Determinación de una medida de masa exacta en

Determinación de una medida de masa exacta en

RIAIDT
Rede de Infraestruturas de Apoio á Investigación
e ao Desenvolvemento Tecnolóxico
Vicerrectorado de investigación
http://www.usc.es/gl/investigacion/riaidt/
Titulo del estudio:
Determinación de una medida de masa exacta en alta resolución en Ionización Química (IQ)
Conceptos clave:
Equipo Magnético, Geometría trisector (EBE), Ionización química (IQ), Medida de masa exacta, sonda sólidos, Alta
resolución, masa monoisotópica, masa promedia.
Test realizado por:
Unidade de Masas e Proteómica
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TABLA DE CONTENIDOS
PÁGINA
1. INTRODUCCIÓN: EQUIPO MAGNÉTICO ..................................................................................................... 3
2. OBJETIVO................................................................................................................................................. 4
3. MATERIALES, MÉTODOS........................................................................................................................... 4
3.1 Conceptos: Masa promedio y monoisotopica ...................................................................................... 4
3.2 Ionización Química ............................................................................................................................. 4
3.3 Condiciones de la muestra .................................................................................................................. 5
3.4 Instrumentación ................................................................................................................................. 5
4. RESULTADOS ............................................................................................................................................ 6
4.1 Determinación de espectros moleculares ............................................................................................ 6
4.2 Determinación de masa exacta ......................................................................................................... 7
4.3 Conceptos clave ............................................................................................................................... 8
5. STATEMENT OF OWNERSHIP ...................................................................................................................... 8
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1. INTRODUCCIÓN: ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN ALTA RESOLUCIÓN
La Espectrometría de Masas es una técnica microanalítica que requiere solamente unos pocos nanomoles de
muestra para obtener información característica de la estrutura e de la masa molecular del compuesto a estudiar. Es
una técnica destructiva en la que la muestra es consumida durante el análisis.
En todas las técnicas usadas en espectrometría de masas, alguna forma de energía es transferida a la molécula
dando lugar la ionización de la misma. En la mayoria de los casos, el ión molecular (Ión resultante de la ionización de
la molécula que representa a la misma y que es la precursora de todos los fragmentos que componen el espectro de
masas) de la muestra “explota” en una variedad de fragmentos (Patrón de Fragmentación). Los produtos que se
forman son iones en fase gas en los que sus masas y abundancias relativas constituyenen el espectro de masas.
Dependiendo del tipo de analizador empleado, la espectrometría de masas puede realizarse en baja o en alta
resolución. Con analizadores como el cuadrupolo o la trampa de iones se trabaja en baja resolución, y con
analizadores magnéticos o TOF se trabaja en alta resolución. En analizadores de alta resolución, podemos separar
mucho mejor los picos. La resolución viene definida por:
Donde R es la Resolución y AM Es el poder resolutivo
Cuanta mayor resolución nos de un analizador, mejor separación de picos espectrales. De esta forma se puede
emplear esta alta resolución para realizar medidas de masa exacta, enfrentando el valor teórico del analito en
cuestión con la medida experimental realizada con el espectrómetro de masas.
Existen diferentes modos de ionización en Espectrometría de masas, que se utilizan en función del tipo de
muestra y polaridad. Entre los más importantes y recurridos tenemos: Impacto Electrónico (EI), Ionización Química
(CI), FAB ( Fast Atom Bombardment) o L-SIMS (Liquid-Secondary Ions Mass Spectrometry), MALDI (Matrix Assisted
Laser Desorption ), ESI Electrospray), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).
Con estas técnicas de ionización en el espectrómetro de masas y con acoplamientos a cromatografía de
Gases o Líquidos, se pueden realizar diferentes tipos de análisis:
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Análisis cualitativo
-
Análisis cuantitativo
-
Elucidación estructural
-
Determinación de masa exacta
-
Estudios de fragmentación selectiva por MS/MS
El análisis por espectrometría de masas se emplea en muestras que estén en estado sólido o líquido.
Dependiendo de la técnica a emplear y las características del analito a medir, se emplea un sistema de introducción
de líquidos o sólidos determinado.
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2. OBJETIVO
El objetivo de este estudio es realizar una medida de masa exacta por ionización química, utilizando un
equipo con analizador de alta resolución como es el equipo magnético. De esta forma, la medida obtenida
nos indicaría con gran precisión (medida experimental inferior a 5 ppm de error contrastada con el valor
teórico), la composición de diferentes elementos químicos de la molécula a analizar.
Se puede utilizar para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o
para determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto.
3. MATERIALES, METODOS
3.1 Conceptos: Masa promedio y monoisotópica.
Masa Promedio: Es aquella que se puede obtener en base al carbono 12. El C12 se usa como patrón de la
masas atómica de los distintos nucleídos que existen en la naturaleza, dado que la masa atómica del 12C es
por definición 12 umas (Unidades de Masa atómica). Basándonos en este concepto, masa promedio es la
suma de la media química de las masas de sus componentes considerando su abundancia.
Masa Monoisotopica: La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada
elemento del analito. Es la que se emplea cuando se hacen medidas en alta resolución.
3.2
Ionización química (CI = Chemical ionisation)
La técnica de Impacto Electrónico es una técnica muy agresiva, ya que provoca mucha fragmentación del ión
molecular, dándonos mucha información estructural y muy poca (o ninguna) información molecular. Esto conlleva la
dificultad de interpretar el espectro. En los casos que interesa tener más información del ión molecular y menos de
la fragmentación es mejor recurrir a otras técnicas de ionización menos agresivas como es el caso de Ionización
Química (Técnica de ionización blanda.- llamada así, debido al poco “exceso” de energía que es depositada en las
moléculas cuando son ionizadas).
La Ionización Química se realiza mediante la reacción de las moléculas neutras de muestra problema con iones
procedentes de la previa ionización (por impacto electrónico) de un gas reactivo.
En el caso de usar metano como gas reactivo, estos iones son: CH5+ (m/z 17); C2H5+ (m/z 29); C2H3+ (m/z 27); C3H5+
(m/z 41).
Las reacciones que tienen lugar entre los iones reactivos cargados positivamente y las moléculas de muestra
pueden ser agrupadas principalmente en 4 categorías: Transferencia protónica, Intercambio de carga, Adición
electrofílica y Abstracción aniónica. Por ejemplo los iones CH5+ e C2H5+ formados a partir del metano reaccionan con
moléculas de la mostra por transferencia protónica:
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M + C2H5+ ------------------------------- MH+ + C2H4+
3.3
Condiciones de la muestra para Ionización Química
Condiciones de almacenaje: dependiendo del tipo de muestra puede almacenarse a temperatura
ambiente, en la nevera (4-7°C), o en congelador (-20°C), protegidas con viales suministrados por el
solicitante.
Cuidados de manipulación: Con muestras líquidas se emplea campana de extracción, guantes de
látex, gafas de protección. En el caso de sólidos, mascarilla de protección contra polvo.
Tipo de muestra para ionización química: Es la técnica usada como alternativa al Impacto Electrónico para
visualizar el ión molecular. Se emplea en análisis de compuestos orgánicos relativamente lábiles, como en
productos farmacéuticos, metabolitos, esteroides, carbohidratos, lípidos, pesticidas, etc.
3.4
Instrumentación
El equipo magnético de alta resolución utilizado es el modelo AUTOSPEC de la casa comercial
Micromass (Actualmente Waters). Las características de este equipo son:
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Geometría trisector EBE patentada por Micromass y que proporciona un instrumento compacto, con alta
sensibilidad y alta resolución, libre de metastables en espectros normales y barridos enlazados libres de
artefactos.
El rango de masas es variable dependiendo de la técnica de ionización empleada.
El voltage de aceleración es de 8 kv.
Posibilidad de ionizar muestras por las técnicas de impacto electrónico, ionización química y L-sims.
Sonda de introducción directa para la medida de muestras sólidas y líquidas, con la posibilidad de
calentar hasta 650ºC, con control tanto automático como manual por el operador.
Reservorio de referencia para estándares conocidos.
Cañón de cesio de 35kv para realización de L-SIMS líquido.
Sonda para medidas exactas usando compuestos de referencias externos.
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4. RESULTADOS
4.1
Determinación de espectros moleculares
C17H24O3
Exact Mass: 276.2
Mol. Wt.: 276.4
O
O
CH3
CH3
H2C
O
Espectro de masas en Ionización química de baja resolución. El pico que en este caso buscaríamos es el 276 +
H⁺(por la presencia del gas metano, siempre sale protonada la masa) que tiene una intensidad relativa del 10%. Este
espectro de baja resolución nos sirve para confirmar la existencia del compuesto que buscamos, con lo cual el paso
siguiente es realizarle el alta resolución
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4.2
Determinación de masa exacta
El informe que se manda en formato PDF da información del espectro del ión molecular solicitado, medido en
alta resolución, y a la vez, la medida de masa exacta del pico experimental con respecto a la masa teórica, con el
error cometido expresado en ppm (siempre inferior a 5 ppm) y un valor estadístico “i-FIT” que da la fiabilidad de la
medida, no solamente viendo el error cometido en ppm del primer pico monoisotópico, sino también la altura de los
picos comparándolos con el perfil teórico; cuanto menor es este valor i-FIT, mejor se ajustará ese perfil (valores
óptimos estarían situados en un valor inferior a 100), el número de insaturaciones viene definido por DBE (Double
Bond Equivalents) .
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4.3 Conceptos Clave
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Masa monoisotópica : La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada elemento
del analito.
La precisión de masa es un porcentaje de la masa medida y se mide tanto en tanto por ciento como en
partes por millón.
Relación masa/carga (m/z), es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número
(z) de unidades cargadas electrostáticamente que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensional
que es el parámetro medido por el analizador de masas.
Definición de ion molecular o progenitor y de pico base. El ion molecular resulta de la ionización de la
molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones
fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z
numéricamente igual al peso molecular del compuesto. El pico base es el pico más intenso en el espectro de
masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una
intensidad relativa de 100%(en el caso de que la muestra que se analiza sea pura)
Gas reactivo. El método de la IQ implica la mezcla de la muestra (aproximadamente 10-4Torr ) con un gas
reactivo en alta presión ( 1 Torr) en la fuente de formación de los iones. Los gases reactivos, comúnmente
usados, son: metano, isobutano y amonio.
5. STATEMENT OF OWNERSHIP
Este informe contiene un estudio realizado por “Unidad de Masas” en la “Universidad de Santiago de
Compostela”, en nombre del sponsor MMMMM.
Todos los resultados e interpretaciones son propiedad del patrocinador . Bajo ninguna circunstancia se
mencionara a cualquier dato sin conocimiento del patrocinador. Las muestras serán devueltas al propietario.
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