1).
Figura 1. Sitios de muestreo de Norte a Sur: Chacocente RVS (anidante) y La Flor NWR
(anidante), Nicaragua, Playa Nancite (anidante), Playa Nancite (anidante) en Santa Rosa PN,
Ostional RVS (anidante) y Golfo Dulce, Puerto Jiménez (forrajeo), Costa Rica.
En el sitio de forrajeo las tortugas fueron capturadas con una red de 100m x 3m, la
cual no ocasiona daños a los individuos capturados. La red fue lanzada al mar y
monitoreada regularmente durante siete horas seguidas por día y retirada al final de
cada día. Las tortugas fueron liberadas de la red inmediatamente para minimizar el
estrés por la captura. En los sitios de anidación, en el caso de C. mydas agassizii
los individuos fueron capturadas posterior a la puesta de huevos, utilizando una red
para inmovilizarlas y cubriéndoles la cabeza para minimizar el estrés. Para L.
olivacea la tortuga fue capturada en época de arribada, durante el periodo de transe
durante el periodo de ovoposición.
Las tortugas capturadas en el sitio de
forrajeo se midió el largo curvo del
caparazón, para tratar de definir si las
tortugas capturadas eran juveniles o
adultos. También se analizó el estado
de salud externa mediante examen
físico. Se tomaron tres muestras de
tejido de 5mm de diámetro de una de
las aletas dorsales de cada tortuga. Si
la tortuga presentaba tumores se
tomaban tres muestras de tejido
tumoral de 5 mm de diámetro.
Detección de CFPHV-ADN:
Se realizó análisis de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la
detección del herpesvirus en muestras de piel, hisopados cloacales, nasales y
oculares y tejido tumorado. Utilizando el mismo procedimiento para todas las
muestras. El ADN total fue extraído de tejidos y de hisopados oculares, nasales y
cloacales utilizando el kit Blood and Tissue ® (Qiagen, Hilden) de acuerdo con las
instrucciones de fabrica indicados. La amplificación de las muestras de ADN para la
detección del Herpesvirus se llevó a cabo a través de un PCR anidado, según el
procedimiento descrito por Lu y colaboradores (2000). Posteriormente se realizó la
amplificación y secuenciación de las muestras positivas siguiendo el protocolo de
Quackebush y colaboradores (2001). Las secuencias virales fueron comparadas a
las secuencias reportadas para herpesvirus en tortugas marinas en el GenBank,
utilizando alineamiento Clustal omega para verificar la identidad de las secuencias
analizadas.
Resultados:
De un total de 101 individuos analizados para la tortuga negra, 8 de playa Nancite,
16 de playa Naranjo (ambos sitios de tortugas anidantes) y 77 del Golfo Dulce
(tortugas en forrajeo), 18 (17.8%) individuos, dos en playa Naranjo y 16 (20.8%) en
Golfo Dulce resultaron positivos.
De acuerdo a las medidas obtenidas de la longitud del largo del caparazón y
tomando en cuenta lo definido por Seminoff y colaboradores (2007), los individuos
mayores o iguales a 75.5 cm son adultos y menores a 75.5 cm son consideradas
juveniles. De 77 tortugas muestreadas en el sitio de forrageo (Golfo Dulce), un 66%
(51) fueron adultos y un 34% (26) juveniles. No se pudo determinar el sexo de las
juveniles, pero todos los adultos capturados aparentemente fueron hembras, de
acuerdo con las características morfológicas externas, ya que todas tenían una cola
pequeña. Para esta especie de tortuga, los machos presentan una cola larga para
facilitar la copula (Wyneken 2001, Eckert et al. 2000). Analizando los resultados de
individuos positivos para CFPHV determinados para el Golfo Dulce, de los 20
individuos positivos, 13 (26%) positivas de 51 se trataban de tortugas juveniles y 7
(54%) positivas de 26 se trataban de tortugas adultas.
En el caso de la tortuga lora, de un total de 154 muestras analizados, 14 de RVS
Chacocente, 66 de RVS La Flor and 74 de RVS Ostional. En total 38 (24.7%) de
estas muestras resultaron positivos, seis en RVS Chacocente, 36 (54.5%) en RVS
La Flor y 10 (13.5%) en RVS Ostional resultaron positivos (Tabla 1).
Tabla 1. Número de tortugas muestreadas por localidad y número de muestras positivas con y
sin tumores.
Especies
C. mydas
agassizii
Localidad
País
Golfo Dulce
Playa Naranjo
Costa Rica
Playa Nancite
Ostional RVS
Costa Rica
Tamaño de
muestra
Muestras
Positivas
Tipe de
Tejido
77
16
16
2
8
0
74
10
NoTumorada
66
36
Tumorada
14
6
NoTumorada
L. olivacea
La Flor RVS
Chacocente RV
Nicaragua
Todas las tortugas capturadas para este estudio presentaron buen estado
nutricional, es decir sin ojos y plastrón hundidos y sin presencia de cantidades
anormales de percebes. A pesar de la revisión minuciosa de todas las tortugas
analizadas, únicamente en el RVS Chacocente y en el RVS La Flor se observaron
tortugas con tumoración evidente, todas ellas positivas a CFPHV, no fue observado
para ningún otro sitio tortugas FP.
De estos individuos con FP, las muestras de tumores fueron positivas en 82% (32 of
39) de los casos y en 34% (14 of 41) de los casos las muestras de tejido sano de
estas mismas tortugas fueron positivas. Se determinó la presencia de CFPHV DNA
en muestras de tejido sano para estas tortugas con FP, obteniendo cuatro positivas
de ocho para Chacocente RVS y 30% de positividad de 33 muestras analizadas
para La Flor RVS.
Discusión:
En todos los sitios (exceptuando Playa Nancite) que se analizaron muestras de
tortugas en apariencia libres de FP, se obtuvieron resultados positivos para CFPHV
DNA: Dulce Gulf 20.8%, Naranjo Beach 2 de 16, Ostional NWR 13.5%. Resultado
que concuerda con lo reportado por Quackenbush et al., 2001 en donde 3 individuos
positivos de 14 tortugas sin FP fueron positivos y Page-Karjian et al., 2012, de 142
biopsias de piel tomadas de 105 animales sanos, 32.4% fueron positivos a ácido
nucleico del virus por la técnica de PCR.
Es importante tomar en cuenta, que al comparar el porcentaje de positividad entre
juveniles y adultos en Puerto Jiménez, tortugas aparentemente libres de FP, si
concuerda con otros autores, el hecho de que las tortugas juveniles presentan un
porcentaje mayor de positividad comparado con tortugas adultas (George 1997;
Murakawa et al. 2000). Van Hourtan y colaboradores (2010) determinaron que en
todos los casos los individuos subadultos son siempre el grupo mayormente
afectado.
La determinación de individuos con FP positivos asociados CFPHV-ADN en
Chacocente RVS y La Flor RVS, representa el primer reporte en L. olivacea
para Nicaragua. Detección CFPHV ADN en muestras tumoradas (Seis de seis en
Chacocente RVS and 82% en La Flor RVS) concuerda con un posible rol potencial
de este CFPHV en la etiología de FP (Quackenbush et al., 1998; Lu et al., 2000).
Además, para estos mismos lugares reportamos la presencia de CFPHV ADN en
muestras de tejido sano de tortugas con FP (cuatro de ocho para Chacocente RVS
and 30% para La Flor RVS) lo cual es consistente con otro autores. Quackenbush et
al (1998) en Hawaii, reportó que el 93.3% del tejido sano de las tortugas con FP era
positivo a CFPHV. Mientras, Lu y colaboradores (2000) reportaron 57.1% de
presencia del agente en el tejido sano analizado, en tanto que Page-Karjian et al
(2012) reportó que 47.6% of las biopsias tomadas de tejido en apariencia normal en
animales que tenían tumores en otros sitios de la piel, fueron positivos al CFPHV.
Resultados similares se encontraron en 45.5% de biopsias de tejido aparentemente
normal en tortugas marinas de Australia de tortugas con FP (Quackenbush et al.,
2001). En Costa Rica en la RVS Ostional se determinó 69.23% de lesiones
tumoradas y únicamente 4.16% de tejido normal (Brenes et al., 2013).
A pesar de que para este estudio en Ostional RVS, no se observaron tortugas con
FP, ya anteriormente había sido determinado (Cornelius y Robinson, 1983, Aguirre
et al. 1999, Orrego y Morales, 2002). Según Aguirre y colaboradores (1999), Un
promedio de 300,000 tortugas anidan en Ostional cada mes. Aproximadamente 6–
10% de estas tortugas pueden presentar FP cutáneo y 1% pueden estar
severamente afectadas. Puede que la falta de evidencia de tortugas con FP se debe
a que el muestreo en esta playa se hizo totalmente al azar y sin realizar una
búsqueda específicas de individuos con tumores.
La población de tortuga negra que forrajea en el Golfo Dulce de Costa Rica, en
apariencia sana, ya que a pesar de que se pudo determinar la presencia de CFPHV
en el tejido de dichas tortugas, no se pudo observar tejido fibropapilomatoso y al
tomar en cuenta que la FP parece estar estrechamente ligada a condiciones
ambientales desfavorables (Herbst y Klein, 1995; Aguirre y Lutz, 2004, dos Santos
et al. 2010, Van Houtan et al. 2010), nos hace destacar la importancia de preservar
un sitio de forrajeo, sitios que se caracterizan por ser espacios utilizados por
juveniles y adultos que pasan largo tiempo como residentes, catalogando a estas
zonas como sitios fundamentales para la conservación de las tortugas marinas,
debido entre otra factores por la amplia diversidad de individuos que se observan
(Amorocho y Reina 2007, Amorocho et al. 2012).
Es importante destacar que las tortugas marinas han sido propuestas como
especies centinelas de la salud de los ambientes marinos, ya que permiten
reconocer rápidamente manifestaciones por cambios ambientales y por ende de
conservación. Nuevas investigaciones sobre la etiología, distribución global y los
impactos a largo plazo de FP deben ser garantizados para la conservación de las
tortugas marinas (Aguirre y Lutz, 2004, Flint et al., 2010).
Colaboradores:
Chaves Andrea , Blanco Kinddle , Soto-Rivas Jose Luis , Aguirre Alonso , Lu,
Yuanan , Chacón Didhier , Fonseca Luis , Jiménez Mauricio , Gutiérrez-Espeleta
Gustavo , Lierz Michael .
1,2
3
8
9
2
5
9
6,7
4
1
Klinik für Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische, Justus-Liebig-Universität,
Giessen, Germany.
Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.
Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.
Universidad de Ciencias Comerciales, Managua, Nicaragua.
Department of Environmental Science and Policy, George Mason University,
Fairfax, Virginia, USA
Smithsonian-Mason School of Conservation, Front Royal, Virginia, USA.
Environmental Health, University of Hawai‘i at Mānoa, Honolulu, USA.
Asociación Widecast, San José, Costa Rica.
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3
4
5
6
7
8
9
Nombre del proyecto general:
“Estudios genéticos, toxicológicos y epidemiológicos (Herpesvirus) en Chelonia
mydas agassizii anidante en el Pacífico Norte de Costa Rica”
Literatura Citada:
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