Instrução de Uso Rubéola IgG

BIOLISA RUBÉOLA IgG
K 125
INSTRUÇÕES DE USO
FINALIDADE
Teste para determinação quantitativa e qualitativa de anticorpos IgG
para Rubéola em soro ou plasma humano por enzimaimunoensaio em
microplaca. Somente para uso diagnóstico in vitro.
EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS
Materiais contidos no kit:
- Reagentes descritos no quadro anterior
- Instruções de uso (manual)
PRINCÍPIO DE AÇÃO
Metodologia: Enzimaimunoensaio ou imunoenzimétrica.
O Kit BIOLISA Rubéola IgG é um ensaio imunoenzimático em fase sólida
baseada no princípio de detecção qualitativa e quantitativa indireta de
anticorpos IgG para Rubéola no soro ou plasma humano. Anticorpos IgG
anti - Rubéola presentes na amostra ligam-se aos antígenos revestidos
na microplaca formando complexos antígeno-anticorpos IgG. Após a
incubação inicial, a microplaca é lavada para remover os materiais não
ligados. A Enzima Conjugada anti-Anticorpos IgG humanos é adicionada à
microplaca e então incubada.
Os anticorpos enzima - conjugado anti-IgG humano se ligam aos anticorpos
IgG imobilizados pelos antígenos presentes.
É realizada nova Lavagem para remover os excedentes.
Após esta etapa, os Substratos A e B são adicionados e incubados
produzindo uma cor azul que indica a quantidade de anticorpos IgG
presentes nas amostras. A Solução de Parada é adicionada para
interromper a reação havendo uma mudança de cor para amarelo, medida
em um leitor de microplacas.
Materiais necessários não contidos no Kit:
1- Pipetas capazes de dispensar volumes de 5, 50 e 100 mL com precisão
maior que 1,5%.
2- Repipetador para pipetagens repetitivas de volumes de 100 mL e 300 mL
com precisão maior que 1,5% (opcional) ou pipeta multicanal.
3- Lavadora de microplaca (opcional).
4- Leitora de ELISA com capacidade de absorbância em 450 e 630 nm de
comprimento de onda.
5- Pipetas com volumes reguláveis (200 mL a 1000 mL) para preparação
do Substrato.
6- Tubos de ensaio para a preparação dos substratos A e B.
7- Papel absorvente para secar as microcavidades.
8- Cronômetro ou relógio.
9- Frasco para estocar a Solução de Lavagem após diluída.
10- Água destilada ou deionizada.
11- Ferramentas de Controle de Qualidade.
12- Incubadora de 37°C ± 2°C.
REAGENTES
1- Padrões Referência ( A - D ) - Conservar entre 2 e 8°C. Quatro (4)
frascos ( A - D ) de Padrões Referência contendo anticorpos IgG anti-rubéola
em diferentes concentrações em solução de tampão e conservante.
A- 0,0 UI/mL
B- 5,0 UI/mL
C- 10,0 UI/mL
D- 200,0 UI/mL
2- Conjugado - Conservar entre 2 e 8°C. Anticorpo anti- IgG humano ligado
à peroxidase e conservante.
3- Placa Sensibilizada - Conservar entre 2 e 8º C
4- Lavagem Concentrada - Conservar entre 2 e 8ºC. Solução tampão,
surfactante e conservante.
5- Diluente de Amostra - Conservar entre 2 e 8°C. Solução tampão e
conservante.
6- Substrato A - Conservar entre 2 e 8°C. Solução tampão contendo
peróxido de hidrogênio e conservante.
7- Substrato B - Conservar entre 2 e 8°C. Tampão contendo
tetrametilbenzidina (TMB) e conservante.
8- Solução de Parada - Conservar entre 2 e 8°C. Ácido clorídrico 1M.
9- Seladores de Placa
APRESENTAÇÃO
REAGENTES
1
2
3
96 CAVIDADES
192 CAVIDADES
480 CAVIDADES
1- Padrões
Referência (A - D)
1 Frasco A-D x
1 mL
2 Frascos A-D
x 1 mL
4 Frascos A-D
x 1 mL
2- Conjugado
1 Frasco x 12 mL
2 Frascos x 12 mL
5 Frascos x 12 mL
3- Placa sensibilizada
1 Unidade
(96 cavidades)
2 Unidades
(96 cavidades)
5 Unidades
(96 cavidades)
4- Lavagem
Concentrada
1 Frasco x
20 mL
2 Frascos x
20 mL
4 Frascos x
20 mL
5- Diluente de Amostra
1 Frasco x 12 mL
2 Frascos x 12 mL
5 Frascos x 12 mL
6- Substrato A
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
5 Frascos x 8 mL
7- Substrato B
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
5 Frascos x 8 mL
8 - Solução de Parada
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
4 Frascos x 8 mL
9 - Seladores de Placa
3
5
10
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE
A temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8°C. O transporte em
temperaturas entre 15 e 30°C não deverá exceder a 72 (setenta e duas)
horas. Não congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade.
CUIDADOS ESPECIAIS
1- Somente para uso diagnóstico in vitro.
2- Seguir com rigor a metodologia proposta para a obtenção de resultados
exatos.
3- O envelope contendo as tiras deve ser aberto somente após atingir a
temperatura ambiente. Recolocar as tiras de microcavidades não utilizadas
no invólucro de alumínio, vedar e estocar a 2-8°C.
4- A água utilizada na limpeza do material deve ser coletada recentemente
e isenta de contaminantes.
5- Colunas deionizadoras saturadas liberam água alcalina, íons diversos,
agentes oxidantes e redutores. que podem alterar de forma significativa os
resultados.
6- Toda matéria-prima do produto é testada e deve ser não reagente para
HBsAg, Anti-HIV 1&2 e Anti HCV. Entretanto, esses testes não oferecem
total segurança da ausência de agentes infecciosos. A manipulação manual
de todo produto que contém soro é potencialmente capaz de transmitir
doenças. Portanto, é preciso tomar os devidos cuidados de biossegurança
na manipulação desses produtos.
7- Pipetar os reagentes sempre na mesma ordem para minimizar a
diferença de tempo de reação entre as microcavidades.
8- Por medida de proteção, pode-se cobrir a placa durante a reação. Caso
opte por este procedimento, é necessário que seja estabelecido como
rotina.
9- Deve-se assegurar que o fundo da cavidade esteja limpo e seco e que
não haja bolhas na superfície do líquido antes de ler a placa. Não permitir
que as cavidades sequem durante o ensaio.
10- Não exponha os reagentes, especialmente o Substrato, à luz forte
ou vapores de hipoclorito durante o armazenamento ou as etapas de
incubação.
11- A Solução de Parada contém ácido clorídrico que é um ácido forte.
Portanto, manuseá-lo com o devido cuidado.
12- Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de
proteção ambiental para que o descarte dos reagentes e do material
biológico seja feito de acordo com a legislação vigente.
13- Para obtenção de informações relacionadas à biossegurança ou
em caso de acidentes com o produto, consultar as FISPQ (Ficha de
Informações de Segurança de Produtos Químicos) disponibilizadas no
site www.bioclin.com.br ou através de solicitação pelo SAC (Serviço de
Assessoria ao Cliente) da Quibasa.
AMOSTRAS
Utilizar soro ou plasma (EDTA ou Heparina).
Amostras hemolisadas ou altamente lipêmicas não devem ser usadas.
As amostras podem ser conservadas sob refrigeração, entre 2 e 8ºC , pelo
período máximo de 7 dias. Se as amostras não puderem ser analisadas
dentro de 7 dias, podem ser estocadas por até 30 dias à temperatura de
-20ºC (freezer).
DESCRIÇÃO DO PROCESSO
PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO
Solução de Lavagem
Diluir o conteúdo do frasco Nº4 (Lavagem Concentrada) em 1000 mL de
água destilada ou deionizada. Estocar entre 2 e 8ºC até a data de validade
impressa no frasco original. Pode ser armazenada em temperatura
ambiente. Caso ocorra cristalização, aquecer a 37°C até dissolução.
Substrato – Solução de Trabalho
Determinar a quantidade de cavidades a serem utilizadas para preparo
de um volume adequado. Preparar a solução misturando partes iguais do
Substrato A e Substrato B 15 minutos antes de sua utilização. Mantenha-o
protegido da luz até ser utilizado.
Para cada microcavidade (teste), utilizar:
50 L de Substrato A + 50 L de Substrato B
Por exemplo: misture 1 mL de Substrato A e 1 mL de Substrato B para duas
tiras de 8 microcavidades (16 testes). Ocorre sobra de reagente.
Usar no máximo até uma (1) hora após preparo.
TÉCNICA
Antes de iniciar o ensaio, colocar todos os reagentes, amostras, Padrões
Referência e controles para estabilizarem em temperatura ambiente (15 –
30ºC) por no mínimo 40 minutos.
Retornar as tiras da microplaca que não serão utilizadas para a embalagem
original selada.
1- Separar as cavidades a serem utilizadas considerando: Padrões,
controles e amostras podendo ser testados em duplicata;
2- Separar a primeira cavidade para Branco (OPCIONAL);
3- Pipetar 100 mL dos Padrões Referência (A-D) nas cavidades
determinadas;
4- Pipetar 100 mL de Diluente de Amostra nas cavidades determinadas para
as amostras e, em seguida, pipetar 5µL de amostra sobre o Diluente de
Amostra;
5- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos;
Ocorre mudança de cor de verde para azul nas cavidades das amostras.
Cobrir as cavidades com o selador de placa;
6- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos a 37°C ± 2°C em uma incubadora;
7- Retirar o selador de placas das cavidades;
8- Descartar o conteúdo das cavidades por aspiração (Lavadora) ou por
decantação (manual).
Usar 300 mL aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente
preparada,* para efetuar um total de cinco (5) ciclos de lavagem;
Para a garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por
alguns segundos em papel absorvente.
Nota: Lavagem/ secagem deficiente pode causar resultados inadequados.
9- Pipetar 100 mL de Conjugado em cada cavidade exceto na cavidade
Branco (caso tenha feito a opção);
10- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir as cavidades
com o selador de placa;
11- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37°C ± 2°C;
12- Retirar o selador de placa das cavidades;
13- Repetir o item 8;
14- ATENÇÃO Siga um dos seguintes procedimentos:
A) Pipetar 100 mL de Substrato previamente preparado* - Solução de
Trabalho ( A + B ) em cada cavidade.
*Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO
Ou
B) Pipetar 50 mL de Substrato A em cada cavidade. Pipetar 50 mL de
Substrato B em cada cavidade;
15- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos; Cobrir as cavidades
com o selador de placa;
16- Incubar por 10 minutos ± 1 minuto em uma incubadora a 37°C ± 2°C;
17- Retirar o selador de placa das cavidades;
18- Pipetar 50 mL de Solução de Parada em cada cavidade;
19- Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos;
20- Ler: 450 nm (filtro primário)/630 nm (filtro secundário) em até 30 minutos
(no máximo).
VERIFICAÇÃO DA TÉCNICA
Verifique se os resultados obtidos para leitura dos Padrões Referência
estão compatíveis com os valores apresentados abaixo:
ITEM
ABSORBÂNCIA
Branco
< 0,050
Padrão Referência A
< 0,100
Padrão Referência B
> 0,200 e < 0,700
Padrão Referência C
> Abs B e < Abs D
Padrão Referência D
> 1,500
As absorbâncias para os Padrões Referência foram obtidas após a
diminuição da absorbância do branco. Para a leitura em filtro único
(450 nm) considerar limite de branco < 0,100 .
Caso os valores se encontrem fora dos valores esperados, deve-se repetir
a técnica.
CÁLCULOS
QUALITATIVO
Considerar como Cut-Off a absorbância média obtida com o Padrão
Referência C.
ITEM
Padrão Referência C
Absorbância média
ABSORBÂNCIA
A1 = 1,012
A2 = 1,102
( 1,012 + 1,102 ) / 2 = 1,057
Calcular o Índice dividindo a absorbância da amostra pelo valor de cut-Off.
Exemplo:
ITEM
ABSORBÂNCIA
Amostra
1,779
Valor de Cut-Off
1,057
Índice: Amostra/ Valor de Cut-Off
1,779 / 1,057 = 1,683
QUANTITATIVO
Uma curva de calibração é usada para determinar a concentração de
anticorpos anti-rubéola em amostras desconhecidas.
Preparo da Curva de Calibração
Registrar as absorbâncias obtidas na Leitora de microplaca, como
apresentado no exemplo 1. Calcular as médias das duplicatas, (caso sejam
realizadas duplicatas).
Plotar as absorbâncias médias de cada Padrão Referência versus a
concentração correspondente em UI/mL em papel milimetrado (antes de
plotá-las no gráfico).Traçar a curva.
Nota: Os dados apresentados no exemplo 1 são apenas para ilustração e
não podem ser usados em substituição à curva de calibração, que deve ser
construída no laboratório.
Exemplo 1
PADRÕES
ABSORBÂNCIA
MÉDIA
ABSORBÂNCIA
0,04
A
0,03
0,22
B
0,25
0,84
C
0,86
0,035
0 UI / mL
0,235
5,0 UI / mL
0,85
10,0 UI / mL
2,275
2,17
2
3
2,546
18,478
112,744
Desvio padrão (UI/mL)
0,039
0,486
0,271
Coeficiente de variação (%)
1,532
2,630
0,240
REPRODUTIBILIDADE
Foram realizadas 20 dosagens durante 3 dias consecutivos com três
amostras, utilizando o mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:
AMOSTRA
1
2
3
Média (UI/mL)
2,545
18,615
112,645
Desvio padrão (UI/mL)
0,002
0,120
0,093
Coeficiente de variação (%)
0,091
0,642
0,083
200,0 UI / mL
As amostras que tenham absorbância acima do Padrão Referência D,
devem ser pré-diluídas utilizando o Diluente de Amostra e devem ser
testadas novamente. A concentração deve ser multiplicada pelo fator de
diluição. Leitura automática e cálculo podem ser realizados através da
função de regressão linear em programas adequados de computador.
RESULTADOS
QUALITATIVO
QUANTITATIVO
ÍNDICE
CONCENTRAÇÃO
Negativo
< 0,5
< 5,0 UI/mL
Positivo
> 1,1
≥ 10,0 UI/mL
Indeterminado
≥ 0,5 e ≤ 1,1
5,0 - 10,0 UI/mL
RESULTADOS
1
Média (UI/mL)
REPRODUTIBILIDADE
2,38
D
CONCENTRAÇÃO
AMOSTRA
REPETIBILIDADE
Observação: No caso de resultado indeterminado, a amostra deve
ser reanalisada. As amostras que obtiverem resultados repetidamente
indeterminados devem ser retestadas utilizando um método alternativo. Se
os resultados permanecerem indeterminados, deve-se coletar uma nova
amostra em duas semanas. Se a nova amostra for positiva, a amostra deve
ser considerada positiva.
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
A interpretação de um teste diagnóstico, não deve ser estabelecido com
base em um único ensaio. Deve-se incluir outros testes de confirmação,
antes que uma amostra seja considerada positiva. Um resultado negativo
não exclui a possibilidade de exposição. Enfim, todos os resultados devem
ser interpretados em conjunto com outras informações clínicas disponíveis.
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
O Laboratório Clínico deve possuir um programa interno de controle da
qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerância para variações
sejam claramente estabelecidos. É importante ressaltar que todos os
sistemas de medição apresentam uma variabilidade analítica característica,
que deve ser monitorada pelos próprios laboratórios. Para tanto, é
recomendável a utilização de controles, que permitem avaliar a precisão e
a exatidão das dosagens.
DESEMPENHO DO PRODUTO
CONTROLE DE QUALIDADE
Exatidão
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS E ESPECIFICIDADE METODOLÓGICA
O kit BIOLISA Rubéola IgG foi comparado com outro kit de ELISA disponível
comercialmente. Foram utilizadas 07 amostras de soro humano.
A equação da reta de regressão linear obtida foi Y = 1,0051X + 0,2739 e o
coeficiente de correlação 0,9999. Com estes resultados pode-se concluir
que os kits apresentam boa especificidade metodológica.
Precisão
REPETIBILIDADE
Foram realizadas 20 dosagens sucessivas com três amostras, utilizando o
mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:
Sensibilidade Analítica
A sensibilidade indica o limite de detecção do método. Foi calculada a
partir de vinte (20) determinações de Rubéola IgG, em uma amostra isenta
desses analitos. Foi encontrado um valor médio igual a 0,98 UI/mL, com
desvio padrão de 0,01 UI/mL. A sensibilidade, que corresponde à soma da
média encontrada com 3 vezes o desvio padrão, para este método, é igual
a 1,01 UI/mL.
Sensibilidade e Especificidade Clínica
O Kit BIOLISA Rubéola IgG foi utilizado para análise de amostras
clínicas em comparação com outro kit de EIA. Os resultados mostram
que a sensibilidade clínica do Kit BIOLISA Rubéola IgG é > 96,4%, e a
especificidade clínica é 99,9%.
BIOLISA Rubéola IgG X EIA Referência
MÉTODO
BIOLISA
RUBÉOLA
IgG
POSITIVO
NEGATIVO
RESULTADO TOTAL
EIA REFERÊNCIA
TOTAL
NÚMERO DE TESTES
Apresentação 1 – 96 testes
Apresentação 2 – 192 testes
Apresentação 3 – 480 testes
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Herrmann, KL. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology.
American Society for Microbiology 4th Edition (1985) 779-784.
2. Turgeon, ML. Rubella Infection. In: Immunology and Serology in
Laboratory Medicine. 2nd Edition (1996). 275-286.
3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical
Microbiology. 6th Edition (1995) 968-973.
4. Voller, A, Bidwell, DE, A simple Method for Detecting Antibodies to
Rubella. Brit. J. Exp. Pathol. (1975) 56:338-339.
5. Rawls WE, Chernesky MA. Rubella Virus. Manual Clinical Immunology
(1976) 452-455.
6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and
Interpretations. Amer. J. Pub. Health (1972) 170-176.
7. Bioclin – Dados de arquivos
GARANTIA DE QUALIDADE
Antes de serem liberados para consumo, todos os reagentes Bioclin são
testados pelo Departamento de Controle de Qualidade. A qualidade dos
reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem
de apresentação, desde que armazenados e transportados nas condições
adequadas.
DADOS DO FABRICANTE
QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda
Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca
CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil
Tel.: ( 31 ) 3439.5454 - Fax: ( 31 ) 3439.5455
E-mail [email protected]
CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Indústria Brasileira
ATENDIMENTO AO CONSUMIDOR
Serviço de Assessoria ao Cliente
Tel.: 0800 0315454.
E-mail: [email protected]
POSITIVO
NEGATIVO
54
0
54
Número de Registro do Kit BIOLISA Rubéola IgG na ANVISA: 10269360191
2
37
39
Revisão: Maio/12
56
37
93
Sensibilidade Clínica: >96,4% (87,7 - 99,6%) *
Concordância global: 97,9% (92,4 - 99,7) *
Especificidade Clínica: 99,9% (90,5 - 100,0%) *
*95% Intervalo de confiança
Linearidade
A reação é capaz de detectar concentrações até a concentração do ponto
mais alto da curva de calibração. Para amostras com valores superiores,
diluir a mesma com Diluente de Amostra, repetir a dosagem e multiplicar o
resultado obtido pelo fator de diluição.
SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO
A Rubéola é um vírus de RNA, esférico, envelope pequeno, pertencente à
família Togaviridae. É vulgarmente conhecido como alemão ou sarampo de
3 dias. A infecção pelo vírus de Rubéola é transmitida através de gotículas
de saliva, resultando em erupção contagiosa leve em crianças ou jovens
adultos.
Na infância, a infecção é uma doença auto-limitante, benigna, caracterizada
por febre baixa, dor de cabeça, linfadenopatia, artralgia e conjuntivite. No
entanto, a infecção durante a gravidez, especialmente no primeiro trimestre,
pode levar ao aborto espontâneo, infecção intra-uterina causando a morte
fetal, ou anomalias congênitas.
A Rubéola Congênita depende do período em que a infecção ocorre e pode
resultar em complicações graves, incluindo a surdez, problemas oculares,
incluindo cataratas e glaucoma, cardiopatia congênita e retardo mental.
Os anticorpos IgM contra a rubéola são produzidos inicialmente, podendo
atingir níveis detectáveis dentro de 2-3 dias e pico de 14-21 dias após o
início dos sintomas que permanecem detectáveis durante as próximas
4-8 semanas. O diagnóstico de infecção ativa ou recente pode ser obtido
pela presença de anticorpos IgM em amostra inicial. Depois de vários
dias, os anticorpos IgG aparecem depois da IgM, com pico de 14-21 dias,
persistindo níveis variados para toda a vida. A presença de
anticorpos IgG anti-rubéola é indicativo de infecção prévia e/ou imunidade.
BIOLISA RUBÉOLA IgG
K 125
INSTRUCCIONES DE USO
FINALIDAD
Test para determinación cuantitativa y cualitativa de anticuerpos IgG
para rubéola en suero o plasma humano, por enzimainmunoensayo en
microplaca. Solamente para uso diagnóstico in vitro.
EQUIPOS E INSUMOS OPERACIONALES
Materiales contenidos en el kit:
- Reactivos descritos en el cuadro anterior.
- Instrucciones de uso (manual).
Las muestras pueden ser conservadas bajo refrigeración, entre 2 y 8ºC , por
el período máximo de 7 días. Si las muestras no pudieran ser analizadas
dentro de 7 días, pueden ser almacenadas por hasta 30 días a temperatura
de -20ºC (freezer).
18- Pipetear 50 L de Solución de Parada en cada cavidad.
19- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos.
20- Leer a 450 nm (filtro primario) / 630 nm (filtro secundario) máximo hasta
en 30 minutos(máximo).
PRINCIPIO DE ACCIÓN
Metodología: Enzimainmunoensayo o inmunoenzimétrica.
El Kit BIOLISA Rubéola IgG es un ensayo inmunoenzimático en fase sólida
basado en el principio de detección cualitativa y cuantitativa indirecta de
anticuerpos IgG para rubéola en suero o plasma humano.
Anticuerpos IgG anti-rubéola presentes en la muestra, se ligan a los
antígenos revestidos en la microplaca formando complejos antígenos
anticuerpos IgG. Después de la incubación inicial, la microplaca es
lavada para remover los materiales no ligados. La Enzima-Conjugada
anti-Anticuerpos IgG humanos es adicionada a la microplaca y entonces
incubada.
Los anticuerpos enzima - conjugado anti-IgG humano se ligan a los
anticuerpos IgG inmobilizados por los antígenos presentes.
Es realizado nuevo lavado para remover los excedentes. Después de esta
etapa, los Sustratos A y B son adicionados e incubados, produciendo un
color azul, que indica la cantidad de anticuerpos IgG presentes en las
muestras. La solución de parada es adicionada para interrumpir la reacción
ocurriendo un cambio de color para amarillo, medido en un lector de
microplacas.
Materiales necesarios, no contenidos en los Kit:
1- Pipetas capaces de dispensar volúmenes de 5, 50 y 100 L con precisión
mayor que 1,5%.
2- Repipetador para pipetajes repetitivas de volúmenes de 100 L y 300 L,
con precisión mayor que 1,5% (opcional) o pipeta multicanal.
3- Lavadora de microplaca (opcional).
4- Lectora de ELISA con capacidad de absorbancia en 450 y 630 nm de
longitud de onda.
5- Pipetas con volúmenes regulables (200 L a 1000 L) para preparación
de Sustrato.
6- Tubos de ensayo para la preparación del Sustrato A y B.
7- Papel absorbente para secar las microcavidades.
8- Cronómetro o reloj.
9- Frasco para almacenar la Solución de Lavado después de diluida;
10- Agua destilada o deionizada.
11- Herramientas de Control de Calidad.
12- Incubadora de 37°C ± 2°C.
DESCRIPCIÓN DEL PROCESO
VERIFICACIÓN DE LA TÉCNICA
Verifique si los resultados obtenidos para lectura de los Patrones son
compatibles con los valores presentados abajo:
REACTIVOS
1- Patrones Referencia ( A - D ) - Almacenar entre 2 y 8°C. Cuatro (4)
frascos (A - D) de Patrones referencia conteniendo anticuerpos antiRubéola en diferentes concentraciones en solución de tapón y conservante.
A- 0,0 UI/mL
B- 5,0 UI/mL
C- 10,0 UI/mL
D- 200,0 UI/mL
2- Conjugado - Almacenar entre 2 y 8°C. Anticuerpo anti- IgG humano
ligado a peroxidasa, y conservante.
3- Placa Sensibilizada - Almacenar entre 2 y 8ºC.
4- Solución de Lavado Concentrado - Almacenar entre 2 y 8ºC. Solución
Tapón, surfactante y conservante.
5- Diluyente de Muestra - Almacenar entre 2 y 8°C. Solución Tapón y
conservante.
6- Sustrato A - Almacenar entre 2 y 8°C. Solución Tapón conteniendo
peróxido de hidrógeno y conservante.
7- Sustrato B - Almacenar entre 2 y 8°C. Tapón conteniendo
tetrametilbenzidina (TMB) y conservante.
8- Solución de Parada - Almacenar entre 2 y 8°C. Ácido Clorídrico 1M.
9- Selladores de Placa
PRESENTACIÓN
1
2
3
96 CAVIDADES
192 CAVIDADES
480 CAVIDADES
1- Patrones
referencia (A-D)
1 Frasco A - D
x 1 mL
2 Frascos A - D
x 1 mL
4 Frascos A - D
x 1 mL
2- Conjugado
1 Frasco x
12 mL
2 Frascos x
12 mL
5 Frascos x
12 mL
3- Placa sensibilizada
1 Unidad
(96 cavidades)
2 Unidades
(96 cavidades)
5 Unidades
(96 cavidades)
4- Solución de Lavado
Concentrado
1 Frasco x
20 mL
2 Frascos x
20 mL
4 Frascos x
20 mL
5- Diluyente de
Muestra
1 Frasco x
12 mL
2 Frascos x
12 mL
5 Frascos x
12 mL
REACTIVOS
6- Sustrato A
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
5 Frascos x 8 mL
7- Sustrato B
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
5 Frascos x 8 mL
8- Solución de Parada
1 Frasco x 8 mL
2 Frascos x 8 mL
4 Frascos x 8 mL
9- Selladores de Placa
3
5
10
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE
La temperatura de almacenamiento deberá ser de 2 a 8°C. El transporte a
temperaturas entre 15 y 30°C no deberá exceder a 72 (setenta y dos) horas.
No congelar. Mantener al abrigo de la luz y evitar la humedad.
CUIDADOS ESPECIALES
1- Solamente para uso diagnóstico in vitro.
2- Seguir con rigor la metodologÍa propuesta para la obtención de resultados
exactos.
3- El sobre conteniendo las tiras debe ser abierto solamente después de
alcanzar la temperatura ambiente Recolocar las tiras de microcavidades no
utilizadas en la envoltura de aluminio, sellar y almacenar a 2-8°C.
4- El agua utilizada en la limpieza del material debe ser reciente e exenta
de contaminantes.
5- Columnas deionizadoras saturadas liberan agua alcalina, iones diversos
y agentes oxidantes y reductores, que pueden alterar de forma significativa
los resultados.
6- Toda matéria prima del producto es probado y debe ser no reactivo para
HBsAg, Anti-HIV 1&2 y Anti-HCV. Sin embargo , esos tests no ofrecen
total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos. La manipulación
manual de todo producto que contiene suero es potencialmente capaz de
transmitir dolencias. Por lo tanto, es necesario tomar los debidos cuidados
de bioseguridad en la manipulación de esos productos.
7- Pipetear los reactivos siempre en el mismo orden para minimizar la
diferencia de tiempo de reacción entre las microcavidades.
8- Por medida de protección, se puede cubrir la placa durante la reacción.
Caso opte por este procedimiento, es necesario que sea establecido como
rutina.
9- Se debe asegurar que el fondo de la cavidad este limpio y seco y que no
haya burbujas en la superficie del líquido antes de leer la placa. No permitir
que las cavidades sequem durante el ensayo.
10- No exponga los reactivos, especialmente el sustrato, a la luz fuerte o
vapores de hipoclorito durante el almacenamiento o etapas de incubación.
11- La Solución de Parada contiene ácido clorídrico, que es un ácido fuerte.
Por lo tanto, manosearlo con el debido cuidado.
12- Se recomienda la aplicación de la ley local, estatal y federal de
protección ambiental para la eliminación de reactivos y material biológico se
hace de acuerdo con la legislación vigente.
13- Para obtener información relacionada con la seguridad biológica o
en caso de accidentes con el producto, consultar la FISPQ (Ficha de
Informaciones de la Seguridad de Productos Químicos) disponibles en el
site www.bioclin.com.br o solicitando a través del SAC (Servicio de Asesoría
al Cliente) de Quibasa.
MUESTRAS
Utilizar suero o plasma (EDTA o Heparina).
Muestras hemolizadas o altamente lipémicas no deben ser usadas.
PREPARO DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO
Solución de Lavado
Diluir el contenido del frasco Nº4 (Solución de Lavado Concentrado) en
1000 mL de agua destilada o deionizada. Almacenar entre 2 y 8ºC hasta
la fecha de validad impresa en el frasco original. Puede ser almacenada
a temperatura ambiente. Caso ocurra cristalización, calentar a 37ºC hasta
su disolución.
Sustrato – Solución de Trabajo
Determinar la cantidad de cavidades a ser utilizadas para preparo de un
volúmen adecuado. Preparar la solución mezclando partes iguales de
Sustrato A y Sustrato B, 15 minutos antes de su utilización. Manténgalo
protegido de la luz hasta ser utilizado.
Para cada microcavidad (test), utilizar:
50 L de Sustrato A + 50 L de Sustrato B
Por ejemplo: mezcle 1mL de Sustrato A y 1mL de Sustrato B para dos tiras
de 8 microcavidades (16 tests). Ocurre sobra de reactivo.
Usar máximo hasta una (1) hora luego del preparo.
TÉCNICA
Antes de iniciar el ensayo, colocar todos los reactivos, muestras y Patrones
Referencia y controles para que se estabilicen a temperatura ambiente (15
- 30ºC) mínimo por 40 minutos.
Retornar las tiras de la microplaca que no serán utilizadas para el embalaje
original sellado.
1- Separar las cavidades a ser utilizadas considerando: Patrones, controles
y muestras pudiendo ser probados en duplicado.
2- Separar la primera cavidad para Blanco (OPCIONAL).
3- Pipetear 100 L de los Patrones Referencia (A-D) en las cavidades
determinadas.
4- Pipetear 100 L de Diluyente de Muestra en las cavidades determinadas
para las muestras y en seguida, pipetear 5 L de muestra sobre el Diluyente
de Muestra.
5- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos.
Ocurre cambio de color de verde para azul en las cavidades de las muestras.
Cubrir las cavidades con el sellador de placa.
6- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos a 37°C ± 2°C. en una incubadora.
7- Retirar el sellador de placa de las cavidades.
8- Desechar el contenido de las cavidades por aspiración (Lavadora) o por
decantación (manual);
Usar 300 L aproximadamente de Solución de Lavado, previamente
preparada*, para efectuar un total de cinco (5) ciclos de lavado.
Para la garantia del secado de la placa, al final del lavado, batir la placa por
algunos segundos en papel absorbente.
Nota: Lavado / secado deficiente puede causar resultados inadecuados.
9- Pipetear 100 L de Conjugado en cada cavidad excepto en la cavidad
Blanco (easo haya hecho la opción).
10- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir las cavidades
con el sellador de placa.
11- Incubar por 30 minutos ± 2 minutos en una incubadora 37°C ± 2°C.
12- Retirar el sellador de placa de las cavidades.
13- Repetir el item 8.
14- ATENCIÓN Siga uno de los siguientes procedimientos:
A) Pipetear 100 L de Sustrato previamente preparado* – Solución de
Trabajo (A + B) en cada cavidad.
*Ved PREPARO DE REACTIVOS DE TRABAJO
O
B) Pipetear 50 L de Sustrato A en cada cavidad. Pipetar 50 L de Sustrato
B en cada cavidad.
15- Homogenizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cubrir las cavidades
con el sellador de placa.
16- Incubar por 10 minutos ± 1 minuto en una incubadora a 37°C ± 2°C.
17- Retirar el sellador de placa de las cavidades.
ITEM
ABSORBANCIAS
Blanco
< 0,050
Patrón Referencia A
< 0,100
Patrón Referencia B
> 0,200 y < 0,700
Patrón Referencia C
> Abs B y < Abs D
Patrón Referencia D
> 1,500
Las absorbancias para los Patrones Referencia fueron obtenidos después
de la disminución de la absorbancia del blanco. Para la lectura en filtro único
(450 nm) considerar el límite de blanco < 0,100 .
Caso los valores se encuentren fuera de los valores esperados, se debe
repetir la técnica.
CÁLCULOS
CUALITATIVO
Considerar como Cut-Off la absorbancia promedio obtenida con el Patrón
referencia C.
ITEM
Patrón Referencia C
Absorbancia promedio
ABSORBANCIA
A1= 1,012
A2= 1,102
(1,012 + 1,102) / 2 = 1,057
Calcular el Índice dividiendo la absorbancia de la muestra por el valor de
Cut-Off.
Ejemplo:
ITEM
ABSORBANCIA
Muestra
1,779
Valor de Cut-Off
1,057
Índice: Muestra/ Valor de Cut-Off
1,779/1,057 = 1,683
CUANTITATIVO
Una curva de calibración es usada para determinar la concentración de
anticuerpos anti-rubéola en muestras desconocidas.
Preparo de la Curva de Calibración
Registrar las absorbancias obtenidas en la Lectora de microplaca, como
presentado en el ejemplo 1. Calcular los promedios de los duplicados, caso
sean realizados duplicados.
Plotear las absorbancias promedios de cada Patrón Referencia frente a la
concentración correspondiente en UI/mL en papel milimetrado (antes de
plotearlas en el gráfico).Trazar la curva.
Nota: Los datos presentados en el ejemplo 1 son apenas para ilustración y
no pueden ser usados en sustitución a la curva de calibración, que debe ser
construida en el laboratorio.
Ejemplo 1
PATRONES
A
B
C
D
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA
PROMEDIO
0,04
0,03
0,22
0,25
0,84
0,86
CONCENTRACIÓN
0,035
0 UI/mL
0,235
5,0 UI/mL
0,85
10,0 UI/mL
2,275
2,17
1
2
3
2,546
18,478
112,744
Desvío patrón (UI/mL)
0,039
0,486
0,271
Coeficiente de variación (%)
1,532
2,630
0,240
REPRODUCTIBILIDAD
Fueron realizadas 20 dosis durante 3 días consecutivos con tres muestras,
utilizando el mismo lote, obteniéndose los siguientes resultados:
CUALITATIVO
CUANTITATIVO
ÍNDICE
CONCENTRACIÓN
Negativo
<0,5
<5,0 UI/mL
Positivo
>1,1
≥10,0 UI/mL
Indeterminado
≥ 0,5 y ≤ 1,1
5,0 – 10,0 UI/mL
Observación: En el caso de resultado indeterminado, la muestra debe
ser reanalizada. Las muestras que obtuvieran resultados repetidamente
indeterminados deben ser reanalizados utilizando un método alternativo. Si
los resultados permanecieran indeterminados, se debe colectar una nueva
muestra en dos semanas. Si la nueva muestra fuera positiva, la muestra
debe ser considerada positiva.
LIMITACIONES DEL PROCESO
La interpretación de un test diagnóstico, no debe ser establecida con base
en un único ensayo. Se deben incluir otros tests de confirmación, antes que
una muestra sea considerada positiva. Un resultado negativo no excluye
la posibilidad de exposición. Por último , todos los resultados deben ser
interpretados en conjunto con otras informaciones clínicas disponibles.
CONTROL INTERNO DE CALIDAD
El Laboratorio Clínico debe poseer un programa interno de control de calidad,
donde procedimientos, normas, límites y tolerancia para variaciones sean
claramente establecidos. Es importante resaltar que todos los sistemas
de medición presentan una variabilidad analítica característica, que debe
ser vigilada por los propios laboratorios. Por lo tanto, es recomendable
la utilización de controles, que permiten la evaluación, la precisión y la
exactitud de las dosificaciones.
DESEMPEÑO DEL PRODUCTO
CONTROL DE CALIDAD
Exactitud
COMPARACIÓN DE MÉTODOS Y ESPECIFICIDAD METODOLÓGICA
O kit BIOLISA Rubéola IgG fue comparado con otro kit de ELISA
disponible comercialmente. Fueron utilizadas 07 muestras de suero
humano. La ecuación de la recta de regresión linear obtenida fue
Y = 1,0051X + 0,2739 y el coeficiente de correlación 0,9999. Con estos
resultados se puede concluir que los kits presentan buena especificidad
metodológica.
Precisión
REPETIBILIDAD
Fueron realizadas 20 dosis sucesivas con tres muestras, utilizando el
mismo lote, obteniéndose los siguientes resultados:
MUESTRA
1
2
3
Promedio (UI/mL)
2,545
18,615
112,645
Desvío patrón (UI/mL)
0,002
0,120
0,093
Coeficiente de variación (%)
0,091
0,642
0,083
200,0 UI/mL
RESULTADOS
MUESTRA
Promedio (UI/mL)
REPRODUCTIBILIDAD
2,38
Las muestras que tengan absorbancia encima del Patrón Referencia D
deben ser previamente diluidas utilizando Diluyente de muestra y deben ser
probadas nuevamente. La concentración debe ser multiplicada por el factor
de dilución. Lectura automática y cálculo pueden ser realizados a través
de la función de regresión linear en programas adecuados de computador.
RESULTADOS
REPETIBILIDAD
Sensibilidad Analítica
La sensibilidad indica el límite de detección del método. Fue calculada a
partir de veinte (20) determinaciones de Rubéola IgG, en una muestra exenta
de esos analitos. Fue encontrado un valor promedio igual a 0,98 UI/mL,
con desvío patrón de 0,01 UI/mL. La sensibilidad, que corresponde a la
suma del promedio encontrado con 3 veces el desvío patrón, para este
método, es igual a 1,01 UI/mL.
Sensibilidad y Especificidad Clínica
El Kit BIOLISA Rubéola IgG fue utilizado para análisis de muestras clínicas
en comparación con otro kit de EIA.
Los resultados muestran que la sensibilidad clínica del Kit BIOLISA Rubéola
IgG es >96,4%, y la especificidad clínica es 99,9%.
BIOLISA Rubéola IgG X EIA REFERENCIA
MÉTODO
BIOLISA
RUBEÓLA
IgG
EIA REFERENCIA
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO
54
0
54
NEGATIVO
2
37
39
56
37
93
TOTAL
Sensibilidad Clínica: >96,4% (87,7 - 99,6%) *
Concordancia global: 97,9% (92,4 - 99,7) *
Especificidad Clínica: 99,9% (90,5 - 100,0%) *
*95% Intervalo de confianza
Linearidad
La reacción es capaz de detectar concentraciones hasta la concentración
del punto más alto de la curva de calibración. Para muestras con valores
superiores, diluir la misma con Diluyente de Muestra, repetir la dosificación
y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.
SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO
La Rubéola es un vírus de RNA, esférico, sobre pequeño, perteneciente a
la familia Togaviridae. Es vulgarmente conocido como alemán o sarampión
de 3 días. La infección por el vírus de Rubéola es transmitida a través de
gotículas de saliva, resultando en erupción contagiosa leve en crianças o
jovenes adultos.
En La infancia, la infección es una dolencia auto-limitante, benigna,
caracterizada por fiebre baja, dolor de cabeza, linfadenopatía, artralgia y
conjuntivitis. Sin embargo, la infección durante el embarazo, especialmente
en el primer trimestre, puede llevar al aborto espontáneo, infección intrauterina causando la muerte fetal, o anomalias congénitas.
La Rubéola congénita depende del período en que la infección ocurre y
puede resultar en complicaciones graves, incluyendo la sordez, problemas
oculares, incluyendo cataratas y glaucoma, cardiopatía congénita y retardo
mental. Los anticuerpos IgM contra la rubéola son producidos inicialmente,
pudiendo alcanzar niveles detectables dentro de 2-3 días y pico de 14-21
días después el inicio de los síntomas que permanecen detectables durante
las próximas 4-8 semanas. El diagnóstico de infección activa o reciente
puede ser obtenido por la presencia de anticuerpos IgM en muestra inicial.
Después de varios días, los anticuerpos IgG aparecen luego de la IgM,
con pico de 14-21 días, persistiendo niveles variados para toda la vida. La
presencia de anticuerpos IgG anti-rubéola es indicativo de infección previa
y/o inmunidad.
NÚMERO DE PRUEBAS
Presentación 1 – 96 pruebas
Presentación 2 – 192 pruebas
Presentación 3 – 480 pruebas
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS
1. Herrmann, KL. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology.
American Society for Microbiology 4th Edition (1985) 779-784.
2. Turgeon, ML. Rubella Infection. In: Immunology and Serology in
Laboratory Medicine. 2nd Edition (1996). 275-286.
3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical
Microbiology. 6th Edition (1995) 968- 973.
4. Voller, A, Bidwell, DE, A simple Method for Detecting Antibodies to
Rubella. Brit. J. Exp. Pathol. (1975) 56:338-339.
5. Rawls WE, Chernesky MA. Rubella Virus. Manual Clinical Immunology
(1976) 452-455.
6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and
Interpretations. Amer. J. Pub.Health (1972) 170-176.
7. Bioclin – Dados de arquivos
GARANTÍA DE CALIDAD
Antes de ser liberado para el consumo, todos los reactivos Bioclin
son testados por el Departamento de Control de Calidad. La calidad de
los reactivos es asegurada hasta la fecha de validad mencionada en el
embalaje de presentacion, desde que sean almacenados y transportados
en las condiciones adecuadas.
DATOS DEL FABRICANTE
QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda
Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca
CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil
Tel.: +55 ( 31 ) 3439.5454 - Fax: +55 ( 31 ) 3439.5455
E-mail: [email protected]
CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Industria Brasileña
ATENDIMIENTO AL CONSUMIDOR
Servicio de Asesoría al Cliente
Tel. : 0800 0315454
E-mail: [email protected]
Numero de registro del kit de BIOLISA Rubéola IgG en la ANVISA:
10269360191
Revisión: Mayo/12
BIOLISA RUBELLA IgG
K125
USAGE INSTRUCTIONS
FUNCTION
Test for quantitative and qualitative of Rubella IgG antibody in human serum
or plasma by immunoassay in micro plates. For in vitro diagnostic use only.
PRINCIPLE OF ACTION
Methodology: Enzyme immunoassay or immunoenzymetric.
The BIOLISA Rubella IgG Kit is a solid phase enzyme immunoassay based
on the indirect quantitative and qualitative detection of IgG antibodies for
rubella in human serum or plasma.
IgG antibodies - rubella present in the sample bind to the antigen coated on
the micro plate forming antigen-antibodies IgG. After the initial incubation,
the micro plate is washed to remove unbound materials. The human enzyme
conjugate anti-IgG is added to micro plate and then incubated.
The human antibody - enzyme conjugate anti IgG antibodies bind to
immobilized IgG by antigens present.
A new rinse is performed to remove the leftover.
After this step, the substrates A and B are added and incubated producing
a blue color indicating that the amount of IgG in the samples. The Stop
Solution is added to stop the reaction having a color change to yellow,
measured in a micro plate reader.
REAGENTS
1- Reference Standards (A - D) - Store between 2 and 8°C. Four (4) bottles
(A - D) of Reference Standards containing rubella anti-IgG antibodies in
different concentrations in tampon solution and preservative. A – 0,0 Ul/mL
B – 5,0 Ul/mL
C – 10,0 Ul/mL
D – 200,0 Ul/mL
2- Conjugate - Store between 2 and 8ºC. Human anti-IgG antibody linked to
peroxidase and preservative. 3- Sensitized Plate - Store between 2 and 8ºC
4- Concentrated Washing Solution - Store between 2 and 8ºC. Buffer
solution, surfactant and preservative.
5- Sample Diluent - Store between 2 and 8ºC. Buffer solution and
preservative. 6- Substrate A - Store between 2 and 8ºC. Buffer containing hydrogen
peroxide and preservative.
7- Substrate B - Store between 2 and 8ºC. Buffer containing
tetramethylbenzidine (TMB) and preservative. 8- Stop Solution - Store between 2 and 8ºC. Chloridric Acid 1 M. 9- Plate Sealers
PRESENTATION
REAGENTS
1
2
3
96 CAVITIES
192 CAVITIES
480 CAVITIES
1 – Reference
Standards (A-D)
1 Flask
A-D x 1 mL
2 Flasks
A-D x 1 mL
4 Flasks
A-D x 1 mL
2 - Conjugate
1 Flask x 12 mL
2 Flasks x 12 mL
5 Flasks x 12 mL
3 - Sensitized Plate
1 unit
(96 cavities)
2 units
(96 cavities)
5 units
(96 cavities)
4 - Concentrated
Washing Solution
1 Flask x 20 mL
2 Flasks x 20 mL
4 Flasks x 20 mL
5 - Sample Diluents
1 Flask x 12 mL
2 Flasks x 12 mL
5 Flasks x 12 mL
6 - Substrate A
1 Flask x 8 mL
2 Flasks x 8 mL
5 Flasks x 8 mL
7 - Substrate B
1 Flask x 8 mL
2 Flasks x 8 mL
5 Flasks x 8 mL
8 - Stop Solution
1 Flask x 8 mL
2 Flasks x 8 mL
4 Flasks x 8 mL
9 - Plate sealer
3
5
10
EQUIPMENTS AND OPERATIONAL INPUTS
Materials in the kit:
- Reagents described in the above table
- Operating instructions (manual)
Required materials not contained in the Kit:
1- Pipette capable of dispensing volumes of 5, 50 and 100 mL with a
precision greater than 1,5%.
2- Re-pipettor for repetitive pipetting volumes of 100 mL and 300 mL, with
precision greater than 1,5% (optional) or multichannel pipette.
3- Micro plate washer (optional).
4- ELISA reader capable of absorbance at 450 and 630 nm wavelength.
5- Adjustable volume pipettes (200 mL to 1000 mL) for preparation of the
substrate.
6- Test tubes for preparation of the substrates A and B.
7- Paper towel to dry cavities
8- Watch or stopwatches.
9- Flask to store the washing solution after diluted.
10- Distilled water.
11- Tools of Quality Control.
12- Incubator 37°C ± 2°C.
TRANSPORTATION AND STORAGE CONDITIONS
The storage temperature should be 2 to 8°C. The transport at temperatures
between 15 and 30°C must not exceed 72 (seventy two) hours. Do not
freeze. Keep away from light and avoid moisture.
SPECIAL CARE
1- For in vitro diagnostic use only.
2- Strictly follow the methodology proposed to obtain accurate results.
3- The envelope containing the strips should be opened only after it reaches
room temperature. Place the strip with unused cavities in the aluminum bag,
seal and store at 2-8°C.
4- The water used in material cleaning must to be recent and free of
contaminants.
5- Deionized and saturated columns release alkaline water, several ions and
oxidizing and reducing agents that can significantly alter the results.
6- All the raw material of product is tested and should be nonreactive for HBs
Antigen, HIV 1 & 2 and Anti HCV. However, these tests do not provide total
assurance of the absence of infectious agents. The manual manipulation of
any product containing human serum is potentially capable of transmitting
diseases. Therefore, we must take due care in handling the bio safety of
these products.
7- Always add reagents in the same order to minimize the difference in
reaction time between the cavities.
8- As a safety measure, you can cover the plate during the reaction. If you
opt for this procedure it must be established as routine.
9- You must ensure that the bottom of the cavity is clean and dry and there
are no bubbles on the surface fluid before reading the plate. Do not let the
cavities run dry during the test.
10- Do not expose reagents, especially the substrate, to strong light or
hypochlorite fumes during storage or incubation steps.
11- Stop Solution contains hydrochloric acid, which is a strong acid. Handle
it with care.
12- We recommend applying the local, state and federal rules for
environmental protection, so that disposal of reagents and biological
material can be made in accordance with current legislation.
13- To obtain information related to biosafety or in case of accidents with the
product, consult the MSDS (Material Safety Data Sheet) available on the
website www.bioclin.com.br or upon request by the SAC (Advisory Service
Customer) of Quibasa.
SAMPLES
Use serum or plasma (EDTA or Heparin).
Hemolyzed or highly lipemic samples should not be used.
Samples may be refrigerated at between 2 and 8°C for a maximum of 5
days. If samples can not be analyzed within 5 days, they can be stored for
up to 30 days at -20ºC (freezer).
PROCESS DESCRIPTION
PREPARATION OF WORKING REAGENTS
Washing Solution
Dilute the contents of the Flask Nº4 (Concentrated Washing Solution) in
1000 mL of distilled water or deionized water. Store between 2 and 8°C
until expiration date printed on the original bottle. Can be stored at room
temperature. In case of crystallization, heat it at 37ºC until dissolution.
Substrate - Working Solution
Determine the amount of cavities to be used for preparation of an appropriate
volume. Prepare the solution by mixing equal parts of Substrate A and
Substrate B, 15 minutes before use. Keep it protected from light until used.
To each cavity (test), use:
50 L of substrate A + 50 L of substrate B
For example: mix 1 mL of Substrate A and 1 mL of Substrate B to two strips
with 8 cavities (16 tests). Leftover reagent occurs.
Use no later than one (1) hour after preparation.
TECHNIQUE
Before starting the assay, bring all reagents, samples, Standard References
and controls to stabilize at room temperature (15-30°C) for at least 40
minutes.
Return the strips of the plate will not be used for the original sealed
packaging.
1- Select the wells to be used considering: Standards, controls and samples
(either tested in duplicate);
2- Select the first cavity for Blank (OPTIONAL);
3- Pipette 100 mL of Standard Reference (A - D) in the determined cavities;
4- Pipette 100 mL of Sample Diluents in certain cavities for samples and then
pipette 5 mL of sample on sample diluent.
5- Mix gently for ± 30 seconds;
Change occurs in color from green to blue in the cavities of the samples.
Cover wells with plate sealer;
6- Incubate for 30 minutes ± 2 minutes in an incubator at 37°C ± 2°C;
7- Remove the sealing of wells;
8- Discard the contents of the wells by aspiration (Washer) or by decanting
(manual); Use approximately 300 mL of Washing Solution, previously
prepared* to perform a total of five (5) washing cycles. To ensure drying
of the plate at the end of the wash, hit the board for a few seconds on
absorbent paper.
Note: Poor washing and drying can cause inadequate results.
9- Pipette 100 mL of Conjugate into each well except in the Blank cavity (if
you made this option);
10- Mix gently for ± 30 seconds.
Cover cavities with plate sealer;
11- Incubate for 30 minutes ± 2 minutes in an incubator at 37°C ± 2°C;
12- Remove the sealer from plate cavities;
13- Repeat item 8;
14- WARNING Do one of the following:
A) Pipette 100 mL of previously substrate* - Working Solution (A+B) in
each cavity.
*See PREPARATION OF WORKING REAGENTS
Or
B) Pipette 50 mL of Substrate A to each cavity. Pipette 50 mL of Substrate B
into each cavity;
15- Shake gently for ± 30 seconds. Cover wells with plate sealer;
16- Incubate for 10 minutes ± 1 minute. In an incubator at 37°C ± 2°C;
17- Remove the sealer from plate cavities;
18- Pipette 50 mL of Stop Solution to each cavity;
19- Mix gently for ± 30 seconds;
20- Perform Reading: 450 nm (primary filter)/630 nm (secondary filter) within
30 minutes (maximum).
TECHNIQUE VERIFICATION
Verify if the results obtained by the reading of the Reference Standards are
compatible to the values below:
ITEM
ABSORBANCE
Blank
< 0,050
Standard Reference A
< 0,100
Standard Reference B
> 0,200 and < 0,700
Standard Reference C
> Abs B and < Abs D
Standard Reference D
> 1,500
The absorbancies for the Reference Standards were obtained after the
reduction of the blank absorbance. For a single filter reading (450 nm)
consider a blank limit of < 0,100.
If the values fall out from the expected values, you must repeat the technique.
CALCULATIONS
QUALITATIVE
Cut-Off regarded as the mean absorbance obtained with the Standard
Reference C.
ITEM
Standard Reference C
Average Absorbance
ABSORBANCE
A1 = 1,012
A2 = 1,102
(1,012 + 1,102) / 2 = 1,057
Calculate the index by dividing the sample absorbance by the value of the
Cut-Off.
Example:
ITEM
ABSORBANCE
Sample
1,779
Cut-off Value
1,057
Index: Sample / Cut-off Value
1,779 / 1,057 = 1,683
QUANTITATIVE
A calibration curve is used to determine the concentration of anti-rubella
virus in unknown samples.
Preparation of Calibration Curve
Record the absorbance obtained in the micro plate reader as outlined
in Example 1. Calculate the averages of duplicates (if they are carried
duplicates).
Plot the absorbances of each Reference Standard versus the corresponding
concentration in Ul/mL on graph paper (before you plot them on the graph.)
Plot the curve.
Note: Data presented in example 1 are for illustration only and may not be
used in replacement to the calibration curve, which should be constructed
in the laboratory.
Example 1
STANDARDS
ABSORBANCE
AVERAGE
ABSORBANCE
CONCENTRATION
0,035
0 Ul / mL
0,04
A
0,03
0,22
B
0,25
0,84
C
0,86
2,38
D
2,17
0,235
5,0 Ul/ mL
0,85
10,0 Ul/ mL
2,275
200,0 Ul/ mL
RESULTS
QUALITATIVE
QUANTITATIVE
INDEX
CONCENTRATION
Negative
< 0,5
< 5,0 Ul/mL
Positive
> 1,1
≥ 10,0 Ul/mL
Undetermined
≥ 0,5 and ≤ 1,1
5,0 – 10,0 Ul/mL
Note: In case of undetermined results, the sample must be retested. Samples
that results have been obtained repeatedly undetermined should be retested
using an alternative method.
If the results remain uncertain, a new sample must be collected in two weeks.
If the new sample is positive, the sample should be considered positive.
PROCEDURE LIMITATIONS
The interpretation of a diagnostic test, there should not be based on a
single run. This should include confirmation of other tests before a sample
is considered positive. A negative result does not exclude the possibility of
exposure. Finally, all results should be interpreted in conjunction with other
clinical information available.
INTERNAL QUALITY CONTROL
The Clinical Laboratory must have an internal quality control, where all
procedures, rules, limits and tolerance to variations be clearly established.
It is important to mention that all measurement systems present a
analytical variety, and it must be monitor by the laboratory. Therefore, it is
recommendable the use of controls, allowing the precision and accuracy of
the dosages.
PRODUCT PERFORMANCE
QUALITY CONTROL
Accuracy
COMPARISON OF METHODS AND SPECIFICITY METHODOLOGY
The BIOLISA-Rubella IgG kit was compared with another commercially
available ELISA kit. Seven (07) human serum samples were used. The
equation of linear regression line obtained was Y = 1,0051 x + 0,2739 and
correlation coefficient of 0,9999. With these results we can conclude that the
kit shows good methodological specificity.
Accuracy
REPEATABILITY
20 successive measurements were performed with three samples, using the
same lot, resulting in the following results:
REPEATABILITY
SAMPLE
REPRODUCIBILITY
Samples that have absorbance above the Reference Standard D, must be
pre-diluted using Sample Diluents and should be retested. Concentration
must be multiplied by the dilution factor. Automatic reading and calculation
can be performed on the linear regression function in appropriate computer
programs.
RESULTS
REPRODUCIBILITY
20 measurements were performed for 3 consecutive days with three
samples, using the same lot, obtaining the following results:
SAMPLE
1
2
3
Average (UI/mL)
2,546
18,478
112,744
Standard Deviation (UI/mL)
0,039
0,486
0,271
Coefficient of Variation (%)
1,532
2,630
0,240
1
2
3
Average (UI/mL)
2,545
18,615
112,645
Standard Deviation (UI/mL)
0,002
0,120
0,093
Coefficient of Variation (%)
0,091
0,642
0,083
Analytical Sensitivity
The sensitivity indicates the limit of detection. Was calculated from twenty
(20) determinations of Rubella IgG in a sample from these analytes. An
average value equal to 0,98 Ul/mL with a standard deviation of 0,01 Ul/mL.
The sensitivity, which is the sum of the average found with three times the
standard deviation for this method is equal to 1,01 Ul/mL.
Clinical sensitivity and specificity
BIOLISA Rubella IgG Kit analyzed clinical samples in comparison with other
kit of EIA.
The results show that the clinical sensitivity of the BIOLISA Rubella IgG kit is
> 96,4% and clinical specificity is 99,9%.
BIOLISA Rubella IgG X Reference EIA
METHOD
BIOLISA
RUBELLA
IgG
POSITIVE
NEGATIVE
TOTAL RESULTS
REFERENCE EIA
TOTAL
POSITIVE
NEGATIVE
54
0
54
2
37
39
56
37
93
4. Voller, A, Bidwell, DE, A simple Method for Detecting Antibodies to
Rubella. Brit. J. Exp. Pathol. (1975) 56:338-339.
5. Rawls WE, Chernesky MA. Rubella Virus. Manual Clinical Immunology
(1976) 452-455.
6. Millian, SJ, Wegman D. Rubella Serology: Applications, Limitations, and
Interpretations. Amer. J. Pub. Health (1972) 170-176.
7. Bioclin – Dados de arquivos
QUALITY ASSURANCE
Before being released for consumption, all Bioclin reagents are tested by the
Department of Quality Control. The quality of reagents is assured until expiration
date stated on the presentation packaging, when stored and transported
under appropriate conditions.
MANUFACTURER’S DATA
QUIBASA QUÍMICA BÁSICA Ltda
Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca
CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil
Phone.: +55 (31) 3439.5454 - Fax: +55 (31) 3439.5455
E-mail: [email protected]
CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Indústria Brasileira
CUSTOMER SERVICE
Customer Advisory Service
Phone.: 0800 0315454.
E-mail: [email protected]
ANVISA registration for BIOLISA Rubella IgG Kit: 10269360191.
Review: May/12
Clinical Sensitivity: > 96,4% (87,7 - 99,6%)*
Overall Agreement: 97,9% (92,4 - 99,7)*
Clinical Specificity: 99,9% (90,5 - 100,0%)*
* 95% Confidence Interval
Linearity
The reaction is able to detect concentrations until the concentration of the
highest point on the curve. For samples with higher values, dilute the same
with Sample Diluents, repeat the dosage and multiply the results by the
dilution factor.
DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE
Rubella is a RNA virus, spherical, small envelope, which belongs to the
Togaviridae family. It is commonly known as German or 3 days measles. The
rubella virus infection is transmitted through droplets of saliva, resulting in
mild contagious rash in children or young adults.
In childhood, infection is a self-limiting, benign condition characterized by
fever, sore head, lymphadenopathy, arthralgia, and conjunctivitis. However,
infection during pregnancy, especially in the first quarter, can lead to
miscarriage, intrauterine infection causes fetal death, or congenital
anomalies.
Congenital rubella depends on the period in which infection occurs and
can result in complications disorders, including deafness, eye problems,
including cataracts and glaucoma, congenital heart disease and mental
retardation. IgM antibodies against rubella are produced initially, reaching
detectable levels within 2-3 days and peak within 14-21 days after onset of
symptoms that remain detectable during the next 4-8 weeks. The diagnosis
of recent infection or can be obtained by the presence of IgM antibodies in
the initial sample. After several days, IgG antibodies appear after IgM, with
a peak of 14-21 days, varying levels persist for a lifetime. The presence of
anti-rubella IgG antibodies is indicative of infection and / or immunity.
NUMBER OF TESTS
Presentation 1 - 96 tests
Presentation 2 - 192 tests
Presentation 3 - 480 tests
BIBLIOGRAPHIC REFERENCES
1. Herrmann, KL. Rubella Virus. In: Manual of Clinical Microbiology.
American Society for Microbiology 4th Edition (1985) 779-784.
2. Turgeon, ML. Rubella Infection. In: Immunology and Serology in
Laboratory Medicine. 2nd Edition (1996). 275-286.
3. Chernesky, MA, Mahony JB. Rubella Virus. In: Manual of Clinical
Microbiology. 6th Edition (1995) 968-973.