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Teorica Fecundacion Mariano Buffone
Eventos celulares y moleculares de la fecundación en mamíferos. Dr. Mariano G. Buffone Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME) CONICET Buenos Aires, Argentina. Proceso de Fecundación Modelo clásico Estructura espermatica Plasma membrane Outer acrosomal membrane Inner acrosomal membrane Acrosomal matrix Limitaciones del sistema Relación 1:1 entre espermatozoides y ovocitos No podemos transfectar (sobreexpresar, knockdown, relocalización, dominantes negativos) Limitación a realizar transgénicos No existe un buen promotor especifico de espermatozoides para KO. Difícil de estudiar in vivo. La mayor cantidad de datos provienen de ensayos in vitro… Interacción con el epitelio Min Chueh Chang Ryuzo Yanagimachi Colin Russell Austin Robert Edwards Chang (1951) “It is quite clear that fertilization occurs when the spermatozoa have been in the tube for six hours before ovulation, which is perhaps the time required for a physiological change in the spermatozoa enabling them to attain fertilizing capacity.” R. Austin (1951) “when sperms were introduced into the fallopian tube of rabbit before ovulation, most of the eggs subsequently recovered were fertilized. However, if the sperms were introduced after ovulation the eggs rarely showed signs of penetration.” “there seems to be a need for sperms to spend some time, apparently a few hours, in the female tract before they can penetrate the zona.” Cronología 1951 Capacitación (Austin y Chang) 1958 Reacción Acrosomal (Austin) 1959 Fertilización in vitro con espermatozoides capacitados in vivo (Chang) 1963 IVF con factores indefinidos (Yanahimachi) 1971 IVF con factores definidos (Toyoda) 1979 IVF en humanos (Edwards) 1992 ICSI en humanos Capacitación Capacitación espermática Extensa serie de cambios metabólicos y de membrana sufridos por el espermatozoide en el tracto reproductor femenino que le permiten adquirir capacidad fecundante. Capacitación Chang, M.C., Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature, 1951. 168(4277): p. 697-8. Austin, C.R., Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res (B), 1951. 4(4): p. 581-96. In vivo tracto reproductor femenino In vitro medio capacitantes Capacitación Soluciones salina (NaCO3-, Ca++) Fuente energía (Glucosa, Piruvato) Suplemento proteico (albúmina) Capacitación – concepto actual Hiperactivación Exocitosis Acrosomal Mecanismos moleculares que regulan la capacitación Fosforilación de proteínas en tirosina Pablo Visconti Visconti et al 1995 Dev Fosforilación de proteínas en tirosina Calcio, BSA y bicarbonato como elementos esenciales Visconti et al 1995 Dev Fosforilación de proteínas en tirosina Participación de la vía AMPc/PKA Visconti et al 1995 Dev BSA Ca2+ Initial Transport Cholesterol sAC Ca2+ ATP cAMP PDE 5’AMP PKA Tyrosine Phosphorylation CAPACITACION HCO3- Hiperactivación Hiperactivación HIPERACTIVADO NO HIPERACTIVADO Hiperactividad Hiperactivación VCL: 195 um/s VCL: 58 um/s ALH: 12.7 um ALH: 2.8 um LIN: 35 % LIN: 96% Capacitacion: eventos moleculares Catsper e hiperactivacion Super resolución – localización de Catsper Catsper NBC Adcyc10 Ca2+ ATP HCO3- cAMP CaM H+ Na+/H+ Antiporter ? PDE pHi PKA 5’AMP Phosphorylation PKA substrates ? Ca2+ Tyrosine phosphrylation HYPERACTIVATION Catsper Na+ ? Initial Transport Ca2+ NBC Adcyc10 Ca2+ ATP HCO3- cAMP CaM H+ Na+/H+ Antiporter ? PDE pHi PKA 5’AMP Phosphorylation PKA substrates ? Ca2+ Acrosome Reaction HYPERACTIVATION Catsper Na+ Controlling fertilization and cAMP signaling in sperm by optogenetics Luz ? Catsper NBC bPAC Ca2+ ATP HCO3- cAMP CaM H+ Na+/H+ Antiporter ? PDE pHi PKA 5’AMP Phosphorylation PKA substrates ? Ca2+ Tyrosine Phosphorylation Acrosome Reaction HYPERACTIVATION Catsper Na+ Controlling fertilization and cAMP signaling in sperm by optogenetics Controlling fertilization and cAMP signaling in sperm by optogenetics Controlling fertilization and cAMP signaling in sperm by optogenetics ? Initial Transport Ca2+ NBC Adcyc10 Ca2+ ATP HCO3- cAMP CaM H+ Na+/H+ Antiporter ? PDE pHi PKA 5’AMP Phosphorylation PKA substrates ? Ca2+ HYPERACTIVATION Catsper Na+ Ionóforo de calcio ? Initial Transport Ca2+ NBC Adcyc10 Ca2+ ATP HCO3- cAMP CaM H+ Na+/H+ Antiporter ? PDE pHi PKA 5’AMP Phosphorylation PKA substrates ? Ca2+ HYPERACTIVATION Catsper Na+ Transferencia de embriones generados con espermatozoides activados con ionosforo de calcio Ratones infertiles recuperados con ionóforo de calcio • Catsper • SLO3 • TSSK6 • sAC Como llegan los espermatozoides al sitio de fecundacion? Rheotaxis Curr Biol 2013 Proteinas de union a la Zona Pellucida Beta-1,4 galactosyltransferase Fertile SED-1 Proacrosin Zonadhesin ? sp56 Adam1a Adam2 Adam3 Ace Clng Dkkl1 Reduced sperm – ZP binding Zona Pellucida ZP1: 185 Kda ZP2: 120 Kda ZP3: ZP3 83 Kda ZP4: (humanos) Especificidad de especie ZP2 ZP1: Estructural ZP3: Binding 1º ZP2: Binding 2º ZP1 Knockout de las proteinas de la Zona Pellucida Zp3 null Exocitosis de los granulos corticales Barrera contra la polispermia Knockin de las proteinas de la Zona Pellucida humanas Ovastacin: proteasa de los granulos corticales 2010 Exocitosis Acrosomal Sustancias inductoras de la Reacción Acrósomica * In vivo * In vitro * Zona pellucida (ZP3) * Progesterona * Ionosforos de calcio (A23187) * Lisofosfolipidos * 17αOH Progesterona * Albumina * EGF * PNA * PAF * ATP Acrosomal Exocytosis Model Modified from: Yanagimachi, 1994 Zanetti and Mayorga, 2009 Acr EGFP RFP Acrosomal Exocytosis of Mouse Sperm Stimulated by Calcium Ionophore Buffone et al, J Cell Physiology. 2009 Acrosomal Exocytosis of Mouse Sperm Stimulated by Calcium Ionophore Buffone et al, J Cell Physiology. 2009 Acrosomal Exocytosis of Mouse Sperm Stimulated by Solubilized ZP Buffone et al, J Cell Physiology. 2009 Acrosomal Exocytosis of Mouse Sperm Stimulated by Ionomycin and ZP Buffone et al, J Cell Physiology. 2009 “Penetra'on into the zona matrix ini'ates a mechanosensory signal transduc'on necessary to trigger the acrosome reac'on” Visualization of exocytosis using progesterone Posterior: 72 % Anterior: 11 % Diffuse: 17 % Calcium Transient Imaging in Response to “Acrosome Reaction Inducers” fluo4 3 ZP/µl 100 µM progesterone 5 µM thapsigargin Phospholipase Cdelta4 is required for Ca2+ mobilization essential for acrosome reaction in sperm. Fukami K, Yoshida M, Inoue T, Kurokawa M, Fissore RA, Yoshida N, Mikoshiba K, Takenawa T. J Cell Biol. 2003 Apr 14;161(1):79-88. Spatial – temporal occurrence of calcium increment and acrosomal exocytosis Spatial – temporal occurrence of calcium increment and acrosomal exocytosis PROG E5 (F-F0)/F0 D 5’’ F 75’’ 85’’ 100’’ 150’’ 255’ ’ 5’’ H 75’’ 85’’ 470’’ 515’’ 820’’ I 3 1 -1 0 G5 (F-F0)/F0 IONO 300’’ 820’’ PROG 100 250 Time (sec) IONO 500 FLUO-4 FM4-64 3 1 -1 0 500 1500 2000 Time (sec) “Penetra'on into the zona matrix ini'ates a mechanosensory signal transduc'on necessary to trigger the acrosome reac'on” Calcium ionophore to induce exocytosis!! FEBS Le(. 1999 Apr 23;449(2-‐3):277-‐83. Real-‐&me observa&on of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. Nakanishi T, Ikawa M, Yamada S, Parvinen M, Baba T, Nishimune Y, Okabe M. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 22;108(12):4892-‐6. Epub 2011 Mar 7 PNAS, 2011 Y los viejos papers? Buffone et al 2014 Acr EGFP RFP IVF: Cummulus-enclosed eggs and GFP sperm Oviducto post apareo Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” A UPPER ISTHMUS MIDDLE ISTHMUS B C AI UPPER ISTHMUS Acr-EGFP DsRed2 Acr-EGFP DsRed2 Acr-EGFP AR DsRed2 Figure 6 Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” A C B C D E BF F BF DsRed2 G Acr-EGFP H AR DsRed2 Acr-EGFP Donde ocurre la reaccion acrosomal? Observar al espermatozoide “in vivo” Buffone et al 2014 Fertilization Process Classic model Fusión espermatozoide - ovocito - Requiere la RA que le da fusogenicidad al SE - Ocurre por SE y microvellosidades - No requiere motilidad - Cesa la motilidad inmediatamente - Mecanismo - Especie-especificidad: menor que penetración de ZP (test de hamster) Fusión espermatozoide - ovocito - Evento mediado por mecanismo ligando- receptor en espermatozoide: fertilin, DE/CRISP1, Izumo en ovocito: Juno, CD9, Proteínas unidas por GPI, integrinas Izumo The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs Naokazu Inoue, Masahito Ikawa, Ayako Isotani and Masaru Okabe Nature (2005) b" S" S" A C Red-Izumo1 Izumo1 poly A mCherry Calmegin promoter (kDa) WT anti-mCherry IZ-/Red-Iz WT IZ-/Red-Iz CBB WT Plane b Plane a GFP anti-IZUMO1 Red-IZUMO Fig. 1 Tagging of IZUMO1 with mCherry and acrosomal status dependent distribution. (Y. Satouh et al.) IZ-/Red-Iz merge 84 56 AC B Red-IZUMO1 GFP/Phase Red-IZUMO1:Green-Ac sperm D OAM i IAM nucleus EQ H ii 2 m iii PM Natural ICSI Activación ovocitaria Fusión espermatozoide - ovocito DNA Activación ovocitaria (Hoechst) - Reinicio de meiosis (salida de Metafase II) - Prevención de polispermia (reacción cortical) - 2do cuerpo polar - Degradación de ARNm - Formación de los PN GC (LCA) Reacción cortical Fallas de activación ovocitaria Muchas gracias! University of Pennsylvania: George Gerton University of Massachusetts Pablo Visconti Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Reproducción. (IBYME-CONICET) Dr. Mariano G Buffone Dra Guillermina Luque Dra Alejandra Vitale. Lic Ana Romarowski. [email protected] Lic Florenza La Spina. Bioq Lis Puga Molina. Osaka University Masaru Okabe Ochanomizu University Noritaka Hirohashi IBYME-CONICET Dra Patricia Cuasnicu Bioq Maria Agustina Battistone IBR-CONICET Dr Dario Krapf
