Tesis - Universidad de Colima

Transcripción

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES
BIOMÉDICAS
EL CERDO JOVEN COMO BIOINDICADOR DE
CONCENTRACIONES BAJAS DE GENOTÓXICOS, MEDIANTE LA
PRUEBA DE MICRONÚCLEOS EN ERITROCITOS DE SANGRE
PERIFÉRICA.
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA
M. en C. SERGIO MARTÍNEZ GONZÁLEZ
ASESOR BÁSICO: Dr. en C. OLIVIA TORRES BUGARÍN
ASESOR CLÍNICO: Dr. en C. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ
Colima, Col.; Enero de 2005.
AGRADECIMIENTOS
2
AGRADECIMIENTO
Gracias al apoyo para la realización de esta Tesis al consejo de ciencia
y tecnología del estado de nayarit (COCYTEN), dado la temática abordada
en el presente es importante para el Estado, ya que actualmente se distribuyen
y aplican grandes cantidades de productos químicos, principalmente en la
agricultura. Muchos productos tienen efectos colaterales desconocidos, como
son los genotóxicos (que dañan al DNA)
que probablemente ocasionarán
carcinogenesis y/o teratogenesis tanto en animales como en el hombre. Estos
efectos dañinos son frecuentes en nuestra comunidad nayarita de causas
específicas hasta el momento desconocidas.
Estos agentes químicos
pueden
ingresar directamente, por ejemplo los
plaguicidas, hormonales, medicamentos o sustancias manejadas en el trabajo o
el hogar; otros ingresan indirectamente con los alimentos (de origen animal o
vegetal), bebidas, plantas medicinales, que contienen tales sustancias dañinas.
3
AGRADECIMIENTOS
Gracias por el apoyo al Programa para el
Mejoramiento del Profesorado (PROMEPSEP), para realizar los Estudios del Doctorado.
Gracias por el apoyo al Centro de
Investigaciones Biomédicas de Occidente
(CIBO), en especial al Laboratorio de
Mutagénesis para la realización de esta
Tesis.
Gracias por el apoyo a la Universidad
Autónoma de Nayarit (U.A.N.), así como a la
Unidad Académica de Medicina Veterinaria
Zootecnia para realizar los Estudios del
Doctorado.
Gracias por el apoyo a la Universidad de
Colima, especialmente al Centro Universitario
de Investigaciones Biomédicas (CUIB), para
realizar los Estudios del Doctorado.
Gracias por las facilidades otorgadas a:
Dr. En C. Norberto Vivanco Pérez
Universidad Autónoma de Nayarit
Dr. En C. María de Jesús Durán Avelar
Universidad Autónoma de Nayarit
4
Mención especial para:
DR. En C. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ
Universidad de Colima
DR. En C. MIGUEL HUERTA VIERA
DR. En C. GUILLERMO ZÚÑIGA GONZÁLEZ
Centro de Investigaciones Biomédicas de Occidente
DR. En C. OLIVIA TORRES BUGARÍN
Universidad Autónoma de Guadalajara
5
Agradecimiento a:
DR. En C. SERGIO ADRIÁN MONTERO CRUZ
DR. En C. XÓCHITL ANGÉLICA R. TRUJILLO TRUJILLO
DR. En C. RAYMUNDO VELASCO RODRÍGUEZ
DR. En C. BELINDA GÓMEZ MEDA
DR. En C. ANA ZAMORA PÉREZ
M. En C. MARÍA LUISA RAMOS IBARRA
6
DEDICATORIAS
A mi esposa FABIOLA, por haberme apoyado y
comprendido durante mis ausencias.
A mis hijos: SERGIO ALEJANDRO y
RODRIGO, que son mis tesoros más grandes y
mi máximo orgullo.
7
INDICE
8
INDICE
TABLA DE CUADROS Y FIGURAS
1
GLOSARIO
3
RESUMEN
5
SUMMARY
6
1.- INTRODUCCIÓN
7
1.1.- CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Y SUS EFECTOS
GENOTOXICOS
8
1.1.2.- MUTACIONES INDUCIDAS Y ESPONTÁNEAS
9
1.2.-DETECCIÓN DE CONTAMINANTES GENOTÓXICOS
11
1.3.- PRUEBA DE MICRONÚCLEOS
12
1.4.- FORMACIÓN DE LOS MICRONÚCLEOS
13
1.5.-BIOMONITORES UTILIZADOS
15
1.6. -ERITROPOYESIS EN MAMÍFEROS
16
1.7.- SELECCIÓN DE BIOMONITORES. INVESTIGACIONES
SOBRE MICRONÚCLEOS.
19
1.8.- AGENTE INDUCTOR- CICLOFOSFAMIDA
23
2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
28
3.- JUSTIFICACIÓN
31
4.- HIPÓTESIS
33
5.- OBJETIVOS
35
6.- MATERIALES Y MÉTODOS
37
6.1.- DISEÑO EXPERIMENTAL
38
6.1.2.- DEFINICIÓN DE VARIABLES
38
6.1.3.-CRITERIOS SELECCIÓN
38
6.1.4.- SELECCIÓN DE ANIMALES
39
6.2.- REALIZACIÓN
40
6.3.- TOMA DE MUESTRAS
40
6.4.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
40
6.5.- ANÁLISIS DE LAMINILLAS
42
6.6.- MODELO EXPERIMENTAL
43
9
6.7.- TAMAÑO DE MUESTRA
44
6.8.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
45
6.9.- ASPECTOS ÉTICOS
45
7.- RESULTADOS
46
8.- DISCUSIÓN
60
9.- CONCLUSIONES
66
10.- BIBLIOGRAFÍA
68
10
TABLA DE CUADROS Y FIGURAS
Pág.
Figura no. 1- Micronúcleos en diferentes tejidos.
12
Figura no. 2- Formación de micronúcleos.
15
Figura no. 3- Eritropoyesis.
16
Figura no. 4- Eritrocitos
17
Figura no. 5- Función del Bazo.
18
Figura no. 6- Formación de micronúcleos en eritrocitos.
19
Figura no.7- Eritrocitos de paciente esplenectomizado
con quimioterapia antineoplásica.
20
Figura no. 8- Mecanismo de alquilación de la guanina de ADN
24
Figura no. 9- Acción de los alquilantes.
25
Figura no. 10- Metabolismo de la ciclofosfamida.
26
Figura no. 11- Realización de frotis.
41
Figura no. 12- Eritrocitos de cerdo con tinción con anaranjado
de acridina.
42
Cuadro no. I- Valor basal de Eritrocitos Micronucleados,
Eritrocitos Policromáticos Micronucleados y Eritrocitos
policromáticos en cerdos jóvenes.
47
Figura no. 13- Eritrocitos micronucleados de cerdo.
47
Cuadro no. II- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto
a la ciclofosfamida en dosis única.
48
Figura no. 14- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto
49
Cuadro no. III- Eritrocitos policromáticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
50
Figura no. 15- Eritrocitos policromáticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
51
Cuadro no. IV- Eritrocitos Policromáticos en el cerdo expuesto
52
Figura no. 16- Eritrocitos Policromáticos en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis única.
53
Cuadro no. V- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis continua.
54
11
Figura no. 17- Eritrocitos Micronucleados en el cerdo expuesto a
la ciclofosfamida en dosis continua.
55
Cuadro no. VI- Eritrocitos policromáticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua.
56
Figura no. 18- Eritrocitos policromáticos Micronucleados en el cerdo
expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua.
57
Cuadro no. VII- Eritrocitos Policromáticos en el cerdo expuesto
a la ciclofosfamida en dosis continua.
58
Figura no. 19- Eritrocitos Policromáticos en el cerdo expuesto a la
ciclofosfamida en dosis continua.
59
12
GLOSARIO
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
ARN: Ácido ribonucleico.
Aducto: Los aductos en el ADN se forman cuando un agente químico altamente reactivo
deficiente de electrones se une covalentemente a un sitio rico en electrones en el ADN
celular. Muchos carcinogénicos ambientales ejercen sus efectos adversos a través de sus
interacciones con el ADN. Los aductos que no son removidos del ADN por los mecanismos
de defensa pueden inducir mutaciones genéticas que son transferidas a futuras
generaciones celulares. Si esas mutaciones ocurren en áreas específicas del genoma,
como podría ser en genes tumor supresor u oncogenes, en subsecuentes eventos pueden
llevar a la transformación celular y carcinogénesis.
Anafase: Tercera etapa de la mitosis o de la meiosis (I o II) durante la cual los
cromosomas migran hacia los polos opuestos de la célula.
Aneuploidógeno: Agente capaz de producir en la célula que uno o más cromosomas
completos de un conjunto normal falten o se presenten más de una vez.
Carcinógeno: Cualquier agente que produce cáncer.
Centrómero: Pequeña masa de cromatina situada en el interior de un cromosoma y a la
que se unen las dos cromátides. El centrómero ocupa una posición característica en todo
cromosoma. Es la última parte del cromosoma que se divide y por medio de la cual se fija
al huso.
Cinetocoro: Es el sitio de fijación de los cromosomas a los microtúbulos del huso durante
la mitosis y la meiosis.
13
Clastógeno: Agente capaz de inducir aberraciones cromosómicas
Cromosoma: Cuerpos constituidos por ADN incluido dentro de una trampa proteica; son
los portadores de la información genética. Se hallan en el núcleo de la célula y pueden
observarse como estructuras intensamente teñidas en forma de bastón, durante la
división celular.
Esplenectomía: Escisión o extirpación del bazo
Genotóxico: Agente que daña al ADN.
Micronúcleo: Fragmento o cromosoma completo que por no poseer huso mitótico no
puede ser integrado al núcleo, por lo que queda en el citoplasma celular.
Micronucleogénico: Agente formador de micronúcleos.
Mitógeno: Sustancia que estimula la mitosis de las células.
Mutación: Cambio permanente y heredable del material genético. Definido comúnmente
como un cambio en un solo gen (mutación en un punto), aún cuando el término se usa
también para designar un cambio en el número o disposición de los cromosomas.
Telofase: Período de la división celular cuando los cromosomas de las células hijas
alcanzan los polos de la célula.
14
RESUMEN
El objetivo de la presente tesis fue establecer la respuesta eritrocitaria micronucleada del
cerdo joven (10 a 13 semanas/edad) expuesto a la ciclofosfamida (0.5, 1.0 2.0 y 4.0
mg/Kg), para utilizarlo como un bioindicador de concentraciones bajas de genotóxicos.
Utilizamos 50 cerdos de la cruza Landrace/Yorkshire. Estos fueron sometidos a
dos tipos de exposiciones: exposición 1) ciclofosfamida vía oral en dosis única, y 2)
administración de ciclofosfamida vía oral en dosis continua. Los cerdos fueron divididos
en 5 grupos (n =10). El grupo 1) que fue considerado como grupo control. Y cuatro
grupos de tratamiento con ciclofosfamida; grupo 2)
0.5 mg/Kg,
grupo 3) 1 mg/Kg,
grupo 4) 2 mg/Kg y grupo 5) 4 mg/kg. Todos los cerdos fueron sometidos y/o cruzados
a las dos exposiciones
(dosis única o dosis continua) con el mismo tratamiento de
ciclofosfamida. Los animales antes de usarse en la dosis continua tuvieron un tiempo de
lavado de 8 días.
Así, en los cerdos inducidos con ciclofosfamida encontramos incrementos significativos en
el número de eritrocitos micronucleados
(EMN) y
eritrocitos policromáticos
micronucleados (EPCMN) con la dosis única en los tratamientos de 0.5 mg/Kg y 4 mg/Kg.
En la dosis continua del tratamiento de 4 mg/Kg de ciclofosfamida, los promedios de
EMN mostraron incremento, así mismo sucedió en el tratamiento de 1 mg/Kg en los
EPCMN.
Los cerdos jóvenes (10 a 13 semanas/edad),
muestran
respuesta
eritrocitaria
micronucleogénica a la ciclofosfamida, aún a dosis más bajas de las recomendadas
para los roedores en pruebas de daño cromosómico. Por lo tanto, el cerdo puede ser
considerado,
como
una
prueba
confiable
para
detectar
agentes
genotóxicos
micronucleogénicos.
15
SUMMARY
The objective of the present thesis was to establish the micronucleated response
erytrocyte from the young pig (age 10 to 13 weeks) exposed to the cyclophosphamide
(0.5, 1.0 2.0 and 4.0 mg/Kg), to use it as a bioindicator of concentrations low of
genotoxic.
We used 50 pigs Landrace/Yorkshire crosses. These were subjected to two types
of expositions: exposition 1) cyclophosphamide
oral way in an unique dose, and 2)
cyclophosphamide administration oral way in a continuous dose. The pigs were divided
in 5 groups (n =10). The group 1) was considered as control. And four treatment groups
with cyclophosphamide; group 2) 0.5 mg/Kg, group 3) 1 mg/Kg, group 4) 2 mg/Kg and
group 5) 4 mg/kg. All the pigs were subjected or cruzed to the two expositions (unique
dose or continuous dose) in the same cyclophosphamide dose. The animals before being
used in the continuous dose had a time of washed-out of the drug of 8 days.
This way, in the pigs induced with cyclophosphamide we found significant increments in
the
number
of
micronucleated
erytrocyte
(EMN)
and
erytrocyte
policromatics
micronucleated (EPCMN) with the unique dose in the treatments of 0.5 mg/Kg and 4
mg/Kg. In the continuous dose of the treatment of 4 cyclophosphamide
mg/Kg, the
averages of EMN showed increment, likewise it happened in the treatment of 1 mg/Kg in
the EPCMN.
The young pigs (age 10 to 13 weeks),
show response micronucleogenic
in the
erytrocytes to the cyclophosphamide, still to lower dose of those recommended for the
rodents to test damage in the cromosomes. Therefore, the pig can be considered, like a
reliable test to detect micronucleogenic genotoxic agents.
16
INTRODUCCIÓN
17
1.1
CONTAMINACIÓN
AMBIENTAL
Y
SUS
EFECTOS
GENOTOXICOS
Diversas actividades realizadas por el hombre así como algunos eventos naturales
contaminan el medio ambiente y debido a la liberación de agentes potencialmente tóxicos
y genotóxicos, actualmente constituye una preocupación mundial por los riesgos que
conlleva para la salud humana y los ecosistemas1.
Así el medio ambiente se ve contaminado debido a que se vierten un sin número de
agentes físicos y químicos derivados de diversas actividades como es la generación de
energía, industria, siderurgia, agricultura, química y por supuesto la farmacología.
Aunado a esto, también son fuente de contaminación algunos proceso naturales como
erupción de volcanes, inundaciones, gases producidos por pantanos, entre otros
fenómenos2, 3.
Desafortunadamente, el desarrollo de la sociedad moderna se basa en la generación
de una gran cantidad de sustancias químicas, muchas de las cuales ocasionan daño a los
seres vivos, y entre ellos al hombre. Este daño puede incluir no sólo los efectos a corto
plazo como quemaduras, intoxicaciones y alergias, sino también efectos de largo plazo
como el cáncer y daños genéticos en las generaciones futuras. Desgraciadamente la
rapidez con la que se generan estas sustancias supera con mucho la velocidad con la
que se diagnostican sus efectos sobre los seres vivos, por lo que resulta de suma
importancia conocer cuáles son estas sustancias y evaluar sus efectos sobre la salud, y
por ende es vital la implementación de nuevos métodos, modelos y biomonitores que
ayuden en esta difícil tarea4,5.
Desde 1969 en respuesta al gran interés por investigar la mutagénesis ambiental, los
objetivos fueron claramente enfocados en tres áreas: la definición del rango de efectos
producidos en el humano por los mutágenos, el desarrollo de métodos confiables para la
detección de los mismos y la elucidación de mecanismos de daño cromosómico y
mutaciones génicas6.
18
Dentro de los múltiples efectos de los contaminantes se encuentra el efecto
genotóxico expresado en sus diversas formas, como por ejemplo teratogénesis,
mutagénesis y por supuesto la cancerogénesis.
Por lo tanto un agente genotóxico es todo aquel ente capaz de lesionar la integridad
del material genético y/o sus componentes asociados, entonces, bajo este término se
incluyen los agentes que interaccionan directa o indirectamente con el ADN provocando
el aumento de mutaciones (mutagénesis), también los que interfieren en algunos
procesos enzimáticos así como en la reparación o en la génesis del material proteico
involucrado en la segregación cromosómica7. Es importante señalar que los compuestos
genotóxicos afectan con mayor frecuencia a las células normales que proliferan
rápidamente como son las células epiteliales y de médula ósea, por lo tanto, existe un
gran número de células susceptibles a estos efectos dañinos8.
1.1.2. Mutaciones Inducidas y Espontáneas
Se reconoce que el ADN es portador de la información genética y tienen la capacidad
de sufrir alteraciones ocasionales, las cuales, pueden ser heredadas en forma estable y
predecible, estos cambios explican las variaciones hereditarias y la diversidad que se
encuentran en el mundo biológico9-10.
Sin embargo, muchos contaminantes son capaces de inducir cambios permanentes y
heredables en el ADN (mutación) con una frecuencia superior a la que ocurre de manera
espontánea (mutagénesis), si bien es cierto que las mutaciones pueden tener lugar por
agentes endógenos10.
Las mutaciones espontáneas son producidas en ausencia de un mutágeno conocido,
estas se generan por situaciones o agentes propios del ambiente intracelular. Estas
mutaciones pueden originarse por errores en la replicación o bien por reacciones que
ocurren de forma espontánea como consecuencia de la inestabilidad química de la
molécula de ADN o de la acción de subproductos del metabolismo celular, denominados
mutágenos endógenos7, 10-12.
19
Las mutaciones inducidas o exógenas son producidas por agentes físicos, químicos o
biológicos ajenos a la célula, y estos son denominados mutágenos exógenos7, 10-12.
La lista de estos agentes mutágenos es muy grande, y los mecanismos y efectos
producidos son muy diversos; algunos actúan como mutágenos directos y otros requieren
ser activados a carcinógenos activos por la acción de ciertas enzimas, por ejemplo7, 10-12:
1)
Agentes alquilantes transfieren grupos, generalmente metilo o etilo, a un átomo
nucleofílico de las bases nitrogenadas,
2)
Análogos de base, los que al insertarse entre los pares de bases del ADN,
distorsionan su estructura helicoidal lo que provoca el desplazamiento del marco de
lectura.
3)
Agentes bifuncionales establecen enlaces cruzados entre bases de la misma hebra o
de hebras opuestas. Tales alteraciones afectan la integridad y/o configuración
bioquímica del ADN y que al no ser corregidas antes de la replicación, por el sistema
de reparación, conducen a una mutación potencialmente cancerígena.
Las mutaciones pueden ocurrir en las células somáticas o gaméticas; cuando el daño
se produce durante la gestación, el agente se convierte en un teratógeno7, y cuando se
presentan en las primeras, se relacionan con la aparición de cáncer ya que dichas células
adquieren el estado transformado debido al aumento de la frecuencia de mutaciones,
característica principal de un proceso cancérigeno4.
Es evidente que un efecto mutagénico podría llevar a un evento cancérigeno, aunque
no es imperativo, o bien a un deterioro progresivo de la salud. De tal suerte, la
correlación entre mutagenicidad y carcinogenicidad cada día es más aceptada porque se
demostró que de 175 carcinógenos conocidos, 157 (90 % aproximadamente) son
mutágenos, lo que permite identificar con claridad la relevancia de saber con precisión el
posible daño que un compuesto puede tener sobre un organismo13.
Por lo anterior, es importante detectar las sustancias mutágenas, pues como ya se
mencionó tienen la capacidad de alterar el material genético de los organismos
incluyendo al hombre, provocando mutaciones en células somáticas con el desarrollo
subsiguiente de cáncer, o teratogénesis10.
20
Una maniobra primaria para evitar el incremento de la contaminación ambiental, sería
conocer el tipo y efecto de los contaminantes sobre los seres vivos, para posteriormente
formar leyes que regulen el manejo, tratamiento y liberación de estas sustancias.
1.2.-DETECCIÓN DE CONTAMINANTES GENOTÓXICOS
En toxicología genética se acepta que una sola prueba no puede detectar con
exactitud o predecir en forma confiable los efectos genotóxicos de una sustancia en el
humano14. Por eso es importante disponer de diversas alternativas de estudios tanto in
vivo como in vitro para probar genotóxicos. Dado que el análisis de los contaminantes de
manera directa requiere de gran precisión y de un conocimiento amplio de agente
químico que se va verificar y de que su evaluación es limitada por su sensibilidad y
especificidad del método utilizado15 es que actualmente se conoce un gran número de
pruebas con las que se puede determinar el daño genético.
Estas se pueden realizar in vivo o in vitro, con micro o macro organismos16-17. Entre
estas se encuentran una variedad de pruebas entre las que existen algunas muy
económicas y rápidas, pero también las hay sumamente costosas: Entre ellas tenemos el
cariotipo, el intercambio de cromátides hermanas, el índice mitótico, la prueba realizada
en Salmonella typhimurium o prueba de Ames y la prueba de micronúcleos11,17-20.
1.3 PRUEBA DE MICRONÚCLEOS
La prueba de micronúcleos, es un método ampliamente utilizado para la detección del
daño genotóxico producido por diferentes sustancias químicas y agentes físicos. Esta
indica el daño de agentes mutagénicos sobre los cromosomas mediante la identificación
de fragmentos acéntricos y/o cromosomas rezagados
21-23
. Los micronúcleos son
21
fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que espontáneamente o por causa
de agentes genotóxicos, quedan fuera del núcleo durante la división celular24. En
hematología los micronúcleos se conocen como cuerpos de Howell-Jolly, su forma es
generalmente redonda o almendrada y alcanza un diámetro entre 0.4 a 1.6 micras
(Figura 1)21-24.
b
a
Aa
b
d
c
d
c
La prueba de micronúcleos permite detectar agentes clastogénicos y aneuploidogénicos. Los ag
Figura 1 – a) MN en médula ósea de ratón b) MN en eritrocito de aves
c) MN en queratinocitos de ambystoma d) MN en mucosa bucal humana
aneuploidogénicos (como colchicina, vincristina y vinblastina), se caracterizan por
bloquear la polimerización de microtúbulos durante la formación del huso mitótico,
originando de esta manera el rezago de cromosomas completos, que no se incluyen en
los núcleos hijos. Mientras que los agentes clastogénicos como son las radiaciones y
algunos medicamentos antineoplásicos (como la ciclofosfamida, la arabinosa-c, el
busulfan y el metotrexate), actúan como análogos de base, por lo tanto se intercalan en
22
el ADN, e inhiben su síntesis y ocasionan posteriormente un debilitamiento de enlace
entre las bases, lo que termina por producir una fractura cromosómica. Los compuestos
aneuploidogénicos causan micronúcleos más grandes que los causados por los agentes
clastogénicos
25
. Se pueden diferenciar unos de otros por la presencia del centrómero y/o
cinetocoro mediante la técnica de FISH (hibridación in situ fluorescente), ya que si los
micronúcleos presentan centrómero generalmente estará formado por un cromosoma
completo (micronúcleo centrómero positivo) de lo contrario estará formado por un
fragmento cromosómico acéntrico (micronúcleo centrómero negativo)26-27.
1.4. FORMACIÓN DE LOS MICRONÚCLEOS
Los cambios más frecuentes en el ADN son la sustitución de una base por otra y las
deleciones o pérdidas de secuencias, si bien las deleciones pueden ser bien de una o dos
pares de bases hasta deleciones de cientos de kilobases11-12, 28.
Normalmente, tras la ruptura de la cadena de ADN los extremos resultantes se suelen
unir rápidamente por la acción de enzimas de reparación. La rotura puede ocurrir en un
solo punto o en dos puntos y si no se repara el fragmento o fragmentos que no contienen
el centrómero se perderá en la siguiente división celular. El centrómero se puede
considerar el centro cinético del cromosoma, pues sobre él se sitúan las estructuras
llamadas cinetocoros, a las cuales se unen las fibras que constituyen el huso acromático o
huso mitótico. Estas fibras o filamentos formados por microtúbulos son de naturaleza
proteica, que sirven como rieles en el huso mitótico durante la separación de las dos
cromátides en la división celular. De esta forma se produce la segregación ordenada de
los cromosomas y cada célula hija recibe
decir,
idéntica
dotación genética11-12,
una
28
cromátide de cada cromosoma, es
. La ausencia de centrómero (cromosoma
acéntrico) impide que el cromosoma se una al huso mitótico y, por lo tanto, que se
incluya en el núcleo de las células hijas11-12, 28.
23
De acuerdo a lo anterior, los micronúcleos pueden ser formados durante la transición
de metafase/anafase de la mitosis, durante la división celular etapas en las cuales ocurre
la separación de cromátides .
Son reconocidos dos mecanismos por los cuales se pueden formar los micronúcleos
(Figura 2)23:
1).-Pérdida mitótica de fragmentos acéntricos.
Es considerado el mecanismo clásico, donde cualquier fragmento cromosómico que
no posea centrómero no podrá integrarse a un núcleo, pues carece del elemento
indispensable para orientarse en el huso acromático. Después de la telofase los
cromosomas normales, así como los fragmentos que posean centrómero, darán origen a
los núcleos de las células hijas regulares. Los elementos rezagados quedarán incluidos en
el citoplasma de las células hijas y una considerable proporción es transformada en uno o
varios núcleos secundarios que son como regla mucho más pequeños que el núcleo
principal y de ahí su nombre de micronúcleo.
24
2).- Pérdida mitótica de cromosomas completos.
Esto sucede cuando se daña el funcionamiento del aparato mitótico, por ejemplo:
bajo la influencia de la colchicina, el núcleo principal es algunas veces reemplazado por
un grupo de pequeños núcleos, los cuales son en general considerablemente más
grandes que el típico micronúcleo; esto es debido a que cromosomas completos son los
que constituyen a estos micronúcleos.
Clastógeno
Aneuploidógeno
Telofase
Figura 2.- Formación de Micronúcleos.
1.5.-BIOMONITORES UTILIZADOS
La prueba de micronúcleos es ampliamente aceptada y es posible utilizarla in vivo e
in vitro en diversas11, así como en especies de laboratorio24, 29-30 y silvestres31-34 entre
ellos se encuentra al humano35-38, rata23, ratón24,39, hámster24, primates39, anfibio40-41,
aves42, peces43, moluscos15, y en gran variedad de tejidos como: sangre periférica31-34, 4446
, reticulocitos de la médula ósea17,35 linfocitos46, hepatocitos24 y en células de mucosa
bucal37-38,47.
25
Por otra parte también es posible aplicar esta técnica en plantas, ya que también
pueden ser biomonitores de agentes genotóxicos micronucleogenicos, este es el del haba
y la cebolla (Vicia faba, Allium cepa) en la que se utilizan los meristemos de la raíz para la
observación de los micronúcleos, o Tradescantia en la que se utiliza el polen
48-56
.
1.6. ERITROPOYESIS EN MAMÍFEROS
La producción de eritrocitos (eritropoyesis), se inicia con la célula tronco-eritrocítica
que se origina a partir de una célula tronco pluripotencial. La célula de la serie roja más
joven, identificable por sus características morfológicas, en la médula ósea es el
prenormoblasto, que madura a normoblasto, el cual pasa por tres estadios de
maduración, el normoblasto básofilo, el policromático y el ortocromático (Figura 3).
Eritroblasto
con micronúcleo
Figura 3. Eritropoyesis
26
El normoblasto ortocromático, 5 horas después de la última mitosis expulsa su núcleo,
proceso que incluye aproximación a la periferia y finalmente aislamiento y liberación del
mismo. Los normoblastos pierden su núcleo al pasar de la médula ósea al torrente
circulatorio, debido a que los poros entre las células endoteliales de los sinusoides
medulares tienen un diámetro menor que el núcleo del normoblasto por lo que al
atravesar dichos poros, la membrana y el citoplasma, que son deformables, pasan
fácilmente, pero el núcleo queda atrapado. La membrana se desgarra pero es reparada,
el núcleo expulsado queda en la médula y es fagocitado por los macrófagos del estroma
medular10, 52.
Al perder su núcleo, el normoblasto ortocromático se convierte en reticulocito
(eritrocito policromático, Figura 4a), que es el eritrocito joven que sale a la circulación.
Los eritrocitos policromáticos tardan aproximadamente 48 horas para convertirse en
eritrocitos maduros (eritrocitos normocromáticos, Figura 4b), y es a medida que aumenta
el contenido de hemoglobina, el citoplasma se vuelve menos azul y más rojo.
b
a
Figura 4. Eritrocitos 4a) Reticulocitos, 4b) Eritrocito
áti
Los eritrocitos policromáticos constituyen aproximadamente
1% del total de la masa
eritrocítica circulante, y el 99 % restante son eritrocitos normocromáticos. Sin embargo
27
existen especies como los equinos, los bovinos, ovinos y caprinos en los que no se
observan en circulación periférica los eritrocitos policromáticos, debido a que la vida
media del eritrocito es prolongada y el reticulocito madura en la médula ósea. La vida
media de los eritrocitos que dura en circulación en algunos mamíferos es la siguiente: en
el caballo (145 días), en la vaca (160 días), en la oveja (120 días), en la cabra (125 días
), en el perro (110 días), en el gato (68 días), en el cerdo (63 días), en el conejo (48
días), en el pollo (20 días), en la rata (48 días), en el ratón (25 días) y en el humano es
de 120 ± 20 días52.
Las células del sistema reticuloendotelial destruyen los eritrocitos viejos, malformados
o con inclusiones. Estas células, conocidas también como histiocitos, macrófagos o
clasmatocitos, varían en tamaño, aspecto y localización, poseen la propiedad de ingerir
materia particulada. Las células reticuloendoteliales incluyen a las células estrelladas o de
Kupffer que se encuentran en las paredes de los senos sanguíneos del hígado, a otras
células similares del bazo y a ciertas células de la médula ósea y de los ganglios linfáticos.
La médula ósea roja es el principal sitio de destrucción de eritrocitos en la mayoría de los
animales domésticos; mientras que en el humano es el bazo el mas importante; y lo es
menos importante en los conejos y en el cobayo; mientras que en las aves el hígado
parece ser el sitio principal de destrucción de eritrocitos dañados (Figura 5)53.
Es imprescindible señalar que en los mamíferos, después de que el eritroblasto
expulsa su núcleo para convertirse en eritrocito (aproximadamente cinco horas después
de
completar
mitosis),
por
la
última
razones
no
conocidas los micronúcleos
permanecen
en
el
citoplasma de los eritrocitos
jóvenes y es cuando es
posible visualizarlos (Figura
6)24.
Figura 5 Función Del Bazo
28
Figura 6. Formación de
Micronúcleos en Eritrocitos
1.7. SELECCIÓN DE BIOMONITORES. INVESTIGACIONES SOBRE
MICRONÚCLEOS.
Los micronúcleos están presentes espontáneamente en diferentes células, en el caso
de los eritrocitos varían desde 0 hasta 28 eritrocitos micronucleados dependiendo de la
especie y para el caso del humano en función de su condición de esplenectomizado o
no31-34.
La presencia de los micronúcleos, se ha observado en algunos animales cuyo control
de calidad que ejerce el sistema reticuloendotelial, principalmente el bazo, es menor y por
tanto, cuando estos organismos son expuestos a genotóxicos micronucleogénicos, los
eritrocitos micronucleados se incrementan de manera significativa y pueden ser
organismos con características de bioindicadores naturales30.
En el humano en condiciones normales el número de eritrocitos con micronúcleos
espontáneos en sangre periférica es casi cero por cada 10,000 eritrocitos
35
y se ha
29
demostrado que aun recibiendo drogas genotóxicas antineoplásicas con conocida
micronucleogenicidad, el valor de eritrocitos micronucleados en sangre periférica no se
eleva de manera importante, debido a la eficiencia del bazo para eliminar los eritrocitos
dañados21.
Sin embargo, en pacientes esplenectomizados se incrementa el número de eritrocitos
micronucleados de manera significativa a valores de 29.5 ± 5.8/10,000 eritrocitos y si en
estas condiciones los pacientes se exponen a un genotóxico propio de su tratamiento
médico este valor se incrementa hasta 65 ± 17.7/10,000 eritrocitos35 (Figura 7).
Por lo tanto, la esplenectomía puede ser utilizada como una herramienta en especies
Figura 7. Eritrocitos de Paciente Esplenectomizado con Quimioterapia
Antineoplásica
en las que el bazo es el responsable de eliminar a los eritrocitos micronucleados de la
circulación17.
En otros animales como el conejo, se encontró un valor basal de eritrocitos
micronucleados, bajo el cual
no se incrementó con inductores micronucleogénicos,
aunque tampoco con la esplenectomía en presencia de inductores; esto indica que en
ausencia del bazo otros órganos como el hígado pudieran suplir la función del bazo10.
Así mismo, en estudios con hámster, gerbo y rata expuestos a la colchicina (0.26 mg/kg)
30
y a la arabinosa C (6 mg/kg) durante cuatro días, no se encontró incremento de
eritrocitos micronucleados; sin embargo al extirparles el bazo hubo un incremento
significativo en el número de eritrocitos micronucleados10.
En el ratón se presenta un número importante de eritrocitos micronucleados
espontáneos y se recomienda usarlo como un biomonitor de genotóxicos mediante el
conteo de eritrocitos policromáticos y reticulocitos en pruebas a corto tiempo y de
exposición aguda a genotóxicos54.
La frecuencia de aparición de micronúcleos en eritrocitos provenientes de sangre
periférica y en eritrocitos de la médula ósea se han evaluado en cuatro especies
domésticas bovinos, ovinos, porcinos y equinos. La comparación entre estas
cuatro
especies demostró que la frecuencia en las ovejas y en el caballo es perceptiblemente
más alto el número en sangre periférica que en médula, mientras que en bovinos es más
alta la frecuencia en eritrocitos procedentes de la médula, sin embargo, en cerdos la
diferencia no es significativa. Estos resultados podrían indicar que en el bovino y en el
cerdo el bazo está implicado en el retiro de eritrocitos de la circulación periférica55.
En un estudio realizado para determinar la frecuencia de eritrocitos micronucleados
en 35 especies de mamíferos con el objetivo de seleccionar a aquellas que presenten el
mayor número de éstos, para proponerlos como probables biomonitores de daño
genotóxico mostró que las especies con valores más altos por cada 10,000 eritrocitos son
el ratón con 21.4 ± 6.5, la jirafa con 18.0 ± 0.0, el gato con 8.4 ± 2.5, el gato siamés
con 11.0 ± 0.9, el gerbo con 9.4 ± 1.3, el hámster con 6.3 ± 1.0, la zarigüeya con 7.5 ±
0.0 y el cerdo con 6.9 ± 4.032. Investigaciones en sangre periférica de gatos expuestos a
colchicina y arabinosa C, durante cuatro días en el estudio de la inducción de
micronúcleos demuestran un incremento significativo de eritrocitos micronúcleados30.
Tradicionalmente, se exponen a los probables biomonitores una vez a un genotóxico
conocido y se toman muestras 24 y 48 horas después, debido a que los eritrocitos
policromáticos aparecen en la circulación en este tiempo; su aparición o presencia indica
la certeza de que los eritrocitos policromáticos micronucleados son originados por la
exposición al agente probado7. Los eritrocitos policromáticos son los eritrocitos jóvenes
que posteriormente maduran a eritrocitos normocromáticos y por esta razón, cuando son
31
expuestos a genotóxicos en forma continua, es notable el incremento de eritrocitos
micronucleados, por su acumulación35.
En un estudio hecho en cerdos jóvenes (16-18 semanas) se encontró incremento
significativo de eritrocitos policromáticos micronucleados en sangre periférica inducidos
con diferentes grados de rayos X, demostrando así que es factible usar al cerdo para
llevar a cabo la prueba de micronúcleos con el fin de estimar daños citogenéticos así
como para valorar el efecto de compuestos potenciales de genotoxicidad56, por otro lado
también se demostró que los cerdos ( 5 semanas de edad) reflejan de manera eficiente el
efecto de potentes micronucleogénicos en reticulocitos, sin embargo, a esta edad
presentan el inconveniente de tener una producción de eritropoyesis inestable
que
interfiere con la interpretación de resultados57.
El valor basal de eritrocitos micronucleados
encontrados en cerdos jóvenes (5
semanas) es de 17.8 ± 8.38/10,000 eritrocitos que difieren con los obtenidos en cerdos
adultos (25 semanas) de 6.9 ± 4/10,00013, 34, esta diferencia tan marcada de eritrocitos
micronucleados
entre animales jóvenes y adultos, concuerda con los resultados
obtenidos en estudios con ardillas y gatos jóvenes comparados con adultos30,33.
En tanto, el valor basal de los eritrocitos policromáticos micronucleados en cerdos de
6 a 7 y de 16 a 18 semanas se encontraron valores de 3.55 ± 3.0 y 1.76 ± 1.0
respectivamente56, 34.
Por otra parte, estudios en niños prematuros, así como en ratas, conejos, cerdos,
perros y gatos lactantes tienen un número espontáneo de eritrocitos micronucleados
debido a que el sistema retículo endotelial es inmaduro a esta edad, por lo contrario en
los animales y en el humano los eritrocitos micronucleados espontáneos disminuyen al
aumentar la edad, lo cual pudiera deberse a la maduración del sistema retículo endotelial
y por lo tanto una mayor eficiencia en la eliminación de células con inclusiones
eritrocitarias34.
32
1.8.- AGENTE INDUCTOR- CICLOFOSFAMIDA
La ciclofosfamida es un compuesto cíclico, fosforado, con un grupo amino, es derivada
de la mostaza nitrogenada, por lo tanto es un agente alquilante que forma enlaces
covalentes con el ADN29.
Los principales
efectos citotóxicos y mutagénicos de los agentes alquilantes son
resultado de sus interacciones con el ADN. Estos agentes son capaces de formar iones
de carbono positivamente cargados que reaccionan con los grupos nucleófilos, como el
fosfato (PO4), sulfhidrilo (SH), amino (NH3 ), hidroxilo, carboxilo e
imidazol
en
los
ácidos nucleicos y en las proteínas relacionadas al ADN58. El átomo N7 de la guanina es
particularmente susceptible a la formación de enlaces covalentes con los agentes de
alquilación monofuncionales y
bifuncionales, (Ver Figura 8). Sin embargo, hay que
advertir que pueden ser alquilados en menor grado otros átomos en las bases de purina y
pirimidina de DNA, como serían los nitrógenos 1 y 3 de adenina, el nitrógeno 3 de
citosina y el oxígeno 6 de guanina, así como los átomos de fosfato en las cadenas de
DNA y las proteínas en relación con el ADN8,
58, 28
. Estas interacciones tal vez se
presentan en una o ambas cadenas de ADN mediante la unión entrecruzada, ya que la
mayor parte de los agentes alquilantes son bifuncionales
33
Figura 8- Mecanismo de Alquilación de la Guanina de ADN.
Una bis(cloroetil) amina forma un ion etilemonio y
un ion carbonio que reacciona con una base como
el N7 de la guanina en el ADN, produciendo una
purina alquilada. La alquilación de un segundo
residuo de guanina, mediante el mecanismo
ilustrado, resulta en el entrecruzamiento de las
cadenas de ADN.
34
(grupo bicloroetil), contando con dos grupos reactivos
que interactúan con dos bases opuestas (Ver Figura 9).
Esta reacción del ADN con estas sustancias produce
aductos, que son las biomoléculas modificadas por los
metabolitos mediante enlaces covalentes a las bases,
azúcares y el fosfato. Siendo el sistema de reparación de
daño del ADN por escisión de nucleótidos y de bases, el
Figura 9. Acción de los
que elimina la región dañada produciendo una rotura de la cadena de ADN y por último
se restituye ADN intacto, de secuencia correcta
2, 18, 23, 52
. Sin embargo, como
consecuencia de la alquilación del ADN puede producirse el daño celular a partir de la
rotura de una sola
cadena
y
el entrecruzamiento del ADN, lo cual interfiere en la
división celular59. La ciclofosfamida
es una pro-droga inactiva que sufre activación
metabólica en el hígado a un metabolito intermediario (aldofosfamida), por el sistema de
las oxidasas del citocromo P-450, posteriormente se transporta por el sistema circulatorio
a los sitios de acción, penetra por difusión a la célula, lugar donde el metabolito activo se
enlaza, generándose dos metabolitos con propiedad citotóxica, mostaza de fosforamida y
acroleína59. Según se piensa, la primera es la que posee los efectos antitumorales y/o
mutágenos; la segunda, la que ocasiona la cistitis hemorrágica (Figura 10)8, 11, 59.
La actividad antitumoral de la ciclofosfamida depende de su biotransformación en
mostaza de fosforamida y acroleína (Figura 10). Estas formas activas alquilan o se unen
en diversas estructuras intracelulares, como los ácidos nucleicos. Aun cuando no se
conocen detalles del proceso, su acción citotóxica final depende de la formación de
enlaces cruzados con las cadenas de DNA y RNA, y de la inhibición de la síntesis de
proteínas53. Como agente antineoplásico alquilante, por su acción forma parte del grupo
de compuestos denominados clastógenos, los cuales
durante la mitosis,
pueden
intercalarse en el ADN, inhibir su síntesis y ocasionar posteriormente un debilitamiento de
enlaces, que terminan por producir una fractura cromosómica23.
35
Figura 10- Metabolismo de la Ciclofosfamida.
CICLOFOSFAMIDA
SISTEMA DE
CITOCROMO P450
HEPATICO
4-hidroxiciclofosfamida
Aldehido deshidrogenasa
aldofosfamida
Enzimática
No enzimática
Mostaza de
fosforamida
4-cetociclofosfamida
Carboxi-fosfamida
METABOLITOS INACTIVOS
Orina
Acroleína
METABOLITOS TÓXICOS
Unión a ADN
La ciclofosfamida se absorbe bien por vía bucal aunque se puede administrar
intravenosa e intramuscular. Por la vía oral el nivel plasmático máximo se observa en una
36
hora y la vida media plasmática es de unas siete horas. Una vez administrada la
ciclofosfamida es eliminada del plasma sanguíneo en un 50% en las primeras 3 a 11
horas. El fármaco es excretado por la orina en un 66% aproximadamente; y el 25% de
la ciclofosfamida se elimina sin cambios58-60. Las dosis recomendadas de ciclofosfamida
en humanos como única dosis es entre 40-50 mg/Kg
vía oral60; también puede
administrarse 4 mg/Kg/día durante 14 días8; así como 3.5 mg/Kg/día vía oral por 10 días
y 16 mg/kg/día vía oral durante 5 días59. También se aplica a adultos 2 a 4 mg/Kg/día vía
oral por 10 días y a niños de 2 a 8 mg/kg/día vía oral por 6 días60.
En perros se recomienda utilizar la ciclofosfamida a dosis de 1.1-4.4 mg/Kg cada 24
horas, durante 6 días61.
Por otra parte, se ha descrito ampliamente en la literatura el efecto de la
ciclofosfamida en especies como la rata y el ratón, dejando claro que la dosis que se
requiere para poder utilizar este compuesto como control positivo en pruebas de daño
cromosómico. La ciclofosfamida es un compuesto con conocido efecto micronucleogénico,
por lo que es utilizado en experimentos para observar incremento de células sanguíneas
micronúcleadas, inducir aberraciones cromosómicas y como control positivo se aplica a
ratas y ratones dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg incluso dosis de 50 y 100 mg/Kg17, 39, 62.
En un trabajo previo (tesis de maestría) realizado en cerdos jóvenes de cinco semanas
de edad al exponerlos a dosis de 10 y 20 mg/Kg de ciclofosfamida, observamos que los
eritrocitos policromáticos disminuyen por la citotoxicidad en su sistema
mieloide, en
cambio con 5 mg/Kg los eritrocitos policromáticos micronúcleados se incrementan
significativamente57.
37
PLANTEAMIENTO
DEL
PROBLEMA
38
La contaminación con el paso del tiempo va en aumento, por otra parte día con día
son muchos los químicos que aparecen en el mercado, y la rapidez con la que se generan
supera con mucho la velocidad con la que se diagnostica sus efectos sobre los seres
vivos11, por lo que es importante implementar alternativas para su detección y en forma
particular, la determinación de aquellos agentes que producen daño a nivel cromosómico
y que pudieran más tarde conducir al desarrollo de tumores o fallas en la transmisión de
la información genética.
Por esto, es que nos hemos dado a la tarea de buscar nuevos biomonitores de
agentes genotóxicos básicamente micronucleogénicos32-38, de entre los cuales se
encuentra el cerdo debido a que presenta las características ideales para ser utilizado
como tal32, 34, 57. En la literatura se destaca que es un organismo que al ser expuesto a la
radiación permite fácilmente detectar el daño micronucleogénico tanto in vivo como in
vitro46,
56
. Además, nosotros ya describimos que la frecuencia espontánea de
micronúcleos esta directamente relacionada con la edad del animal como se ve
continuación32, 34, 57.
Frecuencia de MN
Edad
en 10, 000 eritrocitos
Jóvenes, (5 semanas)
17.8 ± 8.38, espontánea
Adultos
6.9 ± 4.0, espontánea
Sin embargo, encontramos que en animales jóvenes (5 semanas de edad) sufren
mielodepresión al exponerlos a genotóxicos aún a dosis bajas (10, 20 y 30 mg/Kg) de las
recomendadas para los roedores14, 34, y por lo tanto disminuye la eritropoyesis y por ende
no podríamos observar incremento en la frecuencia de micronúcleos, por otra parte
también observamos que cerdos de la misma edad si respondieron satisfactoriamente a la
inducción de EPCMN al ser expuestos a 5mg/Kg de ciclofosfamida.
Estos datos nos indican que el cerdo joven podría ser un excelente biomonitor de
concentraciones mas bajas de genotóxicos que las citadas en la literatura para otros
bioindicadores micronucelogénicos.
39
Por lo tanto nos preguntamos ¿Si en el cerdo de 10 – 13 semana de edad se
incrementa la frecuencia de eritrocitos micronucleados cuando se expone al organismo a
concentraciones bajas de ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg)?.
40
JUSTIFICACIÓN
41
En toxicología genética se acepta el hecho de que una sola prueba no puede detectar
con exactitud o predecir con confiabilidad los efectos genotóxicos de una sustancia en el
ser humano14. Ante esto es que se han implementado diversos modelos, a los cuales se
les induce con altas dosis de genotóxicos conocidos para demostrar su eficacia, pero
muchas veces en la realidad frecuentemente algunos grupos de personas se ven
expuestos de manera continua a concentraciones casi imperceptibles de compuestos
genotóxicos, como es el caso del personal responsable de preparación y aplicación de la
quimioterapia antineoplásica, de aquellos encargados de agroquímicos, así también los
trabajadores de industrias o incluso el mismo ambiente de las ciudades, entre otros.
De tal suerte que contar con un modelo biológico que nos permita detectar
rápidamente dichos compuestos sería el primer paso para prevenir futuros daños al ser
humano irreversibles.
42
HIPÓTESIS
43
En el cerdo de 10 – 13 semana de edad se incrementa la frecuencia de eritrocitos
micronucleados
cuando
se
expone
al
organismo
a
concentraciones
bajas
de
ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg).
44
OBJETIVOS
45
OBJETIVO GENERAL
Establecer la respuesta
eritrocitaria micronucleada del cerdo joven (10 a 13
semanas/edad) expuesto a la ciclofosfamida (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg /Kg), como un
bioindicador de concentraciones bajas de genotóxicos micronucleogénicos.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar el valor basal de eritrocitos micronucleados (EMN) en 10,000
eritrocitos (E), eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en 1,000
eritrocitos policromáticos (EPC) y eritrocitos policromáticos (EPC) en el cerdo
joven.
2. Inducir incremento de EMN/10,000 eritrocitos y EPCMN/ 1,000 EPC en cerdo
joven expuesto a dosis única de ciclofosfamida a diferentes concentraciones.
3. Inducir incremento de EMN/10,000 eritrocitos y EPCMN/ 1,000 EPC en cerdo
joven expuesto a dosis continua/24h/4días de ciclofosfamida a diferentes
concentraciones.
4. Comparar el valor basal vs inducido de EMN/10,000 eritrocitos, EPCMN/ 1,000
EPC y EPC/ 1, 000 eritrocitos de los en cerdo joven expuesto a dosis única de
ciclofosfamida a diferentes concentraciones.
5. Comparar el valor basal vs inducido de EMN/10,000 eritrocitos, EPCMN/ 1,000
EPC
y
EPC/
1,
000
eritrocitos
en
cerdo
joven
expuesto
a
dosis
continua/24h/4días de ciclofosfamida a diferentes concentraciones.
46
MATERIALES
Y
MÉTODOS
47
6.1 DISEÑO EXPERIMENTAL
6.1.1.- Tipo de estudio: Experimental
Por la captación de la información: Prospectivo.
Por el fenómeno en el tiempo: Longitudinal.
Por la presencia de un grupo control: Comparativo.
6.1.2.- DEFINICIÓN DE VARIABLES
Independiente
Inductor ciclofosfamida.
Dependientes
Eritrocitos micronucleados.
Eritrocitos policromáticos micronucleados.
Eritrocitos policromáticos.
6.1.3.-CRITERIOS SELECCIÓN
Criterios de inclusión
- Organismos: Cerdos machos y hembras.
- Peso: 20 a 25 kg.
- Edad: 10 a 13 semanas de edad.
Criterios de no inclusión
-
Estado de salud:

Cerdos golpeados.

Heridos.

Enfermos.
Criterios de exclusión
- Cerdos que enfermaron durante el experimento.
- Laminillas que por razones metodológicas no pudieron ser analizadas.
48
6.1.4.- SELECCIÓN DE ANIMALES
Se utilizaron 50 cerdos (Sus scrofa), de la cruza Landrace/Yorkshire, 25
hembras y 25 machos castrados (practica rutinaria en la porcicultura, que se realiza a los
10 días de edad). Todos los organismos se mantuvieron por un lapso de 16 días en
experimentación, tiempo durante el cual consumieron agua y alimento (porcino etapa I)
add limitum. Los animales fueron alojados en corraletas para engorda y se identificaron
con el método de arete.
49
6.2.- REALIZACIÓN
Este trabajo se realizó en la granja porcina de la Unidad Académica de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Nayarit, así como la colaboración
del Laboratorio de Mutagénesis del Centro de Investigación Biomédica de Occidente IMSS
y apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Guadalajara.
6.3.- TOMA DE MUESTRAS
Para analizar la presencia de eritrocitos micronucleados
se tomaron muestras de
sangre de cada animal. La extracción de la sangre se realizó de la vena cava anterior con
la técnica descrita por Carle y Dewhirst52;
sobre una mesa se sujetó al animal en
posición dorsal, de los miembros posteriores, de los miembros anteriores y del cuello y
mediante el uso de jeringas con aguja del calibre 20 y 2 pulgadas se penetró a 1.25 cm
del vértice del cartílago cariniforme, sobre una línea trazada desde dicho vértice a la base
de la oreja con la aguja en dirección hacia adentro, hacia abajo y hacia atrás, se ingresó
al tórax entre el primer par de costillas pasando una torunda de algodón impregnado de
alcohol en la zona a tomar la muestra, la aguja fue penetrada a la vena cava en el punto
donde convergen las venas yugulares y las braquiales, se hizo fluir sangre al interior de la
jeringa mediante aspiración ligera y una vez tomada la muestra se presionó con el
algodón en el lugar de la punción a fin de cerrar la herida52.
6.4.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Se realizó un frotis sanguíneo, en tres laminillas de las cuales fueron analizadas dos y
la otra fue almacenada como archivo para ser utilizada solo en caso necesario
de
confirmación o pérdida (Figura 10). Los frotis fueron llevados al
50
Figura 11.- Realización de frotis
laboratorio donde se fijan en etanol al 80% por 15 minutos y posteriormente fueron
teñidos con anaranjado de acridina.
En trabajos de esta naturaleza se recomienda la tinción con anaranjado de acridina y
microscopio de fluorescencia ya que este flouorocromo es específico para ácidos
nucleicos. Como
el contenido de los micronúcleos es ADN se observan verde limón
brillante (Figura11) y los reticulocitos por poseer todavía gránulos ribosómicos se ven rojo
naranja31-34,45,63.
Procedimiento de la tinción
1.
La muestra fue tratada con agua destilada, pasada sucesivamente por alcohol etílico
de 80, 70 y 50 %.
2.
3.
Fue enjuagada de 3 a 10 segundos en ácido acético al 1%.
Se tiñó durante 3 minutos en anaranjado de acridina al 0.01% amortiguado (1:9
anaranjado de acridina concentrado al 0.1% y amortiguador de fosfato a pH 6.0).
4.
Se dejó un minuto en amortiguador de fosfato para quitar el colorante no fijado.
5.
Se diferenció con cloruro de calcio 0.1M durante 30 segundos a un minuto o hasta
que los núcleos presenten una evidente fluorescencia verde clara.
6.
Se lavó cuidadosamente en amortiguador de fosfato para quitar el cloruro de calcio.
7.
Se montó poniendo bajo el cubreobjetos una o dos gotas de amortiguador de
fosfato y las laminillas fueron observadas con un microscopio de fluorescencia con
excitación azul (488 nm) y filtro amarillo (515 nm), con el objetivo de inmersión.
51
b
a
Figura 12).-Eritrocitos de cerdo con tinción con anaranjado
de acridina. a) MN b) Reticulocito
6.5.- ANÁLISIS DE LAMINILLAS
El
conteo
de
eritrocitos
normocromáticos
micronucleados
(EMN),
eritrocitos
policromáticos micronucleados (EPCMN), así como la proporción de eritrocitos
policromáticos (EPC), con respecto a los normocromáticos se llevó a cabo de la siguiente
manera; se observó el frotis sanguíneo y se buscó una zona uniforme de eritrocitos para
el conteo, observando campo por campo, donde se contaron de la siguiente manera:
1. Eritrocitos micronucleados: Una vez ubicada una zona uniforme y calculado el número
de eritrocitos normocromáticos por campo, se identificaron los micronucleados,
contando uno por uno. Este mismo procedimiento se repitió hasta contar 10,000
eritrocitos normocromáticos.
2. Los eritrocitos policromáticos micronucleados, fueron contados por campos uno por
uno hasta contar 1,000 eritrocitos policromáticos.
3. Eritrocitos policromáticos:
Una vez ubicada una zona uniforme, y calculado el
número de eritrocitos normocromáticos por campo, se identificaron los eritrocitos
policromáticos, contando uno por uno, este mismo procedimiento se repitió hasta
contar 1,000 eritrocitos normocromáticos.
52
6.6.- MODELO EXPERIMENTAL
Se utilizaron 50 cerdos, de manera aleatoria se formaron 5 grupos con 10 individuos
cada uno (5 hembras y 5 machos) y a cada grupo, excepto el control fueron sometidos
a dos tipos de exposiciones con ciclofosfamida;
Exposición 1) Administración de ciclofosfamida vía oral en dosis única,

Grupo 1) Control.

Grupo 2) tratamiento 0.5 mg/Kg de ciclofosfamida.

Grupo 3) tratamiento 1 mg/Kg de ciclofosfamida.

Grupo 4) tratamiento 2 mg/Kg de ciclofosfamida.

Grupo 5) tratamiento 4 mg/kg de ciclofosfamida.
Exposición 2) Administración de ciclofosfamida vía oral en dosis continua/ 24
h / 4 días.

Grupo 1) Control.
 Grupo 2) tratamiento total 2 mg/Kg de ciclofosfamida. Fraccionada a 0.5 mg/Kg
de ciclofosfamida/ 24h/4 días.
 Grupo 5) tratamiento total 16 mg/Kg de ciclofosfamida. Fraccionada a 4.0
mg/Kg de ciclofosfamida/ 24h/4 días.
Todos los grupos de cerdos fueron sometidos a dos exposiciones con la misma
dosis de ciclofosfamida. La primera exposición
que recibieron fue la
de dosis
única, se dejaron reposar 8 días para posteriormente administrarles la dosis
continua.
53
Tiempo de muestreo
Dosis única
Se tomaron las muestras sanguíneas: basal, 24 h, 48 h y 72 h después de
iniciado el tratamiento y una vez analizadas se compararon todos los tiempos
con la muestra basal.
Dosis continua
Se tomaron las muestras sanguíneas a las 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h y 144
h después de iniciado el tratamiento, para su posterior comparación con el
valor basal.
6.7.- TAMAÑO DE MUESTRA
En todas las especies estudiadas hasta el momento se observa que los valores
sanguíneos tienen una variación muy amplia respecto a la media de la muestra, por lo
que al calcular el número de repeticiones nos resultaría un gran tamaño de muestra. Sin
embargo, en experimentos de este tipo se ha trabajado con 10 animales, incluso se
recomienda usar de 4 a 5 individuos63. En base a estos antecedentes, el tamaño de
muestra por grupo fue de 10 cerdos, formados por 5 machos y 5 hembras. Se usaron las
mismas proporciones de cerdos machos y hembras para evitar una posible interferencia
por diferencia en sexos.
6.8.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los grupos se analizaron con la prueba ANOVA de Friedman para identificar
diferencias significativas intragrupales. En los grupos que mostraron diferencia
significativa se aplicó la prueba de Wilcoxon con corrección de Bonferroni para múltiples
comparaciones para identificar el tiempo en el cual es visible el efecto, las comparaciones
pareadas se hicieron con su respectivo tiempo basal. En todas las pruebas se utilizó un
54
intervalo de confianza de 95% y las diferencias fueron consideradas significativas cuando
el valor de
p<0.05. Las pruebas estadísticas se realizaron por medio del programa SPSS
(v.10.0) para Windows.
6.9.- ASPECTOS ÉTICOS
 Los animales fueron tratados de acuerdo a las Normas y Reglamentos Institucionales, a
la Ley General de Salud en materia de investigación para la salud y a la NOM-062-ZOO199964-65.
 Los cerdos después del experimento continuaron con su crecimiento y engorde
tradicional para su posterior sacrificio (25 semanas/edad) en el rastro. Se debe señalar
que no existió ningún riesgo con respecto al consumo de esta carne porque el 75 % de
la ciclofosfamida se elimina en las primeras 11 horas58-59, el resto es eliminado en las
siguientes horas. Los animales se sacrificaron casi 3 meses después de la
administración del compuesto genotóxico.
 El manejo de la ciclofosfamida como el colorante naranja de acridina fue de acuerdo a
la Ley General de Salud y la Normas Oficiales Mexicanas64,66-67. La ciclofosfamida usada
fue
presentación comercial (Genoxal del Laboratorio Baxter). De acuerdo
a los
lineamientos se usaron guantes, bata u overol y cubre bocas para evitar contacto. Los
excedentes de ciclofosfamida, las jeringas, las agujas, los guantes, los cubre bocas y
las laminillas usadas se depositaron en un recipiente especial, para su posterior
destrucción de acuerdo a las Normas Oficiales Mexicanas.
55
RESULTADOS
56
VALOR BASAL
Se tomaron muestras de 50 cerdos cruza Landrace/Yorkshire de 10 semanas de edad
para obtener el valor basal de los eritrocitos micronucleados (EMN),
policromáticos
micronucleados
(EPCMN)
y
eritrocitos
policromáticos
eritrocitos
(EPC).
Los
parámetros sanguíneos se presentan en medias y desviación estándar, como se observan
en el cuadro I.
CUADRO I
Valor basal de EMN, EPCMN y EPC en cerdos jóvenes
EMN/10,000 eritrocitos
7.68± 4.7
EPCMN/1,000 eritrocitos
policromáticos
2.6 ± 1.5
EPC/1,000 eritrocitos
10.42 ± 5.7
Así se observaron los eritrocitos micronucleados, con microscopio de fluorescencia.
a
b
Figura 13. Eritrocitos micronucleados de cerdo.
a- eritrocito normocromático micronucleado
b- eritrocito policromático micronucleado
57
DOSIS ÚNICA
Análisis de Eritrocitos Micronucleados (EMN)
Al analizar el total de datos del grupo control no encontramos diferencia significativa. Con
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo a las 48 y 72 h.
Mientras que en el tratamiento de 1 mg/kg hay disminución significativa a las 48 y 72 h.
El de 2.0 mg/kg no produjo aumento. Y el de 4.0 mg/Kg indica incremento de EMN a las
24 h (Cuadro II y Gráfica I).
Cuadro No. II EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
GRUPO
TIEMPO
n=10
DOSIS
BASAL
24h
48h
72h
▼P
1
CONTROL
6.3±2.66
7.4±4.12
5.4±2.76
7.0±3.65
p=0.288
7.3±3.62
7.7±2.21
8.9±4.07
p=0.018
**p=0.012
**p=0.008
5.6±2.37
6.1±2.85
**p=0.005
**p=0.007
12.7±5.46
13.9±6.52
14.8±7.32
p=0.012
6.8±2.82
11.9±5.57
10.8±4.44
10.3±4.24
p=0.038
√
**p=0.011
√
2
0.5 mg/Kg
5.1±2.07
√
3
1 mg/Kg
10.7±6.32
6.5±3.41
√
4
2 mg/Kg
9.5±6.06
p=0.008
√
5
4 mg/Kg
▼ ANOVA de Friedman: comparación entre los diferentes tiempos.
** Wilcoxon: comparación del tiempo basal con 24 h, 48 h y 72 h (p<0.016, corrección de Bonferroni).
Datos en Medias y desviación estándar
Eritrocitos micronucleados/10,000 eritrocitos
√ Aplicación de tratamiento
58
Figura 14.
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
ERITROCITOS MICRONUCLEADOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS ÚNICA)
Medias de EMN/10 000
eritrocitos
16
P=0.011
14
P=0.012
12
P=0.008
P=0.005
10
8
P=0.007
6
4
2
0
Control
0.5 mg/kg
1 mg/kg
2 mg/kg
4 mg/kg
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
tiempo/horas
T.Basal
24 h
48 h
72 h
59
Análisis de Eritrocitos Policromáticos Micronucleados (EPCMN)
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo en la frecuencia de
EPCMN a las 48 h. El análisis de 1.0 mg/Kg y 2.0 mg/Kg no existió diferencia significativa
en ningún tiempo. En cambio en el tratamiento de 4 mg/Kg los EPCMN muestran
diferencia significativa a las 24 h ( Cuadro III y Gráfica II).
Cuadro No. III
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
GRUPO
DOSIS
(n=10)
1
TIEMPO
24h
48h
72h
▼
2.2±1.23
2±1.05
2.8±1.32
p=0.208
2.2±1.14
4.6±1.51
2.2±1.32
p=0.001
BASAL
CONTROL
2.7±1.49
√
2
0.5 mg/Kg
1.9±0.99
√
3
1 mg/Kg
2±1.80
**p=0.007
1.8±0.83
3.1±1.92
1.7±1.66
p=0.053
5.3±2.21
4.2±2.1
5.7±2.83
p=0.028
3.1±1.28
6.9±2.33
4±2.05
3.3±1.77
p=0.000
√
**p=0.005
√
4
2 mg/Kg
3.3±1.88
√
5
4 mg/Kg
▼ ANOVA de Friedman: comparación entre los diferentes tiempos (p<0.05).
Eritrocitos policromáticos micronucleados/1,000 eritrocitos policromáticos
60
Figura 15.
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS EN
CERDO (CICLOFOSFAMIDA DOSIS ÚNICA)
P=0.005
Medias de EPCMN/1000 eritrocitos
policromáticos
8
7
P=0.007
6
5
4
3
2
1
0
Control
0.5 mg/kg
1 mg/kg
2 mg/kg
4 mg/kg
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Tiempo/horas
T.Basal
24 h
48 h
72 h
61
Análisis de Eritrocitos Policromáticos (EPC)
respecto al tratamiento 0.5 mg/Kg observamos aumento significativo en la frecuencia de
EPC a las 48 h y 72 h. El análisis de 1.0 mg/Kg no encontramos diferencias y a los 2.0
mg/Kg detectamos diferencia significativa a las 72 h. En cambio en el tratamiento de 4
mg/Kg no se observó diferencia alguna (Cuadro IV y Gráfica III).
Cuadro No. IV
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
GRUPO
DOSIS
TIEMPO
24h
48h
72h
▼
13.4±4.20
15.4±4.35
14.7±3.53
p=0.309
5.3±0.82
7.6±1.84
8±1.49
p=0.001
**p=0.009
**p=0.011
14.4±3.92
13.0±3.09
12.3±3.27
p=0.498
10±1.83
10.2±1.48
12.6±3.53
p=0.020
BASAL
1
CONTROL
17.7±6.51
√
2
0.5 mg/Kg
5.1±0.73
√
3
1 mg/Kg
13.8±2.53
√
4
2 mg/Kg
9.4±1.57
√
5
4 mg/Kg
6.1±1.19
**p=0.014
6.4±1.35
5±1.56
5.6±1.07
p=0.144
√
▼ ANOVA de Friedman: comparación entre los diferentes tiempos (p<0.05)
Eritrocitos policromáticos/1,000 eritrocitos
62
Figura 16.
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis única.
ERITROCITOS POLICROMÁTICOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS ÚNICA)
Medias de EPC/1000 eritrocitos
20
18
16
P=0.014
14
P=0.009
12
P=0.011
10
8
6
4
2
0
Control
0.5 mg/kg
1 mg/kg
2 mg/kg
4 mg/kg
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Tiempo/horas
T.Basal
24 h
48 h
72 h
63
DOSIS CONTINUA
Análisis de Eritrocitos Micronucleados (EMN)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 4mg/Kg en
los tiempos 48 h, 72 h y 144 h (Cuadro V y Gráfica IV)
Cuadro No. V
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
GRUPO
DOSIS
TIEMPO
24h
48h
72h
96h
120h
144h
▼
6.3±2.66
5.3±2.31
5±2.49
4.8±1.99
5.5±2.42
4.7±1.83
4.2±1.93
p=0.582
√
√
√
√
5.1±2.07
3.5±2.22
4.2±1.69
3.2±1.48
3.6±1.65
3.7±1.77
3.9±2.18
p=0.119
√
√
√
√
10.7±6.32
6.3±2.79
6.8±2.25
5.4±3.24
7.1±2.56
7.5±3.34
6.2±3.22
p=0.112
√
√
√
√
9.5±6.06
16±9.48
17.3±8.0
15.5±5.54
11.7±6.29
16.3±8.47
13.1±8.08
p=0.002
√
√
√
√
12±5.5
14±5.7
**
**
p=0.007
p=0.007
**
√
√
p=0.007
BASAL
1
2
3
4
CONTROL
0.5 mg/Kg/día
1 mg/Kg/día
2 mg/Kg/día
5
4 mg/Kg/día
6.8±2.82
√
10.3±2.8
√
p=0.009
8.8±3.43
10.3±3.2
10.5±3.5
** Wilcoxon: comparación del tiempo basal con 24 h, 48 h, 72 h, 96 h , 120 h y 144 h (p<0.008, corrección
de Bonferroni).
Eritrocitos micronucleados/10,000 eritrocitos
64
Figura 17.
EMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
ERITROCITOS MICRONUCLEADOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
P=0.007
Medias de EMN/10 000 eritrocitos
20
P=0.007
18
P=0.007
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Control
0.5 mg/kg/día
1 mg/kg/día
2 mg/kg/día
4 mg/kg/día
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Tiempo/horas
T.Basal
24 h
48h
72 h
96 h
120 h
144 h
65
Análisis de Eritrocitos Policromáticos Micronucleados (EPCMN)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 1mg/Kg en
los tiempos 72 h y 120 h (Cuadro VI y Gráfica V).
Cuadro No. VI
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
GRUPO
DOSIS
TIEMPO
24h
48h
72h
96h
120h
144h
▼
BASAL
1
CONTROL
2.7±1.49 1.8±1.03 1.5±1.08 1.6±0.97 2.0±1.05 1.1±1.29 1.3±0.82 p=0.150
√
2
√
√
√
0.5 mg/Kg/día 1.9±0.99 2.1±2.23 2.8±1.93 2.7±1.57
4.2±2.2
2.1±1.37 1.2±1.23 p=0.038
2.3±1.05 6.5±3.24 **p=0.007 5.6±2.0
5.8±1.30 1.9±0.93 p=0.000
√
√
√
√
5.5±1.30
3
1 mg/Kg/día
2±1.80
√
4
2 mg/Kg/día 3.3±1.88 4.8±2.82
√
5
√
√
4 mg/Kg/día 3.1±1.28 2.5±1.65
√
√
√
√
5±2.71
4.1±2.02
√
√
3.6±1.9
√
**p=0.007
2.8±2.1
2.9±1.73 1.4±1.71 p=0.072
5.3±3.09 1.6±1.35 4.2±2.15
4±1.89
p=0.002
√
de Bonferroni).
Eritrocitos policromáticos micronucleados/1,000 eritrocitos policromáticos
66
Figura 18.
EPCMN en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS EN
CERDO (CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
P=0.007
7
6
policromáticos
Medias de EPCMN/1000 eritrocitos
P=0.007
5
4
3
2
1
0
Control
0.5 mg/kg/día
1 mg/kg/día
2 mg/kg/día
4 mg/kg/día
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Tiempo/horas
T.Basal
24 h
48h
72 h
96 h
120 h
144 h
67
Análisis de Eritrocitos Policromáticos (EPC)
Al analizar el total de datos solo encontramos diferencia en el tratamiento de 2.0
mg/Kg en los tiempos 120 h y 144 h (Cuadro VII y Gráfica VI).
Cuadro No. VII
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
GRUPO
DOSIS
TIEMPO
24h
48h
72h
96h
120h
144h
▼P
BASAL
1
CONTROL 17.7±6.51 16.1±2.47 13.5±3.44 14.3±2.67 15.7±4.76 13.1±2.18 14.3±3.23 p=0.119
√
√
√
√
0.5
5.1±0.73
5.3±1.25
4.5±0.85
6.3±0.67
mg/Kg/día
√
√
√
√
2
3
1
2
√
√
√
6.9±2.77
p=0.002
√
9.4±1.57 14.4±5.08 12.5±4.01 11.5±3.78 9.2±1.32
mg/Kg/día
√
√
√
√
4
6.1±1.19
5.7±1.7
5.6±1.17
6.5±1.58
mg/Kg/día
√
√
√
√
5
6.2±1.03
13.8±2.53 12.9±2.88 14.5±4.97 14.8±3.01 15.7±2.11 15±3.97 17.5±6.11 p=0.305
mg/Kg/día
4
4.8±1.75
4.5±1.72
3.4±1.78
p=0.000
**p=0.005 **p=0.005
4.3±1.25
4.4±1.07
4.6±0.84
p=0.000
de Bonferroni).
Eritrocitos policromáticos/1,000 eritrocitos
68
Figura 19.
EPC en el cerdo expuesto a la ciclofosfamida en dosis continua
ERITROCITOS POLICROMÁTICOS EN CERDOS
(CICLOFOSFAMIDA DOSIS CONTINUA)
Medias de EPC/1000 eritrocitos
20
18
16
14
12
P=0.005
10
8
P=0.005
6
4
2
0
Control
0.5 mg/kg/día
1 mg/kg/día
2 mg/kg/día
4 mg/kg/día
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Tiempo/horas
T.Basal
24 h
48h
72 h
96 h
120 h
144 h
69
DISCUSIÓN
70
Como antecedente sabemos que para que un organismo sea un buen
bioindicador de sustancias micronucleogénicas debe presentar una frecuencia mayor o
igual a 6 EMN espontáneos, pues esto nos indica que su sistema depurador no es muy
eficiente y por lo tanto cuando dicho organismo sea expuesto a un genotóxico nos
permitirá fácilmente identificar el daño. Este sistema depurador no es otra cosa que el
sistema reticuloendotelial, que en el hombre el bazo es muy importante, mientras que en
conejos y cobayos es menos su actividad; en las aves el hígado parece ser el sitio
principal, pero sobre todo la médula ósea roja es el principal sitio de destrucción de los
eritrocitos viejos, dañados o con inclusiones en la mayoría de los animales domésticos53.
Actualmente se cuenta con diversos biomonitores en los cuales es esencial tomar en
cuenta la edad del organismo para aprovechar al máximo su poder para detectar los
agentes genotóxicos básicamente micronucleogénicos, ya que a menor edad mayor
respuesta en la formación de eritrocitos micronucleados31,33-34.
Para el caso del cerdo, con este trabajo
demostramos que tiene estas
características, ya que a las 10 semanas de edad presenta 7.6 EMN/10,000 eritrocitos, lo
cual es un buen número de eritrocitos micronucleados espontáneos.
En el presente trabajo encontramos resultados similares a los registrados en otras
especies animales, en donde a mayor edad del animal menor número de eritrocitos
micronucleados de origen espontáneo. Los cerdos adultos presentan espontáneamente
una frecuencia de 6.9 EMN/1.7 EPCMN32, los cerdos de 5 semanas 17.8 EMN/ 3.5
EPCMN34
y nosotros encontramos en cerdos de 10 semanas de edad
7.6 EMN/ 2.6
EPCMN. Estos datos indican que la edad ideal para usar este organismo como biomonitor
podría ser a las 5 semanas de edad, sin embargo hay que recordar que los cerdos desde
su nacimiento hasta las 5 semanas tienen una eritropoyesis acelerada e inestable lo que
interfiere en la interpretación de resultados, así como en la reproducibilidad del modelo.
71
En los cerdos de 10 semanas de edad el sistema de eritropoyesis ya se encuentra estable
como se demuestra en nuestros resultados de eritrocitos policromáticos
(EPC), esta
frecuencia es similar a la del adulto con un promedio de 10 EPC/1,000 eritrocitos totales,
(Cuadro I.)34,68.
Por otra parte muchos de los compuestos son tóxicos hasta que son
metabolizados, tal es la situación de la ciclofosfamida, y en el caso del cerdo su sistema
microsomal dependiente de citocromo P-450, que es el responsable de metabolizar
compuestos, en el cerdo este sistema termina de madurar a las 6 semanas de edad69, un
argumento más para definir la edad de 10 semanas como la más satisfactoria para utilizar
al cerdo con estos fines.
En el presente trabajo se administró la ciclofosfamida en dos exposiciones: en
dosis única y en dosis continua.
Se realizó la dosis única porque se busca un efecto entre las 24 h y 72 h, el cual se
verá reflejado en los eritrocitos policromáticos ya que estos son los eritrocitos recién
formados, de tal suerte que si estos policromáticos presentan micronúcleos entonces
tenemos la certeza de que son originados por la exposición al inductor usado70. Los
eritrocitos policromáticos maduran posteriormente a eritrocitos normocromáticos (ENC) y
por esta razón, cuando la exposición es continua, es notable el incremento de eritrocitos
micronucleados por su acumulación50.
Para valorar el incremento de células micronucleadas por su acumulación se llevó a
cabo la exposición en dosis continua durante 4 días, como se ve en los resultados.
72
El cerdo joven mostró el efecto de la ciclofosfamida en la
dosis única a los
tratamientos 0.5 y 4 mg/Kg en eritrocitos policromáticos micronucleados y eritrocitos
micronucleados (Cuadros 2,3). En la dosis continua respondió a los tratamientos 1 y 4
mg/Kg en eritrocitos policromáticos micronucleados y eritrocitos micronucleados
respectivamente(Cuadros 5, 6).
Con respecto al tratamiento de 2 mg tanto para la dosis única como la continua se
observa tendencia a incremento de células micronucleadas (EMN y EPCMN) sin embargo
este incremento no es significativo; cabe señalar que en la dosis continua hubo una
franca miolodepresión en respuesta al daño del inductor, lo que queda demostrado por la
disminución estadística significativa de los eritrocitos policromáticos, (cuadro 7).
Resultados similares se han descrito en otros trabajos57,70. Se conoce que muchos
compuestos dependiendo de la dosis y el período de administración pueden inhibir la
mitosis, lo que se ve reflejado en el número de EPC en la circulación sanguínea, y si hay
disminución de mitosis también baja la formación EPCMN70. Lo anterior explica por qué
no hubo incremento significativo en el tratamiento de 2 mg/Kg/día de ciclofosfamida.
En el tratamiento de 0.5 mg/Kg, con la primera exposición que fue la de dosis
única posiblemente se activaron los diferentes sistemas de destoxificación con los que
cuentan los seres vivos como son el caso de la glutation-S-transferasa y la N-acetil
transferasa y por lo cual no se observó incremento en la dosis continua4,71-72.
Por otro lado, en los cerdos quizás existe una variabilidad genética entre
individuos como la que existe en el humano, y por lo tanto diferencias en el metabolismo
de la ciclofosfamida. Estas variaciones metabólicas de los individuos permiten entender
diferentes tipos de respuestas entre organismos a los efectos de los genotóxicos y por lo
tanto diferentes grados de susceptibilidad73.
73
Como se observa en este trabajo la respuesta micronucleogénica fue muy variada,
por lo que investigadores especialistas recomiendan que en este tipo de trabajos se usen
diferentes dosis altas, medianas y bajas del agente en cuestión y tomar en cuenta los
eritrocitos policromáticos y eritrocitos normocromáticos63. También recordar que cuando
se estudia un compuesto con posible actividad genotóxica se debe analizar con varios
modelos, ya sea in vivo o in vitro.
Estos resultados concuerdan perfectamente por los descritos en otros trabajos en
los que usaron como bioindicador a gatos, ardillas y ratones, cabe señalar que en dichos
trabajos utilizaron como inductores a la colchicina y arabinosa C30,33,54. En un trabajo
previo encontramos resultados similares en cerdos de 5 semanas de edad, con una dosis
mayor (5 mg/Kg).
Como se ve en nuestros resultados, el cerdo es un excelente bioindicador
de
agentes micronucleogénicos de dosis bajas de agentes genotóxicos, esto se constata al
observar que hay incremento significativo de células micronucleadas a las dosis de 0.5, 1
y 4 mg/Kg.
Algunos autores señalan que este animal tiene una alta sensibilidad a diversos
compuestos así por ejemplo cuando se expusieron a la ocratoxina presentan incremento
en la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas y que este animal tiene un DL50
para el compuesto antes mencionado menor que para la rata y el ratón74-75, por otra
parte se describe que el cerdo responde a menor dosis de radiación ionizante que otros
organismos56,76.
74
Como ya lo habíamos mencionado La ciclofosfamida es un compuesto de uso
común
para demostrar daño genotóxico mediante la prueba de micronúcleos, e
inducción de aberraciones cromosómicas, sin embargo a las dosis usadas al menos en
ratas17 y ratones77 van de 5,10,20 e incluso hasta 50 y 100 mg, además es importante
señalar que la dosis letal en ratas es de 160 mg/Kg/iv como podemos darnos cuenta las
dosis usada en los diversos modelos son muy superiores a las que nosotros usamos,
incluso realizamos un experimento piloto en 2 cerdos para analizar el comportamiento del
cerdo a 50 mg de ciclofafosfamida en dosis única. De estos dos animales, uno murió
repentinamente a las 72 h, el otro mostró diarrea y recibió tratamiento, lográndose
recuperar, esto causado por el gran efecto citotóxico mielodepresivo a esta dosis de
ciclofosfamida en el cerdo57. La diferencia tan marcada de la dosis de ciclofosfamida,
entre roedores y el cerdo, posiblemente se deba a la variación de la vía metabólica a la
ciclofosfamida entre las especies78-79.
En un estudio con eritrocitos policromáticos micronucleados en sangre periférica de
cerdos jóvenes (16 a 18 sem.) inducidos con rayos X, concluyen que es factible usar al
cerdo con la prueba de micronúcleos para estimar daños citogenéticos, causado por
radiaciones ionizantes o compuestos químicos potenciales56 .
También existen trabajos donde se demostró en cerdos el efecto genotóxico de la
hormona beta agonista mediante la prueba de intercambio de cromátidas hermanas y la
prueba de micronúcleos. La frecuencia de la aberración cromosómica fue correlacionada
positivamente a la cantidad de la hormona usada80.
Estudios con cerdos infestados con el cisticerco Taenia solium, demuestran daño
genotóxico en la forma de intercambio de cromátides hermanas y también con la prueba
de micronúcleos en la que se observaron 4000 linfocitos por cerdo resultando 0.212 %
células de linfocitos micronucleados en cerdos infectados y un valor de 0.027 % para el
grupo control81.
75
Por todo lo anterior se deduce que el cerdo presenta respuesta eritrocitaria
micronucleogénica a la ciclofosfamida, aún a dosis más bajas de las recomendadas para
otros modelos en pruebas de daño cromosómico. Por lo tanto puede ser considerado
como una prueba confiable para detectar genotóxicos micronucleogénicos.
76
CONCLUSIONES
77
1. El número de eritrocitos micronucleados en cerdos jóvenes (10 a 13 semanas de
edad), se incrementa cuando se expone a los animales a concentraciones bajas de
ciclofosfamida.
2. En el cerdo la proporción basal de: eritrocitos micronúcleados, eritrocitos
policromáticos micronucleados y eritrocitos policromáticos respectivamente son
7.68±4.7, 2.6± 1.5 y 10.42± 5.7.
3. En los cerdos inducidos con ciclofosfamida con dosis única encontramos
incrementos significativos en los valores de eritrocitos micronucleados y en los
eritrocitos policromáticos micronucleados en los tratamientos de 0.5 mg/Kg y 4
mg/Kg.
4. En los cerdos inducidos con ciclofosfamida con dosis continua encontramos
incrementos significativos en los valores de eritrocitos micronucleados
en el
tratamiento 4 mg/Kg/día y en los eritrocitos policromáticos micronucleados en el
tratamiento de 1 mg/Kg/día.
5. El cerdo joven es un indicador biológico capaz de detectar concentraciones más
bajas de genotóxicos que las detectadas por otros biomonitores, mediante la
prueba de micronúcleos en eritrocitos normocromáticos y policromáticos.
6. Por lo tanto, el cerdo puede ser considerado como una prueba confiable para
detectar genotóxicos micronucleogénicos.
78
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Tesis - Universidad de Colima

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