citotoxicidad del veneno del escorpión cubano rhopalurus junceus

Transcripción

REVISTA INSTITUCIONAL DEL GRUPO EMPRESARIAL DE PRODUCCIONES BIOFARMACEÚTICAS Y QUÍMICAS, LABIOFAM
No. 1 / 2010
CITOTOXICIDAD DEL VENENO
DEL ESCORPIÓN CUBANO
RHOPALURUS JUNCEUS
SUPLEMENTO
NUTRICIONAL
EFECTIVIDAD COMPARATIVA DEL
BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS
Y TEMEPHOS
SUMARIO
No. 1 /2010
Revista del Grupo Empresarial de Producciones Biofarmaceúticas y Químicas, LABIOFAM
4
Largo camino, evidentes resultados
PRODUCTOSNATURALES
7
Importancia de la producción nacional de
del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus y
12 Citotoxicidad
sus fracciones sobre líneas celulares tumorales humanas.
de la seguridad toxicológica del polvo de pseudotallo de
20 Evaluación
Musa paradisiaca: Suplemento nutricional ACITAN .
productos biológicos para la sostenibilidad de
los programas de control, en la prevención
de epizootias.
®
del extracto acuoso del Solanum torvum Sw en células
30 Genotoxicidad
germinales de ratón.
36 VIMANG
CONTROLDEVECTORES
SALUDANIMAL
del uso de los liposomas como
40 Evaluación
adyuvantes de una vacuna de ADN contra la
enfermedad de gumboro.
48
Obtención y evaluación de un candidato
vacunal contra la Paramixovirosis de las
palomas empleando la cepa La Sota del virus
de Newcastle inactivado.
56
toxicológica de la Gentamicina
62 Evaluación
infusión intramamaria para uso veterinario.
Evaluación de una cepa vacunal contra la
Peste Porcina Clásica.
operacional de biolarvicidas en el control
68 Uso
de culícidos en Mariel y Bejucal.
de la productividad en el proceso
74 Incremento
de obtención del Bactivec .
operacional del rodenticida biológico
80 Uso
BIORAT en Malabo, Bata y Annobón. Guinea
®
®
Ecuatorial, 2008.
de larvicidas biológicos en control
84 Utilización
integral de los vectores de la malaria y otras
enfermedades en Accra metropolitana, Ghana
comparativa del Bacillus thuringien90 Efectividad
sis var. israelensis y Temephos contra larvas de
Aedes aegypti en el municipio de Uberlândia
LA BIO FAM
REPORTEDECASO
97 Bacterias que brindan salud
terapéutico del veneno
100 Efecto
del escorpión Rhopalurus
junceus en pacientes con
cáncer de páncreas
2
104 Recomendaciones a los autores.
DIRECTOR GENERAL: DR. JOSÉ ANTONIO FRAGA CASTRO. DIRECTORES EJECUTIVOS:ING. ISBEL GONZÁLEZ MARRERO, LIC. JUANA NAVARRETE MENDOZA. COMITÉ DE REDACCIÓN: DR. DORA RODRÍGUEZ
SÁNCHEZ, PROF. MERCEDES RODRÍGUEZ EDREIRA, DR. DIGNA CONTRERAS GONZÁLEZ. CORRECCIÓN DE ESTILO: LIC. LEYDA LAGUARDIA ESQUIVEL, ING. YANELIS RIQUENES GARLOBO. ASISTENTE: LIC.
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LEMUS, MSC. RAISELYS TOIRAC PROENZA, DR. GRISEL MONTERO LAGO, LIC. REINALDO GONZÁLEZ BERGARA, LIC. ROSARIO CARRERO SUÁREZ, DR. MARIELA GUEVARA GARCÍA, LIC. LILIAM LEE HERNÁNDEZ, MSC.
VALIA VÁZQUEZ PITA, LIC. ARAMIS MARTÍNEZ ARIAS, LIC. ARAMIS RIVERO GUERRERO, LIC. CARIDAD RODRÍGUEZ TORRES, MSC. IRANIA GUEVARA ORELLANES, DR. M.V. HENRY A. TAIT HERNÁNDEZ.
GRUPO EMPRESARIAL DE PRODUCCIONES BIOFARMACEÚTICAS Y QUÍMICAS, LABIOFAM
AVE. INDEPENDENCIA KM 16 ½. BOYEROS, CIUDAD DE LA HABANA, CUBA. TELF.: +537 683 0326 / 683 0391. FAX: +537 683 0326. [email protected]
IMPRESIÓN: INVERPRINT Ltda.
www.labiofam.cu
EDITORIAL
C
omienza hoy, 28 de septiembre,
el Primer Congreso Internacional
LABIOFAM 2010, evento que marca la
consolidación de casi medio siglo de trabajo
a favor de la salud animal en Cuba. La seriedad
y constancia en el cumplimiento de esta tarea primigenia nos permite mostrar, entre los grandes logros del
Grupo Empresarial LABIOFAM, la erradicación de epidemias
y enfermedades dentro del sector veterinario de nuestro país.
La historia de la institución científica que auspicia el evento
converge con algunos de esos grandes retos que vivió esta pequeña isla del Caribe. Enfrentar una guerra biológica
bajo difíciles circunstancias ilustra la abnegación de un grupo de profesionales para neutralizar las agresiones enemigas.
Mas, los nuevos tiempos marcan el camino hacia otros derroteros, esos que han motivado la investigación y
desarrollo de vacunas y métodos diagnósticos, suplementos alimenticios para consumo humano, productos biológicos
vinculados al control vectorial, todas una amplia gama de productos y servicios que responden a los requerimientos de
calidad que la industria de medicamentos exige.
Cada una de las áreas de estudio, con sus resultados y aplicación práctica será mostrada al mundo en las sesiones de diálogo y sana confrontación que organiza esta cita científica de carácter internacional.
Y en esta jornada en la que se inicia tan significativo Congreso, nace también esta Revista institucional. En sus
páginas podrá encontrar varias de las temáticas que serán analizadas durante el encuentro con un enfoque científico,
sin embargo, otras propuestas le permitirán, desde una perspectiva diferente, ampliar su visión acerca del Grupo Empresarial LABIOFAM.
Es sana ambición de todos los funcionarios, investigadores, especialistas, técnicos y obreros de nuestros centros de investigaciones que las próximas jornadas, con sus debates y análisis, propicien las condiciones para fortalecer
la misión del Grupo Empresarial LABIOFAM: ofrecer salud al hombre y a la masa animal.
Dr. José Antonio Fraga Castro
Director General
G R U P O
E M P R E S A R I A L
L A B I O F A M
LARGO CAMINO,
EVIDENTES
RESULTADOS
Feliberto Mohar Hernández
A
rduo y sostenido trabajo signa el largo camino recorrido
por una institución científica cubana que
hoy muestra, entre sus muchos logros, el
proveer de medicamentos y vacunas al
100 % de nuestra masa animal. El Grupo
Empresarial LABIOFAM ha hecho posible
la erradicación de numerosas enfermedades y plagas en el campo de la veterinaria, lo cual repercute favorablemente en
el sector económico.
La obligada evolución de aquella
idea primigenia que por decreto presi-
Dr. Rafael Polanco Pérez
dencial del entonces mandatario cubano
Gerardo Machado, dejó constituido el 30
de junio de 1927 los Laboratorios Biológicos de Santiago de las Vegas, permitió
que productos como el Biorat, Bactivec
y Griselesf motiven hoy la presencia de
colaboradores cubanos en varias naciones
del mundo con el solidario y humano propósito de salvar vidas. Los bioplaguicidas
cubanos, cuya calidad es reconocida ya a
nivel internacional, contribuyen al control
de vectores trasmisores de enfermedades
como la malaria, el dengue y la leptospira.
Lilian Lee Hernández
A sólo 8 años de creado, el Laboratorio cambió su nombre por Estación
Biopatológica. A partir de ese momento
varios Departamentos asumieron la elaboración de suero anticolérico porcino, vacunas contra el Ántrax y el Carbunco Sintomático, la investigación y diagnóstico de
animales enfermos o fallecidos y uno dedicado a la administración y la contaduría.
Caracterizada por un pobre
equipamiento de procedencia española,
norteamericana y nacional, la Estación
elaboró hasta 10 productos, alcanzando
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Portada de los Laboratorios Bio-Patológicos de la Sección de Industria Animal de la Secretaría de Agricultura, Comercio y Trabajo.
su máxima producción en el año 1938.
En esa época a pesar de existir 9 médicos veterinarios, el nivel cultural y técnico
de sus aproximadamente 46 trabajadores era bajo, propias de las condiciones
socio-económicas del país.
Con posterioridad al año 1938
la producción de biopreparados sufrió seDecreto en el que se disponía la creación
de los Laboratorios Biológicos de Santiago
de las Vegas para la producción del suero
contra el Cólera Porcino y el Laboratorio
de Epizootias.
L ABIO FA M
rias afectaciones, dada la creación de laboratorios privados y a la importación de
medicamentos de uso veterinario fundamentalmente de los Estados Unidos, que
cubría el 70% de la demanda nacional.
Tal situación no solo provocó la casi desaparición de la exigua producción estatal y
privada del país, sino que se mantuvo esta
situación hasta 1959.
Al triunfar la Revolución se nacionalizaron y fusionaron los laboratorios privados, que tenían su sede en las instalaciones de la Estación Biopatológica, nace así
la Empresa de Laboratorios de Producción
Veterinaria, el 15 de julio de 1962. Con
escasos recursos materiales y humanos
comenzó la producción de medicamentos biológicos y farmacéuticos desde una
perspectiva estatal, y en 1963 se inició la
producción del suero contra el Cólera y
Erisipela porcina.
La adquisición de nuevas instalaciones y equipamiento hicieron visible
una mejora tecnológica en 1966, desde
ese instante fue
posible envasar
medicamentos en ámpulas
y bulbos inyectables. Manteniendo su
sede originaria, el 3 de enero de 1977 la
Empresa de Laboratorios de Producción
Veterinaria, adquiere el nombre de Empresa Cubana de Productos Veterinarios,
representada por CUBAVET.
En ese momento aproximadamente 100 profesionales de las más
variadas especialidades conformaban un
equipo de trabajo que llegó a estar integrado por tan sólo 9 personas. Este crecimiento en la fuerza de trabajo, la mayoría
universitaria, representó un significativo
incremento en el número de productos
veterinarios. (figura 1)
Pero también, desde el punto de
vista estructural, existieron trascendentes
modificaciones. La nueva empresa extendió su alcance a toda la nación y amplió
su visión empresarial más allá de la producción de medicamentos al incorporar
su distribución y comercialización a través
de las 14 delegaciones provinciales y una
red de 117 farmacias.
Los muchos años de trabajo en
el campo de la veterinaria, las habilidades
para desarrollar y producir medicamentos, unido a la introducción de nuevas
tecnologías permitieron que CUBAVET
elaborara productos de alta calidad que
cumplían las exigencias del mercado internacional. (figura 2)
Sin embargo, las complejas condiciones socio-económicas y las fluctuaciones de la economía mundial en los 90,
impusieron la necesidad de diversificar
aún más las producciones. Este redimensionamiento gradual en cada una de las
plantas productoras repercutió también
en el nombre de la hasta entonces CUBAVET. Dado el
5
G R U P O
Dr. Medicina Veterinaria
Lic. Microbiología
Lic. Biología
Lic.Economía
Lic. Control Económico
Lic. Derecho
Ing. Industrial
Ing. Sistema Autómatico
Ing. Pecuario
L A B I O F A M
Lic. Ciencias Farmacéuticas
Lic. Bioquímica
Lic. Química
Lic. Planificación y Economía Nacional
Lic. Contabilidad
Lic. Finanzas y Precios
Ing. Eléctrico
Ing. Química
Arquitecto
Figura 1. Perfil profesional de la Empresa Cubana de Productos Veterinarios,
CUBAVET (1977).
200
180
169
Número de productos
160
182
142
140
120
100
82
80
60
LA BIO FAM
40
6
20
0
10
1938
1968
1984
Figura 2. Incremento productivo desde 1938 hasta 1989 .
1988
1989
amplio perfil de las proyecciones, la institución científica comenzó a llamarse Laboratorios Biológicos Farmacéuticos (LABIOFAM), que en el año 2000 adquiriría
el nombre por el cual responde actualmente: Grupo Empresarial LABIOFAM.
A partir de este momento las
plantas se transformaron en empresas y
ellas a su vez se integraron para potencializar las actividades de investigación, desarrollo, producción y comercialización. De
esta forma se crearon las bases para nuevas producciones como: plaguicidas biológicos, vacunas, productos químicos para
higiene, suplementos dietéticos de origen
natural, alimentos y envases plásticos.
En este proceso de perfeccionamiento se hizo necesaria la creación de
la Empresa Comercializadora LABIOFAM
S.A., con la cual se adquirió poder legal
y jurídico para extender el campo de acción del Grupo Empresarial más allá de
nuestras fronteras.
Somero recuento vivido aún entre personas que se incorporaron en algún momento de este largo camino y que
continúan creyendo en esta institución
científica. Palpables son sus muchos logros que se hacen evidentes en un Primer
Congreso Internacional nacido del esfuerzo y el sacrificio de varias generaciones.
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Importancia de la producción nacional de
productos biológicos para la sostenibilidad de
los programas de control, en la prevención de
epizootias
E
Dra. Tania Campos
Dr. Pedro Acosta
Lic. Sandra Moreno
Lic. Xiomara Peña
Dra. Raida Calderón
Lic. Siduet González
LABIOFAM
l Grupo Empresarial LABIOFAM, se encarga de garantizar la salud animal mediante la elaboración de preparados vacunales y
medios diagnósticos de producción nacional, los cuales permiten la sustitución de importaciones y completar el espectro de
vacunación de nuestra ganadería y avicultura. Se ocupa además, de investigar y desarrollar nuevos biológicos de mejor calidad y más
económicos, para lograr así insertarnos en el mercado internacional.
En nuestro país el último reporte de la enfermedad de
Newcastle se realizó en el año 1982 sin embargo, en México, a
comienzos del año 2000 se informó un brote de Newcastle producido por una cepa muy virulenta que provocó una mortalidad
del 60%; en los dos siguientes meses se afectaron un total de 93
granjas de pollos de engorde y fue necesario enterrar más de 13.6
millones de aves; las pérdidas se estimaron en 50 millones de USD
para los avicultores y otros 25 millones de USD al gobierno.
En Cuba, a finales de la década del 70 fue llevada a la
práctica una nueva estrategia de inmunización contra la EN con la
utilización de una vacuna viva, cepa La Sota, liofilizada, producida
por LABIOFAM. Esta enfermedad se ha mantenido bajo control
durante casi tres décadas, con un programa de vacunación y medidas de bioseguridad junto a una vigilancia ininterrumpida, mediante monitoreos que permiten conocer el comportamiento de
las aves cuando son vacunadas con virus vivo o inactivado como
dosis de reforzamiento, para asegurar niveles satisfactorios de inmunidad materna en la progenie. Se puede afirmar, que la estrategia de inmunización ha sido exitosa; no obstante, la misma se
revisa y perfecciona constantemente de acuerdo con la situación
LABI O FAM
VACUNAS
Vacuna contra la enfermedad de Newcastle
La enfermedad de Newcastle (EN) fue inicialmente conocida
en Inglaterra y Java en 1926-1927, casi simultáneamente, desde
entonces hasta el presente ha sido considerado como uno de
los más importantes impactos económicos en la industria avícola
mundial. En los últimos tres años, 88 de los 105 países que reportan a la Organización Internacional de Epizootias (OIE) han
descrito la presencia de virus velogénicos de la Enfermedad de
Newcastle. Según el reporte de enfermedades en el tiempo de
la OIE los siguientes países del área como Belice, Bolivia, Brasil,
Canadá, Chile, Colombia, República Dominicana, Haití, Honduras, México, Perú y Venezuela, han presentado alguna de estas
informaciones:
- Sospecha de la enfermedad pero no ha sido confirmada.
- Presencia de la infección pero sin signos clínicos.
- Presencia de la infección con la presencia de signos clínicos.
- Presencia de la infección limitada a ciertas zonas en
algún período de los últimos cinco años.
7
G R U P O
LA BIO FAM
L A B I O F A M
primera vez en 1975, comenzando a difundirse a la mayoría
60000000
de las provincias. Desde 1979 se
comenzaron los primeros expe40000000
rimentos para lograr una vacuna
que controlara las epizootias,
20000000
concluyendo todos los estudios
en 1993, comenzándose su pro0
ducción industrial en LABIOFAM
AÑOS
DOSIS UTILIZADAS
DOSIS PRODUCIDA
a partir de 1995. En la actualidad
Serie 1
2006
32880000
27736000
se producen más de dos millones
Serie 2
2007
32880000
43800000
de dosis aplicadas a la especie
2008
68864000
50892000
Serie 3
porcina según los programas de
inmunización del Instituto de MeGráfico 1. Cantidad de dosis de vacuna contra la EN, producidas por LABIOFAM y usadas en la Avicultura Nacional en los años 2006, 2007 y 2008.
dicina Veterinaria (IMV) con buenos resultados, manteniéndose y
internacional de la enfermedad. Se mantiene además la produccontrolándose con una incidencia muy baja y sin provocar pérdición de vacunas contra la EN, según programa de inmunización
das económicas significativas. Esta vacuna es una patente cubana.
que tiene establecido la avicultura cubana. (gráfico 1)
Vacuna contra la enfermedad de Aujeszky
Vacuna contra la Encefalomielitis Equina del Este (EEE)
La enfermedad de Aujeszky es provocada por un herpes virus, es
La EEE es clasificada epidemiológicamente como una virosis (arinfectocontagiosa y afecta a la mayoría de los animales domésticos
bovirus) transmitida por artrópodos. Este virus es naturalmente
y salvajes provocando alta mortalidad, sobre todo a los animales
transmitido a los roedores, aves, equinos, al hombre y otros
jóvenes, además de los abortos, que tienen una alta incidencia en
vertebrados por varias especies de mosquito. La infección puede
cerdas gestantes. La enfermedad está difundida a la mayoría de
ser inaparente en las aves y roedores salvajes; la muerte puede
las provincias del país, fue reportada por primera vez en Cuba en
observarse en los equinos, el hombre y las aves domésticas. En
1965 provocando una rápida diseminación. En 1986, un colectivo
1873 se reportó en Cuba los primeros antecedentes clínicos de
de especialistas de LABIOFAM obtuvo la vacuna contra esta enferla enfermedad, y el virus fue confirmado en 1944. Desde 1967
medad, comenzándose a aplicar en los esquemas de inmunización
se comenzó en nuestro país la producción de la vacuna contra
nacional para la especie porcina. De una alta incidencia que existió
la EEE en embrión de pollo (Polanco y col) y a partir de 1972
en las década del 80 y 90, actualmente está controlada la enfermese comenzaron los trabajos experimentales en cultivos celulares.
dad sin provocar grandes pérdidas económicas por estas causas.
En 1993 se comenzaron los estudios con la línea celular BHK-21
Clon 13, obteniéndose la vacuna inactivada y adyuvada con gel
de hidróxido de aluminio de superior calidad a la tradicional en
Tabla 1. Producción de la vacuna contra la EEE desde el año 2002
embrión de pollo. En 2002 se concluyen todos los estudios de
hasta el 2008.
documentación tecnológica de producción y control, así como
CANTIDAD
el registro del medicamento y su generalización en todo el país al
AÑOS
DOSIS
DE FRASCOS
100% de la masa equina.
2002
14 000
140 000
Hasta la actualidad se han producido más de tres millones
de dosis de esta nueva vacuna con buenos resultados (tabla 1).
2003
56 800
568 000
Hace más de 40 años que no se reportan casos clínicos de la
2004
37 400
374 000
enfermedad en el país.
2005
32 500
325 000
Vacuna contra la Encefalomiocarditis del cerdo (EMC)
La EMC es una enfermedad infectocontagiosa provocada por un
2006
64 400
644 000
cardiovirus que afecta a la mayoría de los animales domésticos y
2007
62 000
620 000
salvajes, ocasionando grandes pérdidas económicas fundamental2008
40 000
400 000
mente en la especie porcina, por la alta mortalidad y los abortos
que puede producir. Esta enfermedad fue reportada en Cuba por
Total
307 900
3 079 000
80000000
8
G R U P O
Vacunas polivalentes
En LABIOFAM se comenzaron desde el año 1993 los primeros
experimentos para obtener las vacunas polivalentes, teniendo en
cuenta la tendencia en los últimos tiempos a la aplicación de vacunas polivalentes para la inmunización de la masa animal, resultando de esta forma más económico y práctico los planes de ayuda
y control de las enfermedades, además del ahorro que ocasionan
en materias primas y mano de obra, entre otras ventajas. En el
año 1998 se obtuvo la vacuna Bivalente contra la EMC- Aujeszky
y en 2001 se concluyeron las vacunas Bivalente Aujeszky – Leptospira y la Trivalente EMC –Aujeszky– Leptospira comenzándose
a generalizar a todo el país según los planes de lucha y control del
IMV con buenos resultados.
Actualmente, ya se han producido más de dos millones
de dosis en las diferentes combinaciones polivalentes aplicadas a
la especie porcina.
Vacuna contra la Brucelosis.
La Brucelosis es considerada una de las enfermedades que más
daño ocasiona a la economía pecuaria a nivel mundial. Es una
enfermedad infecto contagiosa de evolución lenta, causada por
L A B I O F A M
los microorganismos del género Brucella. Sus consecuencias sanitarias son muy graves debido a que se desarrolla en especies en
estrecho contacto con el hombre, de ahí que los afecta también,
por esto su característica de zoonosis, demostrada por primera vez en 1905. A nivel mundial existen grandes pérdidas económicas por esta enfermedad, siendo el continente americano
uno de los más afectados, reportando pérdidas de más de 270
millones de dólares anualmente. En nuestro país a raíz del triunfo revolucionario se desarrolló un amplio programa de control y
erradicación que permitió declararnos libre de Brucelosis. Dentro
de este programa se destaca la introducción a nivel nacional de
la producción de la vacuna contra la Brucelosis bovina en el año
1996, por LABIOFAM, lo que ha permitido mantener el control
de la enfermedad ante la aparición de brotes.
Conjuntamente con la vacunación, el diagnóstico de la
presencia de la enfermedad ha sido de vital importancia, para el
mismo se han empleado medios de producción nacional (Rosa
Bengala, Fijación de Complemento, Prueba Lenta, entre otros)
igualmente producidos en LABIOFAM, que han garantizado el
pesquizaje de todo el ganado bovino a nivel nacional.
LABIOFAM
SE ENCARGA DE GARANTIZAR LA SALUD ANIMAL E INVESTIGAR
Y DESARROLLAR NUEVOS BIOLÓGICOS
culina PPD bovina acorde a las exigencias internacionales (1mg/
mL – 32 500 UI/ mL) en la red diagnóstica del país, después de ser
analizado y avalado por el Laboratorio de Control Estatal del Instituto de Medicina Veterinaria de Cuba (LCE) y el Servicio Nacional
de Sanidad Agroalimentaria de Argentina (SENASA), con la finalidad de obtener un producto armonizado y que no solo tuviera
utilidad en Cuba, sino en el resto de los países del área. Ha permitido contar con un producto de mejor calidad en la red diagnóstica
nacional y está incluido en los programas de lucha y control de la
enfermedad en otros países como Venezuela, Bolivia y República
Dominicana. Anualmente se entregan aproximadamente 7000
frascos, que da lugar a la investigación de 70 000 animales.
Juego Diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina
La Anemia Infecciosa Equina (AIE) es una enfermedad transmisible
de origen viral, que sólo afecta a los équidos (asnos, mulas y caballos), la cual se desarrolla con un curso crónico, generalmente
presentándose de manera insidiosa luego de un ataque agudo inicial. En los animales afectados se caracteriza por fiebre intermiten-
LABI O FAM
REACTIVOS PARA DIAGNÓSTICOS
Tuberculina PPD
El PPD (Derivado Proteico Purificado), es la Tuberculina que actualmente se emplea en el diagnóstico alérgico de la Tuberculosis
en bovinos a nivel mundial. Constituye la piedra angular en el desarrollo exitoso de un programa de lucha contra esta enfermedad,
en función de su elevada especificidad y sensibilidad, siendo el
único método confiable para la detección de los bovinos tuberculosos. En el año 2008 en el III Congreso Latinoamericano de Zoonosis, se reportó que la infección tuberculosa en bovinos existe
en la mayor parte de los países de la Región de América Latina y
el Caribe con importancia variable, especialmente concentrada en
el ganado lechero. En todos los países se realizan actividades de
control y de vigilancia y algunos se encuentran ya en la etapa de
erradicación (Cuba, Costa Rica, Panamá, Uruguay).
El programa de control de la Tuberculosis bovina en Cuba
se inició en el año 1964, con cobertura nacional a todo el rebaño
bovino y se ha mantenido hasta la fecha de forma sistemática. En
2002, se logró la introducción del Patrón Internacional de Tuber-
9
G R U P O
te, depresión, emaciación y edema en las porciones ventrales del
cuerpo. La enfermedad se ha reportado en todos los continentes.
El porcentaje de animales positivos al virus es mayor en Centro
y Suramérica. El virus causante de la enfermedad es un lentivirus
(virus lento) de la familia Retroviridae. El diagnóstico clínico de la
enfermedad es difícil, independientemente que se trate de fases
agudas o crónicas de la enfermedad. Se requiere generalmente
de observaciones continuas del animal debido a las crisis febriles
recurrentes. Existen pruebas de laboratorio satisfactorias para la
confirmación de esta enfermedad, como la prueba de agar gel difusiòn, la cual aún es utilizada en la mayoría de los países del mundo como la prueba estándar para AIE, que ha demostrado su gran
utilidad como herramienta para el control de esta enfermedad.
L A B I O F A M
En Cuba, existe un programa de examen serológico a
todos los animales a través de campañas nacionales anualmente
y los animales positivos son segregados. Estos animales se alejan
del resto de la masa, para evitar la infección a otros equinos, pues
la enfermedad se transmite a través de la picada de mosquitos,
de yegua a potrillo, a través de cuchillos y jeringas que no están
esterilizadas y agujas que se utilizan para marcar, tatuar o para sacar
sangre, que han sido previamente usadas en animales infectados. El
diagnóstico se hace por campaña y no se autoriza el traslado de un
animal de un lugar a otro sin hacer la prueba de AIE. En tal sentido
LABIOFAM anualmente entrega a la red diagnóstica alrededor de
5000 a 6000 juegos diagnósticos, lo cual representa la investigación de 390 000 a 468 000 animales.
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(SENASA) Buenos Aires 2007.
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
Citotoxicidad del veneno
del escorpión cubano
Rhopalurus junceus
y sus fracciones sobre líneas
celulares tumorales humanas
Citotoxicity of venom
from Cuban scorpion
Rhopalurus junceus
against human tumor cell lines
1
Departamento de Investigaciones, Laboratorios de
2
Departamento de Microbiología, Laboratorio de cultivos
12
Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM).
celulares, Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”.
* E-mail: [email protected]
Alexis Díaz García1*
Luis Morier Díaz2
Hermis Rodríguez Sánchez2
Yamira Caballero Lorenzo
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
El empleo del veneno del escorpión Rhopalurus junceus, ha cobrado gran interés en los últimos años, debido al conocimiento
popular de que alivia o cura diversas dolencias, incluida el cáncer. En este estudio se determinó la citotoxicidad del veneno y sus
fracciones proteicas, en los cultivos de líneas celulares tumorales Hela, (carcinoma de cérvix humano); Hep-2, (carcinoma epidermoide de laringe humano); NCI-H292, (carcinoma de pulmón) y en la línea diploide MRC-5, (fibroblastos humano de pulmón). El
veneno se fraccionó mediante cromatografía líquida de baja presión empleando una columna de exclusión molecular. El efecto de
las fracciones obtenidas y del veneno, sobre las líneas celulares, se determinó a través de un ensayo colorimétrico empleando el
bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolio y se calculó la concentración citotóxica media para cada uno mediante regresión lineal. Se estudió la apoptosis como mecanismo de muerte celular. El veneno y las fracciones con masas moleculares inferiores a 4 kDa inhibieron significativamente el crecimiento de las células tumorales con respecto a la línea celular diploide.
El veneno provocó la muerte celular en las células tumorales a través del evento de apoptosis. Las proteínas de masa molecular
inferior a 4 kDa son las responsables de la significativa y diferencial toxicidad del veneno del escorpión Rhopalurus junceus, sobre las
células tumorales.
Palabras clave: veneno de escorpión, Rhopalurus junceus, citotoxicidad, células tumorales.
The treatment with venom from scorpion Rhopalurus junceus has raised great interest in the last
years, due to the popular knowledge that it cure some illness, included the cancer. The main goal
of this study was to determine the cytotoxic effect of scorpion venom and fractions against
Hela, (human cervix carcinoma); Hep-2, (human larynx carcinoma);
NCI-H292, (lung carcinoma) and normal cell line MRC-5, (human lung fibroblast). The effect
the human tumor cell lines
of scorpion venom and fractions on cell lines was determined by a colorimetric assay using the
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide and the 50% cytotoxic concentration was calculated by linear regression analysis. The scorpion venom was fractionated by
liquid chromatography with a molecular exclusion column. The mechanism of cellular death was
studied. The venom and their fractions with low molecular below 4 kDa significantly inhibited
the growth of tumor cells and the normal cells showed lesser sensibility. The venom caused the
cellular death through the apoptosis in tumor cells. The proteins of low molecular weight present in venom of Rhopalurus junceus are the responsible for the significant and differential toxicity
against tumor cell.
Keywords: Rhopalurus junceus venom, low molecular weight proteins, citotoxicity, tumor cells.
veneno del escorpión Rhopalurus junceus, especie endémica de
Cuba, ha sido empleado con fines terapéuticos desde principios
del siglo XlX, en que se expendía el llamado "aceite de alacrán"
que se decía era útil para contrarrestar la retención de la orina [6].
Sin embargo, no es hasta comienzos de la década del 80 del siglo
XX, en Guantánamo, que se vislumbran las potencialidades del
veneno de este escorpión, como agente antitumoral a partir de
estudios empíricos [7]. Hasta hoy no se conoce la composición
del veneno de este escorpión y su efecto sobre células tumorales, por lo que en este trabajo nos propusimos determinar la
citotoxicidad del veneno del escorpión Rhopalurus junceus y sus
fracciones proteicas sobre cultivos de líneas celulares tumorales y
normales humanas.
LABI OFAM
E
l veneno de escorpión se ha empleado en la medicina tradicional en algunos países como China e India,
para el tratamiento de diversas dolencias. Los usos más
amplios comprenden el tratamiento de convulsiones,
dolor y cáncer [1,2]. En sus condiciones naturales, el veneno de
los escorpiones, es un fluido opalescente, lechoso, con un pH
7.12, que contiene sales inorgánicas, mucopolisacáridos, enzimas
y una gran variedad de proteínas que incluyen péptidos con masas moleculares inferiores a los 8 kDa [3]. Publicaciones científicas
recientes reconocen las potencialidades de los venenos de escorpión en el tratamiento del cáncer en los que se ha observado en
estudios in vitro la inhibición del crecimiento celular y la existencia
de la apoptosis como evento de muerte celular [4,5]. En Cuba el
13
[ [N PO RMOB DR U
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LABI OFAM
RHOPALURUS
escorpión cubano
JUNCEUS
14
MATERIALES Y MÉTODOS
Escorpiones: los escorpiones de la especie Rhopalurus junceus
utilizados en los experimentos se encuentran en el escorpionario perteneciente a los Laboratorios Biológico-Farmacéuticos
(LABIOFAM). Se emplearon escorpiones adultos y los mismos
se mantuvieron a temperatura ambiente y la alimentación consistió en insectos fundamentalmente Grillos sp (grillos) y Periplaneta
americana (cucarachas) proporcionados una vez por semana.
Veneno: el veneno se obtuvo por estimulación eléctrica
del telson de escorpiones, con períodos de al menos 21 días sin
extraérseles veneno. El veneno obtenido se diluyó en agua destilada convenientemente, se centrifugó a 15 000 rpm durante 20
min para la eliminación de constituyentes como mucus y restos
celulares. Finalmente el sobrenadante, se almacenó en viales de
1.5 mL y se guardó a -20°C hasta su utilización. Estudios previos
han demostrado que el almacenamiento a esta temperatura no
afecta significativamente las características del extracto obtenido.
La concentración de proteínas se calculó en todos los
casos por el método de Lowry modificado [8].
Cromatografía líquida de baja presión (CLBP):
el veneno se disolvió en acetato de amonio 0.1 M (NH4Ac) con
vórtex y se centrifugó a 15 000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se inyectó sobre una columna de gel filtración Superdex 75
HR 10/30, con dimensiones 10 x 300 mm implementado sobre
un sistema AKTA FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). La columna se equilibró con 0.1 M de NH4Ac y el material eluyó en
el mismo disolvente a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. La
elusión del material se monitoreó a una longitud de onda de 280
nm durante 72 min. Se realizaron varias corridas cromatográficas
y las fracciones con tiempos de retención similares se colectaron
y se unieron, se dializaron y se calculó la concentración como se
describe previamente. La separación y obtención de las fracciones
de veneno se realizaron a temperatura ambiente.
Determinación de las masas moleculares relativas: para la determinación de las masas moleculares relativas
se empleó un estuche comercial (Amersham Pharmacia Biotech)
conteniendo: ribonucleasa A (13.7 kDa), quimotripsinógeno (25
kDa), ovoalbúmina (43 kDa), albúmina (67 kDa) y azul dextrana
2000 y se corrieron en las mismas condiciones que el veneno. A
partir de los tiempos de retención y las masa moleculares conocidas se construyó una curva patrón para determinar las masas
moleculares relativas de las diferentes fracciones de proteínas obtenidas durante la cromatografía.
Electroforesis en geles de poliacrilamida: las
muestras del veneno y las fracciones se analizaron en electroforesis de proteínas en condiciones no reductoras, a un 16% de
gel separador y 4% del gel concentrador y se corrieron en una
cámara de electroforesis (Biorad, Mini-PROTEANR ll) [9]. En cada
pocillo se adicionó una cantidad equivalente a 50 μg de veneno
y 10 μg de cada fracción. El peso molecular se estimó por marcadores de peso molecular intermedio, corridos en paralelo con
las muestras. La corrida se realizó a 120 V; 400 mA durante 2 h.
El gel se coloreó con Coomasie Blue G-250 (Sigma) y se empleó
una solución de destinción para visualizar las bandas de proteínas.
Líneas celulares: en el estudio se emplearon tres líneas celulares tumorales: Hela, (ATCC CCL-2; carcinoma de cérvix humano); Hep-2, (ATCC CCL-23; carcinoma epidermoide
de laringe humano); NCI-H292, (ATCC CRL-1848; carcinoma
de pulmón) y la línea diploide MRC-5, (ATCC CCL-171; fibroblastos humano de pulmón). Las líneas celulares Hela, Hep-2
y MRC-5 se crecieron en frascos de cultivo en medio mínimo
esencial (MEM, Sigma), suplementados con 2 mM de glutamina y
aminoácidos no esenciales y 10% de suero fetal bovino (SFB). La
línea NCI-H292 se creció en medio RPMI-1640 (Sigma) suplementado con 2 mM de glutamina y 10% SFB. Cada una se incubó
en atmósfera húmeda a 37°C a 5% de CO2 hasta formación de
monocapa. Cada línea celular se desprendió por tratamiento con
una solución al 0.25% tripsina y se prepararon a concentración de
2 x 105 células/mL.
Ensayo de citotoxicidad: el efecto del veneno se detectó por el método de Mosmann [10]. El ensayo se realizó en
placas de poliestireno de fondo plano de 96 pozos, para cultivos
celulares (Corning Inc. costarR). En cada pozo se adicionó 50 µL
de cada línea celular y se incubaron en atmósfera de 5% CO2 a
37°C durante 24 h. Al cabo de este tiempo se adicionaron 50 µL
de medio de cultivo correspondiente a cada línea celular, con el
veneno previamente disuelto, para quedar a concentración final
[
de 0.25, 0.5, 0.75 y 1 mg/mL en cada pocillo. El efecto de las
fracciones se evaluó en las células Hela, NCI-H292 y MRC-5.
La concentración final de las fracciones se determinó a partir del
por ciento que representa cada una en el veneno. Todas las líneas
celulares quedaron a concentración final de 104 células/pozo y el
SFB se empleó en el medio al 10%.
Las placas se incubaron nuevamente en atmósfera de 5%
CO2 a 37°C durante tres días. Al cabo de este tiempo se adicionaron 10 µL de una solución estéril de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-25difenil tetrazolio (MTT) (Sigma) a 5 mg/mL en solución tampón fosfato estéril, en cada pozo y se incubaron bajo las
mismas condiciones durante 3 h. Finalmente se adicionó 100 µL/
pozo de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) y se incubaron durante
10 min. La absorbancia se determinó en un lector de microplacas
de ELISA MRX Revelation Dynex Technologies a una longitud de
onda de 560 nm con 630 nm como referencia. Cada concentración se realizó por triplicado y el ensayo se repitió tres veces.
Las curvas de concentración-respuesta se obtuvieron
graficando la absorbancia versus las diferentes concentraciones de
veneno. La citotoxicidad se expresó como la CC50, la concentración del veneno que causa el decrecimiento del 50% en el
número de células viables (absorbancia del MTT) comparada con
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
controles no tratados. Los valores de CC50 del veneno y las fracciones se determinaron a partir de las curvas de concentraciónefecto (% proliferación celular) a través del análisis de regresión
lineal, empleando el paquete estadístico GraphPad Prism versión
4.03 (GraphPad Software, Inc.).
Apoptosis: para análisis de la fragmentación del ADN,
las líneas celulares Hela, Hep-2, NCI-H292 se cultivaron en placas de 12 pozos y se incubaron a 37°C, 5% CO2 durante 24 h en
atmósfera húmeda. Al cabo de este tiempo se aplicaron 0.5 mg/
mL en cada línea celular y se incubó en las mismas condiciones
durante 48 h y se utilizaron como controles, pozos cultivados
con las líneas celulares, sin veneno. El ADN se extrajo a las 24 h y
48 h, utilizando el sistema de purificación WisardR Genomic DNA
Purification Kit (Promega)11. El ADN extraído se corrió en una
electroforesis submarina a 70 V, 30 mA durante 1-2 h empleando
la agarosa a 1.2 %.
Análisis estadístico: todos los datos se analizaron para
distribución normal. Se realizó el análisis de varianzas (ANOVA)
seguido de un test de Rangos Múltiples de Duncan empleando
el paquete estadístico GraphPad Prism versión 4.03 (GraphPad
Software, Inc.). En todos los casos se consideró la diferencia significativa para p< 0.05.
EL VENENO DE ESCORPIÓN SE HA EMPLEADO,
EN LA MEDICINA TRADICIONAL,
PARA EL TRATAMIENTO
DEL CÁNCER
LABI OFAM
RESULTADOS
Cromatografía de exclusión molecular: en la figura 1 se
muestra el cromatograma del veneno y las fracciones obtenidas.
El veneno eluyó durante 72 min a una velocidad de flujo constante de 0.5 mL/min monitoreado a 280 nm. El perfil cromatográfico
mostró un rango de elusión desde los 19 min hasta los 72 min. La
fracción FI representa la unión de proteínas desde 14 kDa hasta
70 kDa. Los perfiles cromatográficos tuvieron como promedio
ocho picos. Las fracciones FII, FIII y FIV mostraron masas moleculares relativas de 8 kDa, 4 kDa y <3 kDa respectivamente.
Electroforesis en geles de poliacrilamida: la figura 2
muestra el patrón electroforético del veneno y las fracciones obtenidas en cromatografía de gel filtración. La electroforesis mostró la
presencia de dos bandas definidas a los 45 kDa, 66 kDa y 29 kDa.
La banda mayoritaria se localizó debajo de los 14 kDa, mostrando
que el contenido mayoritario del veneno es de proteínas de bajo
peso molecular. La fracción F-I mostró un patrón electroforético
similar al del veneno completo. Las fracciones F-II, F-III y F-IV mostraron una única banda por debajo de los 14 kDa, lo que evidencia
que se corresponden con proteínas de bajo peso molecular.
15
Figura 1. Perfil cromatográfico del veneno del escorpión Rhopalurus
junceus separado mediante CLBP. El fraccionamiento se realizó empleando una columna de exclusión molecular superdex 75 HR 10/30.
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
M
V
FI
FII
]
FIII
FIV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
94 kDa
67 kDa
43 kDa
30 kDa
20 kDa
23.130pb
9.416pb
6.557pb
4.361pb
14 kDa
2.322pb
2.0.27pb
Figura 2. Electroforesis de proteínas del contenido total del veneno
del escorpión Rhopalurus junceus y de las fracciones. La corrida se
realizó a un 16% de gel separador. M) marcador de masas moleculares (14 kDa-97 kDa). V) veneno total. FI, FII, FIII, FIV) Fracciones
obtenidas en CLBP.
L ABI O FAM
Citotoxicidad: la evaluación de la actividad citotóxica
del veneno se realizó en tres líneas celulares tumorales y una línea
diploide de pulmón humano.
Los resultados evidenciaron que el veneno afectó significativamente (p<0.05) el crecimiento de las células tumorales
con respecto a la célula normal (tabla 1). Las fracciones obtenidas
se agruparon en 4 grupos y se evaluaron en las líneas celulares
Hela y NCI-H292 y MRC-5. F-I mostró mayor toxicidad para
MRC-5 mientras F-II mostró similares niveles de sensibilidad para
las tres líneas celulares. La fracción F-III evidenció una inhibición
significativa del crecimiento de las células tumorales (p<0.05) con
respecto a la célula normal, similar a lo observado para el veneno
completo. La fracción F-IV solo evidenció CC50 significativamente
16
Figura 3. Electroforesis en geles de agarosa (1.2 %), del ADN extraído de las líneas celulares tumorales. 1) Marcador de peso molecular
Lambda DNA /Hind III. 2-4) ADN línea celular Hela; 2: ADN control
sin veneno, 3: ADN extraído a las 24h, ADN extraído a las 48h. 5-7)
ADN línea celular NCI-H292; 2: ADN control sin veneno, 3: ADN
extraído a las 24h, ADN extraído a las 48h. 8-10) ADN línea celular
HEp-2; 2: ADN control sin veneno, 3: ADN extraído a las 24h, ADN
extraído a las 48h.
inferiores (p<0.05) a la de la célula normal para las células NCIH292 (tabla 1). En todos los casos (veneno, FIII, FIV) la línea celular NCI-H292 resultó la más sensible.
Apoptosis: la inducción de apoptosis, debido al efecto del veneno, se observó por el patrón de fragmentación del
ADN (figura 3). En las tres líneas celulares se observó el evento de
apoptosis como mecanismo de muerte celular, incrementándose en la medida que aumentó el
tiempo de incubación con el veCC50 (mg/mL)
neno. Esto indica que a mayores
MUESTRAS
Tr (min)
Ap/At (%) MR (kDa)
tiempos de incubación un mayor
Hela NCI-H292 MRC-5 Hep-2
número de células mueren por
VENENO
1.05*
0.68*
2.2
0.78*
este evento.
FI
20.36-37.58
60
72-14
0.83
0.42
0.24
El cambio morfológico
ocurrido en la línea celular tumoFII
49.52
16
8
0.20
0.25
0.27
ral Hela, debido a la toxicidad del
FIII
54.64
9
4
0.14*
0.11*
0.44
veneno, se observa en la figura
FIV
58.82
12
<3
0.82
0.28*
0.61
4. El cultivo formó una monocapa homogénea en el control sin
Tabla 1. Valores de la CC50 del veneno y las fracciones para las líneas celulares evaluadas. Se presentan el
veneno (figura 4A). La aplicación
rango de los tiempos de retención, las proporciones de cada fracción en el veneno y los pesos moleculares
relativos. Tr: tiempo de retención; Ap/At: Área de los picos/Área total; MR: masas moleculares relativas obdel veneno a bajas concentraciotenidas a partir de una curva de calibración de Tr versus masa molecular de proteínas de masa molecular
nes provocó pérdida de la morconocida.*p<0,05 diferencia estadísticamente significativa comparada con la línea celular MRC-5.
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
Figura 4. Efecto del veneno del escorpión Rhopalurus junceus, sobre
la línea celular Hela, a diferentes concentraciones. A) Línea celular
sin la aplicación del veneno. Monocapa homogénea morfología
característica. B) 0.5 mg/mL de veneno. C) 0.75mg/mL de veneno. D)
1mg/mL de veneno.
DISCUSIÓN
En este trabajo se realizó la caracterización parcial del veneno del
escorpión cubano Rhopalurus junceus. Los resultados de la electroforesis de proteínas evidenciaron la presencia de bandas de
proteínas entre los 29 kDa y los 67 kDa fundamentalmente y una
banda por debajo de los 14 kDa lo que se corresponde con otros
trabajos sobre venenos de escorpión en los que el contenido mayoritario es de proteínas de bajo peso molecular [12,13]
El veneno total y las fracciones F-III y F-IV evidenciaron
una citotoxicidad significativa y diferencial hacia las células tumorales. La fracción FIV solo evidenció toxicidad significativa hacia
NCI-H292. Los principios activos presentes en la fracción FIII
que provocan reducción significativa de la viabilidad celular en
Hela podrían estar en menor concentración o no estar presente
en la fracción FIV. Por otro lado, la elevada sensibilidad de la línea
celular NCI-H292 en todos los casos (veneno, FIII, FIV) podría
deberse a que más de un componente presente en el veneno
de escorpión es capaz de actuar sobre estas células. Las fracciones FIII y FIV mostraron masas moleculares relativas menores
de 4 kDa. Los venenos de escorpión contienen proteínas con
masas moleculares por debajo de los 8 kDa y son consideradas
toxinas [13]. La acción fisiológica de estas toxinas se ejerce fundamentalmente sobre canales iónicos, presentes en las membranas
celulares de mamíferos e insectos y algunas son específicas para
cada especie [14,15]. En el cáncer, en algunos tipos de tumores
la proliferación, migración y la invasividad están relacionadas con
la sobreexpresión en las membranas celulares de canales ióni-
cos [16] y receptores celulares [17]. El bloqueo de la actividad
fisiológica de estos canales iónicos y receptores, inhibe la proliferación y la migración de estas células [18]. La elevada afinidad
del veneno de algunos escorpiones por estos canales iónicos y
el aumento en la densidad de estos canales en las membranas
de las células tumorales, posibilitan que exista una mayor selectividad y por tanto mayor toxicidad, hacia estas células [19]. Esta
característica podría estar relacionada con la toxicidad diferencial
del veneno y las fracciones F-III y F-IV, sobre las líneas celulares
analizadas.
El evento de apoptosis se detectó en las líneas celulares
tumorales. La ocurrencia de la degradación de ADN, a partir de
las 24 h de incubación, en Hela indicó que esta línea celular es
más susceptible de desarrollar apoptosis. Las mayores concentraciones del veneno provocaron aumento del volumen celular y
elevada picnosis lo que podría indicar presencia de necrosis. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos por Omran M.A.A. [20]
quien utilizando el veneno del escorpión L. quinquestriatus, sobre las líneas celulares eucarióticas 293T y C2C12, en diferentes
concentraciones, observó que sólo en una subpoblación del total
de células ocurrió el evento de apoptosis y en la población restante estuvieron implicados otros eventos entre ellos la necrosis.
Otros autores coinciden en señalar que existe una doble vía que
conduce a la muerte celular. Una caracterizada por el evento de
apoptosis y la otra por la necrosis, la cual en condiciones normales
es enmascarada por la primera [21,22].
L ABI OFAM
fología celular típica y ruptura de la monocapa. El aumento de
las concentraciones de veneno provocó cambios celulares relacionados con el alargamiento de las células e irregularidad de los
bordes celulares (figura 4B). Las mayores concentraciones provocaron destrucción total de la monocapa celular, fusión de las
membranas celulares y formación de grandes vacuolas por unión
del contenido citoplasmático de varias células y la formación de
cincitios. También se observaron células con aumento del volumen así como células necróticas con picnosis y restos celulares en
el medio de cultivo (figura 4C, 4D).
17
[ [N PO RMOB DR U
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]
CONCLUSIÓN
En este trabajo el veneno del escorpión Rhopalurus junceus, evidenció una significativa toxicidad sobre células tumorales de origen epitelial. Adicionalmente sus fracciones de masa molecular inferior a 4 kDa, demostraron similar citotoxicidad sobre este tipo celular. Aunque
este trabajo no estuvo dirigido a la identificación de dianas celulares, el hecho de que exista una estrecha relación entre los canales
iónicos y la proliferación tumoral, metástasis, migración e invasividad y que los péptidos presentes en los venenos de escorpión podrían
sugerir que los principios activos del veneno de Rhopalurus junceus actúen de igual forma. Posteriores estudios deben ser dirigidos a la
determinación de los principios activos y su relación con los canales iónicos.
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Evaluación de la seguridad
toxicológica del polvo
de pseudotallo
de Musa paradisiaca:
Suplemento nutricional
María R. Pérez1*
Gregorio Martínez2
Olga S. León2
José A. Fraga1
Leyanis Durán2
Dayné Horta2
Toxicological security of pseudostem
powder Musa paradisiaca:
Nutritional Supplement
ACITAN®
20
1
Grupo Empresarial de producciones Biofarmaceúticas y Químicas, LABIOFAM.
2
Universidad de La Habana, Instituto de Farmacia y Alimentos, Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas.
* María Regla Pérez Capote, E-mail: [email protected] ó [email protected]
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
El pseudotallo Musa paradisiaca posee una variada y rica composición en oligoelementos, nutrientes, compuestos fenólicos, así
como fibra dietética como su componente mayoritario. A partir del mismo se ha desarrollado un suplemento nutricional denominado ACITAN. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la toxicidad aguda oral y el potencial irritante en la mucosa
oral. Se realizó un estudio de dosis límite por vía oral (5000 mg/kg) y un estudio sobre irritabilidad de la mucosa oral a dosis
repetidas. Al concluir el período de observación, se tomaron muestras para estudio hematológico e histopatológico. La administración oral del ACITAN no provocó alteraciones en la ganancia normal de peso corporal, así como tampoco en las variables
hematológicas ni en el estudio histopatológico a los órganos examinados, no produce letalidad ni signos de toxicidad por lo
que se ubica en la categoría toxicológica Sin Clasificar. Se obtuvo un índice de irritación de la mucosa oral igual a 1, que lo
clasifica como irritante mínimo.
Palabras clave. ACITAN, irritación, toxicidad
Musa paradisiaca pseudostem is composed by rich and varied trace elements, nutrients, phenolic
compounds and, mostly, dietetic fiber. Therefore, ACITAN has been developed as a nutritional
supplement using this element. This research is aimed at the evaluation of oral sharp toxicity and
irritability potential on oral mucuos.
Thus, studies on oral dose limits (5000 mg/kg) and oral
mucuos irritability with repeated dosage were carried out. Samples of hematological and histopathological studies were taken once the observation period was over. The oral administration of
ACITAN produced no disorders on normal weight gaining, hematological variables or histopathological studies in organs under consideration. It is concluded that the oral administration
of ACITAN with a 5000 mg/kg dose does not present lethal effects or toxicity signs. Therefore,
toxicologically, it is unclassified. As to irritability on oral mucuos, rate value was 1, classifying as
a minimum degree.
Keywords: ACITAN, irritability, toxicity.
ingredientes farmacéuticos descontinuados, y potencialmente
podrían ser perjudiciales para los consumidores que los ingieran
[5-7]. Para garantizar el uso seguro y la calidad de los mismos, la
FDA, recientemente ha dictado regulaciones de buenas prácticas
de manufactura para los suplementos nutricionales [8].
Desde el punto de vista investigativo las plantas son una
fuente importante de productos biológicamente activos, muchos
de los cuales han servido de modelos para la síntesis de un gran
número de fármacos, de ahí que la investigación de las mismas
haya propiciado importantes avances en la terapéutica de variadas
enfermedades [9].
Por otra parte, las fibras dietarias son partes de frutas,
vegetales, granos, nueces y legumbres que no pueden ser digeridos por los seres humanos. Mejoran la absorción de nutrientes,
LABI OFAM
E
n la alimentación humana hay nutrientes esenciales que
son el motor básico de nuestro metabolismo, sin los
cuales no es posible una mínima nutrición. Sin embargo,
es necesario adicionar, otros muchos ingredientes que
permiten un mejor estado de salud, y para ello se han diseñado
diversas formulaciones o incorporado fuentes de origen natural
en diferentes presentaciones, para suplir el déficit de algunos nutrientes deviniendo estos en suplementos nutricionales.
El empleo de suplementos nutricionales ha experimentado un incremento considerable en años recientes [1-4]. Han
comenzado a ser importantes y comúnmente utilizados por consumidores bajo propia decisión para lograr regímenes de salud
adecuados. Un gran número de suplementos dietéticos destinados a diferentes beneficios han sido ilegalmente adulterados con
21
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
favorecen el tránsito gastrointestinal y pueden ayudar a reducir el
riesgo de enfermedades cardiovasculares, colesterol, prevenir el
cáncer, entre otros [10].
La Musa paradisiaca (Musácea) conocida comúnmente
como plátano está ampliamente distribuida en diversas regiones.
Tradicionalmente sus frutos han sido utilizados como alimento. El
pseudotallo de la planta posee una variada y rica composición en oligoelementos, compuestos polifenólicos, fibra dietética (50%) siendo
este su mayor aporte con valor nutricional [11], los cuales le adjudican
al mismo una marcada actividad antioxidante [12]. Han sido reportados una gran variedad de efectos biológicos a los polifenoles de
la dieta, entre los que se incluyen anticancerígenos, antioxidantes y
antinflamatorios. Existen evidencias que apoyan la hipótesis de que los
polifenoles de la dieta pueden tener efecto protector y un potencial
terapéutico en el daño oxidativo relacionado a las patogenias [13].
El polvo de pseudotallo de Musa paradisiaca, en lo adelante ACITAN, constituye un suplemento nutricional [14]. Para
introducir un nuevo agente en la práctica médica es de obligatorio
cumplimiento la realización de ensayos toxicológicos que garanticen la inocuidad del producto desde el punto de vista tóxico, así
como el establecer un margen de seguridad para su empleo.
Evaluar la toxicidad aguda por vía oral, así como el potencial irritante sobre la mucosa oral y la aparición de signos de toxicidad tras la administración del ACITAN, teniendo en cuenta que
ésta es la vía de elección por la cual se administra este producto,
constituyeron los objetivos de este trabajo.
ACITAN
suplemento nutricional
EL POLVO DE PSEUDOTALLO DE MUSA PARADISIACA CONSTITUYE
LABI OFAM
UN SUPLEMENTO NUTRICIONAL
22
Datos de la muestra en ensayo
La muestra en ensayo fue producida y facilitada por los laboratorios LABIOFAM (C. Habana, Cuba) y empleada en todos los
estudios reportados en este documento. Reunía los requisitos de
calidad química y microbiológicos establecidos por el fabricante.
Animales de experimentación
Se emplearon ratones OF1 (20±2g) de ambos sexos y Hámster
Sirio dorados machos (60±2g) suministrados por el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB,
La Habana, Cuba). Se mantuvieron siete días antes del ensayo y
durante el mismo bajo las mismas condiciones experimentales,
a una temperatura de 20±2ºC, humedad relativa de 70±5%,
con libre acceso al agua y los alimentos. Ciclo de luz-oscuridad
12 x 12 h.
Toxicidad Aguda
Inicialmente se realizó un estudio exploratorio para determinar
la dosis del ensayo, donde se valoraron las dosis propuestas por
metodología de la Organización para la cooperación económica y
el desarrollo (OECD) [15] (50, 300 y 2000 mg/kg), no se observaron muertes en las primeras 24 h por lo que se decidió realizar
el ensayo a una dosis límite de 5000 mg/kg, a la cual tampoco se
observaron muertes y estos animales fueron monitoreados durante 14 días
El procedimiento empleado estuvo en correspondencia
con los principios de buenas prácticas de laboratorio como se
plantea en el procedimiento por “pasos” descrito en el ensayo
alternativo de la Clase Tóxica Aguda de la OECD No 423 [15].
El ACITAN fue preparado previo a la administración para
lo cual se suspendió en CMC 0.5% en agua para obtener una
concentración final de 500 mg/mL. A los animales se les retiró el
alimento (sólo acceso al agua) 18 h antes de la administración de la
sustancia de ensayo y se suministró pasadas 3 h de la inoculación.
Se emplearon ratones OF1 de ambos sexos distribuidos
en dos grupos experimentales de seis ratones cada uno: control
negativo (CMC 0.5%) y tratado con ACITAN a una dosis de 5000
mg/kg. El ACITAN se administró, por vía oral, y se administró un
volumen constante a razón de 2 mL/100 g de peso corporal mediante canulación intragástrica al igual que la CMC del grupo control.
Observaciones
Los animales fueron observados diariamente dos veces al día
durante los 14 días posteriores a la administración con especial
[
atención durante las primeras 24 h, para evaluar mortalidad y
morbilidad. Se examinó el desarrollo de signos de toxicidad (cambios en el pelo, ojos, membranas mucosas, sistema respiratorio,
circulatorio, SNA, SNC, la actividad somatomotora y el comportamiento de reflejos corneal, pineal y flexorhomolateral), control
de la temperatura, así como el peso corporal de cada uno de los
animales al inicio, siete y 14 días del ensayo.
Al finalizar el período de observación todos los animales se sacrificaron por dislocación cervical, según la metodología
descrita para la especie [16] fueron necropsiados y los órganos
(estómago, corazón, pulmón, riñón, hígado, bazo, timo, cerebro,
glándulas suprarrenales, ovarios y testículos) evaluados macroscópicamente de acuerdo a coloración, tamaño y textura.
Las muestras de sangre para la bioquímica sanguínea
fueron extraídas por el plexo retro orbital bajo condiciones de
anestesia. Se empleó EDTA como anticoagulante. Los parámetros
evaluados incluyeron: conteo de eritrocitos, conteo total de leucocitos, hemoglobina, hematocrito, conteo de plaquetas.
Anatomía patológica
La necropsia incluyó una examinación macroscópica de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios, la cavidad craneal, cavidad nasal, cavidades pélvicas y víscera; así como estudio
histopatológico de algunos órganos que fueron colectados de los
animales después de la necropsia y fijados en solución de formaldehído buferado y se procesaron según la técnica convencional
de inclusión en parafina, para colorear con hematoxilina-eosina
y evaluar por microscopía óptica (estómago, corazón, pulmón,
riñón, hígado, bazo, timo, cerebro, glándulas suprarrenales, ovarios y testículos).
Irritabilidad de la mucosa oral. Estudio a dosis repetida
Se emplearon Hámster sirios dorados distribuidos en dos grupos
experimentales (control y tratado con ACITAN) de tres animales
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
cada uno, evaluados según lo establecido por las normas ISO/DIS
10993-10:2002 [17].
Procedimiento experimental
El pellet de algodón se embebió en la solución de ACITAN (500
mg/mL, suspendido en CMC 0.5%) y CMC para el grupo control, se colocó en la bolsa gular, reteniéndose con un collar de
gasa. El pellet estuvo expuesto durante 24 h, posteriormente se
retiró, se lavó la bolsa con solución salina fisiológica (SSF), se observó macroscópicamente y se volvió a colocar un pellet nuevo.
El procedimiento se repitió durante cinco días consecutivos. Se
controló el peso de los animales antes y al final del estudio.
Evaluación del daño
La apariencia macroscópica de las bolsas se evaluó determinando
el grado de irritación para eritema de acuerdo a la siguiente escala:
no eritema: 0, muy ligero eritema: 1, moderado eritema: 2, eritema bien definido: 3 y severo eritema: 4 [18].
Al concluir la última exposición los animales fueron sacrificados en atmósfera de éter, según la metodología descrita
para la especie [16], las bolsas gulares extraídas y fijadas en formol
neutro, buffer al 10% y se procesaron según la técnica convencional de inclusión en parafina, para colorear con hematoxilinaeosina y evaluar por microscopía óptica teniendo en cuenta los
parámetros: edemas, la reacción al epitelio, congestión vascular
e infiltración leucocitaria como criterio de cambios estructurales
y determinar así, el Índice de Irritación Oral (IIO). Este resultado
fue contrastado en la tabla de clasificación para establecer así la
aprobación o rechazo de la sustancia de ensayo. (tabla 1)
Análisis estadístico
Los resultados son expresados la media ± DS. Los datos del peso
corporal, hematología y peso de los órganos (peso absoluto y
peso relativo) fueron chequeados por el test t Student. Valores de
p<0.05 fueron considerados significativos.
CLASIFICACIÓN
ESCALA
ACEPTACIÓN
No irritante
0
Aprobar
Irritante mínimo
1-4
Aprobar
Irritante medio
5-8
Aprobar
Irritante moderado
9-11
Rechazar
Irritante severo
12-16
Rechazar
LABI OFAM
Tabla 1. Clasificación de las sustancias de acuerdo al Índice de irritación oral.
23
ACITAN
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
LAS PLANTAS SON UNA FUENTE IMPORTANTE DE PRODUCTOS
Evaluación de los reflejos, la temperatura y coordinación motora
No hubo modificaciones sobre el sistema sensorial en los animales tratados con respecto a los controles cuando se observa el
comportamiento de las variables: estímulo pineal, corneal, flexorhomolateral. En la tabla 2 se muestran los resultados correspondientes a la temperatura rectal y coordinación motora, donde se
evidencia que no hubo diferencias estadísticas significativas respecto al grupo control, los resultados son similares para ambos sexos.
Los valores representan la media ± DE (n= 5).
Estudio hematológico
Los resultados se muestran en las tablas 3 y 4 respectivamente. A excepción de los siguientes eventos: hemoglobina de las
hembras tratadas fue significativamente menor respecto al control
(p<0.001); conteo diferencial de leucocitos, incremento significativo en los neutrófilos en ambos sexos, machos (p<0.001),
hembras (p<0.05); en machos aumentaron significativamente los
Control
Control
ACITAN
35
ACITAN
35
30
30
Peso corporal (g)
24
RESULTADOS
Toxicidad aguda Oral
No se observó mortalidad seguido de la administración oral de
5000 mg/kg de ACITAN durante las dos semanas de observación.
Durante la observación diaria de la ocurrencia de signos tóxicos
sobre los diferentes sistemas (autonómicos, conductual, sensorial,
neuromuscular, cardiovascular, respiratorio, ocular, gastrointestinal, genito-urinario, cutáneo) no aparecieron signos tóxicos en los
grupos tratados durante el período de ensayo.
Comportamiento del peso corporal
No se encontraron diferencias significativas (p≥0.05) entre el
peso corporal inicial y final de los ratones tratados con ACITAN
y los ratones controles (figura 1 y figura 2). El balance acumulativo en gramos del peso corporal con respecto al peso inicial
de los animales se comportó de modo similar en los grupos de
igual sexo (hembras controles 4.2±0.8 g y tratadas 3.9±0.9 g;
machos controles 7.6±0.6 g y tratados 8.67± 0.7 g), lo cual es
indicativo de la no ocurrencia de alteraciones en este parámetro.
Peso corporal (g)
LABI OFAM
BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS
25
20
15
10
25
20
15
10
5
5
0
0
T0
T7
T14
Tiempo de ensayo (días)
Figura 1. Curva ganancia de peso corporal de ratones machos
tratados por vía oral con ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg.
Ratones OF 1. Los valores representan la media ± DE (n=5).
T0
T7
T14
Tiempo de ensayo (días)
Figura 2. Curva ganancia de peso corporal de ratones hembras
tratados por vía oral con ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg.
Ratones OF1. Los valores representan la media ± DE (n= 5).
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
Tabla 2. Efecto de la administración oral de ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg sobre la temperatura rectal y la coordinación motora
hasta los 14 días.
MACHOS
HEMBRAS
VARIABLES
GRUPO
VALOR MEDIO
GRUPO
VALOR MEDIO
Temperatura
Rectal (oC)
ACITAN
36.1 ± 1.0
ACITAN
36.0 ± 0.9
Control
36.2 ± 0.9
Control
36.5 ± 1.1
Coordinación
Motora (min)
ACITAN
> 3.0 ± 0
ACITAN
2.71 ± 0.4
Control
> 3.0 ± 0
Control
> 3.0 ± 0
monocitos (p<0.001) y los basófilos (p<0.05), no ocurrieron alteraciones significativas en los parámetros hematológicos. Estos
valores se encuentran dentro de los límites fisiológicos establecidos para la especie [19, 20].
Estudio anatomopatológico
La necropsia y el estudio histopatológico no reflejaron ningún
daño en los órganos examinados. Los órganos (corazón, pulmones, timo, hígado, riñones, bazo, órganos reproductores (ovarios/
testículos), adrenales) examinados macroscópicamente no evidenciaron alteraciones patológicas en los animales administrados
oralmente con el ACITAN, comportándose en todos los casos
igual al control.
En la tabla 5 se pueden apreciar los cocientes de peso
de los órganos (bazo, adrenales, riñones, hígado, pulmones)/ peso
corporal. Para estas variables no se evidenciaron diferencias significativas (p>0.05) entre los grupos tratados y controles a los 14 días.
Basándonos en todos estos resultados y bajo las condiciones en las que se efectuó el estudio no es posible estimar una DL50
tras la administración en ratones OF1 por vía oral, lo que presupone
que ésta es superior a la dosis límite 5000 mg/kg de peso corporal.
Tabla 3. Efecto de la administración oral de ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg sobre parámetros hematológicos a los 14 días.
MACHOS
PARÁMETROS
HEMBRAS
ACITAN
CONTROL
ACITAN
CONTROL
1073 ± 170
1401 ± 145
1198 ± 359
1232 ± 410
—
—
3921 ± 194
4109 ± 201
Hemoglobina (mmol/L)
18.71± 4.07
21.07 ± 5.56
13.14 ± 2.64**
16.54 ± 5.80
Hematocrito (%)
47 ± 5
49 ± 4
55 ± 5
38 ± 2
Glóbulos rojos
(cel x103/mm3)
Glóbulos blancos
(cel x103/mm3)
MACHOS
LABI OFAM
Tabla 4. Efecto de la administración oral de ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg sobre las poblaciones de leucocitos a los 14 días.
HEMBRAS
PARÁMETROS
ACITAN
CONTROL
ACITAN
CONTROL
Neutrófilos
4 ± 2*
3±2
3 ± 2*
0±0
Eosinófilos
0±0
0±0
0±0
0±0
Monocitos
1±1
1±1
0±0
0±0
Basófilos
3± 2**
1±0
0±0
0±0
Linfocitos
91 ± 6
94 ± 3
90 ± 6
94 ± 3
Los valores representan la media ± DE (n=5), * diferencia estadística significativa respecto al control (p<0,05), ** p< 0,001.
25
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
Tabla 5. Efecto de la administración de ACITAN a una dosis única de 5000 mg/kg en términos relativos (g/peso corporal (g)) de peso de órganos los 14 días.
PESO DE LOS ÓRGANOS/ PESO CORPORAL(X 10-3)
SEXO
MACHOS
HEMBRAS
ÓRGANOS/
TRATAMIENTO
ACITAN
CONTROL
ACITAN
CONTROL
Bazo
4.0 ± 0.001
3.0 ± 0
3.8 ± 0.001
4.1 ± 0.001
Adrenales
0.7 ± 0
0.4 ± 0
0.6 ± 0
0.6 ± 0
Riñones
11.0 ± 0
12.0 ± 0
16.0 ± 0.001
16.0 ± 0.001
Hígado
45.0 ± 0.01
44.0 ± 0
55.0 ± 0.01
52.0 ± 0.006
Pulmones
7.0 ± 0
6.9 ± 0
7.6 ± 0.002
6.0 ± 0.001
LABI OFAM
Irritabilidad mucosa oral
26
cador importante del estado general de los animales, fue normal
Durante el estudio los animales no mostraron signos clínicos de
y similar al grupo control.
alteración patológica y mantuvieron un acceso normal al agua y
Discusión general
alimentos.
Para velar por la seguridad de los preparados medicinales se esLa tabla 6 muestra el comportamiento del peso corporal
tablecen regulaciones internacionales, que exigen amplias investide los animales al final del ensayo. La variación de esta variable para
gaciones fármaco-toxicológicas en animales de experimentación
los animales tratados con ACITAN durante los cinco días de estudio
antes de iniciar su aplicación en seres humanos. En Cuba no se
fue similar al grupo empleado como control (p≥0.05), no afectánha escapado al influjo de esta tendencia y dentro del Programa
dose la ganancia normal del peso corporal en los animales tratados.
Nacional de Medicina Natural y Tradicional del Ministerio de Salud
La observación macroscópica de la apariencia de la bolPública (MINSAP), se establece la promoción del uso correcto de
sa gular y el grado de reacción de la superficie en ésta, para erilas plantas medicinales científicamente validadas [21].
temas, no mostró alteraciones después de cada aplicación con el
En el presente trabajo se evaluaron en ensayos de priACITAN. Por otro lado, en el estudio histológico no se observamera barrera los posibles efectos tóxicos que podía provocar la
ron modificaciones de gran interés entre los grupos evaluados en
administración oral del ACITAN.
el ensayo (control y ACITAN). En la tabla 7 se muestra el índice de
Un indicador importante en la determinación de la
irritabilidad de la mucosa oral tanto individual como comparado,
toxicidad de cualquier sustancia lo constituye la determinación
determinados según la clasificación microscópica para la reacción
de manifestaciones clínicas, ya que es posible determinar daños
del tejido de la mucosa oral.
asociados a lesiones en sistemas de órganos, que traen por resulEl índice de irritación comparado(IIC) calculado para el
tado alteraciones en sus funciones. Además se plantea que toda
ACITAN, al contrastarlo con el valor de la tabla de clasificación essustancia tóxica produce alteraciones anatomofisiológicas que se
tablecida como patrón para la aprobación o rechazo de las sustanmanifiestan en modificaciones en el cuadro clínico general, y estas
cias permitieron clasificar a ese producto como irritante mínimo
dependen de la severidad y extensión de la lesión, así como de
de la mucosa oral(IIC=1) (Tabla 7).
En la evaluación macroscópica realizada
durante los días de tratamiento no se evidencia- Tabla 6. Comportamiento del peso corporal.
ron cambios relevantes a nivel de la mucosa. No
COMPORTAMIENTO PESO CORPORAL (g)
obstante, las ligeras alteraciones que dieron lugar al
resultado del estudio histológico de la mucosa, no
interfirieron en el comportamiento normal de los
animales tratados con el producto. Además desde
el punto de vista clínico no se apreciaron alteraciones patológicas; la ganancia de peso corporal, indi-
GRUPO
PESO INICIAL
PESO FINAL
Control
56.45 ± 3.45
73.03 ± 3.2
ACITAN
57.52 ± 6.21
71.54 ± 6.7
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
los animales mantuvieron una
apariencia normal corresponÍNDICE DE IRRITACIÓN
diente a su especie. Por otra
GRUPO
CLASIFICACIÓN
parte, en las mediciones de
INDIVIDUAL
COMPARADO
los reflejos flexorhomolateControl
3
—
—
ral, pineal, corneal (indicativo
ACITAN
4
1
Mínima
de las funciones sensoriales y
motoras), no se apreciaron
modificaciones sobre el mislos sistemas de órganos involucrados, duración de la exposición,
mo en los animales tratados con respecto a los controles.
cantidad total de la sustancia en sangre, edad y salud general del
El análisis de los parámetros de la sangre constituye una
animal [22].
evaluación de riesgo relevante, algún cambio en el sistema heEn el ensayo y evaluación de las características tóxicas
matológico tiene un elevado poder predictivo para la toxicidad
de una sustancia, la determinación de la Toxicidad Aguda, según
humana, cuando los datos son extrapolados desde los estudios en
la vía de administración propuesta en humanos, constituye un
animales. Las variaciones que tuvieron lugar tras la administración
paso inicial que provee de información sobre los posibles daños
oral de ACITAN no tienen importancia desde el punto de vista
a la salud que pueden surgir de una exposición a corto plazo de
biológico, ya que los valores están dentro de los intervalos noresa sustancia [23]. El peso corporal, parámetro más sensible para
males para la especie [19,26].
mostrar un efecto adverso, constituye un indicador importante de
Los resultados del estudio de toxicidad aguda indican que
las alteraciones fisiológicas que puedan ocurrir en el organismo
el ACITAN administrado por vía oral a una dosis de 5000 mg/kg
tras la exposición a determinada sustancia [24]. La pérdida aceno produce ningún signo de toxicidad o muerte en ratones, sugilerada del peso corporal (aproximadamente del 15 al 29% en
riendo una DL50 por encima de 5000 mg/kg. De acuerdo a Kenun periodo de cinco a siete días) es un dato a considerar en los
nedy et al. [27] y lo establecido en la OECD, las sustancias que
estudios toxicológicos [25].
presentan una DL50 superior a 5000 mg/kg por la vía oral pueden
El seguimiento del consumo de alimentos, así como las
ser consideradas prácticamente no tóxicas o SIN CLASIFICAR,
variaciones en el peso corporal constituyen indicadores de posibles
respectivamente. Por lo tanto esto sugiere que la toxicidad aguda
trastornos orgánicos causados por el agente que se ensaya. Según los
del ACITAN por la vía oral es prácticamente nula.
resultados del caso que nos ocupa el ACITAN no ocasiona ningún
Unificando toda la información, los datos sugieren que la
trastorno orgánico que se pueda apreciar a través de estas variables.
administración oral del ACITAN no induce ningún efecto tóxico,
Durante el período de ensayo no se evidenciaron signos
lo cual puede constituir el inicio del empleo seguro para el uso
de toxicidad en los animales tratados. Desde el punto de vista clínico
médico de este producto.
Tabla 7. Índice de irritabilidad de la mucosa oral expuesta repetidamente con ACITAN durante cinco días.
LABI OFAM
27
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
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[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
Genotoxicidad del extracto acuoso del
Solanum torvum Sw
en células germinales de ratón
Aníbal Domínguez Odio1*
Edgar Puente Zapata2
Lázaro Ibrahim Romero García3
Irela Yolaine Pérez Andres2
Hilario Salas Perez2
Genotoxicity of
Solanum torvum Sw
aquous broth on germinal mouse cells
30
1
Dirección de Investigación y Desarrollo. Grupo Empresarial de Producciones Biofarmaceúticas y Químicas, LABIOFAM.
2
Centro de Toxicología y Biomedicina. Laboratorio de Genética Toxicológica.
3
Departamento de Docencia. Hospital Clínico Quirurgico y Docente “Saturnino Lora Torres”.
* E-mail: [email protected], [email protected]
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
Se realizó un estudio para evaluar la genotoxicidad del extracto acuoso de las hojas de Solanum torvum en células germinales de
ratón, mediante el ensayo de morfología de la cabeza del espermatozoide. Se administró extracto acuoso a ratones Cenp:NMRI
por vía oral en dosis 500, 1000 y 2000 mg/kg de peso corporal cada 24 h durante los primeros cinco días del experimento. Los
parámetros toxicológicos evaluados fueron peso corporal (0, 6, 12, 18 y 35 días), densidad y morfología espermática (35 días). Al
finalizar el experimento se demostró que el S. torvum no indujo alteraciones toxicológicas en el 100% de los animales tratados.
Se concluye que el extracto acuoso de S. torvum no resultó citotóxico ni genotóxico en las células espermáticas de ratón y bajo
las condiciones experimentales descritas.
Palabras clave: Solanum torvum, células germinales, citotoxicidad, genotoxicidad.
A study was carried out to evaluate genotoxicity of aqueous broth of Solanum torvum leaves on
germinal mouse cells, through a morphological assay on spermatozoon head. Aqueous broth was
administered to Cenp: NMRI mice, orally, with a 500, 1000 y 2000 mg/kg weight dose, each 24 h
for the first five test days. Toxicological patterns evaluated body weights (0, 6, 12, 18 y 35 days)
as density and spermatic morphology (35 days). Once test was finished, it was proved that S. torvum
presented no toxicological effects on 100% of treated animals. It is concluded that aqueous
broth of S. torvum leaves is neither cytotoxic nor genotoxic on mouse spermic cells within the
previous test conditions.
Keywords: Solanum torvum, germinal cells, cytotoxicity, genotoxicity.
propiedades antiparasitarias específicamente contra Rhipicephalus
boophilus microplus, Haemaphysalis bispinosa y Paramphistomum
cervi, [5]; antibacterianas incluyendo Helicobacter pylori [6, 7] y
antimalarica [8]. También sobresale por sus efectos favorables sobre la presión arterial y el metabolismo de la fructuosa en ratas
hipertensas [9], y por sus efectos antiglicemiantes fundamentalmente por inhibir la enzima alfa-glucosidasa contenida en las células intestinales de ratas [10]. Sin embargo, a pesar de existir estos
antecedentes y evidencias científicas, su uso se ha evitado debido
a la citotoxicidad de algunos de sus componentes [11].
En este contexto, resulta importante determinar el potencial genotóxico de esta planta, como una vía para determinar
el riesgo de daño genético en las personas que la consumen. De
todos los ensayos disponibles, el ensayo de morfología de la ca-
LABI OFAM
A
lo largo de los siglos muchas plantas han sido utilizadas por sus propiedades curativas, tradición
transmitida por generaciones hasta la actualidad.
Estos conocimientos heredados constituyen el fundamento de la fitoterapia actual y el punto de partida, de muchas
investigaciones destinadas a otorgarle a esta práctica seguridad,
efectividad y calidad. [1-3]
La planta Solanum torvum Sw (familia Solanaceae, género
Solanum), conocida popularmente en Cuba por el nombre Prendejera, es una de las especies que forma parte del arsenal terapéutico de la flora de nuestro país. Es un arbusto silvestre utilizado
en la medicina tradicional por sus propiedades narcóticas, diuréticas, antiartríticas, antimicrobianas, anticonvulsivantes, entre otras
[4]. De igual forma, se tiene confirmación experimental de sus
31
[ [N PO RMOB DR U
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C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
beza del espermatozoide en roedores tiene especial relevancia,
pues permite identificar compuestos que interactúan con el ácido
nucleico de las células germinales masculinas y con ello, predecir
las alteraciones negativas de su capacidad fertilizante y el riesgo de
ocurrencia de ciertas enfermedades genéticas en las futuras generaciones. Posee además como atractivo adicional, la existencia
de experiencias en evaluaciones de extractos vegetales [12-14],
componentes vacunales parenterales y mucosales [15], radiofrecuencias [16], metales pesados [17], preservantes alimentarios
[18] y medicamentos [19].
Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo tuvo
como propósito evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad del extracto acuoso de las hojas de S. torvum, en células germinales de ratón,
mediante el ensayo de morfología de la cabeza del espermatozoide.
solanum
PRENDEJERA, ES UNA DE LAS ESPECIES QUE FORMA PARTE DEL
LA BIO FAM
ARSENAL TERAPÉUTICO DE LA FLORA DE NUESTRO PAÍS
32
Colecta del material vegetal: el material vegetal elegido para este
estudio consistió en hojas sanas de S. torvum. Su colecta siempre
fue realizada en horario de la mañana, y en lugares pertenecientes
al macizo montañoso Nipe-Sagua-Baracoa a 475 m sobre el nivel
del mar.
Preparación del material vegetal y extracto acuoso: las
hojas se sometieron a un proceso de secado en una estufa con
circulación de aire caliente a una temperatura de 37ºC durante
cuatro días continuos, para posteriormente triturarse. El extracto
acuoso fue obtenido por decocción a partir de 50 g de material
vegetal en 100 mL de agua destilada estéril. Para garantizar la mayor extracción posible de los principios activos del tejido vegetal,
el solvente fue renovado tres veces seguidas por otro fresco cada
30 minutos aproximadamente. Culminada esta fase, se filtró a
presión reducida en condiciones de esterilidad y se concentró en
un evaporador rotatorio, hasta obtener el sirope, el cual se liofilizó y almacenó en recipientes color ámbar con tapas herméticas a
temperatura de 8ºC, hasta el momento de su utilización.
Animales de experimentación: se utilizaron ratones
machos adultos jóvenes de la línea Cenp: NMRI, con edades
entre 8-12 semanas de edad y peso corporal entre 27-30 g,
suministrados por el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Todos se mantuvieron en
condiciones controladas de temperatura (22±3°C), humedad
(30-70%) y períodos de luz/oscuridad de 12/12 h. La alimentación consistió en una dieta a base de pienso concentrado multipropósito convencional CMO 1000 procedente del CENPALAB
y agua fresca ad libitum.
Grupos experimentales: se conformaron cinco grupos
experimentales con cinco ratones cada uno: un grupo control ne-
gativo (agua destilada estéril), tres grupos tratados con diferentes
dosis de extracto acuoso de S. torvum (500, 1000 y 2000 mg /kg
de peso corporal (PC) y un grupo control positivo (ciclofosfamida)
en dosis de 40 mg/kg PC.
Administración y dosificación: todos los grupos se administraron por vía oral con una cánula intragástrica, en el horario
de 9:30-10:30 am, cada 24 h durante los primeros cinco días del
experimento y con 16 h de ayuno. Las dosis de 500, 1000 y 2000
mg /kg PC, se diluyeron en agua destilada estéril una hora antes
de cada administración.
Observaciones: los animales fueron observados diariamente (dos veces al día), registrando la presencia de signos de
toxicidad como: alopecia, disnea, inapetencia, diarreas, temblores, convulsiones, salivaciones, letargo, sueño y coma. Cada uno
de los animales fue pesado al inicio y a los 6, 12, 18 y 35 días del
experimento.
Procedimiento experimental: a los 35 días después de
la última administración, los animales se sacrificaron por dislocación cervical y se les extrajo ambos epidídimos, los cuales fueron
reducidos a pequeños fragmentos y depositados en placas Petri que contenían 2 mL de solución isotónica de NaCl 0.9%. El
contenido se homogenizó y se filtró para realizar el análisis de las
siguientes variables.
Citotoxicidad: se tomó un 1 mL de la suspensión espermática anterior y se colocó en una cámara de Neubauer
(DDR, Alemania), para determinar densidad espermática.
Genotoxicidad: a la suspensión espermática restante se le
añadió tres gotas de eosina al 1%, luego se homogenizó y se dejó
reposar por cinco minutos. Transcurrido ese tiempo, se realizaron
dos frotis por cada animal en portaobjetos codificados. Se analiza-
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
SW
ron 1000 espermatozoides de forma consecutiva por animal y por
un mismo observador, en un microscopio óptico con aumento de
100 x. El criterio de clasificación morfológica se basó en cabezas
espermáticas normales y anormales según criterio de Wyrobeck y
Bruce, 1975 [20] y Dobrzyriska y Gajewski, 2000[21].
Análisis estadístico: se verificó la distribución de las variables tenidas en cuenta por medio de la prueba de Kolmogorov-
Smirnov, y una vez comprobado se procedió a identificar variaciones estadísticamente significativas del peso corporal, en los cinco
grupos experimentales durante los días 0, 6, 12, 18 y 35 del estudio, utilizando una ANOVA no paramétrica de Kruskal Wallis (días
de pesaje y grupo experimental). Para ambas pruebas estadísticas
fue seleccionado un nivel de significación α= 0.05. En todos los
casos se empleó el programa estadístico SPSS 12.0.
torvum
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los animales tratados con las diferentes dosis de extracto acuoso
del S. torvum no presentaron mortalidad, ni signos de toxicidad,
concluyendo el estudio con un 100% de supervivencia. En la figura
1 se muestra el comportamiento del peso corporal en diferentes
momentos del experimento, demostrándose que ninguno de los
grupos administrados con 500, 1000 y 2000 mg/kg PC de extracto
acuoso de la planta tuvieron afectación significativa de la ganancia
de peso corporal cuando se les comparó con el control negativo
(p<0.05).
La densidad espermática determinada para cada grupo
experimental se muestra en la tabla 1. Los valores para este pa-
Peso Corporal (G)
L ABIO FA M
rámetro en los animales administrados con dosis de 500, 1000 y
2000 mg se comportaron de manera similar a los obtenidos en el
grupo control negativo.
Referente a las alteraciones morfológicas en las cabezas
de los espermatozoides, los resultados se muestran en la tabla 2.
La administración del extracto acuoso no produce incrementos
significativos en la frecuencia de aparición de espermatozoides
anormales, en ninguno de los criterios de clasificación tenidos en
cuenta, con respecto al grupo control negativo.
La no detección de efectos citotóxicos y genotóxicos en
el grupo tratado con diferentes concentraciones de extracto acuoso de S. torvum, permite inferir que su administración no afecta
ninguna de las etapas que forman parte de la espermatogénesis.
Este comportamiento favorable podría relacionarse con la presencia de la barrera hematotesticular que protege a las células espermáticas de efectos tóxicos [22],
a las posibles ausencias o bajas
concentraciones de las sustancias
45
responsables de dichos efectos en
40
el extracto acuoso de las hojas, y
35
quizás al recién descubierto efecto
30
antioxidante de la planta en tejidos
Negativo
25
de roedores [23].
S. torvum 500 mg
20
A diferencia de lo obserS. torvum 1000 mg
15
vado
en
los grupos administrados
S.
torvum
2000
mg
10
Positivo
con extracto acuoso de S. torvum,
5
los tratados con ciclofosfamida
0
(control positivo) mostraron afec0
6
12
18
35
Dias De Pesaje
taciones significativas en todos los
parámetros toxicológicos tenidos
Figura 1. Comportamiento del peso corporal en ratones NMRI (n=5) administrados con extracto
acuoso de S. torvum, * diferencia significativa según prueba de Kruskal Wallis (p<0.05).
en cuenta, validándose la conduc-
33
[ [N PO RMOB DR U
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C AC TI U
Ó RN A] L E S
]
ción de este ensayo en nuestras condiciones experimentales. De
igual manera se pudo conocer, que la dosis utilizada no es letal, y
que además permite una posterior recuperación del peso corporal en los animales tratados al final del experimento. La citotoxicidad y genotoxicidad hallada en este grupo, están en correspondencia con lo reportado por otros autores, para esta sustancia y
tipo de ensayo [12, 24, 25]. Tal comportamiento es producto a
que sus metabolitos logran interactuar con las células de Sertoli
y directamente con las células germinales, disminuyendo su producción y maduración [26].
Tabla 1. Comportamiento de la densidad espermática en ratones
NMRI administrados con extracto acuoso de S. torvum.
GRUPOS
EXPERIMENTALES
DOSIS
(mg/kg)
DENSIDAD
ESPERMÁTICA*
(106 x mL)
Control negativo
—
38 a
500
44 a
1000
47.8 a
2000
38 a
40
18.67 b
S. torvum
Control positivo
*valores expresados como medianas, letras diferentes difieren significativamente entre sí para la prueba de Kruskal Wallis, (p<0.05).
Tabla 2. Comportamiento de la frecuencia de aparición de espermatozoides anormales en ratones NMRI administrados con extracto acuoso
de S. torvum.
FRECUENCIA* /1000 CÉLULAS
GRUPOS
EXPERIMENTALES
DOSIS
(mg/kg)
SIN GANCHO
BANANA
AMORFO
Control negativo
—
4a
4a
7a
500
3a
2a
6a
1000
4a
6a
4a
2000
4a
5a
6a
40
15 b
50 b
22 b
S. torvum
Control positivo
LABI OFAM
*valores expresados como medianas, letras diferentes difieren significativamente entre sí para la prueba de Kruskal Wallis, (p<0.05)
34
CONCLUSIONES
El extracto acuoso de las hojas de S. torvum no resultó citotóxico ni genotóxico en las células espermáticas de ratón, bajo las condiciones
experimentales descritas.
Solanum
torvum
SW
Agradecimientos
Esta investigación ha sido financiada parcialmente por el proyecto 36-06/04 (CITMA-MINSAP), titulado Evaluación toxicológica de plantas
medicinales con acción antimicrobiana, empleadas en la salud comunitaria. Se agradece igualmente el apoyo del MSc. Alfredo Alfonso Castillo,
DMV. Dany Larramendi Griñan, DMV. Pedro Suárez Arias, DMV. Petra Aguilera Feria y Téc. Narvis Sedeño Soularí, pertenecientes todos al
Centro de Toxicología y Biomedicina de Santiago de Cuba.
[
PRODUCTOS
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]
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35
LABI OFAM
[ [N PO RMOB DR U
E CDT EO S E N
C AC TI U
Ó RN A] L E S
36
]
FÓRMULA
NATURAL
QUE BRINDA
SALUD
[
PRODUCTOS
N AT U R A L E S
]
Extracto acuoso,
crema cosmética
y jarabe
VIMANG®
L
la familia cocinando un poco de aquellos
pedacitos de corteza que el mismo recolectaba en el campo. Siempre supe que
no todos los árboles de esta extensa familia, la Mangifera indica L. eran apropiados
para ese brebaje. Más de 200 tipos de
anacardiáceas, originarias del continente asiático, están distribuidas en todo el
mundo, sin embargo, alrededor de 15
son las empleadas en acciones curativas
de manera efectiva.”
Años de investigación empírica,
con convincentes resultados, llamaron la
atención a un grupo de especialistas que
se incorporaron a este estudio aportando
valor científico con sus evaluaciones preclínicas y clínicas.
Para el Master en Ciencias Reymundo Miranda Leyva, especialista en II
grado en Medicina Tradicional y Natural,
quien lleva más de 15 años vinculado al
proyecto, este compuesto natural “es un
poderoso antioxidante, incluso más fuerte que la combinación de vitamina A, C y
E. También se destaca como analgésico,
antiinflamatorio e inmunorregulador. Recientemente se le descubrieron, en estudios pre clínicos, además, valores antiangeogénico lo cual abre un camino hacia
el posible tratamiento de enfermedades
oncológicas.”
Este suplemento nutricional resulta beneficioso, además, para desacelerar los procesos de envejecimiento de
la piel, propiedad esta que se la otorgan
los flavonoides polifenólicos, los oligoelementos, los ácidos grasos polinsaturados
y una rica variedad de minerales presentes en su composición.
En busca de satisfacer la demanda
En el municipio de Arroyo Naranjo, donde se interceptan las avenidas 100 y Ojo
LABI OFAM
egada por los abuelos de nuestros abuelos, nacida de la práctica cotidiana, de esa necesidad de tomar
de la naturaleza la cura a las más disímiles
dolencias, la medicina natural y tradicional continúa presentándose, todavía hoy,
como un recurso a tener en cuenta para
el tratamiento y profilaxis en temas vinculados a la salud.
Aunque no toda la comunidad
científica apuesta por este tipo de terapia,
la constancia y el empeño de muchos en
no dejarla morir conceden el privilegio de
poder aprovechar sus bondades. Eleuterio Páez, convencido de las propiedades de la corteza de la planta de mango,
conocimiento que asumió por tradición
familiar, marcó las pautas para esta investigación en Cuba.
“Desde pequeño –refiere Páezmi padre curaba todos los malestares de
37
LABI OFAM
[ [N PO RMOB DR U
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C AC TI U
Ó RN A] L E S
38
de Agua, radican el laboratorio y la planta
de producción en la cual se elaboran los
principales productos de la línea Vimang
–crema cosmética, jarabe y extracto
acuoso– que responden a la marca comercial Natura, perteneciente al Grupo
Empresarial LABIOFAM.
La alta demanda de cada uno
de estos compuestos de origen natural
ha dirigido la mirada hacia la necesidad
de ampliar las capacidades de la industria.
Osvaldo Martínez, director de este centro, anunció la puesta en práctica de nuevas vías para obtener mayores cantidades
del extracto concentrado, sustancia base
para la fabricación de la crema, el extracto
acuoso y el jarabe.
“Estamos utilizando en estos
momentos, a manera de prueba, una
planta de glucosa en la provincia de
Cienfuegos, que tiene un sistema de maceración, extracción y concentración por
efecto muy similar al nuestro. Con esto
asumimos un proceso a gran escala que
nos permitirá lograr miles de litros de este
concentrado primario, lo cual redundará
favorablemente en un incremento notorio de nuestras producciones finales.”
Una clínica para el Vimang
Es interés de los directivos, especialistas,
técnicos y obreros que desarrollan los
productos Vimang, que este compuesto
sea empleado de manera profiláctica y no
sólo como una opción extrema para la
solución, o como paliativo, a determinados problemas de salud. Es evidente una
mejoría en la calidad de vida de la persona enferma, mas, su consumo habitual, a
decir de Páez “puede evitar padecer de
un sinnúmero de enfermedades”.
]
Como parte de este proyecto
de salud en 100 y Ojo de Agua también
radica una clínica de atención médica terciaria a la que asisten todas las personas
interesadas en este tipo de terapia.
El doctor Reymundo, responsable del grupo médico, reafirma que “la
profilaxis es lo más importante del compuesto natural, sin embargo, para lograr
presentarlo como un medicamento se
tendría que hacer un estudio más profundo, trabajar en la dosificación, realizar
muchos más ensayos clínicos, ya que con
ellos podremos demostrarle a los escépticos que el Vimang es muy bueno”.
Allí los pacientes pueden adquirir todos los productos prescritos por
el facultativo en una farmacia que logra
mantener una oferta estable.
Una familia se reencuentra
Cada agosto pacientes y especialistas se
reúnen para exponer sus experiencias en
el uso de los productos Vimang, un encuentro en el que se confirma cuanto de
beneficioso puede resultar su consumo
sistemático. Acudir a esta cita representa
una manera de mostrar agradecimiento.
Según las evidencias puestas de
manifiesto entre los presentes, los valores
del reconstituyente van más allá de sus
propiedades beneficiosas para la salud, a
decir de muchos, a estas se le incorporan
la calidad humana y la sensibilidad de todo
el personal que labora en la clínica. “Esta
convergencia de cualidades provoca que
el Vimang potencie su efecto curativo.”
Los estudios sobre el alcance del
referido compuesto natural para la salud
humana son aún una página abierta. A
pesar de las barreras que persisten para
aceptar la medicina tradicional y natural
como una terapia efectiva, los directivos y
especialistas del centro de investigaciones
Vimang trabajan por consolidar este noble proyecto de salud.

citotoxicidad del veneno del escorpión cubano rhopalurus junceus

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