Desarrollo de un método por dispersión de matriz en fase sólida

Desarrollo de un método por dispersión de matriz en fase sólida

Universidad Autónoma de
Yucatán
Facultad de Ingeniería
Química
Desarrollo de un método de extracción por
MSPD en arroz fermentado con Monascus
purpureus y fortificado con lovastatina
Tesis
Presentada por:
Adriana Isabel Chable Cortez
En opción al título de:
Químico Industrial
Asesores:
Dr. David Muñoz Rodríguez
Dra. Xóchitl Domínguez Benetton
Mérida, Yucatán, México
2012
Aunque un trabajo en opción a titulación hubiere
servido para el Examen Profesional y hubiere sido
aprobado por el sínodo, sólo su autor o autores
son responsables de las doctrinas en él emitidas.
Artículo 76 del Reglamento Interior de la
Facultad de Ingeniería Química de
la Universidad Autónoma de Yucatán.
DEDICATORIAS
A mi familia, en especial a mi madre, por apoyarme en todo momento para
seguir adelante con mi formación académica, y por todos los sacrificios que esto
ha conllevado. Gracias por creer en mí, aún en los momentos en los que ni
siquiera yo lo hacía, y por darme tu amor y comprensión durante toda la vida.
Al amor de mi vida, por estar conmigo en las buenas, las malas y las
peores, y por todo lo que hemos tenido que pasar, no sólo para terminar ésta
tesis, si no para concluir con esta etapa de nuestra formación académica.
A Crisóforo (q.e.p.d.), porque sin tu apoyo, ayuda y comprensión nuestra
familia no sería lo que hoy es. Nunca olvidaremos todo lo que nos diste y lo que
nos enseñaste. Siempre te amaremos, estés en donde estés.
A mi abuelo Luis (q.e.p.d.), por darnos la gran familia que hoy somos,
porque aunque ya no estés aquí siempre vivirás en cada uno de los integrantes de
nuestra familia, ya que todos heredamos un poco de esa fuerza, determinación y
coraje con la que te condujiste en la vida.
A mis amigos, que han estado conmigo en las buenas, en las malas y en
las peores. Por todo el apoyo, su ayuda y comprensión, en especial cuando más
los necesité.
A mis compañeros Químicos Industriales generación 2006-2011, por todos
los momentos compartidos durante estos cinco años.
A todas aquellas personas que permitieron que mi formación académica
fuera muy rica, y que aunque estén en lugares lejanos, todo lo que me enseñaron
siempre estará conmigo.
A Dios, por la vida que me tocó vivir, por lo aprendido y lo vivido, tanto por
las oportunidades que se me han presentado como por todas las experiencias,
únicas e irrepetibles, que he tenido. El camino no ha sido fácil, pero tanto lo bueno
y lo malo me han servido para ser la persona que soy ahora.
i
AGRADECIMIENTOS
A mis profesores, en especial a mis asesores de tesis, Dr. David Muñoz
Rodríguez y Dra. Xóchitl Domínguez Benetton por haber depositado su confianza
en mí y en éste trabajo, pese a todas las adversidades que tuvimos que enfrentar
para sacar a flote este barco.
A la Dra. Zaira Domínguez Esquivel, por las sugerencias e ideas que
proporcionó por este trabajo, y al M. en C. Salvador Medina Peralta, por su apoyo
en el análisis estadístico de los datos obtenidos durante el desarrollo de este
trabajo. A la FIQ-UADY y a FI-UADY, por las facilidades otorgadas para la
realización de este trabajo.
A la I.Q.I Mariana Margarita Alonzo Durán, por el apoyo técnico en la etapa
de caracterización microscópica de la cepa de M. purpureus.
Al CONACYT, por la beca otorgada por el proyecto FOMIX-Yucatán 2008107984 Obtención de estatinas por fermentación de arroz para la elaboración de
un fármaco utilizable en la reducción de desórdenes causados por diabetes y
obesidad.
A la Secretaría de Educación Pública, por la beca otorgada para la
realización de este documento.
ii
CONTENIDO
Página
RESUMEN .............................................................................................................. 1
I.
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 2
II.
ANTECEDENTES ............................................................................................ 4
2.1. Estatinas ....................................................................................................... 4
2.1.1. Características químicas .........................................................................4
2.1.2. Lovastatina .............................................................................................6
2.1.2.1. Producción ...................................................................................... 6
2.1.2.2. Características físicas ..................................................................... 8
2.2.
Métodos de extracción y purificación de lovastatina usando solventes .... 8
2.2.1. Extracción de lovastatina en su forma lactona ...................................... 12
2.2.2. Extracción de lovastatina en su forma hidroxiácida .............................. 13
2.2.3. Extracción mixta.................................................................................... 14
2.2.4. Otros métodos de extracción ................................................................ 15
2.2.5. Estudios previos sobre la degradación de Lov-L .................................. 16
2.3.
Extracción por dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) ................... 18
2.3.1. Metodología general ........................................................................... 18
2.3.1.1. Ventajas ...................................................................................... 20
2.3.1.2. Factores a considerar para MSPD ................................................ 20
2.3.1.2.1. Elección de adsorbentes y solventes ...................................... 23
2.2.3. Extracción de policétidos por MSPD ..................................................... 24
2.4.
Cromatografía líquida de alta resolución ................................................ 26
2.4.1. HPLC en la detección y cuantificación de lovastatina ........................ 27
iii
III.
OBJETIVOS ............................................................................................... 30
3.1. Objetivo general ......................................................................................... 30
3.2. Objetivos particulares ................................................................................. 30
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 31
4.1. Metodología experimental .......................................................................... 32
4.1.1. Propagación del hongo Monascus purpureus ....................................... 33
4.1.2. Fermentación de arroz con Monascus purpureus ................................. 34
4.1.3. MSPD diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente .............................. 35
4.1.3.1. Extracción de lovastatina usando MSPD ....................................... 35
4.1.4. Evaluación del efecto de matriz ............................................................ 36
4.1.5. Diseño experimental factorial 24 no replicado ....................................... 38
4.1.6. Recuperación de Lov-L usando MSPD a diferentes niveles de
fortificación ..................................................................................................... 40
4.1.7. Observación micro y macroscópica de M. purpureus ........................... 41
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................... 42
5.1. MSPD diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente .................................... 42
5.2. Evaluación del efecto de matriz .................................................................. 45
5.3. Diseño experimental factorial 24 no replicado............................................. 46
5.4. Recuperación de Lov-L usando MSPD a diferentes niveles de fortificación 49
5.5. Observación micro y macroscópica de M. purpureus ................................. 51
VI.
CONCLUSIONES ....................................................................................... 54
VII.
REFERENCIAS .......................................................................................... 55
VIII.
ANEXOS .................................................................................................... 61
Anexo 1. Índice de abreviaturas y símbolos ...................................................... 61
Anexo 2. Comparación de curvas de calibración usando a la variable indicadora
Z. ....................................................................................................................... 62
iv
Anexo 3. Análisis estadístico para el diseño experimental factorial 2 4 no
replicado ............................................................................................................ 67
v
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructura de HMG-CoA y dos estatinas comunes .................................. 5
Figura 2. Paso limitante de la biosíntesis de colesterol........................................... 5
Figura 3. Estructuras lactona y β-hidroxiácida de la lovastatina ............................. 8
Figura 4. Esquema general del método de extracción por MSPD......................... 19
Figura 5. Diagrama general de la metodología. .................................................... 33
Figura 6. Porcentajes de recuperación obtenidos en el experimento factorial 3 2. . 42
Figura 7. Comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos usando acetato
de etilo como solvente con los diferentes adsorbentes probados ......................... 44
Figura 8. Comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos usando
acetonitrilo como solvente con los diferentes adsorbentes probados ................... 44
Figura 9. Comparación de las curvas de calibración Lov-L + matriz en ACN (M) y la
de Lov-L en ACN (S) ............................................................................................. 46
Figura 10. Curva de calibración de Lov-L (0-60 µg/mL) ........................................ 47
Figura 11. Curva de calibración para Lov-L .......................................................... 49
Figura 12. Morfología macroscópica de colonias de M. purpureus en agar de papa
y dextrosa (a) colonias reportadas por Chairote et al. (2008) ............................... 52
Figura 13. Comparación de observaciones microscópicas ................................... 52
Figura 14. Algoritmo para comparar dos líneas rectas usando a la variable
indicadora Z. ......................................................................................................... 64
Figura 15. Gráfica de probabilidad normal de las estimaciones de los efectos. .... 68
Figura 16. Gráfica de Pareto para los efectos sin estandarizar............................. 68
Figura 17. Gráfica de efectos principales .............................................................. 69
Figura 18. Gráfico de interacción para los efectos ................................................ 69
Figura 19. Gráfica de probabilidad normal para residuos ..................................... 71
Figura 20. Gráfica de predichos contra residuos................................................... 72
Figura 21. Gráfico de residuos vs. orden de corrida ............................................. 72
vi
LISTA DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Medios de cultivo y rendimientos reportados para la producción de
lovastatina usando diversas especies de Monascus............................................... 7
Cuadro 2. Resumen de métodos de extracción de lovastatina reportados en la
literatura .................................................................................................................. 9
Cuadro 3. Tratamientos realizados a extractos de caldo de arroz fortificados con
Lov-L a 100 µg/mL sin fermentar .......................................................................... 16
Cuadro 4. Recuperaciones obtenidas usando CL y EV como tratamientos para la
concentración de Lov. ........................................................................................... 17
Cuadro 5. Series eluotrópicas para el gel de sílice y florisil .................................. 24
Cuadro 6. Condiciones cromatográficas para la separación, detección y
cuantificación de estatinas usando HPLC con detector UV .................................. 29
Cuadro 7. Matriz experimental para el diseño factorial 3 2 de la extracción de
lovastatina por MSPD. .......................................................................................... 36
Cuadro 8. Preparación de la curva de calibración de lovastatina en ACN a diversas
concentraciones .................................................................................................... 37
Cuadro 9. Factores empleados con sus respectivos niveles para el diseño factorial
24 no replicado ...................................................................................................... 38
Cuadro 10. Matriz experimental para el diseño factorial 2 4 de la extracción de
lovastatina por MSPD ........................................................................................... 39
Cuadro 11. Preparación de curva de calibración de 0-60 µg/mL de lovastatina
empleando ACN como solvente ............................................................................ 40
Cuadro
12.
Datos obtenidos
para
las
curvas
de
calibración,
con
su
correspondiente valor para la variable Z. .............................................................. 45
Cuadro 13. Resultados para el diseño del experimento 24 no replicado. .............. 48
Cuadro 14. Recuperación y precisión de Lov-L añadida a muestras de arroz por
MSPD .................................................................................................................... 50
Cuadro 15. Rendimientos de extracción de diversos policétidos .......................... 50
Cuadro 16. ANOVA obtenido a partir del análisis de la regresión múltiple. .......... 63
Cuadro 17. ANOVA adicional para variables según el orden de introducción ...... 63
vii
Cuadro 18. Estimaciones de los efectos de los factores del diseño 2 4 para la
lovastatina ............................................................................................................. 67
Cuadro 19. Mejor ANOVA para el diseño experimental factorial 24 no replicado. . 71
viii
RESUMEN
La lovastatina es una estatina de origen natural, producida por el hongo
filamentoso Monascus purpureus, cuya importancia radica en su capacidad de
disminuir la producción de colesterol en el cuerpo humano, lo que ayuda a
combatir problemas como la hipercolesterolemia, que actualmente es una de las
principales causas de muerte en México.
En el presente trabajo se propone la aplicación de la extracción por
dispersión de matriz en fase sólida (MSPD), para la extracción de lovastatina
producida a partir de la fermentación de arroz utilizando al hongo Monascus
purpureus.
Se encontró que la MSPD es una técnica útil para la extracción de la
lovastatina producida por M. purpureus en arroz, debido a la facilidad de
preparación de la muestra que aporta este método, además que permite extraer la
lovastatina en sus dos formas, la β-hidroxiácida y la lactona.
Las condiciones de extracción probadas que maximizaron los porcentajes
de recuperación fueron: gel de sílice como adsorbente en una relación 1:4
muestra/adsorbente, con 8 mL de acetato de etilo como solvente de elución.
También se encontró que con el uso de la extracción por MSPD de lovastatina las
recuperaciones obtenidas van de 66.45-101.42%, disminuyendo conforme
aumenta la concentración de lovastatina.
Por otra parte, se encontró que la preparación de la curva de calibración
para este método no requiere del uso de curva de adición estándar.
1
I.
INTRODUCCIÓN
La lovastatina es una molécula de alta importancia en la actualidad, ya que
ayuda a disminuir la concentración de colesterol en pacientes con niveles
riesgosos para la salud y, en consecuencia, a reducir el riesgo de enfermedades
metabólicas, las cuales son actualmente la principal causa de muerte en México.
Por esto, la cuantificación de la lovastatina es importante en diversas
matrices, desde los medios de cultivo donde se produce para mejorar las
condiciones de fermentación, hasta en los productos terminados (medicamentos),
para conocer y asegurar la calidad del producto obtenido.
Actualmente hay una gran variedad de métodos reportados en la literatura
para la extracción de lovastatina, obtenida por fermentación de arroz con el hongo
Monascus purpureus, previa a su análisis cuantitativo; sin embargo, la mayoría de
estos métodos de extracción presentan diversos problemas, desde técnicos hasta
económicos; por ello en este trabajo se propone la aplicación de un método de
extracción por MSPD (dispersión de matriz en fase sólida, del inglés matrix solid
phase
dispersion)
para
su
posterior
cuantificación
usando
HPLC-PDA
(cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a un detector de arreglo de
diodos, del inglés high performance liquid chromatography with photodiode array
detector)
Aunque ya ha sido ampliamente reportada la extracción y cuantificación
analítica de lovastatina por HPLC-PDA utilizando varios métodos de extracción,
principalmente líquido-líquido (cuando se trata de caldos) y sólido-líquido (para
productos sólidos fermentados, como el arroz), hasta ahora no ha sido reportada
la aplicación de MSPD para la extracción de lovastatina producida en la
fermentación en fase sólida (FFS). Una de las ventajas de MSPD es que elimina la
mayoría de las complicaciones características de las extracciones con solventes
(formación
de
emulsiones
o
partículas
suspendidas,
dificultades
en
la
homogeneización de la muestra), particularmente en mezclas biológicas
2
complejas. Por otra parte, se ha demostrado en numerosos experimentos que se
obtienen mejores rendimientos de producción de lovastatina cuando se lleva a
cabo la FFS, por lo cual resulta ventajoso usar arroz como medio de soporte para
la producción de lovastatina. Por todo ello, esta investigación está enfocada al
desarrollo de un método por MSPD para la extracción y posterior determinación de
lovastatina por HPLC-PDA en arroz fermentado con Monascus purpureus.
3
II.
ANTECEDENTES
Las estatinas son inhibidores selectivos de el 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima
A reductasa (HMG-CoA reductasa), que es el enzima que regula el paso limitante
de la biosíntesis de colesterol. De esta manera, estos compuestos disminuyen el
colesterol, y más ampliamente las lipoproteínas de baja densidad (LBD, o LDL por
sus siglas en inglés) o el llamado “colesterol malo”, mientras que incrementan
ligeramente las lipoproteínas de alta densidad (LAD, o LDH por sus siglas en
inglés), que es conocido como “colesterol bueno”; previniendo la acumulación de
placas de colesterol dentro de las arterias, evitando diversas enfermedades, como
arterioesclerosis, infartos y, finalmente, la muerte (Li et al., 2004, Barrios-González
et al., 2010).
2.1. Estatinas
2.1.1. Características químicas
Las estatinas se clasifican en naturales, junto con sus derivados
semisintéticos, y sintéticas. Todas las estatinas son hexahidronaftalenos lactona
sustituidos (Barrios-González et al., 2010).
Las estatinas son inhibidores competitivos de la HMG (3-hidroxi-3metilglutaril) CoA reductasa con respecto a la HMG-CoA. La primera es el enzima
que controla la velocidad en la biosíntesis de colesterol. Este poder inhibitorio se
debe a que la forma ácida de las estatinas tiene una semejanza con el sustrato de
la enzima, debido a la presencia de un grupo carboxilo y un grupo hidroxilo, lo cual
se asemeja al grupo carboxilo y el carbonilo presentes en la molécula de HMGCoA, esto se resalta en la Figura 1, con un círculo.
4
HO
HO
COOH
H3C
COO
O
-
OH
F
S
HO
COOH
CH3
N
NH
OH
O
O
CH3
O
H3C
O
H
HN
CH3
NH
CH3
O
H3C
OH
H3C
Atorvastatina
Lovastatina
H3C
O
3'-ADP
HMG - CoA
Figura 1. Estructura de HMG-CoA y dos estatinas comunes
De esta manera, en lugar de que se dé la reacción entre la HMG-CoA y la
HMG-CoA reductasa, ésta ocurre entre la estatina y la HMG-CoA reductasa, lo
que impide la formación de mevalonato, bloqueando de esta manera la ruta
biosintética de colesterol (Figura 2) (Endo et al., 1976).
2 NADPH + 2H+
OH
COO
-
CH2 C CH2
CH3
2 NADP +
HS - CoA
O
OH
C S
CoA
HMG CoA reductasa
COO
HMG CoA
-
CH2 C CH2
CH3
Mevalonato
Figura 2. Paso limitante de la biosíntesis de colesterol
5
CH2 OH
2.1.2. Lovastatina
2.1.2.1. Producción
Monascus purpureus es un hongo filamentoso, del grupo de los
Ascomicetos. Sus esporas, por formarse dentro de un saco, se denominan
ascosporas (Madigan et al., 2004). Como integrante de la familia Monascaceae, se
caracteriza por tener ascosporas esféricas de 5 µm, o ligeramente ovoides (6x5
µm), talos anamórficos o basipétalos holoblásticos en su estado conidial,
Basipetospora (Dugan, 2006). Forman micelio blanco en etapas tempranas y
cambia rápidamente a un rosado y posteriormente, reflejo del incremento de
acidez del medio, cambia a un color amarilllo-naranja distintivo. Un profundo color
rojo se forma conforme envejece el cultivo. Monascus purpureus es un hongo
homotálico, es decir su reproducción sexual se da por dos gametos aportados por
el mismo talo (Ávila Lavalle, 2010).
Los hongos integrantes de la familia Monascaceae son fuente de varios
metabolitos secundarios de estructura policétida (compuestos comúnmente
producidos por hongos), como diversos colorantes (Jozlová et al., 1996), pero
destacan por ser productores de lovastatina. En años recientes, la lovastatina ha
sido obtenida de 17 cepas diferentes del género Monascus, particularmente de M.
ruber, M. purpureus, M. pilosus, M. vitreus, y M. pubigerus (Negishi et al., 1986).
Vale la pena destacar que M. anka y M. purpureus han sido usados por centurias
en países asiáticos, donde les conocen como “koji rojo” para fermentar alimentos,
tales como el arroz y preparar bebidas (anchu y somsu), también son utilizados
para obtener un colorante rojo (Lin et al., 2007, Pattanagul et al., 2008). En el
Cuadro 1 se muestran algunas especies de Monascus productoras de lovastatina,
así como sus rendimientos, tanto en medios líquidos como en medios sólidos.
6
Cuadro 1. Medios de cultivo y rendimientos reportados para la producción de lovastatina usando
diversas especies de Monascus
Medio de cultivo
Microorganism Rendimiento
o empleado
Medio definido:
M.
purpureus 351 mg/L
29.56 g de dextrosa, 3.86 g MTCC 369
NH4Cl, 1.73 g de KH2PO4,
0.86 g de MgSO4·7H2O y 0.19
g de MnSO4·H2O por litro.
Arroz enriquecido con solución M.
purpureus 3.422 mg/g
nutritiva:
MTCC 369
14.32 g de NH4Cl, 0.76 g
MgSO4·7H2O, 14.65 g NaCl y
0.54 g de CaCl2·2H2O por litro.
Medio definido:
M. paxii AM12M 127 mg/L
70 g de glicerol, 8 g de
peptona, 1 g de MgSO4·7H2O,
30 g de glucosa y 30 g de
harina de soya.
Caldo
glucosa-glicerol- Mutante de M. 725 mg/L
peptona.
pilosus IFO4520
Arroz Thai aglutinado
M.
purpureus 33.79 mg/g
CMU001
Arroz
de
grano
largo M.
purpureus 378 mg/kg
adicionado con 1.0% nitrato CCRC 31615
de sodio de y 0.1% de
hidrofosfato de dipotasio.
Referencia
(Sayyad et al., 2007)
(Panda et al., 2009)
(Manzoni
1999)
et
al.,
(Miyake et al., 2006)
(Chairote
et
2008)
(Su et al., 2003)
al.,
La lovastatina es producida como una mezcla de su forma β-hidroxiácida
(Lov-H) y lactona (Lov-L) (Figura 3), siendo la β-hidroxiácida la predominante
(Alberts et al., 1980). La forma activa capaz de inhibir la biosíntesis de colesterol
en el organismo es la β-hidroxiácida (Nakamura et al., 1985), por la semejanza
con la HMG-CoA que se mencionó anteriormente.
7
HO
O
HO
COOH
O
OH
O
O
H3C
O
H3C
H
CH3
CH3
O
H
CH3
H3C
CH3
H3C
Forma - hidroxiácida
Forma lactona
Figura 3. Estructuras lactona y β-hidroxiácida de la lovastatina
2.1.2.2. Características físicas
La lovastatina es un sólido blanco a temperatura ambiente, con tres
longitudes de onda máximas (λmáx) de absorción en la región UV del espectro
electromagnético, a 231, 238 y 247 nm. En etanol cristaliza como agujas incoloras
(Alberts et al., 1980). Su punto de fusión es de 174.5ºC y su solubilidad es, en
mg/mL: 47 en acetona, 28 en acetonitrilo, 7 en n-butanol, 14 en i-butanol, 350 en
cloroformo, 90 en N,N-dimetilformamida, 16 en etanol, 28 en metanol, 2 en noctanol, 11 en n-propanol, 20 en i-propanol, 0.4 x 10-3 en agua. (Merck, 2006).
2.2.
Métodos de extracción y purificación de lovastatina usando
solventes
En general, hay varios métodos de extracción utilizando solventes, ya sean
líquido-líquido o sólido-líquido, pero se distinguen tres tipos: aquellos en los que la
lovastatina es extraída en su forma lactona disminuyendo el valor de pH, los
métodos en los cuáles la lovastatina es extraída en su forma β-hidroxiácida, y
aquellos en los que ambas formas están presentes en diferentes proporciones.
Estos métodos y sus variantes se resumen en el Cuadro 2.
8
Cuadro 2. Resumen de métodos de extracción de lovastatina reportados en la literatura
Muestra
Forma de la
I
lovastatina
Hongo
Condiciones de
extracción
Medio
de
cultivo, arroz
fermentado
Lov-L
Hongos
filamentosos:
Monascus
purpureus,
Monascus
ruber
5 ml de caldo son
sonicados, ajustado su pH
y extraídos. Se centrifuga,
recolecta
y
lactoniza.
II
Reconstituir en ACN .
1 g de muestra solida es
extraída con 5 ml de
solvente,
incubado.
Centrifugar,
recolectar
sobrenadante, concentrar
a 80ºC s/vacío, reconstituir
Caldo
micelio
Lov-L y Lov-H
Aspergillus
terreus
Monascus
purpureus
y
Té
Lov-H
No
menciona
Residuos
agroindustriales
Lov-H y Lov-L
Aspergillus
terreus
y
se
Solventes y
soluciones
empleados
Extracción: Acetato
de etilo (5 ml)
Reconstitución:
1
ml ACN
Observaciones
Referencias
Caldo: 3.0 con H3PO4 2 N
o con HCl. Arroz: no se
ajusta pH.
Lactonización con 10 ml
III
TFA 1.0%
Centrifugación a 3,000 xg
por 8 min o 1,500 xg por
15 min.
Incubación
con
baño
ultrasónico o incubación en
shaker 180 rpm, 70ºC o
temperatura ambiente por
1.5-2 h.
3
pH 3 con TFA
(Samiee et al.,
2003, Su et al.,
2003, Sayyad et
al., 2007, Panda
et al., 2009).
(Manzoni et al.,
1999).
Caldo: Filtrado, ajustar pH,
extracción
(3x400
ml
acetato de etilo), secado
con Na2SO4, concentrado.
Micelio: lavado por 1 h con
agitación, extracción (2 x
400 ml de cloruro de
metileno, 400 ml acetato
de etilo) 1 h a 40ºC
Se añade mezcla de
estándares a 10 g de té,
extracción, t. amb., 24 h o
reflujado en agua (100 ml)
a 100ºC, 1 h. filtrar,
concentrar a sequedad en
rotavapor, 35ºC. Disolver
en 1 ml de metanol.
Lavado: HCl 0.05 M
Extracción: acetato
de etilo y cloruro de
metileno
Secado: Na2SO4
Extracción: 10 ml
metanol o acetato
de etilo
------------------------------------
(Yang, D. et al.,
2006)
40 ml de cada solvente
fueron mezclados con 1.5
g de matriz sólida y
sonicados, seguidos de
Extracción:
se
probó
ACN,
metanol, acetato de
etilo, acetato de
Centrifugación a 10,000
rpm por 10 min. Sonicación
por 5 min
(Pansuriya
al., 2009).
I
Lov-L: forma lactona de la lovastatina; Lov-H: forma hidroxiácida de la lovastatina
ACN: acetonitrilo
III
TFA: ácido trifluorocético
II
9
et
Muestra
Forma de la
I
lovastatina
Caldo
cultivo
de
Caldo
cultivo
de
Lov-H
Hongo
Monascus
pilosus
Monascus
purpureus
Lov-H
Aspergillus
terreus
Arroz
fermentado
Lov-H
Monascus
purpureus
Caldos
de
fermentación
Lov-H
Aspergillus
terreus
Caldo
cultivo
Lov-H
Aspergillus
terreus
de
y
Condiciones de
extracción
y
una incubación a 28ºC,
200 rpm, 2 h. filtración,
centrifugación.
Cinco
extracciones individuales.
Conservado a -5ºC en
botellas de vidrio.
Filtración. 1 g de biomasa
(a
peso
seco)
fue
suspendida en solvente,
incubado a 25ºC por 24
hrs.
Filtración
en
membrana de 0.45 µm
Filtración de un volumen
conocido en un filtro de
celulosa (0.45 µm), lavado
de células con agua estéril
y liofilizando.
Diluir en 10 partes de
mezcla 1:1 ACN/agua.
0.5 g de arroz molido,
extraído con 10 ml de
solvente, baño ultrasónico,
centrifugación y recolectar
sobrenadante. Repetido 3
veces, y el sobrenadante
fue transferido a un matraz
volumétrico de 25 ml,
aforando a 25 ml con
etanol. Mantenida a 30
min, filtrada en membrana
de 0.45 µm.
Ajustar pH a 3.0, extraer
con solvente por 1 h en un
agitador rotatorio a 200
rpm y 30ºC. La suspensión
fue filtrada, primero con
papel filtro, y luego con
membrana de poro de 0.22
µm.
3 g o 10 ml de muestra
extracción con 10 ml de
10
Solventes y
soluciones
empleados
butilo, tolueno y
cloroformo.
ACN
fue el mejor
Observaciones
Referencias
Etanol 60%
------------------------------------
(Miyake et al.,
2006).
ACN
------------------------------------
(Casas López,
J. et al., 2005).
Etanol HPLC 75%
Optimizado
a
EtOH/agua
75:25
v/V
Centrifugación a 3,000 rpm
a 4ºC por 10 min.
Incubación de 30-60 min
(Li et al., 2004,
Chairote et al.,
2008).
Metanol
Optimizado a pH 7.7
(Friedrich et al.,
1995, Novak et
al., 1997).
Incubación a 250 rpm por
20 min. Sonicación por 30
(Baños
2009).
Mezcla 1:1
agua v/v
Mezcla
1:1 v/v
ACN/agua
et
al.,
Muestra
Forma de la
I
lovastatina
Hongo
cultivo sólido
Caldo
de
cultivo
y
productos
fermentados
en polvo
Lov-L
Lov-H + Lov-L
si no se ajusta
el pH
Aspergillus
terreus
y
Monascus sp.
Fermentación
en fase solida
Lov-H
Aspergillus
terreus
Polvo
monascal
adlay
Lov-H
Monascus
Condiciones de
extracción
Solventes y
soluciones
empleados
mezcla
e
incubación
seguido
de
baño
ultrasónico. Concentración.
2 ml de caldo fueron
diluidos con 2 ml de ACN y
se ajustó pH. Incubación
por 60 min, centrifugación
y recoger sobrenadante.
Para el polvo 150 mg de
muestra fueron preparados
en 15 mL de solvente y
mezclado por 4 h. filtración
en membrana de 0.22 µm.
Secado a 60ºC, 12 h. 0.5 g
extraídos con 10 ml de
solvente
por
12
h.
Filtración en papel.
0.5 g de muestra fueron
disueltas en 10 ml de
solvente,
sonicado,
centrifugado y filtrado (0.45
µm)
11
Observaciones
Referencias
min
ACN
pH ajustado con 0.1 mL
H3PO4 concentrado.
Centrifugación a 2,000 g,
15 min.
Incubación por 60 min – 4
h
(Morovján et al.,
1997, Ou et al.,
2009).
Metanol
----------------------------------
(Wei
et
2007).
EtOH 75%
10 min de centrifugación,
60 min de sonicación
(Yang, J. H. et
al., 2004).
al.,
2.2.1. Extracción de lovastatina en su forma lactona
El primer método descrito de extracción de lovastatina producida en cultivo
fue empleado pro Alberts et al. (1980). Este método empleó acetato de etilo como
solvente y el valor de pH se ajustó de 4.0 - 4.2. El acetato de etilo fue propuesto
por su escasa miscibilidad con el agua y su alta volatilidad, lo que permitió
concentrar y recuperar la lovastatina extraída.
En estudios más recientes, Samiee et al. (2003) reportaron un método de
extracción diferente, aún usando acetato de etilo como solvente. Éste se resume
como sigue: se ajustó el valor de pH de la muestra líquida a 3.0, y se añadió un
volumen igual de acetato de etilo, seguido de incubación de la muestra, después
se recuperó la fase orgánica (sobrenadante), se centrifugó y concentró a
sequedad. El porcentaje de recuperación (%R) reportado fue de 90% de la
lovastatina existente en la forma lactona.
Por su parte, el grupo de Su et al. (2003) usaron un método basado en el
descrito precedentemente. El método fue modificado al adicionar un paso de
lactonización con ácido trifluoroacético al 1.0% v/v previo a la concentración, sin
especificar cómo puede llevarse a cabo esta concentración. Finalmente se
resuspendió el extracto seco en acetonitrilo. Cabe destacar que la concentración
es un paso crítico cuando se emplea esta metodología, ya que según Yang
(2006), Ou (2009) y sus respectivos colaboradores, si se emplean temperaturas
elevadas
(90-100ºC)
se
provocaría
una
degradación
de
las
estatinas,
disminuyendo la recuperación de la forma lactona y aumentando la de la forma βhidroxiácida, dando recuperaciones de 123-137%, por lo que se deben de
descartar todos aquellos procedimientos que utilicen temperaturas elevadas.
Debido a esto, se propuso estudiar el efecto del calentamiento para la
concentración de la lovastatina cuando se aplica ésta metodología, como se
explicará en la sección 2.2.5. Estudios previos sobre la degradación de Lov-L.
Éste finalmente es el método más utilizado para la extracción de lovastatina en
forma lactona previo a su análisis por HPLC, sin embargo, existen metodologías
12
basadas en ésta, con pequeñas modificaciones (Sayyad et al., 2007, Panda et al.,
2009).
2.2.2. Extracción de lovastatina en su forma hidroxiácida
Friedrich et al. (1995) encontraron que cuando se realiza la extracción con
metanol, la lovastatina se encuentra presente en tres formas: la β-hidroxiácida, la
lactona y su metil-éster, siendo ésta última producto de la reacción entre la forma
β-hidroxiácida y el metanol que sirve para extraerla. También descubrió que en
solución acuosa la forma más estable es la hidroxiácida, por lo cual se establece
que lo más conveniente para muestras de fermentación es convertir la lovastatina
a su forma β-hidroxiácida.
Por su parte, Morovján et al. (1997) realizaron la extracción de lovastatina
diluyendo 2 mL de caldo fermentado con 2 mL de acetonitrilo. Éste solvente fue
elegido debido a que en él no se da la formación del éster, como ocurre en las
soluciones alcohólicas ácidas. Para acidificar el extracto añadieron 0.1 mL de
H3PO4 concentrado. Las muestras se mezclaron e incubaron por 60 min, fueron
centrifugadas (2000 xg, 15 min), y las alícuotas de sobrenadante claro fueron
usadas para el análisis. De esta manera, obtuvieron recuperaciones del 98%,
además de que este tratamiento ayudó a la identificación de cantidades mínimas
de lovastatina, debido a que el espectro de ésta es fácilmente identificable gracias
a la ausencia de interferentes en estas condiciones.
Posteriormente Casas et al. (2003) tomaron en cuenta los hallazgos de
Friedrich et al. (1995) y Morovján et al. (1997) y determinaron la lovastatina en su
forma hidroxiácida. Para ello emplearon caldo de cultivo que contenía la forma
hidroxiácida y lo diluyeron diez veces en una mezcla acetonitrilo/agua 1:1 v/v,
previo al análisis. También establecieron las condiciones para convertir el estándar
de la forma lactona a la forma hidroxiácida por disolución en una solución de
NaOH 0.1N y etanol (1:1 v/v), calentamiento de la solución a 50ºC por 20 min y
neutralización. Varios métodos derivados de éste han sido reportados en años
recientes (Hajjaj et al., 2001, Pattanagul et al., 2008, Baños et al., 2009).
13
Un método alternativo propuesto por Li et al. (2004) para determinar
lovastatina en su forma hidroxiácida consiste en extraer una cantidad conocida de
muestra con etanol a 75% por 60 min en un baño ultrasónico y centrifugar. Esto se
repite tres veces, y el sobrenadante total se transfiere a un matraz volumétrico y
se afora a un volumen conocido con etanol a 75%. Esta solución final se mantiene
por 30 min, se filtra previo a la inyección al equipo de HPLC. La solución madre se
prepara disolviendo el estándar en etanol a 75% y, para los estándares de la curva
de calibración, se diluye con etanol acuoso a 70%. El rango de la curva de
calibración fue en el rango de 0.2-20 ng. Éste método da un límite de detección
(LOD) de 0.5 µg/ml, un límite de cuantificación (LOQ) de 1.5 µg/ml y una %DER
de 6-7%.
Debido a la existencia de una amplia variedad de solventes empleados en
la literatura para la determinación de lovastatina, Li y sus colaboradores (2005)
hicieron pruebas para determinar el solvente óptimo para la extracción de
lovastatina en arroz fermentado con Monascus purpureus usando su método antes
reportado (Li et al., 2004). Para ello hicieron pruebas con etanol, metanol y acetato
de etilo, debido a la buena solubilidad de la lovastatina en éstos, pero encontraron
que añadiendo una cantidad apropiada de agua al solvente se mejora la disolución
de los compuestos de interés (estatinas), ya que ayudan a permear el polvo de
arroz y consecuentemente promueven su extracción del material base. La mezcla
que considera fue la óptima fue la de etanol y agua (75:25 v/v) por 90 min. El
rendimiento reportado con este método fue de 98.90% con un %DER (desviación
estándar relativa) de 1.2%. Éste método fue empleado por Chairote et al. (2008)
para determinar el perfil químico de las estatinas presentes en la levadura de arroz
rojo (red mold rice).
2.2.3. Extracción mixta
Morovján et al. (1997) usaron dos diferentes solventes, acetonitrilo y
metanol, para la extracción de muestras de caldos de fermentación. Se obtuvieron
porcentajes de recuperación entre 95 y 98%, pero se descubrió que estos
disminuían cuando la muestra era acidificada. Debido a los inconvenientes
14
reportados anteriormente, Friedrich et al. (1995) realizaron la extracción con
acetonitrilo.
En general, se concluye que las extracciones usando acetonitrilo (>70%) o
acetato de etilo tienen menos inconvenientes para determinar la forma lactona que
aquellas en las que se usa etanol; esto se debe a que en los primeros no ocurre la
interconversión de la lovastatina a la forma hidroxiácida, como han podido probar
experimentalmente diversos grupos de investigación.
2.2.4. Otros métodos de extracción
En cuanto a los métodos de extracción en fase sólida (SPE, del inglés solid
phase extraction) de estatinas, también existen una gran variedad, pero están
limitados a su uso en muestras biológicas, como sangre y suero sanguíneos
(Ertürk et al., 2003). Entre los que se pueden encontrar destaca el reportado por
Yang et al. (2006) para la separación de una mezcla sintética de estatinas. En este
método usa cartuchos con C18 -sílica derivatizada con octadecilsilil (ODS),
acondicionado con 6 ml de metanol, seguidos de 6 ml de agua. Luego se carga
una mezcla de cinco estándares de estatinas disueltos en 1 ml de metanol. Se
seca el cartucho con N2 gaseoso y el cartucho se abre y se eluye con alícuotas de
6 ml de agua, 5% de metanol en agua (con incrementos de 5% cada vez) y 100%
metanol. La recuperación es de 95-99% cuando las cantidades de estatinas que
pasan a través del cartucho van de 20 a 100 ng.
Las metodologías antes descritas para la extracción de lovastatina se
resumen en el Cuadro 2.
También cabe destacar el uso de la extracción con fluidos supercríticos, el
cual ha sido recientemente reportado para la extracción de lovastatina. Esto se
realiza utilizando CO2 como fluido supercrítico. La extracción de lovastatina por
ésta técnica se muestra como una opción viable para procesos de flujo
descendente (downstream), dando extractos con menos impurezas que los
obtenidos por extracción en fase sólida (Pansuriya et al., 2009).
15
2.2.5. Estudios previos sobre la degradación de Lov-L
Los métodos de extracción de lovastatina en su forma lactona exigen el
cambio de pH hacia valores ácidos, como reportan Panda et al. (2009), donde se
añadieron 10 mL de TFA al 1.0% acuoso a 1 mL de extracto de arroz fermentado
en acetato de etilo. Posteriormente, se requiere la concentración de esta mezcla,
con el fin de eliminar el solvente y el agua proveniente de la solución de TFA. Para
esto, se pueden usar diferentes tratamientos para su concentración, algunos de
los cuales requieren temperaturas de aproximadamente 80 ºC
(Panda et al.,
2009). Sin embargo, como señalan Ou et al. (2009), el tratamiento térmico puede
causar la degradación de la lovastatina, disminuyendo el %R de ésta, y la
sensibilidad del método. Debido a esta discordancia, se planteó realizar pruebas
pre-eliminares para verificar si la Lov-L se degradaba bajo las condiciones
especificadas en los experimentos de Panda et al. (2009). Para probarlo, se siguió
una metodología basada en Su et al. (2003) y Panda et al. (2009). Se procedió
como sigue: una muestra de arroz sin fermentar se fortificó con solución estándar
de Lov-L en ACN para obtener una concentración final de 100 µg/mL y se trató de
acuerdo a las metodologías antes mencionadas. Para el paso de concentración se
probaron diversas técnicas, con el fin de eliminar el agua añadida en el paso de
lactonización de la lovastatina, las cuales se muestran en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Tratamientos realizados a extractos de caldo de arroz fortificados con Lov-L a 100 µg/mL
sin fermentar
Abreviatura
Tratamiento
Temperatura
Vacío
Tiempo
de
tratamiento
RV
Evaporación con rotavapor
80 ºC
Sí
1h
CL
Liofilización
-43 ºC
Sí
5 días
EV
Estufa de vacío
60 ºC
Sí
2 días
BA
Baño de agua
80 ºC
No
3 días
Como resultado, para las muestras tratadas con CL o EV se obtuvieron
perfiles cromatográficos con dos picos identificables, indicando la presencia de
lovastatina en sus formas Lov-L y Lov-H. Para las muestras cuyo tratamiento fue
16
RV o BA no se obtuvieron picos a los tr de la Lov-L o Lov-H, por tanto se consideró
que no hubo recuperación. Para las muestras tratadas usando CL o EV, se
calcularon las recuperaciones obtenidas con cada tratamiento. Esto se realizó
sumando las áreas de los picos de Lov-L y Lov-H y comparándolas con el área del
pico del estándar de Lov-L (100 µg/mL). Los resultados se muestran en el Cuadro
4.
Cuadro 4. Recuperaciones obtenidas usando CL y EV como tratamientos para la concentración de
Lov.
Tratamiento
Pico
%R
SD
%RLov-H + %RLov-L
CL
Lov-H
19
68
52
Lov-L
33
226
Lov-H
12
60
Lov-L
13
104
EV
25
En estos estudios previos, se concluyó que la liofilización fue el tratamiento
menos agresivo para la concentración de la Lov-L después de la etapa de
lactonización (TFA 1.0%). Esto se debe a que, al no aplicar temperatura, se
disminuye la degradación de la Lov-L tal como lo indica en la literatura Ou et al.
(2009). Entre las condiciones que puede causar la degradación de la Lov-L, se
encuentran el tiempo de calentamiento (de 30 a 90 min) y la temperatura (de 85 a
121 ºC) (Ou et al., 2009), como sucedió en los tratamientos EV, BM y RV, donde la
temperatura fue mayor de 70ºC, y se mantuvo por períodos prolongados de
tiempo, lo cual pudo ser el factor más determinante para la degradación del
analito.
Aunque la liofilización es un tratamiento factible para la extracción de
lovastatina, requirió equipo costoso (liofilizadora) y tiempos prolongados (5 días)
para la concentración de ese analito. Por ello, se propuso otro método para su
extracción, que sea más económico, rápido y simple para la preparación de las
muestras previo a su análisis por HPLC-PDA, como la extracción por MSPD.
17
2.3.
Extracción por dispersión de matriz en fase sólida (MSPD)
Desde su introducción en 1989 por Barker (1989), la dispersión de matriz en
fase sólida (MSPD, matrix solid phase dispersión) ha sido aplicada a la extracción
de una gran cantidad de sustancias orgánicas, tanto exógenas (fármacos,
contaminantes, pesticidas) como endógenas (componentes de alimentos y
bacterias, etc.), con algunas modificaciones (Capriotti et al., 2010).
La MSPD tiene aplicación particularmente en los procesos analíticos para la
preparación, extracción y fraccionamiento de muestras sólidas, semisólidas o
viscosas (Barker, S., 2007). La novedad de esta técnica consiste en el aislamiento
de los analitos por dispersión de los tejidos en un soporte sólido, evitando muchas
de las dificultades encontradas en los métodos clásicos de SPE, como la
necesidad de homogeneizar la muestra previo a la aplicación en la columna, así
como la disrupción incompleta de las células (Capriotti et al., 2010).
El uso de condiciones medias para la extracción (temperatura ambiente y
presión atmosférica) con una combinación adecuada de adsorbente, dispersante y
solvente de elución normalmente proporciona porcentajes de recuperación
apropiados y selectividad media (García-López et al., 2008). Las ventajas
adicionales de la extracción MSPD son:

Bajo costo por extracción

No necesita instrumentación costosa

Consumo moderado de solventes orgánicos
2.3.1. Metodología general
De este modo, en el procedimiento de MSPD, una pequeña cantidad de
muestra (hígado, fruta, etc.) es puesta en un mortero de vidrio o ágata que
contiene una cantidad apropiada de fase ligada u otro material sólido de soporte.
Éstos son mezclados mecánicamente usando un pistilo de vidrio o ágata, por
aproximadamente 30 s. Los estándares internos o el dopado de la muestra se
deben hacer antes de este paso. Entonces el material mezclado es transferido y
18
empacado dentro de una columna o cartucho de extracción para llevar a cabo la
elución secuencial con solventes apropiados. La columna comprende los
componentes de la muestra, molidos y distribuidos en la fase ligada y el soporte,
produciendo una nueva fase que muestra características únicas debidas a la
dispersión de la muestra. De esta manera, deben de usarse un solvente o una
secuencia apropiada de solventes para limpiar la columna o eluir directamente el
compuesto de elección (Cámara, 2004, Carvalho et al., 2005, Kristenson et al.,
2006, Barker, S., 2007, García-López et al., 2008, Capriotti et al., 2010). El
procedimiento general se esquematiza en la Figura 4 (Capriotti et al., 2010). Las
co-columnas consisten en otra fase sólida o soportes cromatográficos, que pueden
ser incorporados para ayudar al aislamiento del analito o para mayor pureza del
extracto (Barker, S., 2007).
Figura 4. Esquema general del método de extracción por MSPD
El proceso que se lleva a cabo es un equilibrio de partición y adsorción, similar a lo
que ocurre en la cromatografía de columna; estos equilibrios son responsables de
la distribución del analito entre la fase dispersa y el solvente de elución (GarcíaLópez et al., 2008).
19
2.3.1.1.
Ventajas
La MSPD ha encontrado lugar en muchas aplicaciones, ya que elimina la
mayoría de las complicaciones que surgen al llevar a cabo las clásicas
extracciones líquido-líquido o en SPE de muestras sólidas o semisólidas (como
formación de emulsiones o partículas suspendidas), particularmente cuando se
trata de mezclas biológicas complejas. También es útil como tratamiento
preparativo para cromatografía, ya que para llevar a cabo una separación
cromatográfica la mayoría de las veces se requiere que la muestra esté
solubilizada para poder aplicarla directamente a la columna (Barker, S., 2007).
Éste método es rápido, menos laborioso y más eco-compatible (Capriotti et al.,
2010).
Además, los métodos clásicos para la preparación de muestras sólidas o
semisólidas para cromatografía usualmente consisten en varias combinaciones de
molienda, corte, pulverización y presurización de la muestra para devastar
completamente su arquitectura. Este paso usualmente es seguido de la adición de
solventes, ácidos, bases, amortiguadores, abrasivos, sales, detergentes y/o
quelantes en un esfuerzo para destruir completamente la arquitectura celular y la
composición de la muestra e iniciar la extracción y fraccionamiento de los varios
componentes de la muestra (Barker, S., 2007). Además, la MSPD puede ser
mejorada por extracción de los analitos con el solvente en un baño ultrasónico
previo a la elución (Capriotti et al., 2010).
2.3.1.2. Factores a considerar para MSPD
Algunos factores tienen que ser evaluados por su efecto en la extracciones
con MSPD (Kristenson et al., 2006, Barker, S., 2007, García-López et al., 2008,
Capriotti et al., 2010). Estos son:
1. Efecto de diámetro de partícula promedio: las partículas muy pequeñas (310 µm) requieren de largos tiempos de elución y necesitan grandes
20
presiones o alto vacío para lograrla. Las partículas de sílice en el rango de
40-100 µm trabajan bien, además de ser materiales más baratos.
2. Materiales encapsulados contra no encapsulados o materiales con carga de
carbono (8-18%).
3. Carácter de la fase ligada: dependiendo de la polaridad de la fase elegida,
hay efectos observados bastante drásticos en los resultados. Las
aplicaciones que requieren fases ligadas lipofílicas deben usar materiales
intercambiadores como C18 y C8.
4. Uso de sílice sin derivatizar u otros soportes sólidos: el uso de materiales
sin derivatizar o sin modificar, como arena, para mezclar la muestras no
trabajan necesariamente igual a otros soportes sólidos con fase ligada,
como el ODS. Sin embargo, si se aplican los mismos principios básicos;
ocurrirá una abrasión y disrupción de la muestra durante la mezcla. No
obstante, la disrupción completa de la muestra y la dispersión de
componentes solo ocurrirá en el grado en que los componentes interactúen
con las características de la superficie particulada y otros. Todas las
superficies tienen una química definida y muchas sustancias, incluyendo
varios minerales, servirán para mejorar el aislamiento de compuestos
específicos o clases de compuestos para lograr los resultados esperados. A
la fecha, materiales basados en sílice (sílice derivatizada, gel de sílice,
arena, florisil) han sido exclusivamente reportados en MSPD. También hay
reportado el uso de fibras de carbón activado, materiales poliméricos y
alúmina.
5. La mejor relación muestra/material sólido de soporte: la más aplicada es 1 a
4, respectivamente, pero varía de aplicación en aplicación. La mayoría de
los protocolos que usan materiales con fases ligadas lipofílicas (C 18, C8),
mezclan 2 g de soporte sólido con 0.5 g de muestra. Esta relación depende
de la aplicación y debe ser evaluada la mejor posible durante el desarrollo
del método.
21
6. Modificaciones químicas a la matriz o a la matriz sólida de soporte molida:
la adición de agentes quelantes, ácidos, bases, etc. y el tiempo de molido
afectan la distribución y elución de los analitos objetivo de la muestra. El
perfil de elución de los componentes de la matriz es afectado de manera
parecida.
7. La elección de los solventes óptimos y la secuencia de su aplicación a la
columna: la secuencia de elución de solventes trata de aislar el analito o
eliminar de la columna las sustancias interferentes. Las columnas MSPD
permiten aislar analitos de diferente polaridad o clases enteras de
compuestos químicos en un solo solvente o en solventes de diferente
polaridad que pasan a través de la columna, haciendo fácil de realizar con
la MSPD el aislamiento de multirresiduos y el análisis en una muestra
sencilla. El pre-acondicionamiento del material de soporte usado para
aplicaciones de la MSPD aumenta la recuperación de analito y extiende el
proceso de la mezcla y dispersión de la muestra. Esto es debido al
rompimiento de la tensión superficial que puede existir entre la mezcla y la
fase ligada del soporte sólido.
8. El volumen de elución: se ha observado que cuando se usa una columna
MSPD de 2 g de adsorbente mezclada con 0.5 g de muestra y con 8 ml de
elución,
los
analitos
usualmente
eluyen
en
los
primeros
4
ml,
aproximadamente equivalente a un volumen de columna. Esto varía para
cada aplicación y debe ser evaluado, con el fin de reducir el uso de solvente
y evitar la co-elución de posibles interferentes.
9. El efecto de la matriz: todos los componentes de la muestra son
dispersados a través de la columna, y éstos cubren gran parte de la
superficie de la fase ligada del soporte sólido, de esta forma crean una
nueva fase que puede tener efectos muy importantes en el aislamiento del
analito, estos efectos varían de una matriz a otra.
22
Las muestras sólidas requieren una selección más cuidadosa de los
adsorbentes dispersantes y los solventes de elución para mejorar el rendimiento
de toda la extracción, mientras se mantiene un nivel razonable de co-elución de
interferencias (García-López et al., 2008).
El eluente obtenido en MSPD puede ser tomado directamente para análisis
instrumental, ya que es considerado “limpio” para inyección directa. Sin embargo,
en algunos casos se requieren pasos adicionales para eliminar los componentes
de la matriz a co-eluir. Esto puede involucrar más aproximaciones a la SPE,
usando un segundo material sólido, co-columnas o columnas de separación
(Barker, S., 2007).
2.3.1.2.1. Elección de adsorbentes y solventes
Las aplicaciones clásicas de la MSPD emplean adsorbentes de fase
reversa como adsorbentes dispersantes. El octadecil (C18) ligado a gel de sílice
(ODS) es, por mucho, el más usado. Teóricamente, las partículas de sílice
destruyen la arquitectura gruesa de la muestra biológica, mientras que las
cadenas alquílicas de C18 contribuyen a disolver los componentes, proporcionando
extractos relativamente excentos de matrices grasas cuando se usan con
solventes polares (acetonitrilo, metanol, o combinaciones) como extractantes. En
general, las especies orgánicas de polaridad media son extraídas eficientemente
bajo estas condiciones (García-López et al., 2008).
Recientemente, muchas aplicaciones de la MSPD involucran la mezcla de
la muestra con soportes como silicatos sin derivatizar (gel de sílice, arena, etc.),
fibras de grafito, o soportes inorgánicos (florisil, alúmina, etc.) los cuales producen
la disrupción de la muestra, pero no poseen, aparentemente, las mismas
propiedades dispersantes (Barker, S., 2007).
Para aplicaciones de MSPD en fase normal se han propuesto adsorbentes
no ligados (florisil, alúmina y sílice). Estos interactúan con los componentes de la
muestra únicamente por adsorción, y obviamente, no son capaces de disolver la
matriz de la muestra. Las propiedades de adsorción de estos adsorbentes pueden
23
ser ajustadas dependiendo de su contenido de agua o de su carácter ácido-base
(García-López et al., 2008).
La selección de solventes está en función de la polaridad del analito. Las
sustancias no polares pueden ser recuperadas usando solventes apolares, por
ejemplo hexano, diclorometano, o mezclas de ambos. Cuando los analitos tienen
una polaridad media o alta, se prefiere acetonitrilo, acetona, acetato de etilo o
mezclas de agua con etanol o metanol (García-López et al., 2008).
En general, en las metodologías de extracción en fase sólida usando
sorbentes polares, el disolvente compite con los analitos (y/o compuestos
interferentes) por los sitios activos de adsorción del sorbente. De esta forma,
cuanto más polar es el disolvente, mayor poder de elución presenta. Este poder de
elución se establece a través de la fuerza eluotrópica (EΦ*), la cual es una medida
de la energía de adsorción del disolvente en un determinado sorbente. La serie
eluotrópica es una lista de disolventes ordenados en función de su capacidad
relativa para eluir los solutos en un determinado sorbente (Cámara, 2004). La
elución de un soluto de un sorbente de fase normal está típicamente en función de
la fuerza eluotrópica y la polaridad del solvente de eluido (Thurman et al., 1998).
En el Cuadro 5 se muestran las series eluotrópicas para sorbentes comúnmente
usados en extracción en fase normal (Deyl et al., 1975, Thurman et al., 1998,
Moldoveanu et al., 2002, Cámara, 2004).
Cuadro 5. Series eluotrópicas para el gel de sílice y florisil
Solvente
Polaridad (p')
Gel de sílice (EΦ*)
Florisil (EΦ*)
Acetonitrilo
6.2
0.5
0.35
Acetato de etilo
4.3
0.45
0.31
Cloruro de metileno
3.4
0.32
0.23
2.2.3. Extracción de policétidos por MSPD
Actualmente, no existe ninguna metodología donde se reporte la extracción
de estatinas por MSPD. Sin embargo, existen diversos estudios donde se aborda
24
la extracción de diversos policétidos por MSPD en matrices variadas, por ejemplo,
para la extracción de diversas micotoxinas en alimentos, tales como las aflatoxinas
y la patulina.
Blesa et al. (2003) desarrollaron la optimización de diferentes parámetros
para la extracción de aflatoxinas en cacahuates por MSPD. Para ello emplearon
alícuotas de 2 g de muestra y se mezclaron en un mortero con 0.5 g de arena y 2
g de diferentes adsorbentes (sílica, fenilsílica, C8 o C18, según el caso), se
molieron manualmente por 5 min usando un pistilo, para obtener una mezcla
homogénea. La mezcla fue introducida con 1 g de sílica dentro de una columna
cromatográfica de vidrio de 100 x 9 mm de d.i., se pasaron por la columna 4 mL de
hexano, 1 mL de dietil éter y 4 mL de cloruro de metileno y se descartaron.
Entonces, se eluyeron las aflatoxinas con 20 mL de solvente (etanol, acetona,
metanol, acetonitrilo-agua 9:1 v/v o acetonitrilo). El eluato se secó con N2 a 45 ºC.
Se añadió un volumen de 2 mL de metanol, se mezcló y se centrifugó a 5000 rpm
por 10 min. El extracto fue filtrado con acrodisco de nailon (0.45 µm), evaporado a
sequedad con N2 a 45 ºC, redisuelto con 100 µL de ácido trifluoroacético por 3
min, re-evaporado a sequedad con N2 a 45 ºC y se reconstituyó con 1 mL de
acetonitrilo-metanol-agua 1:1:1 v/v para su análisis por cromatografía de líquidos
con detector de fluorescencia. Como resultado, se obtuvieron recuperaciones
similares con los solventes probados, pero se consideró al acetonitrilo como el
mejor solvente debido a que proporcionó los extractos y perfiles cromatográficos
más limpios. En cuanto a los adsorbentes probados, no hubo diferencias
significativas entre el empleo de C8 y C18, pero sí entre C18, fenilsílica y sílica. Se
eligió al C18 como el mejor adsorbente debido a sus características hidrófobas y a
su gran afinidad por las aflatoxinas, produciendo perfiles cromatográficos más
limpios comparados con los resultantes del empleo de las otras fases. Además, el
empleo de sílica fue descartado debido a que produjo resultados heterogéneos. El
%R obtenido fue de 78-86% y la %DER se encontró en el rango de 4-7%.
En 2010, Rubert et al. estudiaron la optimización de las condiciones para la
extracción por MSPD de aflatoxinas en cereales. En este trabajo, se estudió la
25
influencia del adsorbente, el solvente de extracción y la relación muestra/solvente.
La metodología se resume como sigue: 1 g de muestra fue mezclado con 1, 2 ó 4
g de adsorbente (C18, C8, C18-C8, sílica, florisil, fenil o amino). La mezcla, una vez
homogénea, se introdujo en una columna de vidrio de 100 x 9 mm de d.i. y fue
eluida con 10 mL de solvente (diclorometano, acetato de etilo, hexano-acetonitrilo,
acetonitrilo, metanol-acetonitrilo o metanol). El extracto fue evaporado a sequedad
con N2 a 35 ºC. El residuo fue reconstituido a un volumen final de 1 mL con
acetonitrilo y filtrado con filtro de nailon con poro de 0.45 µm. El %R osciló entre
64-91% y la %DER fue menor al 19% en todos los casos. Las mejores condiciones
de extracción fueron con C18 como adsorbente, 10 ml de ACN como solvente de
elución, con una relación 1:1 g de adsorbente/muestra.
Por otra parte, Wu et al. (2008) aplicó la MSPD para la extracción de
patulina en jugo y concentrado de manzana. Para esto, 22 g de C18 se preacondicionaron con 15 mL de hexano, 15 mL de diclorometano y 15 mL de
metanol y se secó antes de su uso. Después, 2 g de C18 se mezclaron con la
muestra en un mortero, y se empacaron en un cartucho de 10 mL que contenía
0.4 de sulfato de sodio anhidro. Se comprimió y se añadieron 0.5 g de sulfato de
sulfato de sodio anhidro. Se lavaron las paredes de la columna con 3 mL de
hexano y se secó con corriente de aire. Este eluato se descartó, y se eluyó tres
veces con 3.0 mL de diversos solventes (diclorometano, acetato de etilo y
diclorometano-metanol 1:9 v/v). A este eluato se le añadió una gota de ácido
acético glacial y fue evaporado a sequedad en un baño de agua a 40 ºC bajo
corriente de N2. Finalmente, este residuo fue disuelto en 0.5 mL de solución
amortiguadora
de
ácido
acético.
El solvente
que
proporcionó
mayores
recuperaciones fue el diclorometano. Los %R obtenidos fueron de 89.80-103.16
con %DER entre 2.96-5-45%.
2.4.
Cromatografía líquida de alta resolución
La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más
ampliamente utilizada. Las razones son su sensibilidad, fácil adaptación a
determinaciones cuantitativas exactas, automatización, capacidad para separar
26
sustancias no volátiles o termolábiles, pero sobre todo, su amplia aplicabilidad a
sustancias que son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y a
la sociedad.
En las separaciones por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC,
high performance liquid chromatography) la muestra se disuelve en una fase móvil
líquida la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible fija en
una columna. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la
muestra se distribuyen en grados distintos entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase
estacionaria se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase móvil. En
cambio, los componentes unidos débilmente a la fase estacionaria se mueven con
gran rapidez. Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los
componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se
pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa (Skoog et al., 2008).
2.4.1. HPLC en la detección y cuantificación de lovastatina
Casi todos los ensayos empleados en la separación y cuantificación de
estatinas se han basado en el uso de HPLC o cromatografía de gases (GC),
siendo el HPLC el más popular. Las metodologías que emplean HPLC para la
separación de las estatinas están basadas en la separación en fase reversa, y la
fase estacionaria más comúnmente utilizada es C18. A menudo se utilizan
detectores UV, y raramente detectores de fluorescencia o de masas (Ertürk et al.,
2003). La mayoría sigue el método de Morovján (1997), incluyendo diversas
variantes, principalmente en la relación de solventes en la fase móvil, una mezcla
de ACN (acetonitrilo) / H3PO4 0.1%, que van desde 60:40 hasta 72:28 (Cuadro 6).
Éste método es muy usado independientemente del tratamiento previo que se le
da a la muestra, o si la lovastatina se encuentra en su forma β-hidroxiácida o
lactona. También se presentan variaciones en la λ de onda empleada en la
cuantificación, pero todas ellas son cercanas los máximos de absorción conocidos
para la lovastatina (231, 238 y 247 nm).
27
En general se sabe que la forma β-hidroxiácida de la lovastatina tiene un
menor tiempo de retención que la lactona cuando se hace la separación en fase
reversa (Friedrich et al., 1995). Además, existe una amplia variedad de estudios
donde se reporta en orden de elución de diversas estatinas (Li et al., 2005, Yang,
D. et al., 2006, Madan et al., 2007, Chairote et al., 2008).
Con base en los hallazgos obtenidos a partir de la investigación documental
antes presentada, se propone estudiar la extracción de lovastatina utilizando la
MSPD, analizando los factores que más impactan a los porcentajes de
recuperación que se pueden obtener usando esta técnica de extracción .
28
Cuadro 6. Condiciones cromatográficas para la separación, detección y cuantificación de estatinas usando HPLC con detector UV
Columna
Fase móvil
Columna C18, 250 x 4.6 mm ID
Columna C-18 (150mm x 3.9 mm, 4
µm)
Columna ODS (50x4.6 mm D. I.)
Columna Waters NovaPak C18
d
(150x3.9 mm D. I. .
Elución isocrática de ACN y agua acidificada (0.1%) con H3PO4
(65:35, 60:40, 72:28). Flujos que van de 0.5 a 1.5 mL/min
g
Columna Hypersil ODS
mm i.d
250 x 4-0
Merck LiChrosphere 60 RP-SelectB.
Columna C18 (4.6 x 250 mm ID,
partícula de 5 µm).
Columna de 250 x 4 mm D. I.,
columna termostatizada a 40ºC,
empacada con Sphersorb ODS 2-5
µ de tamaño de partícula.
Temperatura del horno, 40ºC
Columna Novapak C18
d
Columna C-18, 4.6 x 220 mm
Columna Symmetry C18 (150 mm x
3.9 D. I., 5 µm). La temperatura de
la columna fue ajustada a 30ºC
Columna Symmetry C18 (150 mm x
3.9 D. I., 5 µm). La temperatura de
la columna fue ajustada a 30ºC
e
f
Detección
(λ analítica,
nm)
235 ó 238
Referencias
Flujo de 1.0 mL/min. Fase móvil consistente en agua (pH ajustado a 2.5
con H3PO4/ACN//isopropanol (55:35:10, v:v:v) (solución A) y ACN
(solución B, corrido a razón de 50:50 (v:v) por 20 min.
h
Eluido a un flujo de 0.75 ml/min TFA 0.05% y ACN en diferentes
proporciones (55:45 v/v, 60:40 v/v, 67:33 v/v); agua y ACN (60:40 v/v y
65:35 v/v) en presencia de sulfato ácido de tetrabutilamonio 0.2% (v/v)
(PIC-A)
Fase móvil acetonitrilo:agua:ácido acético (70/30/0.5, v/v) a 1 mL/min.
238
(Morovján et al., 1997,
Samiee et al., 2003, Su et
al., 2003, Casas López, J.
et al., 2005, Sayyad et al.,
2007, Baños et al., 2009,
Panda
et
al.,
2009,
Pansuriya et al., 2009)
(Pattanagul et al., 2008)
238
(Manzoni et al., 1999)
237
Gradiente lineal, ACN-agua 0.1% ácido fórmico (100:0 v/v) en 20 min;
flujo a 0.5 ml/min
237
(Shen et al., 1996, Yang,
D. et al., 2006)
(Novak et al., 1997)
Fase móvil metanol 18 mM/H3PO4 (75:25, v/v) a un flujo de 0.6 ml/min.
Fase móvil fue de 80:20 ACN//H2O, a un flujo de 0.8 ml/min a
temperatura ambiente.
Fase móvil eluida con gradiente de ACN (eluente A) y TFA 0.1%
(eluente b). Elución con gradiente lineal (1 ml/min) de 35% a 75% A en
20 min y mantenido a 75% de A de 20 a 28 min.
El cromatograma fue realizado usando un gradiente de ACN (eluente
A) y TFA (eluente b). La elución con gradiente lineal (1 ml/min) de 35%
a 75% A en 20 min y mantenido a 75% de A de 20 a 28 min.
237
237
(Wei et al., 2007)
(Ou et al., 2009)
237
con
barrido
de
210 a 350
237,
con
barrido
de
210-350
(Li et al., 2004, Chairote et
al., 2008)
d
Tamaño de partícula: 5 µm, y la última tuvo partículas de 4 µm
ACN: acetonitrilo
H3PO4: Ácido ortofosfórico
g
Tamaño de partícula: 5 µm
h
TFA: ácido trifluoroacético
e
f
29
i
(Li et al., 2005)
III.
OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Desarrollar un método de extracción por MSPD en arroz fermentado con
Monascus purpureus y fortificado con lovastatina.
3.2. Objetivos particulares

Determinar
las
diferentes
condiciones
(adsorbente,
relación
muestra/adsorbente, solvente y volumen de elución) para la extracción de
lovastatina por MSPD en arroz fermentado con Monascus purpureus.

Evaluar el rendimiento de la extracción de lovastatina en arroz fermentado,
y fortificado con dicha sustancia, a diferentes niveles de concentración, a
las condiciones determinadas en el objetivo anterior.
30
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS
La parte que comprendió la producción de lovastatina por fermentación de
arroz utilizando al hongo Monascus purpureus y la obtención de muestra se llevó a
cabo en el Laboratorio de Biotecnología, de la Facultad de Ingeniería Química, de
la Universidad Autónoma de Yucatán (FIQ-UADY). Por otro lado, la parte del
tratamiento de la muestra y la extracción con MSPD, así como su análisis en
HPLC-PDA se realizaron en el laboratorio de Análisis Instrumental, de la FIQUADY.
De manera general, se utilizó material de cristalería típico de laboratorio. El
hongo que se empleó para la fermentación de arroz fue Monascus purpureus IMI
210765 fue obtenido de la National Collection of Industrial and Marine Bacteria. El
arroz que se fermentó fue de la variedad Oryza sativa adquirido en un comercio de
la ciudad de Mérida, Yucatán, México.
Entre los equipos que se emplearon destacan balanzas, bomba de vacío,
estufa de vacío Branstead Lab-Line Hi-Temp Vaccum Oven, rotavapor Büchi R205 con baño recirculador, baño ultrasónico con capacidad 2.8 L. Branson y
cromatógrafo de líquidos de alta resolución Agilent 1100 series, con bomba
cuaternaria y detector de arreglo de diodos, equipada con una columna
cromatográfica columna Hypersil ODS (C18) 5µm (Supelco) (250 x 4.6 mm d. i.).
Las sustancias químicas que se emplearon para la fase experimental se
enlistan a continuación: agar de papa y dextrosa para microbiología (Millipore),
ácido fosfórico (H3PO4) y ácido trifluoroacético (TFA) grado reactivo, acetonitrilo
(ACN), cloruro de metileno (CH2Cl2) y acetato de etilo (AcOEt) grado HPLC y
estándar de lovastatina (Lov-L) extraída a partir de Aspergillus terreus grado HPLC
(>98% pureza), ésta última proveída por Sigma Aldrich. Los adsorbentes utilizados
fueron florisil 60-100 mallas grado reactivo (Sigma Aldrich) secado a 650ºC por 4 h
y deactivado con 5% de agua, gel de sílice 230-400 mallas para cromatografía de
31
columna sin deactivar (J.T. Barker) secado a 180ºC por 2 h y dietilaminoetil
(DEAE) celulosa para intercambio iónico (J.T. Barker).
Para la recolección y análisis de los datos obtenidos a partir de la
cromatografía de líquidos de alta resolución, usada para detectar y cuantificar la
lovastatina, se usó el software ChemStation for LC 3D. Para el tratamiento
estadístico de los datos se empleó el software Statgraphics Centurion XV, así
como la hoja de cálculo Microsoft Excel 2007.
4.1. Metodología experimental
De manera general en la Figura 5 se muestra la metodología general de
este trabajo.
32
Cultivo inicial de M. purpureus
Propagación del hongo y
caracterización
Crecimiento en agar papa y
dextrosa
Microcultivos
Fermentación de arroz
Crecimiento en agua de lavado
de arroz
Inoculación de arroz
Fermentación de arroz
Toma de muestra
Determinación de condiciones de
extracción por MSPD
Adsorbentes y solventes
Adsorbentes, relación
muestra/adsorbente, solvente
y volumen de eluato
Evaluación de %R bajo condiciones
determinadas
%R a diferentes niveles de
dopado
Figura 5. Diagrama general de la metodología.
4.1.1. Propagación del hongo Monascus purpureus
Para la producción de lovastatina se empleó un cultivo de hongo Monascus
pupureus IMI 210765. Inicialmente se propagó y mantuvo en tubos inclinados con
agar de papa y dextrosa (APD) a 30ºC y fue sub-cultivado a intervalos de 30 días
(Sayyad et al., 2007, Panda et al., 2009).
33
En esta etapa se siguió la metodología modificada de Panda et al. (2009)
para la propagación de Monascus purpureus previo a la fermentación de arroz.
Primero, se preparó la suspensión de esporas a partir de tubos inclinados con
crecimiento activo, preparados como se indicó anteriormente. Para esto, a un tubo
inclinado de APD se le agregó 1 mL de agua destilada estéril, y se agitó con
movimientos circulares. Ésta suspensión de esporas se transfirió a un matraz
Erlenmeyer de 250 mL que contenía 100 mL de agua obtenida a partir del lavado
de arroz, previamente esterilizada y ajustada a un pH de 6. Finalmente, cada
cultivo fue incubado a 30ºC por tres días en una incubadora shaker Lab-Line®
Orbit a 110 rpm.
4.1.2. Fermentación de arroz con Monascus purpureus
Para la fermentación en fase sólida (FFS), se adquirió arroz tipo súper extra
de un comercio local. Inicialmente, 20 g de arroz previamente remojado en 50 mL
de agua destilada por 8 h se colocaron en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se
le añadieron 40 mL de agua destilada que contenía diferentes nutrientes
optimizados por Panda et al. (2009) (14.32 g de NH4Cl, 0.76 g de MgSO4·7H2O,
14.65 g NaCl y 0.54 g/L de CaCl2·2H2O por cada litro de solución). El pH del
medio se ajustó a 6.0 con HCl 0.1M o NaOH a la misma concentración,
dependiendo del pH inicial. El arroz ya preparado se esterilizó por 20 min a 121ºC
en una autoclave. Después de enfriarse, se inoculó con 5.0 mL de cultivo semilla
de M. pupureus en agua de lavado de arroz (preparados como se indicó en el
apartado anterior) a 30ºC por 14 días mezclando ocasionalmente con el propósito
de homogeneizar la muestra.
Para las muestras estériles, se preparó arroz y agua de lavado de arroz sin
inocular y ambos se incubaron bajo las mismas condiciones que las muestras
inoculadas.
34
4.1.3. MSPD diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente
4.1.3.1. Extracción de lovastatina usando MSPD
Debido a la falta de estudios previos de la extracción de estatinas por
MSPD, se realizó un estudio exploratorio para determinar los posibles solventes y
adsorbentes a utilizar en este trabajo.
A 0.5 g de muestra de fermentación sólida sin producción de lovastatina,
tomada después de transcurrido el tiempo de crecimiento del hongo según las
condiciones mencionadas en la sección 4.1.1., se le añadieron 200 µL de estándar
de Lov-L 0.1 mg/mL en ACN (concentración final de 40 µg/g), se homogeneizó con
una varilla de vidrio y se dejó reposar 15 min para que el solvente se evaporara.
Luego, se colocó la muestra en un mortero de vidrio de 50 mL de capacidad, y se
añadieron 2.0 g del adsorbente de prueba correspondiente, de acuerdo al diseño
experimental; después, ambos se mezclaron por 1 min con un pistilo de vidrio. La
mezcla se introdujo en una columna de polietileno (15 x 85 mm) con capacidad de
10 mL con un papel Whatmann No. 1 previamente colocado al fondo como soporte
de la columna. La mezcla fue eluida con 8 ml de solvente de prueba de acuerdo
con el diseño experimental, esto con el fin de determinar las mejores condiciones
de elución. El eluato obtenido fue concentrado a sequedad con flujo de aire,
resuspendido en 1 ml de ACN grado HPLC, centrifugado a 5,000 rpm por 10 min y
finalmente fue filtrado a través de una membrana de PTFE (0.45 µm) previo al
análisis. Esto se realizó por triplicado para cada tratamiento.
Para el diseño experimental se usó un diseño factorial 3 2, donde se
evaluaron dos factores con tres diferentes niveles cada uno (Gutiérrez Pulido et
al., 2008), el diseño se describe en el Cuadro 7. Los factores analizados fueron
adsorbente y solvente, y sus respectivos niveles de factor fueron para el
adsorbente: florisil (+), gel de sílice (0) y DEAE celulosa (-); para el caso del factor
solvente los niveles empleados fueron: acetato de etilo (+), cloruro de metileno (0)
y acetonitrilo (-). La variable de respuesta empleada para el análisis estadístico fue
la recuperación (%R) de la lovastatina obtenida con cada tratamiento, calculada
35
como
, además se calculó la DER
(desviación
estándar
relativa)
como
y
,
donde
. Con esto se determinó el efecto
del solvente y el adsorbente en el %R de lovastatina.
2
Cuadro 7. Matriz experimental para el diseño factorial 3 de la extracción de lovastatina por MSPD.
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Adsorbente
+
0
+
0
+
0
-
Solvente
+
+
+
0
0
0
-
11
El análisis por HPLC-PDA fue realizado con una columna Hypersil ODS 5
µm, 4.6 x 250 mm, y un volumen de inyección de 20 µL. La fase móvil consistió en
una mezcla isocrática de ACN con H3PO4 0.1% (58:42 v/v) a un flujo de 1.2
mL/min. La detección se realizó a 235 nm, con un barrido espectral de 190-260
nm.
4.1.4. Evaluación del efecto de matriz
Se realizaron dos curvas de calibración, una en ausencia de la matriz de la
muestra, y otra en presencia de la matriz, a fin de determinar la existencia de
efecto de matriz, que pudiese afectar en una sobre o sub estimación del analito.
Para preparar la matriz de la muestra se usó la misma metodología de
extracción por MSPD que la indicada en el apartado 4.1.3. MSPD diseño factorial
32, adsorbente vs. solvente, usando como adsorbente gel de sílice y como
solvente
10
11
acetato
de
etilo
previamente
determinados
Adsorbentes: florisil (+), gel de sílice (0) y DEAE celulosa (-).
Solventes: acetato de etilo (+), cloruro de metileno (0) y acetonitrilo (-).
36
en
la
evaluación
adsorbente/solvente del experimento anterior. Finalmente, se prepararon los
estándares como se indica en el Cuadro 8. Todos los estándares se centrifugaron
a 5,000 rpm por 10 min y se filtraron a través de una membrana de PTFE (0.45
µm) previo al análisis cromatográfico. La respuesta fue el área debajo los picos del
estándar (Y).
Cuadro 8. Preparación de la curva de calibración de lovastatina en ACN a diversas concentraciones
Concentración
Lov-L en ACN
Lov-L + matriz + ACN
Vsolución
Vaforo
Vsolución
madre
ACN
madre
(µL)
(µL)
(µL)
0
0
1000
20
20
40
estándar
Vaforo ACN
Vaforo matriz
(µL)
(µL)
0
100
900
980
20
80
900
40
960
40
60
900
60
60
940
60
40
900
80
80
920
80
20
900
100
100
90
100
0
900
(µg/mL)
Las condiciones de análisis por HPLC-PDA fueron las mismas que las
indicadas en la sección 4.1.3.1. Extracción de lovastatina usando MSPD.
Para determinar si la curva de calibración Lov-L + matriz en ACN coincidía
con la Lov-L en ACN, se utilizó el método basado en un modelo de regresión lineal
múltiple con una variable indicadora Z (Kleinbaum et al., 1998). Con éste método
se asignan diferentes valores a la variable indicadora para distinguir a cada una de
dichas curvas (0 si fue en presencia de la matriz de la muestra, y 1 si fue realizada
únicamente en presencia del solvente), para que finalmente ambas sean descritas
por medio de una sola ecuación:
, donde Y=área,
X=concentración, E=error aleatorio. Posteriormente se realizó la prueba de
coincidencia de ambas rectas aplicando dicho modelo. Las pruebas estadísticas
fueron consideradas significativas cuando P<0.05.
37
4.1.5. Diseño experimental factorial 24 no replicado
Después del experimento exploratorio para investigar la combinación
solvente-adsorbente adecuada para la extracción por MSPD, se decidió probar
estos factores en combinación con otros dos factores importantes en este tipo de
extracción, como la relación muestra/adsorbente y el volumen de eluato de la
columna. Por ello, se propuso el uso de un experimento con diseño factorial 2 4 no
replicado (Montgomery, 2004, Gutiérrez Pulido et al., 2008), consistente en cuatro
factores con dos niveles de tratamiento cada uno. Los factores estudiados fueron:
absorbente (A: sílica, florisil), relación masa muestra/adsorbente (B: 1:1, 1:4),
solvente (C: AcOEt, ACN) y volumen de elución (D: 4 mL, 8 mL), que maximicen el
%R de la Lov-L.
Para ello se empleó la metodología previamente indicada en el apartado
4.1.3. MSPD diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente. La masa de muestra
usada fue de 0.5 g. A ésta se le añadieron 30 µL de solución estándar de Lov-L
con concentración de 1000 µg/mL, para llegar a una concentración esperada de
60 µg/mL en la muestra de arroz fermentado, y de 30 µg/mL de Lov-L en el
extracto final previo a su inyección en el equipo de HPLC. Los factores evaluados
con sus respectivos niveles se muestran en el Cuadro 9.
4
Cuadro 9. Factores empleados con sus respectivos niveles para el diseño factorial 2 no replicado
Factor
Niveles del factor
A: Adsorbente
B: Relación masa muestra/adsorbente
C: Solvente
D: Volumen eluato (mL)
(-)
(+)
Gel de sílice
Florisil
1:1
1:4
Acetato de etilo (AcOEt)
Acetonitrilo (ACN)
4
8
La respuesta empleada para el análisis estadístico fue la recuperación
obtenida con cada tratamiento (%R). Esto se hizo para determinar el mejor
tratamiento para la extracción de Lov-L a una concentración de 60 µg/g en el arroz
fermentado. La matriz experimental se muestra en el Cuadro 10.
38
4
Cuadro 10. Matriz experimental para el diseño factorial 2 de la extracción de lovastatina por MSPD
Tratamiento
Factor
Notación de
A
B
C
D
Yates
1
-
-
-
-
(1)
2
+
-
-
-
a
3
-
+
-
-
b
4
+
+
-
-
ab
5
-
-
+
-
c
6
+
-
+
-
ac
7
-
+
+
-
bc
8
+
+
+
-
abc
9
-
-
-
+
d
10
+
-
-
+
ad
11
-
+
-
+
bd
12
+
+
-
+
abd
13
-
-
+
+
cd
14
+
-
+
+
acd
15
-
+
+
+
bcd
16
+
+
+
+
abcd
Las concentraciones finales reales después de cada tratamiento fueron
obtenidas partir de una regresión lineal de la curva de calibración preparada a
partir de una solución madre de concentración de 1000 µg/mL como se describe
en el Cuadro 11. Una vez hallada la concentración final en cada tratamiento, se
calculó %R como
.
39
Cuadro 11. Preparación de curva de calibración de 0-60 µg/mL de lovastatina empleando ACN como
solvente
Concentración
Volumen de solución madre
Volumen de ACN añadido
(µg/ml)
(µL)
(µL)
0
0
1000
10
10
990
20
20
980
30
30
970
40
40
960
50
50
950
60
60
940
Las condiciones de análisis por HPLC-PDA fueron las mismas que las
indicadas en experimentos anteriores.
4.1.6. Recuperación de Lov-L usando MSPD a diferentes niveles de
fortificación
Una vez establecidas las condiciones de extracción de Lov-L usando
MSPD, se probó la recuperación de este analito a diferentes concentraciones en el
arroz fermentado.
Para ello se siguió la metodología establecida en la sección 4.1.5. Diseño
experimental factorial 24 no replicado. En este experimento, a la muestra de
fermentación sólida se le añadieron 30, 90 y 150 µL de una disolución de Lov-L
(1.0 mg/mL) en ACN (niveles de fortificacion), para obtener concentraciones de 60,
180 y 300 µg/g de Lov-L en el arroz fermentado, respectivamente, antes de
realizar la extracción por MSPD. Esto se hizo por triplicado para cada nivel de
dopado de Lov-L.
Para su análisis, se usó la metodología HPLC indicada ya en experimentos
anteriores.
Se calculó la recuperación (%R), y se obtuvo la concentración de Lov-L
interpolando los valores dentro de una curva de calibración preparada como se
40
describió en experimentos anteriores, con concentraciones 0-200 µg/mL. Luego se
compararon los %R obtenidos para cada nivel de dopado de Lov-L, para ver su
comportamiento.
4.1.7. Observación micro y macroscópica de M. purpureus
Para observar la morfología macroscópica de las colonias de hongo se
empleó un cultivo de hongo M. pupureus IMI 210765 indicado anteriormente. Se
tomó una azada de la suspensión de esporas en agua de arroz preparada como
se indicó en la sección 4.1.1. Propagación del hongo Monascus purpureus y se
transfirió a cajas de Petri que contenían agar de papa y dextrosa. Estos cultivos se
incubaron en posición invertida por 30 días a 30 ºC.
Para observar la morfología microscópica de M. purpureus se recurrió a la
técnica del microcultivo. Para ello se cortaron cubos de agar de papa y dextrosa
previamente preparado, de aprox. 1 cm de cada lado y se depositaron sobre un
portaobjetos estéril situado en una caja de Petri vacía. A cada lado del cubo de
agar del inoculó con M. purpureus, se colocó sobre el agar un cubreobjetos y
finalmente se colocó la tapa de la caja de Petri, incubándose en ambiente húmedo
durante 30 días a 30 ºC.
El microscopio empleado para la observación fue un Carl Zeiss Axiostar
Plus, equipado con una cámara Cannon de 14 MP. Para la observación en el
microscopio, se tiñó usando azul de lactofenol como colorante de contraste (Prats,
2005).
41
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. MSPD diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente
Después de haber obtenido los perfiles cromatográficos de los extractos
obtenidos a partir de MSPD, se identificó el tr de la Lov-L, así como su espectro en
la región UV del espectro electromagnético. Una vez identificados estos picos de
Lov-L, se calcularon las áreas de estos por integración y a partir de estos datos se
calcularon las recuperaciones para cada tratamiento probado. Todo lo anterior fue
de acuerdo a lo planteado en el apartado 4.1.3. MSPD diseño factorial 32,
adsorbente vs. solvente. Los resultados gráficos de estos cálculos se muestran en
la Figura 6.
2
Figura 6. Porcentajes de recuperación obtenidos en el experimento factorial 3 .
42
Cabe destacar que al utilizar CH2Cl2 como solvente de elución, no se
observó el pico de la lovastatina en el perfil cromatográfico para ninguno de los
adsorbentes, por lo que se descartó su uso para la extracción de Lov-L por MSPD.
Esto puede explicarse en función de la fuerza eluotrópica. La fuerza eluotrópica
del cloruro de metileno es baja comparada con las de los otros dos solventes
empleados, ya sea en florisil o gel de sílice, como se presentó en el Cuadro 5
(Deyl et al., 1975, Thurman et al., 1998, Moldoveanu et al., 2002, Cámara, 2004),
por lo cual no tuvo la fuerza suficiente para eluir de la columna los compuestos de
polaridad media (como la Lov-L) y de polaridad alta.
En cuanto a los %R mayores al 100%, pudieron deberse a la forma en que
se realizó el cálculo de %R, debido a que no se empleó una curva de calibración, y
que únicamente se empleó una réplica del estándar a 20 µg/mL para éste fin, lo
cual produjo error.
Como se observa en la Figura 6, cuando se emplea DEAE celulosa las
recuperaciones son notablemente menores comparadas con el uso de los otros
dos adsorbentes, por lo que se descartó su uso en esta metodología. Estas bajas
recuperaciones pueden deberse a interacciones intermoleculares entre el analito
con el adsorbente, las cuales impiden la elución completa del analito. Estas
interacciones intermoleculares pueden ser puentes de hidrógeno o fuerzas dipolodipolo.
Los perfiles cromatográficos para los extractos obtenidos con acetato de
etilo (AcOEt) y acetonitrilo (ACN) se muestran en la Figura 7 y 8, respectivamente.
La línea punteada indica el tr de Lov-L. Cabe destacar que los perfiles mostrados
no se encuentran a la misma escala, para facilitar la identificación lo Lov-L en las
imágenes.
43
Figura 7. Comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos usando acetato de etilo como
solvente con los diferentes adsorbentes probados
Figura 8. Comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos usando acetonitrilo como solvente
con los diferentes adsorbentes probados
44
Finalmente, debido a que los experimentos aquí presentados no fueron
concluyentes se planteó realizar experimentos adicionales en los cuales se
evaluara el efecto de otras variables que afectan a las extracciones por MSPD,
como la relación muestra/adsorbente y el volumen de eluato recuperado de la
elución de solvente a través de la columna MSPD.
5.2. Evaluación del efecto de matriz
Se evaluó el efecto matriz que pudiera presentarse bajo las condiciones
experimentales previamente determinadas en este trabajo (sección 5.1. MSPD
diseño factorial 32, adsorbente vs. solvente) y que darían lugar a una sobre o sub
estimación del analito.
En el Cuadro 12 se muestran los datos obtenidos experimentalmente para
ambas curvas de calibración, así como el valor de la variable indicadora
asignado a cada una (0 si fue en presencia de la matriz de la muestra, y 1 si fue
realizada únicamente en presencia del solvente).
Cuadro 12. Datos obtenidos para las curvas de calibración, con su correspondiente valor para la
variable Z.
Concentración (µg/mL)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Área
0
835.7
1357.2
2191.6
2900.3
3597.4
0
632
1498.6
2206.3
3095.5
3669.3
Z
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
A partir de estos datos, se realizó la comparación de ambas curvas de
calibración, como se muestra en el Anexo 2. Comparación de curvas de
calibración usando a la variable indicadora Z.
45
Finalmente, se determinó que las rectas son coincidentes
, lo cual significa que la curva de calibración de Lov-L en el intervalo de
concentraciones probado no se requiere preparar en presencia de la matriz, por lo
cual se puede usar la curva de calibración únicamente con el analito y el solvente.
(X 1000.0)
4
Curva
M
S
Á re a
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
Concentración
Figura 9. Comparación de las curvas de calibración Lov-L + matriz en ACN (M) y la de Lov-L en ACN (S)
Debido a lo anterior, se concluyó que existe una ausencia de efecto de la
matriz, ya que, aunque las rectas tienen diferentes pendientes e interceptos no
hay una diferencia significativa entre ellas. Por lo tanto, se consideró que el
proceso de calibración se puede llevar a cabo preparando los estándares de Lov-L
en solvente (ACN), lo que simplifica el procedimiento analítico.
5.3. Diseño experimental factorial 24 no replicado
De acuerdo a lo realizado según 4.1.5. Diseño experimental factorial 24 no
replicado, se obtuvo la curva de calibración que se muestra en la Figura 10, con su
correspondiente función de calibración y coeficiente de determinación R2.
46
3500
3000
y = 51.29x - 31.031
R² = 0.997
Área (uA)
2500
2000
1500
Área de pico
1000
Lineal (Área de pico)
500
0
0
10
20
30
40
50
60
Concentración (µg/mL)
Figura 10. Curva de calibración de Lov-L (0-60 µg/mL)
A partir de esta recta de regresión lineal y de las áreas de pico resultantes
de los diferentes tratamientos se obtuvieron las recuperaciones para cada
tratamiento (Cuadro 13).
Una vez hallados estos valores, se procedió a hacer el análisis del
experimento de acuerdo a lo recomendado por Montgomery (2004) y Gutiérrez
Pulido et al. (2008), como se muestra en el Anexo 3. Análisis estadístico para el
diseño experimental factorial 24 no replicado.
Para el análisis de estos datos, se tomó la interpretación obtenida a partir
las mejores recuperaciones de lovastatina se dan de la Figura 18, donde se
concluyó que las mejores recuperaciones se dieron en las siguientes condiciones:
1) con una relación 1:4 masa muestra/adsorbente y acetato de etilo como solvente
se obtuvo la mayor recuperación, 2) con gel de sílice como adsorbente y relación
1:4 masa muestra/adsorbente se obtuvo la segunda mayor recuperación, 3) con
florisil como adsorbente y acetato de etilo como solvente se obtuvo la tercera
mayor recuperación, y 4) cuando se usa un volumen de elución de 8 mL.
47
4
Cuadro 13. Resultados para el diseño del experimento 2 no replicado.
Tratamiento
Factores
Recuperación (%)
Al Bm Cn Do
Al
final,
1
-
-
-
-
25.9
2
+
-
-
-
88.2
3
-
+
-
-
89.0
4
+
+
-
-
97.3
5
-
-
+
-
81.9
6
+
-
+
-
60.3
7
-
+
+
-
89.8
8
+
+
+
-
37.2
9
-
-
-
+
77.9
10
+
-
-
+
83.8
11
-
+
-
+
96.3
12
+
+
-
+
71.6
13
-
-
+
+
75.4
14
+
-
+
+
85.0
15
-
+
+
+
73.6
16
+
+
+
+
34.1
las
combinaciones
que
proporcionaron
las
más
altas
recuperaciones fueron:
a) A en el nivel bajo (sílica), B en el alto (1:4), C en el bajo (acetato de etilo) y
D en el alto (8 ml).
b) A en el nivel alto (florisil), B en el alto (1:4), C en el bajo (acetato de etilo) y
D en el bajo (4 ml).
l
Adsorbente, (-): sílica, (+)florisil.
Relación masa muestra/adsorbente, (-): 1:1, (+): 1:4
n
Solvente, (-): AcOEt, (+): ACN)
o
Volumen de elución, (-): 4 mL, (+): 8 mL),
m
48
Finalmente, al considerar la economía del método, se optó por la primera
opción, debido al precio más económico del gel de sílice, comparado con el uso de
florisil (Sigma-Aldrich, 2012).
5.4. Recuperación de Lov-L usando MSPD a diferentes niveles de
fortificación
Se obtuvieron las áreas de pico en los perfiles cromatográficos, y se
interpolaron estos valores en una curva de calibración de Lov-L, obtenida a partir
de una recta de regresión lineal (Figura 11). El valor del coeficiente de
determinación R2 fue de 99.7047.
Gráfico del Modelo Ajustado
Área = 38.8909 + 59.9075*Concentración
(X 1000)
15
Área
12
9
6
3
0
0
40
80
120
Concentración
160
200
Figura 11. Curva de calibración para Lov-L
Una vez interpolados los valores en la recta de regresión lineal, y de
acuerdo a los cálculos indicados para el experimento anterior, se calculó %R y
DER. Los resultados se muestran en el Cuadro 14.
49
Cuadro 14. Recuperación y precisión de Lov-L añadida a muestras de arroz por MSPD
Nivel de dopado (µg/mL)
30
90
150
Concentración en arroz (mg/g)
0.06
0.18
0.30
%R
101.4
75.7
66.5
DER
1.9
12.6
7.0
En general, los %R obtenidos a partir del método optimizado fueron del
66.45-101.42%, con una DER de 1.9-12.6%. Además, se observa que los %R
disminuyen conforme aumenta la concentración de lovastatina en el arroz. Esto
puede deberse a que los componentes de la matriz son más afines al solvente que
la Lov-L, y menos afines al adsorbente que el analito, por lo cual eluyen
preferentemente de la columna y Lov-L queda adsorbida en la superficie del gel de
sílice, y cuánto más Lov-L existe menos eluye, por lo cual si aumenta su
concentración disminuye su %R.
Comparados estos %R con los reportados en la literatura para extracciones
por MSPD de policétidos, mostrados en el Cuadro 15, los %R obtenidos en este
trabajo son cercanos a los reportados, por lo que se consideran adecuados
tratándose de ésta técnica. Sin embargo, si se comparan estos datos con los
reportados para las extracciones de lovastatina usando solventes, la DER es
mayor usando extracción por MSPD y el %R obtenido es menor, por lo cual se
concluye que la MSPD no proporciona resultados tan precisos como los obtenidos
por extracciones con solventes.
Cuadro 15. Rendimientos de extracción de diversos policétidos
Analito
Método de extracción
%R
DER
Referencia
Aflatoxinas
MSPD
78-86
4-7
(Blesa et al., 2003
Aflatoxinas
MSPD
64-91
19p
(Rubert et al., 2010)
Patulina
MSPD
85.23-103.16
2.96-5.45
(Wu et al., 2008)
Lovastatina
Solventes
95-98
-------
(Morovján et al., 1997)
Lovastatina
Solventes
98.9
1.2
(Li et al., 2005)
Lovastatina
Solventes
90
-------
(Samiee et al., 2003)
p
Desviación estándar
50
Finalmente, en trabajos futuros se sugiere analizar el comportamiento del
%R de Lov-L usando concentraciones mayores a las presentadas en este trabajo,
para estudiar si las condiciones de extracción previamente probadas siguen
siendo adecuadas para la extracción de Lov-L, ya que si se consideran los
rendimientos de fermentaciones de arroz usando al hongo M. purpureus
reportadas en la literatura, que van de 3.42 mg/g (Panda et al., 2009) a 33.79 mg/g
(Chairote et al., 2008), las concentraciones probadas en estos experimentos son
cuando menos 10 veces menores a la menor concentración reportada en la
literatura para producción de lovastatina.
5.5. Observación micro y macroscópica de M. purpureus
Se hizo la observación macro y microscópica de las colonias formadas en
agar de papa y dextrosa. En la Figura 12 se observa un comparativo de la
morfología macroscópica de colonias de M. purpureus, en el caso de la Figura
12a) se muestra lo reportado por Chairote et al. (2008), y en la Figura 12b) se
muestran las colonias obtenidas en los experimentos realizados en este trabajo a
los 17 días de incubación a 30 ºC. En la Figura 12a), las colonias presentaron un
color rojo característico, indicativo de envejecimiento del cultivo; mientras que en
b) se observa que la cepa empleada en este trabajo produjo un halo rojo alrededor
de la colonia, indicativo de la difusión en el agar de los pigmentos producidos por
la cepa. Además, ésta última presentó micelio aéreo de color amarillo, lo cual fue
indicativo de envejecimiento del cultivo, pero menor que el de la cepa reportada en
la literatura.
Cabe resaltar que la cepa reportada por Chairote et al. (2008) es la
denominada CMU001, aislada a partir de arroz rojo comercial en Tailandia,
mientras que la cepa empleada en este trabajo es la IMI 210765, la cual según la
American Type Culture Collection (ATCC, 2012), corresponde con la cepa ATCC
16365, aislada de granos de arroz fermentado por Went (1895), misma que ya ha
sido reportada como productora de lovastatina por Pattanagul et al. (2008).
51
b
Figura 12. Morfología macroscópica de colonias de M. purpureus en agar de papa y dextrosa (a)
colonias reportadas por Chairote et al. (2008)
Además, se hicieron observaciones microscópicas del hongo y se comparó
con lo reportado con Chairote et al. (2008) (a y b) y lo observado en este trabajo
(c,d y e) como se muestra en la Figura 13.
a
b
d
c
e
Figura 13. Comparación de observaciones microscópicas
En la Figura 13a) se observan varios estados del crecimiento de ascomata
y la formación de conidios, que se señalan con flechas, lo cual no se pudo
52
observar en los experimentos de este trabajo, debido a la resolución del
microscopio. En la Figura 13b) Se observa al conióforo con su conidio, de forma
similar a lo que se observa en la Figura 13c), d) y e). En la Figura 13d) se
observan las hifas y los conióforos, además de las hifas septadas. En la Figura
13e), se observa al conióforo y una espora ovoide liberada por éste.
Pese a las similitudes morfológicas observadas, existen diferencias entre la
cepa de este trabajo y la reportada por Chairote et al. (2008). Estas diferencias
morfológicas pueden deberse a diversos factores, como la diferencia entre las
colecciones de cepas; por ejemplo, la cepa empleada en este trabajo requirió que
se tiñiera la preparación con azul de lactofenol, debido a la ausencia de coloración
del hongo, a diferencia de lo mostrado por la cepa empleada por Chairote et al.
(2008). Además, bajo las condiciones experimentales de este trabajo esta cepa no
fue productora de lovastatina, tal como indican todos los experimentos de
extracción usando MSPD, ya que en las muestras donde no se añadió Lov-L o
Lov-H no se observaron los picos en los tiempos característicos.
Esta ausencia de capacidad productora de lovastatina puede deberse a la
falta de un correcto mantenimiento de la cepa, esto debido a la siembra sucesiva
del hongo para su mantenimiento. Lo recomendable para la conservación de
hongos es la liofilización, y los medios recomendados para hacer la suspensión
son suero, azúcares y leche descremada. Los hongos pueden ser fácilmente
preservados en nitrógeno líquido en conjunción con agentes protectores que se
han probado satisfactoriamente para grupos de hongos que no resisten la
liofilización (Lapage et al., 1990). Además, para evitar las posibles mutaciones en
la cepa que puedan afectar su actividad metabólica, se deben de evitar en lo
posible las siembras sucesivas, ya que de esta forma se aumenta la probabilidad
de mutaciones, y con ello, cambios metabólicos en el microorganismo.
53
VI.
CONCLUSIONES
La MSPD es una técnica que permite extraer lovastatina en muestras de
arroz fermentado con el hongo M. purpureus fortificadas, debido a la facilidad de
preparación de la muestra que aporta este método, comparado con los métodos
clásicos de extracción.
Se demostró la ausencia de efecto de matriz en los extractos obtenidos por
fermentación de arroz usando a M. pupureus fortificados con lovastatina, por lo
que no se requiere el uso de la adición estándar para la determinación de este
analito.
Las mejores condiciones de extracción encontradas que maximizaron los
porcentajes de recuperación fueron usando a) gel de sílice como adsorbente en
una relación 1:4 muestra/adsorbente, 8 mL de acetato de etilo como solvente de
elución, o b) y florisil como adsorbente en una relación 1:4 muestra/adsorbente,
eluyendo con 4 mL de acetato de etilo. Debido al costo de los reactivos y el tiempo
que requieren para prepararlos, se recomienda emplear el método a).
Las recuperaciones obtenidas a partir de diferentes concentraciones
iniciales de lovastatina (0.06-0.30 mg/g) estuvieron en el intervalo de 66.5-101.4%
con una DER 1.9-12.6% y disminuyeron al aumentar la concentración de
lovastatina. Se concluye que éstos valores son aceptables tratándose de
extracciones por MSPD, y aunque no son mayores que los obtenidos por
extracción con solventes, hacen de la MSPD un método con potencial para la
extracción de este analito.
54
VII.
REFERENCIAS
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60
VIII. ANEXOS
Anexo 1. Índice de abreviaturas y símbolos
ACN
Acetonitrilo
AcOEt
Acetato de etilo
APD
Agar de papa y dextrosa
DEAE
Dietil aminoetil
DER
Desviación estándar relativa
E
Φ*
Fuerza eluotrópica
FFS
Fermentación en fase sólida
HMG
3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
HPLC-PDA Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a un detector
de
arreglo
de
diodos,
del
inglés
high
performance
liquid
chromatography with photodiode array detector
LOD
Límite de detección
LOQ
Límite de cuantificación
Lov-H
Lovastatina en su forma β-hidroxiácida
Lov-L
Lovastatina en su forma lactona
MSPD
Dispersión de matriz en fase sólida, del inglés matrix solid phase
dispersion
ODS
Octadecil silano
%R
Porcentaje de recuperación
SC
Suma de cuadrados
SPE
Extracción en fase sólida, del inglés solid phase extraction.
TFA
Ácido trifluoroacético
61
Anexo 2. Comparación de curvas de calibración usando a la variable
indicadora Z.
Todo
el
análisis
estadístico
fue
realizado
utilizando
el
software
STATGRAPHICS Centurion XV.
Para probar si la curva de calibración Lov-L + matriz en ACN coincidía con
la Lov-L en ACN, se utilizó el método basado en un modelo de regresión lineal
múltiple con una variable indicadora Z, que fue empleada para distinguir las rectas
que fueron comparadas (Kleinbaum et al., 1998). El modelo empleado para
comparar estas rectas está dado por la ecuación 1:
(Ecuación 1)
donde
área de pico de Lov-L,
concentración de Lov-L y
es una variable
indicadora que indica la curva de calibración (0 si fue en presencia de la matriz de
la muestra, y 1 si fue realizada únicamente en presencia del solvente).
Si se sustituyen los valores de la variable indicadora para cada caso
(
) en la Ecuación 1, se obtienen los modelos para cada una de las
rectas:
(Ecuación 2) y
(Ecuación 3)
Ésta última se puede factorizar como
(Ecuación 4)
A partir de los datos experimentales mostrados en el Cuadro 12, se obtuvo
el modelo ajustado, el cual se muestra en la Ecuación 5:
(Ecuación 5)
62
En la ecuación anterior se sustituyeron los valores de
(0 si fue en
presencia de la matriz de la muestra, y 1 si fue realizada únicamente en presencia
del solvente) tal como se hizo para las Ecuaciones 3 y 4, obteniendo así las
ecuaciones separadas de ambas líneas rectas:
(Ecuación 6)
(Ecuación 7)
Además, se obtuvo el ANOVA (Cuadro 16 y Cuadro 17), necesario para responder
las preguntas de la inferencia estadística acerca de este modelo (Ecuación 5).
Cuadro 16. ANOVA obtenido a partir del análisis de la regresión múltiple.
Fuente
Modelo
Residuo
Total
(Corr.)
Suma de
Cuadrados (SC)
1.89338x107
47307.1
1.89811x107
Grados de
libertad
3
8
11
Cuadrado
Medio (CM)
6.31125x106
5913.39
Razón-F
Valor-P
1067.28
0.0000
Cuadro 17. ANOVA adicional para variables según el orden de introducción
Fuente
Suma de
Cuadrados (SC)
ConcentracionX 1.89152 x107
Interceptos
4015.02
Pendientes
14596.2
Modelo
1.89338 x107
Grados de
libertad
1
1
1
3
Cuadrado
Medio (CM)
1.89152 x107
4015.02
14596.2
RazónF
3198.70
0.68
2.47
Valor-P
0.0000
0.4338
0.1548
Una vez obtenidas las Ecuaciones 6 y 7, se procedió de acuerdo al
algoritmo mostrado en la Figura 14 (Kleinbaum et al., 1998) para hacer la prueba
de coincidencia de ambas rectas a partir del modelo completo (Ecuación 5).
63
Empezar con el método completo:
Inicio
Probar
No significativa
Significativa
Se concluye
coincidencia.
Prueba de coincidencia
Probar
Significativa
Prueba de
paralelismo
No significativa
Sí
Probar
usando
variables
añadidas a la
última prueba.
¿Se quiere
probar que los
interceptos son
iguales?
No significativa
No
Se concluye que
las rectas no son
paralelas y tienen
diferentes
interceptos.
Se concluye que
las rectas no son
paralelas y tienen
el mismo
intercepto.
Significativa
Se concluye que las rectas
no son paralelas y tienen
diferentes interceptos.
Se concluye que las rectas
no son paralelas y tienen
diferentes interceptos.
Fin
Figura 14. Algoritmo para comparar dos líneas rectas usando a la variable indicadora Z.
64
En la prueba de coincidencia, la hipótesis para probar que ambas líneas de
regresión son coincidentes fue:
(Ecuación 7)
Si la hipótesis anterior no se rechaza, el modelo de la Ecuación 4 se reduce
a
(Ecuación 8)
que coincidió con el modelo de la Ecuación 2, es decir, las rectas resultan
coincidentes.
Para probar la hipótesis nula, se compararon los modelos de las ecuaciones
siguientes (prueba F parcial-múltiple):
(Ecuación 1)
(Ecuación 9)
Para esta prueba, el estadístico de calcula como sigue:
Sustituyendo los valores obtenidos a partir del Cuadro 16 para el modelo
completo y del Cuadro 17 para la SCregresión x se obtuvo
Comparando el valor obtenido con el valor en tablas para
Entonces
65
con
Por lo tanto la hipótesis
no se rechaza, es decir, las dos
rectas de regresión coinciden estadísticamente.
Cabe señalar que el nivel de significación de la prueba (valor P) se calcula como
sigue:
P=P(F2,8 ≥ Fcalculada)= P(F2,8 ≥ 1.572702)=0.2654
66
Anexo 3. Análisis estadístico para el diseño experimental factorial 24
no replicado
Todo
el
análisis
estadístico
fue
realizado
utilizando
el
software
STATGRAPHICS Centurion XV.
En el análisis del experimento, lo primero es estimar los efectos
potencialmente importantes. En el Cuadro 18 se muestran los cuatro efectos
principales (A: adsorbente, B: relación masa muestra/adsorbente, C: solvente y D:
volumen de elución), las seis interacciones dobles (AB, AC, AD, BC, BD y CD),
tres interacciones triples (ABC, ABD y BCD) y la interacción cuádruple (ABCD)
observados en este experimento. De este cuadro, llaman la atención los seis
efectos cuya magnitud es grande en comparación con la de los demás efectos (C,
AB, AC, BC, BD y ACD).
4
Cuadro 18. Estimaciones de los efectos de los factores del diseño 2 para la lovastatina
Efecto
Estimado
promedio
72.9459
A:A
-6.53799
B:B
1.32904
C:C
-11.6007
D:D
3.50783
AB
-20.5872
AC
-19.4856
AD
-5.64762
BC
-18.254
BD
-12.933
CD
-3.78891
ABC
0.568662
ABD
0.635277
ACD
16.7008
BCD
3.54683
ABCD
5.1797
67
Para determinar gráficamente los efectos significativos, se construyó una
gráfica de probabilidad normal de las estimaciones de los efectos (gráfico de
Daniel) (Figura 15).
Gráfico de Probabilidad Normal para Recuperación
99.9
99
ACD
porcentaje
95
BCD
B:Relacion muestra adsorbente D:Volumen
ABD
AD CD
ABC
C:Solvente A:Adsorbente
80
50
20
5
BC
AC
AB
BD
1
0.1
-4
-2
0
Efectos estandarizados
2
4
Figura 15. Gráfica de probabilidad normal de las estimaciones de los efectos.
También se realizó el diagrama de Pareto para observar qué efectos fueron
más representativos, en cuanto a su magnitud (Figura 16).
Diagrama de Pareto para Recuperación
AB
+
AC
-
BC
BD
C:Solv ente
A:Adsorbente
AD
CD
D:Volumen
B:Relacion muestra adsorbente
0
4
8
12
16
20
24
Ef ecto
Figura 16. Gráfica de Pareto para los efectos sin estandarizar.
Como se puede observar en la gráfica de Daniel (Figura 15), los efectos más
significativos fueron C, AC, BD, BC y AB, que coincide con lo encontrado en el
diagrama de Pareto (Figura 16), donde los efectos más significativos por su
magnitud fueron (en orden creciente) C, BD, BC, AC y AB, siendo todos negativos.
68
A continuación, se muestra la gráfica de efectos principales, donde se
corroboran los resultados de las gráficas anteriores, ya que se observa que el
efecto principal mayor es C (solvente), debido a que éste es el que tiene la mayor
pendiente (Figura 17).
Gráfica de Efectos Principales para Recuperación
79
Recuperación
77
75
73
71
69
67
Adsorbente Relacion muestra adsorbente Solvente
Volumen
Figura 17. Gráfica de efectos principales
En la siguiente figura, se muestra el gráfico de interacción para los efectos
(Figura 18).
Gráfica de Interacción para Recuperación
94
-
Recuperación
+
-
84
+
- +
-
+
74
64
+
+
-
-
-
+ -
+
-
-+
+
+
+
54
AB
AC
AD
BC
BD
Figura 18. Gráfico de interacción para los efectos
17
CD
17
Adsorbente (A), (-): sílica, (+)florisil; Relación masa muestra/adsorbente (B), (-): 1:1, (+): 1:4;
Solvente (C), (-): AcOEt, (+): ACN), Volumen de elución (D): (-): 4 mL, (+): 8 mL),
69
A partir del gráfico anterior, se puede hacer la interpretación del efecto de
los factores analizados en el experimento. De acuerdo a la Figura 18, las
interacciones observadas que resultaron más significativas fueron AB, AC y BC,
correspondientes a la interacción del adsorbente con la relación masa
muestra/adsorbente, adsorbente con solvente y relación masa muestra/adsorbente
con solvente. Estas interacciones indican que las mejores recuperaciones se
dieron cuando: 1) interacción BC indica que con B en el nivel alto (relación 1:4
masa muestra/adsorbente) y C en el bajo (acetato de etilo como solvente) se
obtuvo la mayor recuperación, 2) la interacción AB indica que con A en el nivel
bajo (gel de sílice como adsorbente) y B en el alto (relación 1:4 masa
muestra/adsorbente) se obtuvo la segunda mayor recuperación, 3) la interacción
AC indica que con A en el nivel alto (florisil como adsorbente) y C en el bajo
(acetato de etilo como solvente) se obtuvo la tercera mayor recuperación, y 4) las
interacciones AD, BD y CD proporcionan recuperaciones similares e inferiores a
los tres casos anteriores; lo destacable fue que el factor D se encontró en el nivel
alto, esto quiere decir que cuando se usa un volumen de elución de 8 mL se
obtienen mejores recuperaciones en todos los casos.
Finalmente, para determinar qué efectos fueron significativos, se agruparon
los efectos insignificantes como una estimación del error, y se realizó el análisis de
varianza para el porcentaje de recuperación, como se muestra en el Cuadro 19.
Este ANOVA indicó que los efectos considerados resultaron significativos
estadísticamente (P<0.05).
70
4
Cuadro 19. Mejor ANOVA para el diseño experimental factorial 2 no replicado.
Fuente
Suma de
Cuadrados (SC)
Razón-F
Valor-P
538.3
Grados Cuadrado
de
Medio (CM)
libertad
1
538.3
C:C
3.19
0.1045
AB
1695.3
1
1695.3
10.04
0.0100
AC
1518.8
1
1518.8
8.99
0.0134
BC
1332.8
1
1332.8
7.89
0.0185
BD
669.0
1
669.0
3.96
0.0745
ACD
1115.7
1
1115.7
3.19
0.1045
Error total
572.8
9
63.6
Total (corr.)
7442.8
15
Una vez concluido en análisis estadístico, se procedió a hacer la
verificación de los supuestos de normalidad, varianza constante e independencia.
Para verificar el supuesto de normalidad, se construyó la gráfica de
probabilidad normal para los residuos que se muestra en la Figura 19. En ella se
puede observar que los residuos tienden a formar una línea recta, por lo que se
concluye que el supuesto de normalidad es correcto.
Gráfico de Probabilidad Normal para Residuos
99.9
99
porcentaje
95
80
50
20
5
1
0.1
-18
-8
2
residuos
12
Figura 19. Gráfica de probabilidad normal para residuos
71
22
Para verificar el supuesto de varianza constante, se graficaron los predichos
contra los residuos, que se muestra en la Figura 20. Como los puntos tienen una
distribución aleatoria, sin poderse observar algún patrón, se concluye que se
cumple el supuesto de varianza constante.
Gráfica de Residuos para Recuperación
28
residuo
18
8
-2
-12
-22
25
45
65
predichos
85
105
Figura 20. Gráfica de predichos contra residuos
Para verificar la suposición de independencia en los residuos, se grafica el
orden el que se colectaron los datos contra el residuo correspondiente, como se
muestra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. El observar
este gráfico, no se detecta una tendencia o patrón no aleatorio claramente
definido, por lo cual no existe evidencia de que existe una correlación entre los
de Residuos para Recuperación
errores, y por lo tanto, se cumpleGráfica
el supuesto
de independencia.
28
residuo
18
8
-2
-12
-22
0
4
8
número de corrida
12
Figura 21. Gráfico de residuos vs. orden de corrida
72
16