1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES TRABAJO PRÁCTICO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES
Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales
“2015 - Año del Bicentenario del Congreso de los Pueblos Libres”
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6/15 SECUENCIACIÓN
PARTE PRÁCTICA
OBJETIVOS:
•
Revisar los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos.
•
Efectuar el análisis y la edición de electroferogramas generados por equipos
automatizados de secuenciación mediante la aplicación de softwares específicos.
ACTIVIDAD 1: SECUENCIAS DE GENOMAS HAPLOIDES
Consigna: Efectuar el análisis de electroferogramas que se encuentran disponibles en el
Aula Virtual.
Información sobre la secuencia: la región secuenciada corresponde a un fragmento de
genoma cloroplástico de la especie Calophyllum brasiliense Cambess.
1.
Edición
a) Abrir la secuencia F con ‘BioEdit’ (FILE>OPEN). Se abrirán dos ventanas, una
mostrará el electroferograma y otra la secuencia. Mantener ambas abiertas,
ubicándolas de modo que puedan verse en simultáneo.
b) El inicio de la lectura suele estar poco definido (“secuencia sucia”) por lo que es
necesario recortarla hasta la posición a partir de la que se observa una lectura
correcta o “confiable”. Este procedimiento se conoce como “limpiar” la
secuencia. Para ello se debe comparar una a una cada base de la secuencia con la
lectura del electroferograma (los picos). Comprobar que coincidan. Las primeras
30-40 bases en general deben eliminarse. Para ello, modificar las opciones del
menú MODE desplegable dentro de la misma ventana (seleccionar EDIT).
Luego seleccionar la región que será descartada y eliminarla con SUPR). En
ocasiones, puede acontecer que en regiones de picos claros y definidos, haya
diferencias entre el pico y la base informada o haya un pico no informado.
Cuando el error sea evidente, corregir la secuencia (MODE>EDIT, prestar
atención si deseamos sobreescribir o insertar, seleccionar OVERWRITE o
INSERT). También podrá eliminarse la región final de la lectura que esté
“sucia”. Guardar la secuencia editada en un nuevo archivo, para conservar el
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original (FILE>SAVE AS, poner un nombre que indique que corresponde a la
secuencia editada).
El mismo procedimiento debe efectuarse con la secuencia R.
2.
Alineamiento
a) Abrir las secuencias F y R editadas.
b) Seleccionar, copiar y pegar la secuencia R en el archivo de la cadena F
(Seleccionar la secuencia. EDIT> COPY SEQUENCE. Posicionarse donde se
pegará la secuencia. EDIT> PASTE SEQUENCE). Guardar en un nuevo
archivo (FILE> SAVE AS. Guardar en el formato por defecto).
c) Seleccionar la secuencia R y obtener la cadena reversa y complementaria
(SEQUENCE> NUCLEIC ACIDS> REVERSE COMPLEMENT).
d) Seleccionar ambas secuencias para efectuar el alineamiento (ACCESSORY
APPLICATION> CLUSTALW MULTIPLE ALIGMENT. Emergerán dos
ventanas consecutivamente, hacer click sobre RUN CLUSTALW y OK). El
resultado aparece en un nuevo archivo que deberán guardar como en el inciso b.
e) Explorar el alineamiento en forma global, verificar que existe una zona central
de solapamiento. Comprobar que en esta región existe coincidencia. Si existieran
posiciones que difieran, volver a los electroferogramas y resolverlos, siempre
que sea posible decidir cuál es la base correcta. De lo contrario, dejar ambas
opciones. Mantener el archivo abierto.
3.
Consenso
a) Seleccionar ambas secuencias del alineamiento y obtener la secuencia consenso.
(ALIGNMENT>CREATE CONSENSUS SEQUENCE). ¿Qué longitud tiene
la secuencia finalmente obtenida?
4.
BLAST
a) Una vez depuradas ambas cadenas y obtenida la secuencia consenso es
conveniente efectuar un alineamiento en BLAST introduciendo la secuencia
consenso, para verificar si corresponde a la región genómica esperada. En las
secuencias más similares que arroje el alineamiento, es posible ubicar los
primers que se encuentran en el archivo .txt dentro de la carpeta y realizar
inferencias acerca del producto obtenido.
b) Caracterizar la secuencia en función del alineamiento realizado.
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Consideraciones
BioEdit: Cuando se abren los archivos de secuencia (.AB1) se abren dos ventanas: una
de la secuencia y otra del electroferograma. Observar que según cuál de ellas
esté activa, el programa ofrece un menú con diferentes opciones.
ACTIVIDAD 2: SECUENCIAS DE GENOMAS DIPLOIDES
Consigna: Efectuar el análisis de electroferogramas que se encuentran disponibles en el
Aula Virtual. Descargar la carpeta que corresponde a su grupo.
a)
Abrir la secuencia con ‘Chromas lite’
b)
Comparar con secuencia patrón (Ensembl y Genatlas)
c)
Determinar localización de primers, intrones, UTR, exones
d)
Identificar alteraciones (por nombre de corrida y número de pb)
e)
Determinar la posición de la alteración en el codón (base 1, base 2 o base 3)
usando Ensembl
f)
Determinar qué tipo de mutación es: polimórfica o patogénica con Ensembl
g)
Determinar qué tipo de mutación es: non sense, miss sense, stop codon, frame
shift utilizando la Tabla de código genético, que les hemos incluido en las carpetas
de cada grupo.
h)
Determinar si existe cambio de aa
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