teileriosis

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teileriosis

CAPÍTULO 2.3.11.
TEILERIOSIS
RESUMEN
Los parásitos del ganado vacuno y transmitidos por garrapatas del género Theileria constituyen
importantes restricciones para la mejora de la industria ganadera en amplias regiones del Viejo
Mundo1. Las especies más importantes económicamente, Theileria annulata y T. parva, son
responsables de una mortalidad y de pérdidas en la producción que solamente pueden adivinarse,
aunque sistemáticamente estas especies están documentadas como una causa muy importante de
enfermedad. Generalmente, la theileriosis bovina se controla mediante el uso de acaricidas para
matar a las garrapatas, aunque este método no es sostenible porque los acaricidas son caros,
porque se ha desarrollado resistencia frente a muchos de ellos, porque las normas con respecto a
la circulación del ganado vacuno y la cuarentena no se hacen cumplir de manera rigurosa, y,
porque habitualmente la gestión y el mantenimiento de los baños desinfectantes y los sistemas de
pulverización son deficientes.
Identificación del agente: El diagnóstico de una variedad de síndromes provocados por los
parásitos se basa principalmente en los síntomas clínicos, el conocimiento de la enfermedad y la
distribución del vector, y la identificación de los parásitos en la sangre teñida mediante Giemsa y
frotis de ganglios linfáticos. La presencia del esquizonte en frotis de biopsias de ganglios linfáticos
es un rasgo diagnóstico característico de las infecciones con T. parva y T. annulata. Los animales
infectados con T. parva presentan ganglios linfáticos hipertróficos, fiebre, una frecuencia
respiratoria que crece gradualmente, disnea y diarrea esporádica. Las lesiones post mortem
observadas son edema pulmonar, hipertrofia del bazo, espuma en la traquea, hipertrofia de los
ganglios linfáticos, hemorragias en los órganos internos, erosiones abomasales y presencia de
linfocitos parasitados e infiltraciones linfoproliferativas en los tejidos viscerales. La patología
general provocada por los esquizontes de T. annulata recuerda la de T. parva, aunque las fases de
piroplasma también pueden ser patógenas, causando anemia e ictericia.
Pruebas serológicas: El ensayo más ampliamente utilizado para el diagnóstico de las especies
de Theileria es la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Para realizar la prueba de IFI,
pueden prepararse antígenos de esquizonte y piroplasma sobre portas o en suspensión y
almacenarse mediante congelación a –20°C, excepto en el caso de la suspensión de piroplasma,
que se guarda a 4°C. Los sueros problema se diluyen con lisado de linfocitos bovinos y se incuban
con el antígeno en suspensión, y entonces se añade una inmunoglobulina anti-bovina conjugada.
La fluorescencia es específica para el agente causal si se utiliza el ensayo como se describe. El
ensayo IFI es sensible, bastante específico y, normalmente, fácil de realizar. Sin embargo,
presenta limitaciones para estudios a gran escala en zonas donde las especies se solapan,
debido a los problemas de reacción cruzada entre algunas especies de Theileria. El ensayo IFI
para T. parva no distingue entre diferentes concentrados inmunogénicos. Los nuevos
enzimoinmunoensayos para T. parva y T. mutans, basados en antígenos recombinantes
específicos del parásito, han demostrado mayor sensibilidad y especificidad y han sustituido
mayoritariamente a los ensayos IFI utilizados previamente en África. Además, los ensayos
diagnósticos moleculares más recientes, en particular aquellos basados en la reacción en cadena
de la polimerasa y la hibridación de línea inversa, están demostrando ser herramientas poderosas
para la caracterización de polimorfismos parasitarios, definiendo una genética de poblaciones y
generando datos epidemiológicos.
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564
En este Capítulo, el término “Nuevo Mundo” se refiere a las Américas, y el término “Viejo Mundo” se refiere a Europa,
Africa y Asia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.3.11. — Teileriosis
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas fiables, de eficacia
conocida, constituyen un desarrollo reciente. La vacuna frente a T. annulata se prepara a partir de
líneas celulares infectadas con esquizontes que han sido aislados a partir de ganado vacuno y
atenuados durante el cultivo in-vitro. La vacuna contiene células infectadas con esquizontes y debe
mantenerse congelada hasta poco antes de la administración. La vacunación frente a T. parva se
basa en un método de infección y tratamiento en el cual al ganado vacuno se le administra una
dosis subcutánea de esporozoitos derivados de garrapatas y un tratamiento simultáneo con una
formulación de tetraciclina de larga duración. Este tratamiento da por resultado una reacción de
fiebre de la Costa Este moderada o no aparente seguida de recuperación. Los animales
restablecidos presentan una inmunidad fuerte frente a un estímulo homólogo, la cual se mantiene
toda la vida del animal.
En el método de vacunación con células vivas puede ser necesario utilizar más de un concentrado
del parásito para inducir una inmunidad protectora más amplia. Generalmente, los animales
inmunizados llegan a hacerse portadores del concentrado parasitario inmunizante. Deben tomarse
precauciones de seguridad en la preparación y la manipulación de vacunas de T. parva para
proteger a los trabajadores implicados y para evitar la contaminación de los estabilizados. También
debería considerarse el riesgo de introducir nuevos aislados en una zona en la que entonces
pueden establecerse como portadores.
A. INTRODUCCIÓN
Las teilerias son parásitos protozoarios intracelulares obligados que infectan Bovidae salvajes y domésticos en la
mayor parte del mundo (algunas especies también infectan a pequeños rumiantes). Se transmiten por garrapatas
ixodides, y presentan ciclos vitales complejos en los hospedadores vertebrados e invertebrados. Existen seis
especies identificadas de Theileria que infectan el ganado vacuno; T. parva y T. annulata son las dos más
patógenas y las más importantes desde el punto de vista económico. T. parva se encuentra en 13 países del
Africa subsahariana y causa la fiebre de la Costa Este, la enfermedad Corridor y la enfermedad “January”.
Theileria annulata, la causa de la teileriosis tropical, se encuentra en grandes zonas de la costa Mediterránea del
Norte de Africa, extendiéndose hacia el norte de Sudán, y hacia Europa del sur. También se encuentran
afectadas el Sur-este de Europa, el próximo y Medio Este, India, China y Asia Central. Generalmente, Theileria
taurotragi y T. mutans no causan enfermedad o bien provocan una enfermedad leve, y T. velifera no es
patógena. Estos tres últimos parásitos se encuentran principalmente en Africa, y se solapan en su distribución,
complicando la epidemiología de la theileriosis en el ganado vacuno. Actualmente, se cree que el grupo de
parásitos mencionado como el complejo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis consiste en dos especies- T. sergenti y
T. buffeli/T. orientalis; este último puede denominarse como T. buffeli (14).
La mayoría de los concentrados de Theileria parva producen un estado de portador en el ganado vacuno
recuperado, y estudios recientes en los que se utilizaron marcadores de ADN para cepas del parásito han
mostrado que los animales portadores de T. parva constituyen una fuente de infección y que el parásito puede
transmitirse por las garrapatas de manera natural en el campo (R. Bishop, R. Skilton, D. Odongo y S. Morzaria,
datos no publicados). La gravedad de la fiebre de la Costa Este puede variar dependiendo de factores tales
como la virulencia de la cepa del parásito, las tasas de infección de esporozoitos en las garrapatas y el fondo
genético de los animales infectados. A menudo se observa que el ganado vacuno autóctono de las zonas
endémicas de fiebre de la Costa Este experimenta una enfermedad leve o infección subclínica, mientras que el
ganado vacuno indígena o exótico introducido desarrolla normalmente una enfermedad grave.
El método más práctico y más ampliamente utilizado para el control de la teileriosis consiste en el control químico
de las garrapatas con acaricidas. Sin embargo, la práctica del control de las garrapatas se ha vuelto menos
segura debido a la resistencias al acaricida, el elevado coste de estos, la pobre gestión del control de las
garrapatas y el movimiento ilegal del ganado vacuno en muchos países. Para T. annulata se ha utilizado
ampliamente la vacunación empleando líneas celulares infectadas con esquizontes atenuados, mientras que
para el control de T. parva en varios países de Africa del este, central y del sur, se está aplicando la infección
empleando esporozoitos derivados de garrapatas y el tratamiento con tetraciclina.
Para tratar T. parva y T annulata, se utiliza la quimioterapia empleando parvaquone, buparvaquone y
halofuginone, aunque los tratamientos con estos agentes no esterilizan las infecciones por teilerias.
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B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico se basa en los síntomas clínicos, el conocimiento de la enfermedad y la distribución del vector, así
como el examen de la sangre teñida con Giemsa y de frotis de ganglios linfáticos e impresiones de tejidos.
Theileria parva y T. annulata se diagnostican mediante la detección de los esquizontes en las células blanca o de
los piroplasmas en los eritrocitos. La fase de piroplasma sigue a la fase de esquizonte y, tanto en T. parva como
en T. annulata, generalmente es menos patógena y, por tanto, se encuentra a menudo en casos recuperados o
menos agudos.
1.
Identificación del agente ( prueba prescrita para el comercio internacional)
La presencia del esquizonte en biopsias teñidas mediante Giemsa o en frotis de impresiones de tejido de
ganglios linfáticos, hígado y bazo, es un rasgo diagnóstico característico de las infecciones por T. parva y
T. annulata. Los esquizontes son transitorios en el grupo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis, y la fase de
piroplasma puede ser patógena. Los esquizontes de T. taurotragui no se detectan fácilmente en frotis de sangre
teñidos mediante Giemsa. T. velifera puede distinguirse por la presencia de un velo en una cara del piroplasma.
Los esquizontes de T. mutans, si se detectan, son diferentes de los de T. parva, y presentan partículas nucleares
más grandes, aplanadas e irregulares. Los piroplasmas (fase intraeritrocitaria) de T. parva, T. annulata y
T. mutans son similares, aunque los de T. annulata y T. mutans, normalmente, son más grandes y pueden
observarse mientras se dividen. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, los esquizontes y los
piroplasmas de las diferentes teilerias son difíciles de distinguir en frotis teñidos mediante Giemsa.
La fase patógena de T. parva y T. annulata es el esquizonte. Al principio causa un proceso linfoproliferativo, y
más tarde provoca una enfermedad linfodestructiva. El animal infectado presenta un aumento de tamaño de
los ganglios linfáticos, fiebre, un aumento gradual de la frecuencia respiratoria, disnea y/o diarrea. Las lesiones
post-mortem más frecuentes consisten en ganglios linfáticos aumentados de tamaño, un bazo notablemente
hipertrófico, edema pulmonar, espuma en la tráquea, erosiones y ulceración en el abomaso, y enteritis con
necrosis de las placas de Peyer. Los tejidos linfoides se hacen más grandes en las fases iniciales de la
enfermedad, pero si el animal sobrevive se atrofian durante las fases crónicas de la misma. Cuando se examinan
histológicamente, se encuentran presentes infiltraciones de linfocitos inmaduros en el pulmón, riñón, cerebro,
hígado, bazo y ganglios linfáticos. Las células parasitadas con esquizontes pueden encontrarse en frotis de
impresiones de todos los tejidos: los frotis de pulmón, bazo, riñón, hígado y ganglios linfáticos son
particularmente útiles para demostrar esquizontes, y, en casos de más larga duración, infiltraciones linfocitarias
de los riñones que recuerdan a infartos. En los animales recuperados aparecen recaídas ocasionales. En las
zonas endémicas de T. parva se observa, a veces, un síndrome nervioso denominado “turning sickness”, y se
considera que se encuentra asociado con la presencia de agregados intravasculares y extravasculares de
linfocitos infectados con esquizontes, trombosis y necrosis isquémica.
En T. annulata, tanto las fases de esquizonte como la de piroplasma pueden ser patógenas. Los esquizontes son
escasos en la sangre periférica de los animales con enfermedad aguda. La patología general causada por los
esquizontes de T. annulata recuerda a la de T. parva, mientras que la anemia y la ictericia son rasgos de la
patología por piroplasmas. Las cepas patógenas de T. mutans también producen anemia, al igual que las cepas
de Japón y Corea referidas como T. sergentii.
Los piroplasmas de la mayoría de las especies de Theileria pueden persistir durante años o meses en los
animales recuperados, y pueden detectarse de manera intermitente en exámenes posteriores. Sin embargo, los
resultados negativos del examen microscópico de frotis de sangre no excluyen una infección latente. Puede
inducirse la recaída en la parasitemia con algunas especies de Theileria mediante esplenectomía. Los
piroplasmas también se ven en los frotis preparados post-mortem, aunque los parásitos parecen encogidos y su
citoplasma apenas es visible.
La respuesta inmune frente a estos parásitos es complicada. La inmunidad mediada por células es la respuesta
protectora más importante en T. parva y T. annulata. En T. parva, las principales respuestas protectoras se
encuentran mediadas a través del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) bovino de clase I y restringido
a los linfocitos T citotóxicos.
2.
Pruebas serológicas
•
Prueba de inmunofluorescencia indirecta (la prueba prescrita para el comercio
internacional)
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la prueba diagnóstica para Theileria spp. más
ampliamente utilizada.
566
•
Preparación del antígeno de esquizonte
i)
Portas con antígeno de esquizonte
Los antígenos utilizados para los ensayos IFI de esquizontes se obtienen a partir de líneas celulares
infectadas con esquizontes y preparadas como se describe más adelante:
Los cultivos con 200 ml a 1 litro de células infectadas con esquizontes de T. parva o T. annulata, de
los que al menos un 90% de las células se encuentran infectadas, se centrifugan a 200 g durante
20 minutos a 4°C. Se retira el líquido sobrenadante y el precipitado celular se resuspende en 100 ml
de tampón salino fosfato (PBS) frío (4°C), pH 7,2-7,4, y se centrifuga como antes. Este proceso de
lavado se repite tres veces y, después del lavado final, se resuspende el precipitado en PBS
(aproximadamente 100 ml) para alcanzar una concentración final de 107 células/ml.
Se preparan frotis con la suspensión celular sobre portas multipocillo recubiertos con Teflón2, o para
su separación en portas ordinarios empleando TEXPEN3 o laca de uñas. Los frotis deberían
proporcionar entre 50 y 80 células intactas por campo visual cuando se examinan con un objetivo de
40X.
Los antígenos se reparten sobre los portas utilizando una pipeta multicanal o una pipeta de 100 µl.
Dispensando y aspirando inmediatamente la suspensión de esquizontes, queda una monocapa de
esquizontes en cada pocillo.
Este procedimiento se realiza para cada pocillo hasta que se agota el volumen. Con este
método pueden obtenerse aproximadamente 600 portas de buena calidad que contienen un total de
6.000 puntos antigénicos. Los frotis se secan al aire, se fijan en acetona durante 10 minutos, se
envuelven individualmente en papel de seda y, a continuación, en grupos de cinco en papel
de aluminio, y se almacenan en contenedores plásticos herméticos e impermeables al agua a –20 o a
–70°C. Los antígenos se mantienen estables durante al menos 1 año a –20°C y durante más tiempo a
–70°C.
ii)
Antígeno de esquizonte en suspensión
Primero se centrifugan 500 ml de células infectadas con T. parva o T. annulata que contienen
106 células/ml a 200 g durante 10 minutos a 4°C, y el precipitado celular obtenido se lava dos veces
en 100 ml de PBS frío. La viabilidad de las células se determina mediante eosina o exclusión con azul
tripan (debería ser superior al 90%). Las células se resuspenden a 107/ml en tampón salino frío. A
este volumen se le añade gota a gota dos volumenes de una solución de fijación fría que contiene un
80% de acetona y formaldehído al 0,1 % (0,25% de formalina) en PBS, mientras la suspensión celular
se agita lentamente y de manera continua. La suspensión celular se mantiene a –20°C y se deja fijar
durante 24 horas. Las células fijadas se lavan entonces tres veces en tampón salino frío y se
centrifugan a 200 g durante 20 minutos a 4°C. Después del último lavado, las células se resuspenden
a razón de 107/ml en tampón salino. Las células fijadas se distribuyen en alícuotas de 0,5 ml. El
antígeno con un 0,2% de azida sódica es estable a 4°C durante 2 semanas, y se mantiene estable
indefinidamente a –20°C. Este método también se puede utilizar para preparar antígeno de esquizonte
de T. taurotragi (J. Katende, A. Musoke y S. Morzaria, datos no publicados).
•
Preparación del antígeno de piroplasma
i)
Portas con antígeno de piroplasma
La fase de piroplasma de Theileria spp. no puede mantenerse en cultivo, con lo que el antígeno de
piroplasma debe prepararse a partir de animales infectados. Las infecciones experimentales se
inducen infectando subcutáneamente al ganado vacuno con esporozoitos, o utilizando garrapatas
infectadas con T. parva, T. annulata o T. taurotragi. Los picos de parasitemias presentan una duración
corta y, si los animales sobreviven a la enfermedad, el porcentaje de células rojas infectadas (RBC)
disminuye considerablemente en pocos días. Las infecciones con el grupo parásito referido como
T. sergentii/T. buffeli/T. orientalis, T. mutans o T. velifera se inducen, generalmente, inoculando
intravenosamente a ganado vacuno esplenectomizado con sangre de un animal portador, o con un
estabilizado de sangre, o mediante la aplicación de garrapatas infectadas. Cuando la parasitemia de
piroplasmas es del 10% o superior, se recogen 100 ml de sangre infectada a partir de la vena yugular
en un contenedor de vacío heparinizado o con ácido etilén diamino tetraacético (EDTA), y se mezclan
cuidadosamente con 2 litros de PBS. La mezcla se centrifuga a 500 g durante 10 minutos a 4°C; se
retiran el plasma y la capa de células blancas, los RBC se resuspenden de nuevo en 2 litros de PBS, y
se repite el paso de centrifugación. Es importante retirar la capa de células blancas después de cada
lavado. Este procedimiento de lavado se repite cuatro veces. Después del lavado final se utiliza una
alícuota de los RBC concentrados para preparar diluciones seriadas dobles en PBS, y se coloca una
gota de 5 µl de cada dilución sobre los portas. Las gotas secas se fijan con metanol y se tiñen con
colorante Giemsa, y se examina la concentración de los RBS empleando un microscopio de campo
2
3
A la venta, por ejemplo, en Bellco Glass, Vineland, New Jersey, Estados Unidos, o Glaxo-Wellcome, Reino Unido.
A la venta en Twmark-tex, Roseland, N.J. 07068, EEUU.
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claro. Se selecciona entonces para la preparación a gran escala de portas con antígeno de piroplasma
la dilución que proporciona una capa sencilla de RBS dispuestos uniformemente en la gota. Se
pueden preparar aproximadamente 10.000 portas de antígeno (100.00000 puntos antigénicos) a partir
de 100 ml de sangre infectada. Los frotis con antígeno se dejan secar a temperatura ambiente antes
de fijarlos en acetona fría durante 10 minutos. Los frotis fijados pueden almacenarse de la misma
forma que los portas con los antígenos de esquizonte, y mantenerse durante tiempos similares.
ii)
Antígeno de piroplasma en suspensión
Se encuentra disponible un método alternativo al descrito anteriormente para la preparación de
antígenos, y ha sido probado en T. parva. En este procedimiento, se recogen 100 ml de sangre de una
animal con una alta parasitemia de piroplasmas y se preparan como se ha descrito previamente, y el
volumen de células concentradas se ajusta al 5% con PBS.
Se añade un volumen de la suspensión de RBC a dos volúmenes de líquido de fijación (ver más arriba
en antígeno de esquizonte en suspensión) mientras se agita. Las células se dejan fijar a –20°C
durante 24 horas. Las células fijadas se lavan entonces tres veces con PBS y se centrifugan a 1.000 g
durante 30 minutos. El sedimento se resuspende hasta el volumen original de sangre con PBS que
contiene un 0,2% de azida sódica.
El antígeno de piroplasma es estable a 4°C cuando se conserva con azida sódica al 0,2% durante un
periodo de al menos 3 años.
•
Estandarización del antígeno
Las suspensiones de antígeno de esquizonte y piroplasma se mezclan en un mezclador rotatorio y se titulan
en PBS mediante dilución doble comenzando a partir de la muestra sin diluir hasta la dilución 1/16. La
dilución recomendada para el uso de ese lote de antígeno se toma como la dilución que proporciona una
distribución celular de aproximadamente 50-80 células infectadas con esquizontes, o 150-200 de RBC
infectados por campo visual cuando se examinan con una lente objetivo de 40X. Cuando se emplea esta
dilución se preparan frotis de antígeno sobre portas. Los frotis de antígeno, más los portas con antígeno
congelados previamente (y descongelados antes de usarse) se prueban frente a una gama de diluciones de
un panel de sueros control fuertes, intermedios, y débilmente positivos y negativos. El antígeno se utiliza en
el ensayo IFI de rutina si los sueros control positivo son titulados hasta su título conocido y los sueros
negativos control no dan fluorescencia.
En muchos laboratorios se utilizan rutinariamente ambos tipos de preparaciones de antígeno, los frotis
fijados con acetona almacenados a –20°C o –70°C, y los antígenos en suspensión fijados y almacenados a
4°C o –20°C. La sensibilidad de ambos tipos de antígenos es parecida. Los portas con antígenos pueden
utilizarse en los laboratorios donde se encuentran disponibles instalaciones para almacenamiento a baja
temperatura y una fuente segura de electricidad. Sin embargo, tales antígenos solamente pueden
transportarse en hielo seco o nitrógeno líquido. Los antígenos fijados en suspensión tienen la ventaja sobre
los portas con antígeno de que el método inicial de preparación es más simple y rápido. Puede
almacenarse un lote grande de este antígeno en un contenedor y tomarse alícuotas cuando sea necesario,
a partir de las cuales se preparan frotis frescos para el ensayo IFI. Se evita, por lo tanto, la necesidad de
una instalación de almacenamiento de gran tamaño. Los antígenos fijados en suspensión también pueden
almacenarse a 4°C y pueden transportarse a temperatura ambiente sin pérdida de antigenicidad.
•
Preparación del lisado de linfocitos bovinos
Se prepara un lisado de linfocitos de acuerdo con el método descrito por Goddeeris et al. (15) para su
empleo en los ensayos con antígenos de T. parva en suspensión. Brevemente, se esplenectomiza un
ternero de 3 meses y se mantiene bajo condiciones libres de garrapatas y moscas tse-tsé. Para excluir la
posibilidad de una infección latente, se toman frotis de sangre del animal diariamente durante un periodo de
4 semanas, se tiñen con colorante de Giemsa y se examinan para detectar la presencia de parásitos. Se
sacrifica el animal y se eliminan el timo y todos los ganglios linfáticos accesibles. Estos tejidos se cortan en
pedacitos en PBS frío que contiene un 0,45% de EDTA como anticoagulante. Se extraen las células del
tejido, y se separan del resto pasándolas a través de un paño de muselina, y se lavan tres veces con
PBS/EDTA mediante centrifugación a 200 g durante 20 minutos a 4°C. Los linfocitos lavados se
resuspenden en PBS sin EDTA hasta dar una concentración final de 5 x 107 células/ml. Las células se
destruyen mediante sonicación en alícuotas de 100 ml en hielo durante 5 minutos empleando la sonda de
3/8. El material sonicado se centrifuga a 1.000 g durante 30 minutos a 4°C y el sobrenadante, ajustado a
10 mg proteína/ml, se almacena a –20°C en alícuotas de 4 ml.
•
Procedimiento del ensayo
Antes de desenpaquetarlos, los portas con antígenos de esquizonte y piroplasma se sacan del almacenaje
a –20°C y se dejan descongelar durante 30 minutos a 4°C y 30 minutos a temperatura ambiente. El
antígeno de esquizonte congelado, fijado en suspensión y almacenado a –20°C, se descongela a
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temperatura ambiente, mientras que el antígeno de piroplasma, mantenido a 4°C, se resuspende mediante
agitación, se pasa a través de una aguja de calibre 25 para deshacer los grumos (no es necesario para el
antígeno de esquizonte), y se diluye hasta alcanzar las diluciones estandarizadas previamente. Los
antígenos se distribuyen sobre los portas empleando una pipeta multicanal o una pipeta de 100 µl.
Dispensando y aspirando inmediatamente la suspensión de esquizonte o piroplasma, quedará una
monocapa de esquizontes o piroplasmas en cada pocillo. Los portas se dejan secar bien a 37°C o a
temperatura ambiente.
Para la investigación inicial utilizando antígeno en suspensión de T. parva, se preparan diluciones 1/40 de
los sueros problema y control en lisado de linfocitos (195 µl de lisado de linfocitos + 5 µl de suero), y se
incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para los portas con antígeno se emplean las
diluciones 1/40 y 1/60. Si se desea obtener un título de anticuerpo de punto final, se pueden preparar
diluciones dobles o quíntuples en PBS. Para cada porta se incluyen los sueros control positivo y negativo
diluidos 1/40. Los portas se incuban a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante 30 minutos, y
entonces se lavan dos veces en PBS durante 15 minutos. A cada pocillo se le añaden 20 µl de
inmunoglobulina antibovina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) a la dilución óptima
recomendada. Como colorante de contraste se incorpora en el conjugado azul Evans a una dilución final de
1/10.000. Los portas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda, se
lavan como antes, se montan con un cubreobjetos en glicerol al 50% en PBS, pH 8,0, y se examinan para
observar fluorescencia empleando por ejemplo un microscopio fluorescente equipado con iluminación epiKoem (lámpara de mercurio de 100 W), con filtro de UV, oculares 6,3X y objetivos de inmersión Phaco FL
40/1,3.
•
Características del ensayo de inmunofluorescencia indirecta
Empleando el ensayo como se ha descrito, la fluorescencia es normalmente específica para las especies
concretas de Theileria (ver más adelante). La incorporación del azul Evans proporciona un buen contraste,
haciendo fácil la lectura. El montaje de los portas en glicerol al 50% a pH 8.0 reduce la pérdida rápida de
intensidad del FITC y permite fotografiar la preparación. Los portas son estables una vez preparados, y
pueden leerse hasta 72 horas después de la preparación cuando se mantienen en la oscuridad a 4°C.
Los anticuerpos frente a T. parva y T. annulata se detectan por primera vez entre los días 10 y 14 utilizando
el antígeno de esquizonte después de la infección con los esporozoitos, mientras que, empleando el
antígeno de piroplasma, los anticuerpos se detectan primero entre los días 15 y 21. Los anticuerpos
permanecen durante un periodo de tiempo variable después de la recuperación, dependiendo de factores
tales como el establecimiento de la fase de portador, la intervención quimioterápica, y la presencia o
ausencia de estimulación repetida. Después de la recuperación de la fiebre de la Costa Este o la teileriosis
tropical, algunos animales pueden presentar niveles bajos de título de anticuerpo en el ensayo IFI después
de 4-6 meses, aunque los anticuerpos pueden persistir durante más de un año después de una sola
estimulación.
El ensayo IFI es útil para identificar manadas que contienen portadores de T. annulata, pero no siempre es
suficientemente sensible para detectar a todos los individuos infectados. Tanto los antígenos de esquizonte
como de merozoito para IFI han fracasado en la detección de anticuerpo en algunos animales que son
portadores de una infección evidente con piroplasmas (10).
En las infecciones por T. mutans inducidas mediante inoculación con esporozoitos, los anticuerpos se
detectan por primera vez entre los días 10 y 15 después de la aparición de los piroplasmas. Se detectan
títulos bajos durante al menos 12-24 meses.
Cuando el ensayo IFI se emplea rutinariamente para la detección de anticuerpos frente a una de las
Theileria spp. bovinas, es sensible y requiere poca estandarización. Sin embargo, si el ensayo se emplea
para detectar anticuerpos cuando tienen lugar infecciones mixtas de Theileria, es necesario evaluar
cuidadosamente la especificidad del ensayo. Por ejemplo, T. annulata y T. parva presentan reacción
cruzada, aunque estas reacciones cruzadas son cuatro a seis veces más bajas que con el suero homólogo.
Esto no es importante en el campo, ya que las enfermedades no solapan. Tal reacción cruzada no parece
ocurrir entre T. parva y T. mutans o entre T. annulata y T. mutans. Existe un título bajo de reacción cruzada
entre T. parva y T. taurotragi, lo cual es un problema, ya que las dos infecciones solapan completamente
con la distribución de T. parva. Se ha modificado el ensayo IFI de forma que se puede usar un panel de
anticuerpos monoclonales (MAbs) para detectar antígenos de Theileria preparados como linfocitos
infectados con esquizontes fijados sobre portas multipocillo recubiertos con Teflón (ver nota al pie 2). Este
panel de MAbs puede detectar diferencias entre ciertos concentrados de T. parva y entre T. parva y otras
especies de teilerias. Es un ensayo útil y forma parte del proceso de caracterización de T. parva,
especialmente, para los aislamientos de campo y para el control de la calidad del laboratorio durante la
preparación del estabilizado (7).
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•
Ensayos futuros para el diagnóstico de Theileria
El ensayo IFI es fácil de realizar y razonablemente sensible y específico. Sin embargo, el ensayo presenta
limitaciones para los estudios serológicos a gran escala, particularmente en zonas donde se solapan varias
especies, debido a los problemas de reacciones cruzadas entre diferentes especias de Theileria descritos
más arriba. Son necesarias pruebas más específicas, fáciles de interpretar, y suficientemente robustas para
utilizarse en condiciones de campo. Las pruebas serológicas basadas en los enzimoinmunoensayos
(ELISA) se están utilizando cada vez más para la detección de anticuerpos específicos frente al parásito. El
ELISA se ha adaptado con éxito para la detección de anticuerpos frente a T. annulata (16), y se ha
mostrado que detecta anticuerpos durante un periodo de tiempo más largo que el IFI (20, 21). También se
ha descrito un ELISA para T. mutans (22). Se han utilizado dos MAbs específicos frente a T. mutans en un
sistema ELISA para la detección de anticuerpos y antígenos en infecciones agudas, subagudas y crónicas.
El ensayo es más específico y sensible que la prueba IFI. Sin embargo, los ensayos utilizados más
ampliamente para la detección de T. parva y T. mutans son los ELISA indirectos basados en antígenos
específicos del parásito, PIM y p32, respectivamente. Estos ensayos se han evaluado exhaustivamente en
el laboratorio y en el campo, y actualmente se están empleando en grandes zonas de Africa. Los antígenos
que se usan en estos ensayos se expresan en Escherichia coli utilizando el pGEX como vector de
expresión. Los productos expresados son proteínas de fusión con la glutatión S transferasa y se recubren
directamente sobre las placas del ELISA. Estos ELISAs proporcionan una especificidad y sensibilidad más
altas que el ensayo IFI (24, 27) y se espera que pronto se encuentren disponibles comercialmente.
Una gama de sondas que están basadas en secuencias génicas del RNA ribosomal se encuentra
disponible para detectar todas las especies de Theileria que se sabe que infectan el ganado vacuno (2, 6).
También se han desarrollado sondas de ADN específicas para T. parva (1, 9, 24) y T. mutans (25). La
tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentra disponible para amplificar
cantidades mínimas de ADN del parásito un millón de veces, aumentando enormemente la sensibilidad de
las sondas de ADN (3). Se desarrolló una PCR específica para ensayar muestras de sangre de ganado
vacuno portador de T. annulata (12). Recientemente se ha presentado un ensayo de transferencia de línea
inverso (RLB) basado en la hibridación de productos de PCR con sondas específicas de oligonucleótidos
inmovilizadas sobre una membrana para la detección simultánea de diferentes especies de Theileria (17).
Se espera que la combinación del ELISA, PCR y sondas de ADN aumentará enormemente nuestra
capacidad actual para identificar a los animales infectados, haciendo posible el seguimiento preciso de las
especies de Theileria.
La amplificación por PCR de los genes p33/p34 del complejo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis, seguida de
un análisis mediante enzimas de restricción, puede emplearse para diferenciar T. sergenti de
T. buffeli/T. orientalis (23).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
C1. Vacunas de cultivos celulares frente a Theileria annulata
Se ha intentado la vacunación frente a T. parva y T. annulata desde que los microorganismos causales fueron
reconocidos por primera vez al principio del siglo pasado. Sin embargo, las vacunas vivas seguras y de potencia
conocida constituyen un desarrollo mucho más reciente. Las más utilizadas consisten en vacunas de cultivos
celulares de esquizontes atenuados frente a T. annulata. Se han descrito los procedimientos para la producción y
el ensayo de seguridad (13, 18, 30), y la vacuna se utiliza ampliamente en Israel, Irán, Turquía, India, Africa del
norte, Asia central y la República Popular de China.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Los cultivos primarios de células infectadas con T. annulata pueden establecerse a partir de ganglios
linfáticos, hígado o bazo tripsinizados recogidos asépticamente a partir de un animal infectado después de
la muerte, o a partir de la capa de leucocitos de sangre periférica heparinizada separada en un gradiente de
densidad (Ficoll Hypaque), o utilizando linfocitos centrifugados de una biopsia de material de nódulos
linfáticos, empleando el método sencillo de la jeringa de plástico (8, 13).
Los cultivos del inóculo se preparan a partir de líneas celulares preservadas en frío que se han aislado de
ganado vacuno y han sido atenuadas como se describe más adelante. Se recomienda el cultivo para la
producción de la vacuna a partir del cultivo del inóculo después de un máximo de 25-30 pases, aunque
existe alguna duda sobre la estabilidad inmunogénica de estos cultivos durante los pases a largo plazo.
570
b)
Método de cultivo
las células infectadas se cultivan inicialmente en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) o en medio
Leibovitz L15 suplementado con suero bovino al 20% y que contiene penicilina (100 unidades/ml),
estreptomicina (50 µg/ml) y micostatina (75 unidades/ml) en frascos de cultivo celular de 25 ml con tapón de
rosca. Un medio alternativo es el RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina y
estreptomicina, y normalmente se emplea con cultivos establecidos. El medio se repone cada 3-4 días. La
presencia de células libres brillantes y refráctiles en el medio (mediante examen con un microscopio
invertido o de contraste de fases) es indicativa de un cultivo celular infectado. Los cultivos pueden
establecerse como monocapa o en suspensión. El pase se efectúa decantando el medio, añadiendo
versene al 0,025% durante 15 minutos a los cultivos en monocapa, dispersando las células, y contando y
dispensando según el tamaño del frasco. Se introducen aproximadamente 106 células en los frascos de
25 cm2, y, para los frascos más grandes, se usa la misma proporción de inóculo en 100-200 ml. La técnica
general de cultivo es la descrita por Brown (8).
El suero es esencial para el mantenimiento de estos cultivos, y se obtiene a partir de terneros hasta una
edad de 6 meses, o de fuentes comerciales, y se prueba antes de utilizarse para la existencia de toxicidad
mediante tres pases en una línea celular establecida.
c)
Atenuación de la virulencia
La atenuación de los esquizontes de T. annulata se consigue mediante crecimiento prolongado y pase en
cultivo (30). Se desconoce el mecanismo de atenuación, aunque el número de las divisiones celulares
parece ser más importante que el tiempo en cultivo o el número de pases. Los aislados de campo han
requerido el pase durante periodos desde 4 hasta 30 meses para conseguir una atenuación completa. La
atenuación se ensaya mediante la inoculación del cultivo en terneros susceptibles cada 20-30 pases. Una
muestra del cultivo debería criopreservarse cada 10 pases en caso de pérdida accidental o de
contaminación. Las atenuación completa se consigue cuando los cultivos no generan fiebre o esquizontes y
piroplasmas detectables en ganado vacuno susceptible. Un cultivo atenuado de 105 células infectará con
cierta seguridad al ganado vacuno e inducirá una reacción serológica, y no producirá enfermedad a una
dosis de 109 células. Los cultivos pueden criopreservarse empleando bien dimetil sulfóxido (DMSO) o
glicerol. Más adelante se describen dos métodos para almacenar y repartir la vacuna.
2.
Método de fabricación
Antes de comenzar a producir la vacuna, se necesita un material para el inóculo con características conocidas
(31). Se distinguen tres tipos de material para el inóculo:
Inóculo original: Células infectadas con esquizontes a partir de un pase específico que han sido seleccionadas y
almacenadas permanentemente, y, a partir de las cuales, se derivan todos los pases. Para preparar el inóculo
original, las células infectadas con esquizontes que han demostrado ser seguras para el ganado vacuno se
propagan hasta obtener aproximadamente 5 x 108 células en un sólo pase de cultivo. Las células se
criopreservan en aproximadamente 100 criotubos que contienen 5 x 106 células cada uno.
Inóculo de trabajo: Células infectadas con esquizontes con un nivel de pase entre el inóculo original y el inóculo
de producción. Para preparar el inóculo de trabajo, se transfiere el contenido de un sólo criotubo de inóculo
original a un tubo de centrífuga de 10 ml que contiene 8 ml de medio completo. El tubo se centrifuga a 600 g
durante 15 minutos a 4°C, y el precipitado se transfiere a frascos de 75 cm2 que contienen 15-20 ml de medio. El
medio se cambia al día siguiente y 4 días después las células se dispersan y se siembran en frascos más
grandes. Después de 5-6 subcultivos adicionales, hay suficientes células disponibles para comenzar la fase de
producción. Debería realizarse una revisión de la viabilidad del inóculo original, recuperando uno de los criotubos
una vez que éste ha sido criopreservado durante al menos 24 horas.
Inóculo de producción: Células infectadas con esquizontes de un nivel de pase específico, que se utiliza para la
preparación de un lote de la vacuna sin una propagación posterior. El inóculo de producción se obtiene
propagando grandes cantidades de células en cultivos en monocapa o suspensión. Los cultivos monocapa se
cultivan en frascos desde 150 cm2 hasta 175 cm2 que normalmente proporcionan una media de 7 x 107 hasta 8 x
107 células por frasco. Se necesitan aproximadamente 80 ml de medio completo por frasco. En un sistema de
cultivo de frascos rotatorios se pueden obtener 1.2-1.5 x 108 células en un frasco rotatorio convencional
(700 cm2) que contienen 100-120 ml de medio. La mejor producción a gran escala para obtener un rendimiento
máximo en células la han mostrado los cultivos estacionarios sembrados con 106 células y los frascos rotatorios
con hasta 4x107 células/frasco en medio L-15 con un 20% de suero, seguido de 7 días de cultivo sin cambio de
medio (34).
571
Se concentran y se juntan las células infectadas con esquizontes de todos los frascos y se computa su número
total. Alternativamente, pueden sembrarse de nuevo aproximadamente un 20% de las células para preparar otro
lote de vacuna. Pueden prepararse varios lotes de vacuna utilizando una porción del inóculo de producción como
inóculo de trabajo. Como el cultivo prolongado puede provocar la alteración en las propiedades de los
esquizontes, tales como la capacidad inmunogénica, después de varios lotes la vacuna siguiente se produce
preparando un inóculo de producción fresco a partir del inóculo original.
Las células infectadas con esquizontes se mezclan con DMSO hasta una concentración final del 7% o en glicerol
hasta una concentración final del 10%, y se distribuyen en viales de plástico de 2 ml en alícuotas de 1,8 ml, y
cada vial contiene diez dosis de la vacuna concentrada. El número adecuado de células infectadas con
esquizonte por dosis se encuentra sujeto a controversia. Una aproximación práctica recomendada consiste en
preparar dosis de 106-107 células infectadas para contrarestar las condiciones ambientales variables en el
campo.
La vacuna se congela introduciendo los viales en un ultracongelador (-70°C) y transfiriéndolos a nitrógeno líquido
24 horas después. Alternativamente, los viales pueden introducirse en vapores de nitrógeno líquido durante
3 horas y entonces sumergirse en nitrógeno líquido para ser almacenados (30). La vacuna se transporta hasta el
campo en nitrógeno líquido, y se diluye 1/10 en tampón isotónico salino en una botella con tapón de rosca con
una tapa de goma o silicona para un vaciado aséptico. La vacuna se administra subcutáneamente hasta
30 minutos después de la descongelación (28).
En Irán se emplean las células cultivadas de dos lotes. El segundo lote se administra 30-60 días después de la
inoculación de la vacuna preparada con el primer lote (18).
En Marruecos se utiliza una vacuna de cultivo en fresco, normalmente a una dosis decimal más baja. Sin
embargo, existen problemas con el control de calidad de las vacunas de este tipo.
3.
Control de lote
En Israel, las vacunas de esquizontes se prueban antes de ponerse en circulación mediante el siguiente
procedimiento (29).
La vacuna congelada tiene una vida media prácticamente ilimitada en estado congelado, pero normalmente se
produce en lotes individuales pequeños (3-5 ml dosis), lo que hace impracticable la prueba completa de cada
lote, por razones económicas. Por lo tanto, se recomienda que se pruebe la inocuidad y eficacia del inóculo
original, mientras que en cada lote se estudie solamente la esterilidad y la potencia. Esta recomendación se basa
en el hecho de que una vez que los cultivos de esquizontes se han atenuado nunca se ha observado reversión a
virulencia durante el cultivo posterior. En lo que concierne a la eficacia, no se han observado alteraciones obvias
de las propiedades inmunogénicas durante el número limitado de pases (20-30) implicados en la producción de
la vacuna real.
a)
Inocuidad
Ausencia de propiedades que originen reacciones locales o sistémicas indebidas: A pesar del hecho de que
el inóculo original se prepara a partir de esquizontes atenuados, por razones legales y prácticas se
recomienda ensayar la inocuidad de una muestra de la vacuna real que se produce a partir del inóculo
original. Con este propósito se inoculan dos a cuatro terneros susceptibles del lote más sensible disponible,
con una dosis diez veces mayor que la recomendada para la inmunización. Esta dosis no debería producir
síntomas clínicos más allá de un incremento transitorio en la temperatura. Con el inóculo original
completamente atenuado no se observarán esquizontes o piroplasmas en frotis de ganglio linfático o de
hígado o en frotis de sangre. Sin embargo, diferentes razas de ganado vacuno pueden mostrar
sensibilidades diferentes frente a la vacuna. Esto debería tenerse en mente cuando se va a administrar la
vacuna de un inóculo original parcialmente atenuado a lotes de ganado vacuno de alta calidad.
A continuación de la prueba de inocuidad satisfactoria con una muestra, todos los lotes siguientes
producidos a partir del mismo inóculo original pueden también utilizarse sin realizar una prueba posterior de
inocuidad. Sin embargo, si a consecuencia de la vacuna aparecen parásitos y signos clínicos en el ganado
bovino de campo, debe probarse de nuevo el lote implicado u otro paralelo del mismo inóculo origina,l para
garantizar su inocuidad.
b)
Eficacia
Capacidad para proteger frente a la teileriosis transmitida de forma natural: El lote de la vacuna
experimental utilizado para el ensayo de inocuidad también puede emplearse para probar la eficacia de la
vacuna anti-Theileria derivada de cultivo. Se vacunan tres o cuatro terneros con una dosis convencional de
vacuna 6 semanas más tarde; los terneros vacunados y el mismo número de terneros no vacunados se
572
infectan entonces con esporozoitos de T. annulata. La infección puede inducirse mediante garrapatas
adultas vivas derivadas de fases preimaginales infectadas con T. annulata, o mediante inoculación del
estabilizado preparado a partir de garrapatas infectadas maceradas (para ver las técnicas, ver la Sección
C2.1.). La experiencia muestra que la inoculación del estabilizado (garrapatas maceradas) induce
generalmente una respuesta más grave que un número equivalente de garrapatas vivas infectadas a las
que se les permite alimentarse del ganado. Sin embargo, a largo plazo, los resultados obtenidos mediante
la sensibilización con el estabilizado parecen ser más reproducibles que los obtenidos con diferentes lotes
de garrapatas vivas, infectándose cada uno de ellos en condiciones distintas.
No existen estándares acordados internacionalmente sobre el tamaño de la dosis de sensibilización
utilizada para ensayar la eficacia de la vacuna derivada del cultivo de T. annulata. Se han empleado de
cinco a diez hembras y el mismo número de machos de garrapatas infectadas de Hyalomona sin alimentar
para la infección del ganado vacuno. De manera alternativa, un estabilizado equivalente a 2-4 garrapatas
maceradas inoculadas subcutáneamente en la zona del cuello producirá siempre una teileriosis aguda. Para
la evaluación de las respuestas frente a la infección de los terneros control vacunados y no vacunados se
siguen empleando los siguientes parámetros: la duración e intensidad de la pirexia, el porcentaje de células
infectadas con esquizontes en frotis de ganglio linfático o biopsia hepática, el porcentaje de infección con
piroplasmas en frotis de sangre, la disminución en el recuento de células rojas y blancas y la intensidad de
manifestaciones clínicas tales como anorexia, depresión y posición yacente.
Los resultados de la prueba de eficacia dependen de factores tales como las características inmunológicas
del aislado de T. annulata crecida y atenuada en cultivo, la virulencia del aislado de campo utilizado para la
sensibilización, las especies de garrapatas infectadas utilizadas para producir esporozoitos y la dosis del
parásito empleada para la sensibilización. Los datos de la bibliografía (30) muestran que los terneros
vacunados con la vacuna de esquizontes pueden exhibir aparentemente una protección casi total, o pueden
mostrar un nivel bajo de parasitemia, acompañada de fiebre moderada y una alteración insignificante del
resto de los parámetros a partir de sus valores de prevacunación. Cuando el ganado vacunado con la
vacuna de esquizontes se sensibilizó con parásitos derivados de garrapatas de una zona geográficamente
apartada, se demostró un grado de protección menor. Por el contrario, los terneros control no vacunados
exhibieron un nivel alto de parasitemia y pancitopenia en la mayoría de los ensayos, acompañado de
manifestaciones clínicas graves. En ausencia de una medicación específica una porción considerable de los
animales control sucumbieron a la infección.
Las observaciones de campo también se han utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas anti Theileria
(29, 35). El ganado vacuno autóctono susceptible, así como razas exóticas de alta calidad fueron protegidas
frente a la teileriosis clínica, y sucumbieron frente a la teileriosis en pastos en los que el ganado no fue
vacunado. Como la vacuna de esquizontes atenuada totalmente no produce piroplasmas, la presencia de
esta fase de la teileria en el ganado vacunado que no muestra signos clínicos se considera que es el
resultado de una infección no aparente inducida por garrapatas.
c)
Potencia
Viabilidad de las células infectadas con esquizonte: La vacuna congelada permanece básicamente estable
durante el tiempo de su almacenamiento, incluso durante largos periodos, aunque durante los procesos de
congelación y descongelación tiene lugar alguna pérdida de viabilidad. La viabilidad debería ensayarse en
condiciones lo más parecidas posibles a aquellas que se obtienen cuando la vacuna se emplea en el
campo. Por esta razón la vacuna debería descongelarse, y la suspensión diluida de células infectadas con
esquizontes debería dejarse a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de realizar los ensayos de
viabilidad. Una prueba sencilla para evaluar la viabilidad de las células infectadas es el recuento por
exclusión con nigrosina (36). Aunque, en la mayoría de los casos, se encuentran un 80-90% de células
vivas, aquella vacuna que, después de descongelarse, diluirse y dejarse a temperatura ambiente durante
1 hora, todavía contiene un 50% o más de células vivas, puede emitirse para su uso.
La viabilidad de los esquizontes también se refleja por la eficiencia de plaqueo de las células infectadas con
esquizontes (36), ya que sólo las células que contienen esquizontes viables se multiplican en cultivo. Con
este propósito la vacuna descongelada y diluida se pasa del frasco a un tubo de centrífuga. Se toma una
muestra para el recuento y la suspensión se centrifuga durante 15 minutos a 600 g. Mientras tanto se
determina el número total de células (vivas y muertas) para establecer que la vacuna congelada tenía la
concentración inicial de células necesaria. Después de la centrifugación se desecha el sobrenadante y las
células se resuspenden en el volumen original utilizando medio de cultivo completo. Se preparan diluciones
seriadas decimales de las células en medio completo en tubos estériles de 10 ml, de manera que las dos
últimas diluciones contengan 5 x 10 y 5 células por ml. Se introducen doce réplicas de 200 µl de cada una
de las dos últimas diluciones en una placa de cultivo con 96 pocillos. Las placas se incuban a 37°C en una
atmósfera de CO2 al 5% y los cultivos se revisan con un microscopio invertido 6 y 9 días después de la
siembra. Se cuenta el número de pocillos que contienen teóricamente 1 célula cada uno y en los cuales se
573
observa crecimiento. La vacunas que muestran una eficiencia de plaqueo <2 (células) son adecuadas para
el uso en el campo.
d)
Esterilidad
Los ensayos de esterilidad y ausencia de contaminación de los materiales biológicos puede encontrarse en
el Capítulo I.1.5.
e)
Método de empleo
Estas vacunas no producen efectos adversos en el ganado vacuno sano. Sin embargo, los animales con
infecciones, concretamente infecciones víricas, pueden no tolerar bien la vacunación. No se recomienda la
administración de una vacuna vírica, como la de la glosopeda, durante el periodo de inmunización (periodo
de reacción), ya que puede encontrarse comprometida la respuesta inmune (18). En Irán no está
recomendado vacunar vacas de más de 5 meses de gestación, aunque los estudios en ganado gestante
con los concentrados de la vacuna utilizados en Israel no encontraron efectos sobre la gestación (29). La
inmunidad generada es de larga duración.
En general, el ganado vacuno debería inmunizarse en los primeros meses de vida, y la sensibilización con
garrapatas en condiciones naturales refuerza la inmunidad. Aunque se han identificado cepas de
T. annulata diferentes antigénicamente (28), normalmente, se considera que existe suficiente protección
cruzada entre las cepas para proporcionar una protección adecuada frente a la sensibilización en el campo
en todos los países, como en Israel. Un sólo concentrado ha demostrado ser efectivo inmunológicamente
en 1.5 millones de cabezas de ganado vacuno (11, 35) en las zonas extensas e infectadas de Asia central.
Sin embargo, como se ha descrito previamente, en Irán se utilizan rutinariamente dos concentrados (18).
C2. Infección y tratamiento de vacunación frente a Theileria parva
La vacunación frente a T. parva se basa en un método de infección y tratamiento en el que se inocula
subcutáneamente una alícuota de esporozoitos viables, y los animales se tratan simultáneamente con una
formulación de una tetraciclina de larga duración (32). Las tetraciclinas disminuyen la gravedad de la infección, y
la infección leve resultante se controla normalmente por medio de la respuesta inmune del hospedador, de
manera que se consigue un estado de portador. Siempre existen riesgos asociados con el empleo de parásitos
vivos para la inmunización; sin embargo, con un control de calidad apropiado y la determinación cuidadosa de la
dosis para inmunización segura y efectiva, el método puede utilizarse y está siendo utilizado con éxito en el
campo. Este método también se ha aplicado de manera eficaz para T. annulata, aunque se prefiere la
vacunación con cultivo celular, el cual no es práctico para la inmunización frente a T. parva. Algunos
estabilizados de T. parva han mostrado ser capaces de infectar ganado vacuno eficazmente sin inducir
enfermedad, y pueden utilizarse sin tratamiento con tetraciclina. Uno de estos estabilizados se está aplicando en
el campo y ofrece unas ventajas considerables sobre las infecciones con estabilizados potencialmente letales, y
ahorros en el coste de la vacunación. Sin embargo, distintos estabilizados obtenidos a partir de estos
concentrados pueden provocar una enfermedad grave en el ganado vacuno, acentuando la importancia de una
dosis inmunizante controlada cuidadosamente.
1.
Preparación del estabilizado
Para obtener resultados consistentes en las inmunizaciones de campo es esencial que los estabilizados de
esporozoitos preparados a partir de garrapatas se preparen a partir de un “estabilizado del inóculo de trabajo”
completamente caracterizado. El “estabilizado del inóculo de trabajo” debería derivar directamente del
“estabilizado del inóculo original” de referencia, con características del “estabilizado del inóculo original” y
disponible en cantidad adecuada para la preparación futura de estabilizados inmunizantes.
La infección se establece con el estabilizado del inóculo de trabajo de T. parva mediante inoculación de ganado
vacuno sano y serológicamente negativo frente a las enfermedades transmitidas por garrapatas. Durante la fase
de parasitemia de la enfermedad, los animales se alimentan con ninfas limpias de Rhipicephalus appendiculatus
cultivadas en el laboratorio, y se recogen las garrapatas hinchadas e infectadas. Las garrapatas adultas
resultantes se aplican entre 3 semanas y cuatro meses después de la muda en las orejas de conejos sanos. Se
aplican unas 600 garrapatas en cada oreja y las garrapatas no adheridas se eliminan después de 24 horas.
Después de cuatro días se obtienen las garrapatas y se recogen muestras (normalmente 60 garrapatas) para
determinar la proporción de infección en las glándulas salivares diseccionadas. Las garrapatas restantes se
cuentan en lotes de 1000 aproximadamente. Se puede obtener una estimación del número total de garrapatas
contando y pesando un número determinado y pesando entonces el número total de garrapatas. Las garrapatas
se lavan en un tamiz bajo un chorro rápido de agua del grifo y pueden desinfectarse en su superficie con
clorhidrato de benzalconio al 1%, o en alcohol al 70%, y ser lavan de nuevo en agua destilada.
574
Las garrapatas se depositan (~ 1000) en tarros de cristal grueso o en vasos de plástico, y se añaden 50 ml de
MEM con sales de Hank o Earle y albúmina de plasma bovino (BPA) al 3,5%. Los tarros se mantienen en hielo, y
las garrapatas se muelen utilizando un homogenizador de tejidos (por ejemplo Silverson LR2) durante 2 minutos
empleando un cabezal de desintegración de apertura grande, y durante 3 minutos utilizando un cabezal de
apertura pequeña (filtro emulsionante). El material molido de las garrapatas se lleva hasta 50 ml por cada 100
garrapatas, se centrifuga a 50 g durante 5 minutos, y se concentra el sobrenadante. Se añade un volumen igual
de glicerol frío al 15% en MEM/BPA gota a gota mientras que el tejido de las garrapatas se mantiene frío en hielo
y se agita mediante un agitador magnético. El volumen final contendrá esporozoitos de un equivalente a diez
garrapatas/ml. El número de equivalentes de garrapatas/ml puede ajustarse si la proporción de infección por
parásito en un lote concreto de garrapatas fuese muy alto o muy bajo. La concentración final de glicerol en el
estabilizado de esporozoitos es del 7.5%.
El tejido molido de las garrapatas se distribuye en tubos de cristal mediante una jeringa o pipeta para los
volúmenes pequeños, o mediante una jeringa automática para volúmenes más grandes. Como alternativa, se ha
utilizado un equipo de inseminación artificial con tubos de plástico premarcados, como el que se emplea para
dispensar el semen. Este sistema es el ideal para grandes volúmenes de estabilizados, y el código de color y el
marcaje proporcionan una seguridad extra para identificar cada tubo. Se debería permitir un tiempo de equilibrio
de 30-45 minutos para los estabilizados de pequeño volumen antes de colocarse en el ultracongelador (-70°C).
Una vez congelado, el estabilizado puede trasladarse a un almacenamiento permanente en nitrógeno líquido
teniendo cuidado de no permitir ninguna subida de temperatura durante el traslado.
La infectividad del estabilizado se determina mediante inoculación de una dosis estándar de 1,0 ml en ganado
vacuno susceptible. El estabilizado se titula en el ganado vacuno, y se establecen su infectividad y letalidad a
distintas diluciones para su empleo en la inmunización. También se determina la sensibilidad frente a
tetraciclinas, básicamente para proporcionar una dosis controlada de estabilizado, preferiblemente mediante una
dosis única de una tetraciclina de larga duración administrada al mismo tiempo que la inoculación. La dosis
inmunizante debería inducir una infección muy leve o no aparente (4), y el animal debería desarrollar un título
serológico y ser inmune frente a una sensibilización homóloga letal. Si un tratamiento único con tetraciclina no
suprime la infección en todo el ganado vacuno, entonces se examina una dosis más baja de estabilizado o
pueden utilizarse dos tratamientos con tetraciclina (en los días 0 y 4). Más recientemente, cuando se ha utilizado
con una dilución apropiada de estabilizado, una dosis única de 30 mg/Kg de oxytetraciclina de larga duración ha
mostrado ser efectiva en inmunizaciones de campo. Un método alternativo que se ha empleado implica la
infección con el estabilizado y el tratamiento con buparvaquon a 20 mg/Kg el octavo día (dependiendo del
estabilizado). Este método puede aplicarse cuando las tetraciclinas no son fiables, pero requiere que el animal
sea manipulado más de una vez. Un tratamiento único con buparvaquon a 2,5 mg/Kg en el momento de la
infección también ha mostrado ser efectivo en infecciones con estabilizado que no se han controlado con un
tratamiento único de 20 mg/Kg de una formulación de tetraciclina de larga duración. Una vez que se establece el
procedimiento que da por resultado una dosis inmunizante segura y efectiva, debe cumplirse estrictamente en el
campo, o puede tener lugar un fallo en la inmunización. También es importante que se determinen la dilución del
estabilizado y el régimen droga/dosis en el ganado vacuno más susceptible de ser utilizado. La infección y el
método de tratamiento se aplica normalmente empleando una tetraciclina de larga duración, y se recomienda
que la tetraciclina se administre primero, por si el animal se escapa habiendo recibido solamente el estabilizado.
2.
Precauciones de seguridad
En una reunión celebrada en Malawi en 1988 se adoptaron las siguientes recomendaciones sobre la seguridad
en la preparación, manipulación y entrega de las vacunas para el tratamiento de la infección por T. parva (4).
a)
Recogida de garrapatas en el campo
Es importante que se utilicen cepas de laboratorio bien caracterizadas de Rhipicephalus appendiculatus
durante la preparación de los estabilizados para la inmunización.
Si las garrapatas de campo se recogen con fines experimentales, debería tenerse en consideración el
posible peligro para los humanos de los patógenos presentes en estas garrapatas. El patógeno más
importante que se ha reconocido es el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, generalmente
asociado con las garrapatas del género Hyalomma y ampliamente extendido en la zona de distribución
geográfica de R. appendiculatus. Por tanto, aquellos que manipulen colecciones de garrapatas de campo
deberían estar sobre aviso de los riesgos potenciales. Las garrapatas de las especies de Hyaloma no
deberían separarse de los hospedadores; las garrapatas hinchadas total o parcialmente no deberían
machacarse entre los dedos. Si se sacan, las garrapatas deberían manejarse con pinzas.
b)
Instalaciones para la manipulación de garrapatas
Debe controlarse la manipulación en el laboratorio de las garrapatas recogidas en el campo para evitar la
adherencia al personal. Las garrapatas recogidas en el campo deberían alimentarse sobre conejos y
575
ganado vacuno en instalaciones de aislamiento. Los animales de los que se han alimentado las garrapatas
infectadas en el laboratorio o recogidas en el campo deberían destruirse después de la transmisión y
recogerse antes de dejar las instalaciones de aislamiento. Después del hinchado de las garrapatas
recogidas del campo en los animales de laboratorio, deberían homogenizarse alícuotas y examinarse para
la presencia de patógenos humanos externos mediante inoculación en células Vero y de riñón de hamster
lactante (BHK). Los efectos de estas inoculaciones deberían estudiarse durante tres pases. Cualquier
garrapata no utilizada debería destruirse mediante métodos químicos o por incineración.
c)
Preparación del estabilizado
Debería tenerse cuidado durante la preparación del estabilizado de esporozoitos cuando se están moliendo
las garrapatas, para evitar la infección del personal por aerosoles con patógenos externos. Los encargados
de la molienda de las garrapatas deberían instruirse en los peligros potenciales implicados; el acceso a
zonas donde se homogenizan las garrapatas debería restringirse a personal específico e informado; el
personal debería llevar puesta ropa protectora, incluidos guantes y mascarillas; y el molido de las
garrapatas debería llevarse a cabo en una campana de seguridad microbiológica (ver Capítulo I.1.6.
Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología).
d)
Estándares futuros para garantizar la calidad y la seguridad
En una reunión posterior en Kampala en 1991 (5), se creó un comité bajo los auspicios de la Organización
para la Unidad Africana (OUA), la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO), y el Laboratorio Internacional para la Investigación sobre Enfermedades de los
Animales (ILRAD) para determinar los estándares de las vacunas vivas frente a enfermedades transmitidas
por las garrapatas. En el caso de T. parva, este comité observará con detalle la caracterización de los
parásitos empleando MAbs y sondas de ADN, la titulación de la infectividad in-vitro, y las recomendaciones
más formales sobre los ensayos de inocuidad con los organismos contaminantes. Se han preparado
borradores con estándares y es esencial que la FAO revise un conjunto de estándares actualizados y que
sean aprobados por la OIE. Más recientemente se han preparado estabilizados para la inmunización de
acuerdo con un conjunto propuesto de estándares (26). De esta manera, los estabilizados inmunizantes
futuros se prepararán de acuerdo con estándares que permitirán su utilización en el campo de manera
efectiva y con confianza.
3.
Pureza de los estabilizados
Tanto las garrapatas como los mamíferos de experimentación son fuentes potenciales de contaminación de los
estabilizados con patógenos externos. En ambos casos, entre los contaminantes potenciales se incluyen
Ehrlichia bovis, Borrelia sp. bovina, orbivirus, bunyavirus y otros. Por lo tanto, las garrapatas recogidas en el
campo no deberían utilizarse para la preparación de estabilizados inmunizantes. Con este propósito deberían
emplearse colonias de garrapatas de laboratorio bien caracterizadas y libres de patógenos. Solamente deberían
utilizarse para la alimentación de las garrapatas ganado bovino y conejos sanos y libres de parásitos transmitidos
por garrapatas. Los estabilizados deberían prepararse en condiciones asépticas. En algunas circunstancias
puede estar indicado el empleo de antibióticos a concentraciones adecuadas para el cultivo de tejidos. Los
estabilizados preparados deberían someterse a ensayos rutinarios de seguridad mediante su inoculación en
células BHK y Vero, seguidos de tres pases en estos sistemas (como se indica anteriormente). Los estabilizados
deberían someterse a una caracterización in vivo rutinaria, la cual debería implicar el ensayo de infectividad en
ganado vacuno intacto susceptible, sensibilidad a las tetraciclinas y otras drogas anti-Theileria, y estudios de
inmunidad cruzada. Debería prepararse un “estabilizado del inóculo de trabajo” caracterizado para asegurar la
pureza de los concentrados de T. parva en el estabilizado inmunizante derivado.
Durante la preparación del estabilizado se debe también tener cuidado para evitar la contaminación del
concentrado utilizado con otros concentrados de T. parva. Se deben hacer cumplir los procedimientos de
garantía de seguridad, por ejemplo, para la manipulación de las garrapatas infectadas, y las reglas beberían
cumplirse estrictamente. Las instalaciones para garrapatas deberían permitir la separación estricta de las
garrapatas infectadas y las no infectadas. El personal de la unidad de garrapatas debería utilizar batas
independientes para cada lote de garrapatas utilizado en la preparación del estabilizado, y las batas deberían
esterilizarse diariamente. Debería evitarse el trabajo simultáneo con muchos concentrados diferentes. Los
sistemas de almacenamiento del estabilizado deberían incorporar un marcaje claro en cada tubo o tubos del
estabilizado.
Las inspecciones del control de calidad del estabilizado deberían determinar el parecido del inóculo al
concentrado parental, y también detectar cualquier contaminación externa por T. parva.
4.
Riesgos de la vacunación
La introducción de un concentrado para inmunización en una zona/país del que no es originario puede dar como
resultado que el parásito o un componente (s) de ese concentrado se establezcan como portadores en el ganado
576
vacuno y sean transmitidos por garrapatas. Debería considerarse el efecto a largo plazo sobre la epidemiología
de la enfermedad de los parásitos nuevos (y potencialmente letales) antes de su introducción, y debería
controlarse cuidadosamente después de la inmunización.
Antes de la inmunización, debería llevarse a cabo la caracterización de los parásitos en poblaciones concretas, e
intermitentemente después de la inmunización. Actualmente, la caracterización de los concentrados de parásitos
en relación con la vacunación se basa principalmente en la inmunización y en experimentos de sensibilización
cruzada en el ganado vacuno. Sin embargo en laboratorios que poseen un alto grado de experiencia se han
intentado realizar varios métodos para caracterizar in vitro los concentrados de parásitos. Estudios preliminares
han mostrado que los concentrados de parásitos que difieren en su perfil de MAbs pueden no presentar
protección cruzada, mientras que los concentrados que presentan perfiles similares ofrecen protección cruzada
(19). Sin embargo, experimentos más recientes utilizando otros concentrados de T. parva han demostrado que
esta observación es errónea. Otro método ha utilizado clones de células T específicos frente a líneas celulares
parasitadas para detectar diferencias antigénicas, ya que se cree que las respuestas de las células T son
importantes como mediadores de la inmunidad frente a T. parva. (19). Actualmente no existen ensayos in vitro
que se correlacionen con la protección in vivo. Recientemente se ha propuesto un índice de reacción frente a la
enfermedad obtenido estadísticamente y basado en medidas parasitológicas, clínicas y hematológicas, para
caracterizar los niveles de infectividad y virulencia de diferentes concentrados de parásitos y valorar la
intervención del control frente a la teileriosis (33).
5.
Estrategia de vacunación
A diferencia de T. annulata, donde se observa una protección cruzada considerable en diferentes cepas del
campo, en T. parva se da una situación mucho más compleja. Se utilizan dos estrategias para tratar de superar
esta complejidad antigénica. En varios países se ha probado una combinación de tres concentrados que
proporcionan un amplio espectro de protección. La mezcla se preparó en Malawi en un proyecto de la FAO para
la distribución de T. parva en una región endémica. A continuación se preparó por la ILRI un estabilizado
trivalente similar para la FAO. Este último estabilizado se preparó según los últimos estándares propuestos y se
utiliza de manera segura y efectiva en Tanzania. Si un estabilizado no protege frente a un concentrado nuevo,
debería aislarse, caracterizarse, ensayarse y considerarse para su empleo, bien sólo o junto con el estabilizado
inmunizante actual. Otra estrategia consiste en preparar estabilizados a partir de concentrados nacionales o
locales para su empleo en zonas definidas. Esta estrategia es más costosa en tiempo y recursos, pero evita
hasta un cierto límite la introducción de nuevos concentrados en una zona. Con el movimiento del ganado existe
un riesgo de introducción de diferentes concentrados en una zona, lo que puede cortar la inmunidad
proporcionada por el concentrado local. Por lo tanto es necesario evaluar cuidadosamente la utilización de
concentrados locales o introducidos para la inmunización.
La infección y el método de tratamiento por medio de la inmunización son efectivos con tal de que se hagan
cumplir las medidas adecuadas de garantía de calidad. A largo plazo, los problemas relacionados con la entrega
y el riesgo de inducción de estados de portador y transmisión de la enfermedad subrayan la necesidad de la
identificación de antígenos protectores para el desarrollo de vacunas de subunidades.
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