2 Aislamiento.p65

19
ARTÍCULO
o RIGINAL
¿Y QUIÉN ES EL CULPABLE?
El Lulo (Solanum quitoense Lam), especie endémica de los Andes de Colombia,
Perú y Ecuador.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
20
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
ISSN 0124-213X
9 Número 1
Enero - Junio 2009
DE UN FRAGMENTO
DEVol.DNA
GENÓMICO
CORRESPONDIENTE A UN GEN QUE CODIFICA
PARA UNA POLIFENOL OXIDASA (PPO) EN LULO
(Solanum quitoense Lam.)
Mauricio Pulido Jiménez1, Víctor Manuel Núñez Zarante2
1
Director CEBM, Gimnasio Campestre.
Investigador Centro de Biotecnología y Bioindustria, Corpoica
Correspondencia para el autor: [email protected]
2
Recibido: Abril 20 de 2009
Aprobado: Mayo 18 de 2009
RESUMEN
SUMMARY
Reportamos el aislamiento de un fragmento de DNA genómico correspondiente a un
gen que codifica para una polifenol oxidasa
(PPO) de hoja de lulo y su secuencia de
nucleótidos. El contenido de guaninascitosinas del fragmento es 43,42%, valor
que se encuentra dentro del rango que ha
sido determinado para los genes ppo de
papa y tomate. De la secuencia nucleotídica
se dedujo un fragmento de proteína de 278
aminoácidos. La secuencia caracterizada
muestra similitudes superiores a 73 y 66% a
nivel de nucleótidos y aminoácidos respectivamente con genes y proteínas PPO de
papa, tomate y tabaco.
We report the isolation of a genomic DNA
fragment corresponding to a gene encoding
polyphenol oxidase (PPO) from a lulo leaf
and its nucleotide sequence. The guaninecitosine fragment content is a 43,42%, value
found within the rank determined for
potato and tomato ppo genes. A protein
fragment of 278 amino acids was deduced
from the nucleotide sequence. The
characterized sequence shows similarities
upper to 73% and 66% at nucleotide and
amino acid level respectively with genes and
PPO proteins from potato, tomato and
tobacco.
Palabras clave: Pardeamiento enzimático,
polifenol oxidasa, Solanum quitoense,
silenciamiento de genes, RNA antisentido.
Key words: Enzymatic browning, polyphenol
oxidase, Solanum quitoense, gene
silencing, antisense RNA.
El Astrolabio
21
INTRODUCCIÓN
El lulo (Solanum quitoense Lam.), perteneciente a la familia Solanaceae (así como
la papa, el tomate, el tabaco y la uchuva)
es una especie frutal originaria de los Andes de Colombia, Perú y Ecuador (Heiser,
1985) que ha sido considerada como
promisoria para la explotación agrícola e
industrial por más de 80 años. Sin embargo
en Colombia la productividad del lulo alcanza niveles que están por debajo del rendimiento potencial debido a la baja oferta
tecnológica disponible para la especie ya que
los esfuerzos de investigación y fomento se
han canalizado a cultivos tradicionales relacionados con la seguridad alimentaria del
país, la industria y la generación de divisas.
Se estima que en Colombia la superficie
sembrada con lulo es de aproximadamente
4.500 hectáreas, con una producción anual
de 39.000 toneladas (Gómez, et al., 1999).
Aunque la especie tiene un gran mercado y
amplia aceptación en el país, para suplir la
demanda nacional se precisa importar de
Ecuador alrededor de 25% del volumen consumido por año, lo que equivale a la producción de cerca de 1000 hectáreas. De
otro lado, la comercialización de aproximadamente el 50% de la producción nacional se ve considerablemente afectada por
los daños ocasionados por un fenómeno cuyas características son muy similares a las
del pardeamiento enzimático.
El pardeamiento enzimático es el principal
causante del deterioro de características
como color, sabor y aroma en la gran mayoría de frutas y verduras de importancia
agrícola y económica, hecho que limita de
manera significativa la posibilidad de
comercialización del producto, ya sea para
el consumo en fresco o para el procesamiento industrial (McEvily, et al., 1992).
Este fenómeno es provocado por la actividad de una familia de enzimas denominadas polifenol oxidasas (PPO) que están
confinadas dentro de los plastidios de las
células vegetales y se liberan al citoplasma
una vez se ha producido daño en la estructura celular de los tejidos como consecuencia del impacto mecánico ocasionado
durante la recolección de la cosecha y la
manipulación poscosecha de los frutos
(Vaughn y Duke, 1981; Vaughn, et al.,
1988). El método más ampliamente utilizado para controlar el pardeamiento
enzimático es la adición de agentes químicos antioxidantes tales como los sulfitos
(Martínez y Whitaker, 1995). Sin embargo,
recientes estudios efectuados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) han demostrado que
dichas sustancias representan un riesgo considerable para la salud humana. Por tal razón, la búsqueda de alternativas de
naturaleza biotecnológica a este problema
ha cobrado gran importancia a nivel mundial. Para implementar una de tales opciones, conocida como silenciamiento de genes
mediante RNA antisentido se requiere aislar un gen o parte de un gen ppo.
Puesto que en las especies vegetales económicamente importantes en las que se
observa este hecho se han encontrado genes
que codifican para PPO (Newman, et al.,
1993; Thygesen, et al., 1995; Goldman, et
al., 1998), se presume que la alteración
anteriormente referida en lulo es
pardeamiento enzimático. Sin embargo, no
hay evidencias de la presencia de genes ppo
en la especie. En este trabajo se reporta el
aislamiento y caracterización molecular de
un fragmento de DNA correspondiente a un
gen que codifica para PPO en lulo.
MATERIALES
Y MÉTODOS
Material vegetal: El tejido empleado en el
estudio se obtuvo de plantas de lulo
(Solanum quitoense Lam., accesión ILS 388)
y papa (Solanum tuberosum L., variedad
Millenia). Semillas de lulo provenientes de
los bancos de germoplasma de CORPOICA
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
22
se sembraron en macetas con turba como
sustrato; tanto la germinación de las semillas como el desarrollo de las plántulas
se dieron bajo condiciones de invernadero. El material vegetal de papa se colectó
de plantas pertenecientes a la Colección
Central Colombiana que se encontraban en
el campo.
Cultivo de Escherichia coli cepa DH5α:
La bacteria se cultivó en medio Luria-Bertani
(LB) líquido a 37oC y agitación (250 rpm)
durante 8 horas.
Extracción y purificación de DNA
genómico de lulo, papa y E. coli: El DNA
genómico de lulo y papa se aisló a partir de
hojas jóvenes, empleando el protocolo reportado por Doyle y Doyle (1990). El DNA
genómico de E. coli se extrajo utilizando
el procedimiento reportado por Chen y Kuo
(1993).
Evaluación de la integridad y
cuantificación de los DNA S genómicos:
Alícuotas de los DNAS y del marcador de
masa molecular High DNA Mass Ladder
(Invitrogen, USA) fueron sometidas a
electroforesis en gel de agarosa 1%. El gel
se fotografió y la imagen se analizó con el
programa GeneTools (Syngene, USA).
Diseño de los iniciadores para PCR: Las
secuencias nucleotídicas de los genes ppo
previamente reportadas en tomate, papa,
tabaco, batata, durazno, manzana, pera y
haba se alinearon utilizando el programa
Clustal X versión 2.0.9 (Larkin et al., 2007)
con el fin de identificar la región hacia el
extremo 5´ que mostrara el mayor grado
de conservación posible. Una vez determinada dicha región, se utilizaron el gen ppoF de tomate (como gen de referencia) y el
programa Oligo versión 6.71 (Rychlik y
Rhoads, 1989; Rychlik, et al., 1990)
(Molecular Biology Insights, Inc., USA) para
diseñar los iniciadores que permitieran amplificar un fragmento de aproximadamen-
El Astrolabio
te 950 pares de bases (pb) a partir de DNA
genómico de lulo. La especificidad del posicionamiento de los iniciadores sobre la región seleccionada se verificó analizándolos
con el programa BLAST (Altschul, et al.,
1990).
Amplificación por PCR de un fragmento
del gen ppo de lulo: Para determinar las
condiciones óptimas que permitieran la
amplificación de un fragmento ubicado hacia el extremo 5´ del gen ppo de lulo se
ensayaron diversas concentraciones de iniciadores, sulfato de magnesio (MgSO 4) y
DNA; de otro lado se evaluaron programas
de amplificación con diferentes temperaturas de anillaje y períodos de extensión.
Una vez estandarizadas las condiciones de
amplificación, el producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa 1%
para verificar su tamaño y la especificidad
de la amplificación.
Purificación y cuantificación del fragmento amplificado: El fragmento amplificado
por PCR fue purificado empleando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega, USA). La concentración del mismo se determinó utilizando el método descrito anteriormente.
Secuenciación del fragmento aislado: La
secuencia de nucleótidos del fragmento aislado se obtuvo empleando el método de terminación de cadena con dideoxinucleótidos
(Sanger, et al., 1977) y los mismos iniciadores diseñados para producirlo (SupPPO-F
y SupPPO-L). El fragmento se secuenció dos
veces por cada extremo con el fin de confirmar las secuencias logradas.
Secuencia consenso del fragmento aislado:
Las secuencias correspondientes tanto a la
cadena positiva como a la negativa del fragmento aislado fueron alineadas empleando
el programa CodonCode Aligner versión
2.0.4 (CodonCode Corporation, USA) para
generar una secuencia consenso definitiva.
23
Identificación de marcos de lectura abiertos en el fragmento secuenciado: Para
identificar los posibles marcos de lectura
abiertos en el fragmento aislado se utilizó
el programa ORF Finder.
Análisis de similitud con genes y proteínas PPO previamente reportadas: La secuencia de nucleótidos consenso y la
secuencia de aminoácidos derivada de la
primera fueron comparadas con las bases
de datos empleando el programa BLAST con
el fin de determinar el grado de similitud
de éstas respecto a los genes y proteínas
PPO previamente reportados en otras especies.
RESULTADOS
260 pb. del sitio de inicio de la secuencia
codificante.
Iniciador Longitud
(pb)
Posición
degenerada
% G-C
Tm (oC)
SupPPO-F
22
nucleótidos 7, 8, 12 y 14
45,5
66.6
SupPPO-L
22
nucleótidos 5 y 8
36,4
65.2
Tabla 1. Características de los iniciadores diseñados para
amplificar un fragmento ubicado hacia el extremo 5´ del
gen ppo de lulo.
El análisis BLAST hecho para los dos iniciadores diseñados permitió determinar las posiciones en las cuales éstos se ubican en los
genes ppo de otras especies y el tamaño
del producto de PCR que permiten obtener
(Tabla 2).
Y DISCUSIÓN
Iniciadores para PCR
Los trabajos sobre la estructura de los genes
ppo en papa (Hunt, et al., 1993) y tomate
(Newman, et al., 1993) han señalado que
el tamaño de éstos oscila entre 1300 y 1900
pb. y que las secuencias que flanquean los
extremos 5´ y 3´ muestran un alto grado
de divergencia incluso entre genes pertenecientes a la misma especie. Considerando la variabilidad existente en los extremos
de la región que se pretendía amplificar y
buscando iniciadores cuyas características
permitieran un posicionamiento altamente
específico en los sitios previamente determinados, se diseñaron oligonucleótidos con
degeneración en varias posiciones.
Para amplificar por PCR el fragmento de DNA
localizado hacia el extremo 5´ del gen ppo
de lulo se diseñaron los iniciadores SupPPO-F
(directo) (5’ CTCCTAYWCCAYCYCCTGATCT 3’)
y SupPPO-L (reverso) (5’ AGAAYTCN
GAGTTCAACCAATC 3’). Las características
de los iniciadores diseñados se muestran en
la Tabla 1. Teniendo en cuenta las particularidades de los genes ppo anteriormente referidas, el iniciador directo SupPPO-F fue diseñado
para que se posicionara aproximadamente a
Especie
Gen
Tomate
ppo-A
Tomate
ppo-B
Tomate
ppo-C
Tomate
ppo-D
Tomate
ppo-E
Tomate
ppo-F
Papa ppo-POT 32
Papa ppo-POT 33
Papa
ppo-A
Papa
ppo-B
Tabaco
ppo
Tamaño
Lugar
Tamaño posicionamiento producto
gen (pb)
PCR (pb)
iniciadores
1893
1791
1881
1776
1764
1758
1794
1800
1752
1767
1781
263 - 1180
263 - 1183
251 - 1168
251 - 1168
263 - 1159
260 - 1153
242 - 1186
272 - 1192
251 - 1147
266 - 1162
271 - 1176
939
942
939
939
918
915
966
942
918
918
927
Tabla 2. Sitios de posicionamiento de los iniciadores diseñados para este estudio sobre genes ppo de diferentes
especies y tamaño de los productos de PCR que permiten
generar.
Los resultados del anterior análisis demuestran que los sitios en los cuales se posicionan
los dos iniciadores varían incluso en los genes
ppo de la misma especie; ello implica que
la longitud de los fragmentos que se pueden amplificar con estos iniciadores también presenta diferencias. Aunque el tamaño
de los genes ppo oscila entre 1300 y 1900
pb. y muestran un nivel considerable de divergencia en la secuencia de la región 5´,
el análisis muestra que también presentan
variaciones en otras regiones. De otro lado,
el hecho que los iniciadores diseñados para
este estudio encuentren en el DNA de to-
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
24
mate, papa y tabaco secuencias pertenecientes a genes ppo sobre las cuales puedan posicionarse de manera muy específica
demuestra que el método utilizado para el
diseño de éstos es muy efectivo. De todo lo
anterior se deriva que el uso de esta pareja de iniciadores sobre los genomas de lulo
y otras especies vegetales garantiza la amplificación exclusiva de fragmentos correspondientes a genes ppo.
Amplificación del fragmento
correspondiente al gen ppo de lulo
Los análisis de PCR virtual realizados con el
programa Oligo 6.71 permitieron establecer
que el tamaño del producto de amplificación debía estar entre 915 y 960 pb. Los
iniciadores SupPPO-F y SupPPO-L permitieron amplificar un fragmento de aproximadamente 950 pb. (Figura 1) a partir de los
genomas de lulo y papa. Después de evaluar
diferentes concentraciones de magnesio (1.0,
1.5, 2.0, 2.5, 3.0 y 3.5 mM) con el fin de
optimizar la amplificación del fragmento, se
determinó que el valor óptimo era 1.5 mM.
Los ensayos de estandarización de la temperatura de anillaje cubrieron el rango entre 60 y 67oC. Los mejores resultados se
obtuvieron utilizando 65.7oC. Las condiciones de reacción óptimas bajo las cuales se
logró amplificar el fragmento se presentan
en la Tabla 3. El programa de ciclaje utilizado se presenta en la Tabla 4.
Figura 1. Productos de amplificación por PCR de 950 pb correspondientes al gen ppo. Carril 1: Marcador de peso molecular;
carril 2: genoma de lulo; carril 3: genoma de papa; carril 4:
genoma de E. coli (control negativo); carril 5: blanco.
El Astrolabio
Reactivo
Concentración Concentración Volumen/
inicial
final
Reacción
Agua
Buffer PCR
MgSO4
dNTP’s
Iniciador SupPPO-F
Iniciador SupPPO-L
Taq Polimerasa Hi-Fi
DNA
Volumen final
10X
50 mM
2.5 mM
10 µM
10 µM
5 U/µL
20 ng/µL
1X
1.5 mM
0.2 mM
0.4 ìM
0.4 ìM
-
13.70
2.5
0.75
2.0
1.0
1.0
0.25
3.8
25.0
µL
µL
µL
µL
µL
µL
µL
µL
µL
Tabla 3. Condiciones de reacción utilizadas en la amplificación por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a
partir de DNA genómico de lulo.
Etapa
Denaturación inicial
Amplificación
Denaturación
Anillaje
Extensión
Extensión final
Temperatura /
Tiempo
94oC X 3 min.
94oC X 1 min.
65.7oC X 45 seg.
72oC X 75 seg.
72oC X 7 min.
Número de
ciclos
1
45
1
Tabla 4. Programa de ciclaje utilizado en la amplificación
por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a partir de
DNA genómico de lulo.
Secuencia del fragmento de gen ppo
de lulo
El método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos permitió determinar una
secuencia de 843 nucleótidos (Figura 2).
La diferencia observada entre el tamaño
del fragmento amplificado por PCR (950
pb aprox.) y el resultado arrojado por el
procedimiento de secuenciación (843 pb.)
obedece a que la técnica no logra resolver
eficientemente los nucleótidos de los extremos de las cadenas de DNA que se producen durante la reacción de secuencia.
La longitud de las regiones que no se logra
identificar con claridad es de aproximadamente 100 nucleótidos.
El fragmento de 843 pares de bases está
constituido por 239 adeninas (28,35%), 199
citosinas (23,61%), 167 guaninas (19,81%)
y 238 timinas (28,23%). El contenido de
guaninas-citosinas (%GC) para este fragmento es 43,42%, valor que se encuentra
25
vemente superior al mostrado en las dos
especies anteriores, y para el caso de especies como manzana, pera, durazno y batata (las tres primeras pertenecientes a la
familia Rosaceae y la última a la familia
Convolvulaceae) los valores se encuentran
entre 52,24 y 56,48% respectivamente. El
valor más bajo encontrado en la comparación corresponde a haba (37,94%), especie
perteneciente a la familia Fabaceae. El alineamiento de los genes ppo de tomate y
papa con el segmento de 843 pb. identificado en lulo permitió precisar que hacia el
extremo 5´ de éste hay un fragmento de
aproximadamente 280 pb. cuya secuencia
aún está por determinar. Este hecho coincide con lo presupuestado inicialmente en
el diseño del iniciador directo. La diferencia observada puede ser la consecuencia de
la inserción en el fragmento de lulo o la
deleción en los genes de tomate y papa de
aproximadamente 20 pb; todo ello concuerda con las observaciones sobre la notable
variabilidad de la secuencia de los genes
ppo en esta región (Newman, et al., 1993).
G AT TA AT C T T G T G TA A A G C C C ATATA A A G C C A G ATA C G G A
G G T G A C ATA C A G T T G T T G C C C T C C G ATA C C C G A A G ATAT
C G A C A G C G T T C C T TA C TA C A A G T T C C C T T C TAT G A C TA A A C
T C C G C AT C C G G C C C C C T G C T C A C G C C G T G G AT G A G G A G
TATAT T G C C A A ATA C C A AT T G G C TA C TA G T C G A AT G A G G G
G A C T T G ATA A A G A C C C T T T T G A C C C T C T T G G C T T TA A G C
A A C A A G C TA ATAT T C AT T G T G C T TAT T G TA AT G G T G C T TA
TA A A G T T G G T G G A A A A G A G T T A C A A G T G C A C T T C T C T T
G G C T T T T C T T T C C T T T T C ATA G AT G G TA C T T G TA C T T C TA C G
A G A G A AT C T T G G G AT C T C T C AT TA AT G AT C C A A C T T T C G C
T T T G C C ATA C T G G A AT T G G G A C C AT C C A A A A G G C AT G C G
TATA C C T C C C AT G T T T G AT G T T G A A G G T T C AT C C C T T TA C G A
T G A A A A A C G TA A C C A A A AT C A C C G A A AT G G A A A A ATA AT T
G AT C T C G G C T T T T T C G G TA A A G A A A C C C A A A C A A C T C A A
C T C C A A A C A AT G A C G A ATA A C T TA A C T C T TAT G TA C C G T C
A A AT G ATA A C TA AT G C T C C T T G T C C T T C G C T G T T T T T C G
G TA AT C C T TA C C C T C T T G G A A C C G AT C C A A G T C C A G G A AT
G G G C A C TAT C G A A A ATAT T C C T C A C A AT G C G G T C C A C G T C T
G G G T G G G T G A C C C A C G A C A A C C A A A C G G A G A G G A C AT
G G G TA AT T T C TA C T C AT C C G G T C TA G A A C C G G C T T T C
T T T T G C C A C C A C T C C A AT G T G G A C C G A ATG
T G G A A T G A A T G G A A A G C A A T C G
Figura 2. Secuencia de nucleótidos correspondiente al fragmento del gen ppo identificado en lulo (843 pb).
dentro del rango que ha sido determinado
previamente para los genes de solanáceas
como papa y tomate, que oscila entre 40 y
45% (Rensink, et al., 2005). El %GC específico para genes que codifican para PPO
(Tabla 5) en tomate y papa oscila entre
41,67 y 43,64%; en tabaco es 44,80%, le-
Especie
Lulo
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Tomate
Papa
Papa
Papa
Papa
Papa
Papa
Tabaco
Batata
Batata
Durazno
Pera
Haba
Manzana
Manzana
Gen
Tamaño gen (pb)
Adenina
Citosina
ppo A
ppo B
ppo C
ppo D
ppo E
ppo F
pot 32
pot 33
pSP32
ppo A
ppo B
pSRP33
ppo
ppo
ppo -1
ppo
ppo
ppo -1
ppo -1
ppo -2
843
1893
1791
1881
1776
1764
1758
1794
1800
1325
1752
1767
1315
1781
1767
1767
1794
1359
1821
1782
1782
239
530
519
529
513
498
491
517
537
375
501
507
391
491
420
419
485
350
602
463
462
199
379
370
365
366
379
365
366
376
251
367
367
251
409
523
525
512
351
353
462
472
Guanina
167
420
399
437
409
374
382
401
377
311
378
377
297
389
475
478
437
367
338
475
459
Timina
238
564
503
550
488
513
520
510
510
388
506
516
376
492
349
345
360
291
528
382
389
% G+C
43,42
42,20
42,94
42,63
43,64
42,69
42,49
42,75
41,83
42,41
42,52
42,10
41,67
44,80
56,48
56,76
52,90
52,83
37,94
52,58
52,24
Tabla 5. Contenido de nucleótidos y porcentaje de guaninas y citosinas (%GC) en genes ppo de especies
económicamente importantes pertenecientes a las familias Solanaceae, Rosaceae y Fabaceae.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
26
La comparación de la secuencia de 843 pb.
encontrada en lulo con los genes ppo de
otras especies reveló valores de identidad
elevados no sólo con los genes de especies
pertenecientes a la familia Solanaceae, sino
con los de familias filogenéticamente distantes (Tabla 6). El porcentaje de identidad
que arrojó el análisis BLAST, definido como
el grado de invariabilidad que presentan dos
secuencias (de nucleótidos o proteínas) al
ser comparadas, puede ser asumido como
una medida de la similitud existente entre
las mismas (Altschul, et al., 1990).
Se identificaron dos grupos de genes: aquellos cuyas similitudes respecto al fragmento
de lulo son iguales o superiores a 81% y aquellos que tienen similitudes inferiores a 80%.
La secuencia encontrada en lulo mostró similitudes entre 83 y 84% con dos de los
cinco genes ppo de papa (ppo-B y ppo-A),
entre 81 y 83% con tres de los seis genes
ppo de tomate (ppo-F, ppo-P2 y ppo-E), el
gen ppo de tabaco y el de caqui (Diospyros
kaki L.), especie frutal de la familia
Ebenaceae. Los genes POT32 y POT33 de
papa exhibieron similitudes de 76 y 77% res-
Descripción del gen
Valor E
% identidad
ppo-A papa (Solanum tuberosum)
ppo-E tomate (Solanum lycopersicum)
ppo caqui (Diospyros kaki)
ppo-B papa (Solanum tuberosum)
ppo-P2 tomate (Solanum lycopersicum)
ppo tabaco (Nicotiana tabacum)
ppo-F tomate (Solanum lycopersicum)
ppo alelo POT32 papa (Solanum tuberosum)
ppo alelo POT33 papa (Solanum tuberosum)
ppo-B tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-D tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-A tomate (Solanum lycopersicum)
ppo-C tomate (Solanum lycopersicum)
ppo chaparro (Larrea tridentata)
ppo alfalfa (Medicago sativa)
ppo albaricoque (Prunus armeniaca)
ppo ciruela del Japón (Prunus salicina)
ppo penacho de apache (Fallugia paradoxa)
ppo dormidera (Papaver somniferum)
ppo haba (Vicia faba)
ppo trébol rojo (Trifolium pratense)
ppo Camellia nitidissima
ppo Physocarpus capitatus
ppo soya (Glycine max)
ppo Neillia thyrsiflora
ppo manzana (Malus pumila)
ppo uva (Vitis vinifera)
ppo palo de rosa (Vauquelinia californica)
ppo manzana común (Malus domestica)
ppo batata (Ipomoea batatas)
ppo Fragaria x ananassa
ppo palmitero (Euterpe edulis)
ppo Eriobotrya japonica
ppo Cydonia oblonga
ppo Spiraea densiflora
ppo Rhodotypos scandens
ppo Pyrus communis
ppo Heteromeles arbutifolia
ppo Crataegus monogyna
ppo membrillo (Chaenomeles speciosa)
ppo Frangula californica
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1e-175
2e-173
4e-163
2e-154
8e-147
8e-134
6e-34
1e-30
1e-30
1e-29
2e-28
2e-26
4e-24
7e-21
2e-20
1e-18
1e-18
5e-16
2e-15
2e-14
3e-13
3e-13
9e-13
3e-12
3e-12
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
1e-11
84
83
83
83
83
82
81
76
77
76
75
73
73
75
76
76
76
74
71
74
71
71
76
79
74
76
72
74
75
75
74
80
77
76
73
74
73
75
74
75
73
Tabla 6. Valores de identidad entre la secuencia de 843 pb. identificada en lulo y genes ppo reportados
en otras especies.
El Astrolabio
27
pectivamente mientras que para el caso de
los genes ppo-C, ppo-A, ppo-D y ppo-B de
tomate fueron de 73, 73, 75 y 76% respectivamente.
Se encontraron valores de similitud que oscilan entre 71 y 80% con genes ppo de especies de las familias Fabaceae como soya,
haba, alfalfa y trébol rojo (Sullivan, et al.,
2004), Rosaceae como albaricoque
(Chevalier, et al., 1999), ciruela del Japón, manzana, pera común, Papaveraceae
como la dormidera, Vitaceae como la uva,
Theaceae como el té, Arecaceae como el
palmitero, Convolvulaceae como la batata,
Rhamnaceae y Zygophyllaceae como el chaparro. En esta última especie, el gen ppo
codifica para una polifenol oxidasa que cumple un papel central en la biosíntesis de
lignanos (metabolitos secundarios de las
plantas), sustancias polifenólicas cuyos representantes, tales como el ácido
nordihidroguaiarético y sus congéneres tienen potentes propiedades antivirales,
anticancerígenas y antioxidantes (Cho, et
al., 2003).
En la Tabla 6 se observa que los valores E
arrojados por el análisis BLAST se presentan en orden numérico ascendente mientras que los porcentajes de identidad se
muestran en aparente desorden. Ello responde al hecho que el valor E representa el
número de alineamientos que se puede esperar que ocurran por azar entre la secuencia en estudio y cualquiera otra de las
existentes en la base de datos. Por lo tanto, entre más cercano a cero sea el valor
E, más significativo es el alineamiento entre la secuencia que se analiza y la secuencia relacionada (Altschul, et al., 1990). Los
valores E más bajos que arrojó la comparación de la secuencia identificada en lulo
frente a la base de datos de genes correspondieron a los alineamientos con los genes
ppo reportados en papa, tomate y tabaco,
especies cercanamente relacionadas con el
lulo; sin embargo, llama la atención que se
presente un valor E de cero (0.0) respecto
al caqui, especie perteneciente a una familia que hace parte del orden de las
Ericales, filogenéticamente distante de las
solanáceas.
El programa ORF Finder permitió determinar que dentro de la secuencia nucleotídica
identificada hay un marco de lectura abierto
de 835 nucleótidos en la cadena positiva,
que se inicia en la posición 9 y se extiende
hasta la posición 843. La proteína deducida
tiene 278 aminoácidos (Figura 3).
L C K A H I K P D T E V T Y S C C P P I P E D I D S V P Y Y K F P S M T K L R I R P PA
H AV D E E Y I A K Y Q L AT S R M R G L D K D P F D P L G F K Q Q A N I H C AY
C N G AY K V G G K E L Q V H F S W L F F P F H RW Y LY F Y E R I L G S L I N D P
T FA L P Y W N W D H P K G M R I P P M F D V E G S S LY D E K R N Q N H
R N G K I I D L G F F G K E T Q T T Q L Q T M T N N LT L M Y R Q M I T N A P C P S
L F F G N P Y P L G T D P S P G M G T I E N I P H N AV H V W V G D P R Q
P N G E D M G N F Y S S G L E PA F F C H H S N V D R M W N E W K A I
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la proteína deducida del fragmento de 843 pb. identificado en lulo.
El análisis BLAST para la secuencia de
aminoácidos deducida del fragmento de 843
pb. reveló valores de similitud elevados con
las proteínas PPO de papa, tomate y tabaco que oscilan entre 66 y 86% (Tabla 7). Tal
como en el caso del análisis de la secuencia
de nucleótidos, el fragmento de proteína
hipotética de lulo muestra niveles de similitud menores con las PPO de especies pertenecientes a las familias Rosaceae y
Salicaceae. Ello se explica en función de la
distancia filogenética que hay entre la familia Solanaceae y las familias Rosaceae y
Salicaceae, pertenecientes a los órdenes
Rosales y Malpighiales respectivamente; estos dos órdenes son mucho más cercanos
entre sí que cualquiera de ellos al orden
Solanales, el cual incluye a la familia
Solanaceae. Tanto el lulo como la papa y el
tomate pertenecen al género Solanum; la
similitud entre lulo y tabaco es levemente
menor, lo que se puede justificar en función del hecho que tabaco pertenece al género Nicotiana. La notable cercanía entre
el fragmento de proteína deducido de la
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
28
Descripción de la proteína
Valor E
% identidad
PPO-E tomate (Solanum lycopersicum)
proPPO-A papa (Solanum tuberosum)
PPO-B papa (Solanum tuberosum)
PPO-P2 tomate (Solanum lycopersicum)
PPO tabaco (Nicotiana tabacum)
PPO-F tomate (Solanum lycopersicum)
PPO caqui (Diospyros kaki)
PPO POT33 papa (Solanum tuberosum)
PPO-B tomate (Solanum lycopersicum)
PPO POT32 papa (Solanum tuberosum)
PPO-D tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-A tomate (Solanum lycopersicum)
PPO-C tomate(Solanum lycopersicum)
PPO (Dasiphora fruticosa)
PPO (Neillia thyrsiflora)
PPO (Fallugia paradoxa)
PPO abeto balsámico(Populus trichocarpa)
PPO abeto del Canadá (Populus balsamifera)
6e-147
2e-145
9e-145
1e-143
1e-142
1e-142
1e-128
1e-122
1e-121
1e-118
5e-114
1e-112
2e-111
1e-87
9e-86
3e-85
4e-85
7e-85
86
85
85
85
83
85
86
73
73
69
68
67
66
56
55
54
55
55
Tabla 7. Niveles de similitud entre la proteína hipotética derivada del fragmento de 843 pb. identificado en lulo y polifenol oxidasas reportadas en otras especies.
secuencia encontrada en lulo y la PPO del
caqui, una especie de la familia Ebenaceae
que a su vez pertenece al orden Ericales
puede ser el reflejo de la relativa proximidad de los órdenes Ericales y Solanales. Con
niveles de similitud menores respecto al
fragmento de proteína de lulo se encuentran las PPO de algunas de especies de la
familia Rosaceae y las identificadas en abetos, especies pertenecientes a la familia
Salicaceae, que a su vez hace parte del orden Malpighiales, relativamente cercano al
orden Rosales.
CONCLUSIONES
Aunque una de las características que distingue a todos los genes ppo conocidos es
la divergencia en la secuencia de su extremo 5´, los iniciadores utilizados en este
estudio permitieron evidenciar que existen
variaciones a lo largo de toda la secuencia
de los genes ppo encontrados en las especies de la familia Solanaceae. Los análisis
BLAST demuestran que el diseño de los iniciadores les confiere la capacidad de am-
El Astrolabio
plificar exclusivamente genes ppo, hecho
que abre la posibilidad de que sean utilizados para estudios similares en otras especies. La elevada similitud del fragmento
identificado tanto a nivel de nucleótidos
como de aminoácidos con los genes y proteínas PPO de papa, tomate y tabaco, junto con un %GC situado dentro del rango
esperado para los genes de solanáceas se
constituyen en evidencia de que el fragmento de DNA identificado corresponde a
un gen ppo. De otro lado, los resultados
obtenidos muestran que el valor de los porcentajes de similitud entre la secuencia
encontrada en lulo y las secuencias
homólogas en otras especies (a nivel de
nucleótidos o de aminoácidos) refleja de
manera clara la distancia filogenética existente entre los individuos comparados. El
aislamiento y la caracterización molecular
de la secuencia codificante restante del gen
ppo de lulo permitirán reunir más evidencias y hacer análisis de tipo estructural y
filogenético que respalden las pruebas presentadas en este estudio respecto a la existencia de por lo menos un gen ppo en lulo.
Si bien el examen de un fragmento de DNA
29
en términos de su secuencia de nucleótidos,
el nivel de homología respecto a otros genes
y la existencia de secuencias que codifiquen para algún tipo de proteína pueden
aportar información valiosa, la prueba definitiva de la existencia de proteínas PPO
en lulo consiste en expresar el gen aislado,
purificar la proteína obtenida y hacer pruebas de actividad sobre sustratos específicos que permitan determinar su capacidad
para catalizar las reacciones de oxidación
de orto-difenoles a orto-diquinonas (Cary,
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