Microscopía (2012)

Microscopía (2012)
Hooke, Micrographia (1664)
Mikeladze-Davi et al, Cell (2005)
Dr. Juan Burdisso
EVOLUCION DE LOS MICROSCOPIOS OPTICOS
Carl Zeiss
1857
STED Microscopy
http://micro.magnet.fsu.edu/
http://www.zeiss.com/micro
Tipos de Microscopia
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Microscopía de campo claro (coloreado).
Contraste de fase.
Microscopía de contraste de interferencia (DIC).
Microscopía de epifluorescencia.
Microscopía de Fuerza Atómica (AFM).
Microscopia de fluorescencia de refección interna
total (TIRFM).
– STED Microscopy
Partes de un Microscopio Óptico de Epifluorescencia (Nikon Eclipse 600)
http://www.microscopyu.com
Fuente : lámpara de mercurio
Célula epitelial, triple coloración:
núcleo (azul),
microtubulos (verdes),
actina (rojo). 1000X
Otras Fuentes: LED; Lasers
Entonces las partes fundamentales de un
microscopio de epifluorescencia son….
* Cubos
* Objetivos
* Cámara (chip CCD) "Charge Coupled
Device"
Estos componentes hacen la diferencia en este
tipo de microscopia
CUBO 1 (para observar GFP; Alexa 488; etc)
first barrier filter (Excitación) 465-495 nm (Blue light)
beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑505 nm
second barrier filter (Emisión) 515-555 nm (Green light)
CUBO 2 (para observar mRFP; DsRED; Alexa 546; Alexa 568; etc)
first barrier filter (Excitación) 528-553 nm (Green light)
beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑565 nm
second barrier filter (Emisión) 600-660 nm (Red light)
CUBO 3 (para observar DAPI; Hoechst; etc)
first barrier filter (Excitación) 330-380 nm (Violet light)
beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑400 nm
second barrier filter (Emisión) 435-485 nm (Blue light)
RECORDEMOS: Espectros de Absorsión o Excitación y de emisión
Pasaje de canal!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
La intensidad de fluorescencia emitida
varía con la longitud ( de excitación.
La exitación a la max (A), produce la
fluorescencia más intensa (A).
La distribución del espectro no depende
de la de exitación.
Las moléculas fluorescentes absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra
longitud de onda mayor (corriemiento de Stokes).
Objetivos de microscopía óptica
Apertura Numérica (AN) = n X sen 
n= índice de refracción
n aire: 1
n agua: 1.3
n aceite/vidrio: 1.5
Limite de Resolución = 0,61 X λ
AN
Intensidad =
(Apertura Numérica)4
(Magnificación)2
Objetivos
10X NA=0.25 → R= 1.34 µm
20X NA=0.40 → R= 840 nm
40X NA=0.65 → R= 520 nm
60X NA=0.80 → R= 420 nm
100X (oil) NA=1.25 → R= 270 nm
Cámara (Chip CCD)
La resolución de una cámara depende del tamaño y numero de pixeles del chip.
chip: 1360 x 1024 pixels
El Binning (reagrupación de pixeles para formar un superpixel)
B: 0
B: 2x2
B: 4x4
Que ganamos: Sensibilidad (util en muestras poco fluorescentes, para estudios in vivo).
Que perdemos: Resolución (la imagen esta mas pixelada).
Debe existir una relación entre la resolución optica de un
microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.
Nyquist Frecuency
(Límite de resolución del microscopio → 2.3 pixeles en el
chip).
Si este principio no se cumple nuestro microscopio es casi
obsoleto.
función de dispersión de punto 3D
(point spread function)
El rango dinámico: parámetro relacionado con la capacidad de
captar diferencias cuantitativas entre la señal mas débil y la mas
Intensa.
2 n bits
1bit= 2 niveles de grises
2 bits= 4 niveles de grises
3 bits= 8 niveles de grises
4 bits= 16 niveles de grises
8 bits= 256 niveles de grises
9 bits= 512 niveles de grises
10 bits= 1024 niveles de grises
12 bits= 4095 niveles de grises
16 bits= 65536 niveles de grises
Fotones → → → Electrones → → → → → Bits
Fluorescencia → Pixeles del chip CCD → Digitización
Tipos de Microscopia
Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM)
In cell and molecular biology, a large number of molecular events in cellular surfaces such as cell adhesion,
binding of cells by hormones, secretion of neurotransmitters, and membrane dynamics have been studied with
conventional fluorescence microscopes.
However, fluorophores that are bound to the specimen surface and those in the surrounding medium exist in
an equilibrium state. When these molecules are excited and detected with a conventional fluorescence microscope,
the resulting fluorescence from those fluorophores bound to the surface is often overwhelmed by the background
fluorescence due to the much larger population of non-bound molecules.
The TIRFM was developed by Daniel Axelrod at the University of Michigan, Ann Arbor in the early 1980s.
A TIRFM uses evanescent wave to selectively illuminate and excite fluorophores in a restricted region of the
specimen immediately adjacent to the glass-water interface.
The evanescent wave is generated only when the incident light is totally reflected at the glass-water interface.
The evanescent electromagnetic field decays exponentially from the interface, and thus penetrates to a depth of
only approximately 100 nm into the sample medium.
The selective visualization of the plasma membrane renders the features and events on the plasma membrane in
living cells with high axial resolution. TIRF can also be used to observe the fluorescence of a single molecule,
making it an important tool of biophysics and quantitative biology.
Total internal reflection fluorescence
microscopy (TIRFM) exploits the
properties of an induced evanescent
wave or field in a limited specimen
region immediately adjacent to the
interface between two media having
different refractive indices.
Beyond the angle of total reflection,
the electromagnetic field of the
incoming/reflected light still extends
into the z direction.
This evanescent wave is identical in frequency to the
incident light, but it decays exponentially in intensity
with distance from the interface and its effects
extend only a few hundred nanometers into the
second medium (having the lower refractive index).
Marcación: GFP-PTP 1B DA
Epifluorescencia
TIRFM
Fotos: Lic. Ana G Wusener
Microscopía Confocal
Fuente de luz: Lasers
Detectores: Tubos fotomultiplicadores
Pinholes (confocalidad)
Microscopía de Epifluorescencia
Microscopía Confocal
Seccionamiento óptico y recosnstrucción 3D
Polen
STED MICROSCOPY
(Stimulated Emission Depletion)
Microscopia STED
Actin Fibers
Sample Courtesy of Elise Stanley, Division of Genetics & Development,
Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada
Microscopia STED
Keratin Filaments
YFP labeled keratin filaments in SW-13 cells.
Sample: courtesy of Reiner Windoffer, RWTH
Aachen University, Institute of Molecular and
Cellular Anatomy, Aachen, Germany
Microscopia STED
Clathrin Vesicles
Distribution of Clathrin vesicles in HeLa cells.
Fluorescent marker: Alexa 488, immunolabeling.
Microscopía de campo claro
Absorción : es la disminución en la amplitud de onda cuando esta pasa a
través de un objeto . La mayoría de las células muestran muy baja absorción
con la luz visible. Esto resulta en la naturaleza transparente del objeto bajo la
luz del microscopio, y en un contraste pobre.
Microscopía de campo claro (preparados coloreados)
• Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado):
El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan
el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera
Microscopía de contraste de fase
A) Las zonas coloreadas reducen
la amplitud de ondas de luz de
determinadas longitud que pasan
a través de ellas.
B) La luz que pasa a través de una célula
sin teñir experimenta poco cambio en su
amplitud.
Sin embargo hay un cambio de fase al
pasar a través de la célula y estos cambios
se hacen visibles explotando los efectos
de interferencia
Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o
células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz. En el
microscopio de fase el cono de luz entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un
dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un
cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice
de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible.
Microscopía de contraste de interferencia (DIC)
Nomarski - DIC. Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes
combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras
hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy
difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización invitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar
contraste de fases
Microscopía de Fuerza Atomica (AFM)
El Microscopio de Fuerza Atómica (MFA) es un instrumento mecano-óptico capaz de
detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, se registra
continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma
piramidal. La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de
las fuerzas, de sólo unos 200 μm de longitud.
La fuerza atómica se puede detectar cuando la punta se aproxima a la superficie de la
muestra. Se registra la pequeña flexión del listón mediante un haz láser reflejado
en su parte posterior. Un sistema auxiliar piezoeléctrico desplaza la muestra
tridimensionalmente, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie.
Todos los movimientos son controlados por una computadora.
La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización
permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de
varios millones de veces.
El microscopio de FA, puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza. En la
modalidad de imagen, la superficie es barrida en el plano de la superficie por la
punta. Durante el barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la punta y los
átomos en la superficie de la muestra, provoca una flexión del listón. Esta flexión es
registrada por un sensor adecuado (normalmente balanza óptica) y la señal obtenida
se introduce en un circuito o lazo de realimentación. La fuerza interatómica se puede
detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra. En medidas
de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras se registra la flexión del
listón. Las medidas de fuerza son útiles en estudios de fuerzas de adhesión y permiten
estudiar a nivel de una sola molécula interacciones específicas entre moléculas (ej:
Interacción molécula de adhesión celular- proteínas de matriz extracelular, interacción
antígeno-anticuerpo, interacción entre hebras complementarias de ADN) o
interacciones estructurales de las biomoléculas (plegado de proteínas) así como
caracterizar la elasticidad de polímeros.
Microscopía de Fuerza Atomica (AFM)
Tocadisco molecular
Microscopía de Fuerza Atomica (AFM)
Moléculas de ADN
FIN”
“