Metabolismo e inflamación: nuevos mediadores lipídicos
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Metabolismo e inflamación: nuevos mediadores lipídicos
Metabolismo e inflamación: nuevos mediadores lipídicos Jesús Balsinde Instituto de Biología y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 47003 Valladolid, Spain, July 8, 2016 Existe un interés creciente en el descubrimiento de biosensores u otras maneras de analizar directamente muestras clínicas y obtener información específica relevante para el paciente. En la era de la medicina personalizada ese tipo de información será fundamental para optimizar el diagnóstico y tratamiento. Sin embargo, encontrar biomarcadores de enfermedad es una tarea muy complicada y encontrar un ácido graso como el ácido cis-7-hexadecenoico es aún más sorprendente. Abre interrogantes acerca de qué otros ácidos grasos no identificados puedan estar presentes y qué papel pueden desempeñar en fisiología humana. (Editor’s thoughts. From “In This Issue” section, Cell Chem Biol, Volume 23, Issue 6, pv–vi). Transcripción de la conferencia impartida en la Universidad del País Vasco el viernes 8 de julio de 2016 (Slide 1 – Title). Largo tiempo ignorados por pretendidamente aburridos, los lípidos están ganando mayor y mayor aceptación como moléculas clave en fisiología y fisiopatología. Aún hoy, para muchos científicos y no científicos la palabra “lípidos” les lleva a pensar ineludiblemente en estas sustancias como simples fuentes de energía procedente de la comida o como componentes estructurales de las membranas (Slide 2 – Classical View of Lipids). Esta visión, aparte de limitada es bastante errónea, porque los lípidos son muchísimo más que eso, son sustancias fundamentales en fisiología y fisiopatología porque regulan la comunicación intercelular (Slide 3 – Lipids Are Key to Signaling). Desde hace ya más de 30 años se conoce con certeza que los lípidos conecta la estimulación externa de células y tejidos vía receptor con la ejecución de respuestas específicas. Desde un punto de vista muy general, podríamos dividir a los estímulos que utilizan lípidos para comunicar mensajes en tres grandes grupos, no mutuamente excluyentes. En primer lugar, los estímulos que señalizan a través de cambios en la concentración intracelular de calcio. A este grupo pertenecen la mayoría de hormonas y neurotransmisores. Estos estímulos activan una fosfolipasa C específica de lípidos de inositol que genera dos mensajeros, uno lipídico, el diacilglicerol (DAG) y otro soluble en agua, el inositol trisfosfato (IP3). Ambos mensajeros cooperan de modo sinérgico en la ejecución de respuestas. Luego tenemos los estímulos que generan muerte celular, aquí a la izquierda. Estos estímulos activan otra enzima del metabolismo lipídico similar a la anterior, pero que hidroliza esfingomielina para generar ceramida, que a su vez activará las rutas conducentes a la muerte celular. Y por último tenemos otro grupo de estímulos que señalizan a través de la activación de fosfolipasa A2, una enzima que es ligeramente diferente de las anteriores y que produce dos mensajeros de origen lipídico, con la particularidad de que pueden actuar dentro y fuera de las células. El primero de ellos es el lisofosfolípido, que puede ser secretado y actuar sobre células vecinas propagando de este modo la respuesta. Por otro lado tenemos un ácido graso libre, reacción de gran interés si se trata de ácido araquidónico ya que este es el precursor de una enorme colección de compuestos con potente actividad biológica con efectos reguladoras tanto fisiológicos con fisiopatológicos. Se trata de los eicosanoides: prostaglandinas, leucotrienos etc, que participan en el mantenimiento homeostático de un gran número de tejidos (Slide 4 – Eicosanoids in Physiology), y también participan en procesos fisiopatológicos, en concreto en las reacciones inflamatorias de las que son mediadores fundamentales (Slide 5 – Eicosanoids in Pathology). Inflamación es la respuesta de un organismo ante una agresión de cualquier tipo. La inflamación es necesaria para advertir al organismo que algo malo está sucediendo y hay que solucionarlo y como imagino que sabréis, toda enfermedad humana consta de una componente inflamatoria, en mayor o menor grado. (Slide 6 – Eicosanoids in Pathology). De hecho algunas de las enfermedades que más gente matan en el mundo son de origen inflamatorio (diabetes, enfermedades cardiovasculares) y que se inician por inflamaciones mal curadas que, con el tiempo se cronifican y producen un enorme daño en los tejidos circundantes y en última instancia conducen a la muerte. Bien, como resumen de todo lo anteriormente dicho podríamos entonces hacer el siguiente enunciado de la visión actual de los lípidos, donde enfatizamos que se trata en realidad de las moléculas biológicas más importantes puesto que regulan nuestras funciones vitales y que desequilibrios en el metabolismo de los lípidos causa un gran número de enfermedades. Por tanto, si queremos curar estas enfermedades, deberemos saber qué lípidos están implicados y qué es lo que hacen (Slides 7 & 8 – Current View of Lipids). Para esta misión poseemos un herramienta muy poderosa, la lipidómica. Nuestro labo lleva ya unos cuantos años haciendo lipidómica en Valladolid, siempre con un enfoque en señalización lipídica en inmunidad innata e inflamación (Slide 9 – Lipidomics in Valladolid). En este sentido es importante notar que un lipidoma esta compuesto por miles de moléculas diferentes con estructuras químicas muy distintas entre sí. Qué quiere esto decir? Que hacer lipidómica es inherentemente complejo, porque hay mucha variedad estructural. Por tanto, pretender desentrañar el lipidoma completo de un sistema celular dado es muy complicado sino se poseen enormes recursos. Lo que se hace es la estrategia “Julio César”, divide y vencerás, cortar el lipidoma en pedacitos y estudiar aquel en que uno se siente más cómodo o crea que puede aportar más. Así nosotros nos hemos centrado en el ácido araquidónico (AA), lo que no solo es este ácido y sus derivados oxigenados, sino también todos sus parientes de la familia omega-6 y de las familias relacionadas omega-3 y omega-9 y los fosfolípidos que contienen este AA en las células. Esto que nos lleva a un aspecto muy importante en cuanto a la regulación celular de AA que implica volver de nuevo a la fosfolipasa A2 mencionada anteriormente antes (Slide 10 – Role of Phospholipase A2 in Arachidonic Acid Release), ya que este ácido no está habitualmente en forma libre sino que se produce “bajo demanda”, es decir bajo estimulación por receptor para producir los metabolitos oxigenados necesarios en cada ocasión. Y el resto del tiempo está “escondido” en los fosfolípidos de membrana. En células humanas el AA se distribuye casi exclusivamente en tres clases de fosfolípidos, PC en rojo, PE en verde y PI en amarillo (Slide 11 – Role of Phospholipase A2 in Arachidonic Acid Release). Ahora bien esta situación es compleja desde un punto de vista molecular, porque las células contienen múltiples enzimas con actividad fosfolipasa A2 potencialmente capaces de efectuar la liberación de AA de fosfolípidos. Las PLA2s que participan en estos procesos pueden clasificarse en tres familias, c, s e i, de las cuales la cPLA2 es la clave, sPLA2 es accesoria e iPLA2 no parece estar directamente implicada en procesos relacionados con AA (Slide 12 – Distinct Roles in Signal Transduction for Each of the Phospholipase A2...). Y la cosa se puede complicar aún más si tenemos en cuanta que el AA es un intermediario de un ciclo aparentemente fútil de desacilación/reacilación, pero la clave aquí es que e AA no regresa a los mismos fosfolípidos de los que salió (Slide 13 – Free Arachidonic Acid Levels Depend on a Deacylation/Reacylation Cycle) y que existen reacciones de transacilación entre fosfolípidos donde el AA se transfiere y por tanto genera un perfil de distribución específico para cada condición (Slide 14 – Arachidonic Acid Trafficking Among Phospholipids). En resumidas cuentas, la homeostasis del AA se podría resumir como un soka-tira entre la cPLA2 tirando por un lado y las enzimas de la reacilación y transacilación por otro (Slide 15 – The Arachidonic Acid Tug-of-War). En cualquier caso, que da claro que es importante conocer en qué especies moleculares dentro de cada clase de fosfolípidos se halla el AA y cuales y cuanto de cada uno se usan durante la estimulación puesto que esta información puede ser muy útil para estudiar la regulación celular pero también a la hora de identificar marcadores de distintos estados de activación (Slide 16 – Lipidomics as a Useful Approach). Este es el protocolo experimental utilizado (Slide 17 – Lipidomic Profiling of Arachidonic Acid-containing Phospholipids). En estos estudios usamos monocitos humanos y los estimulamos con un agente típico de estimulación de monocitos, el zimosán, derivado de levaduras. Esto va a activar las células y va a dar lugar a la activación de fosfolipasa A2, lo que conducirá a la liberación del AA, producción de eicosanoides y en resumen a una pérdida de AA de los fosfolípidos celulares. Entonces pararemos las reacciones, extraeremos los lípidos y analizaremos los fosfolípidos conteniendo AA con el masas lo que será sencillo porque darán una señal de 303. Como control de estos experimentos añadimos una cosa llamada pirrofenona, que es un inhibidor de la fosfolipasa A2 y por tanto en su presencia no debe ocurrir nada. Antes de pasar a mostrar datos, un pequeño comentario sobre nomenclatura de lípidos (Slide 18 – Glycerophospholipids. Nomenclature). No olvidar mencionar los éteres (Slide 19 – Glycerophospholipids. Nomenclature) y los plasmalógenos (Slide 20 – Glycerophospholipids. Nomenclature). Con esta información, aquí tenemos lo que yo llamo el araquidonoma de monocitos humanos (Slide 21 – Arachidonic Acid-containing Phospholipids of Human Monocytes). Este es ya una resultado ‘diagnóstico’, es ya una huella digital lipídica de los monocitos, porque presenta características únicas que lo hacen inmediatamente identificable como perteneciente a monocitos. Por ejemplo, el alto contenido de AA en plasmalógenos de PE, y el alto contenido de AA en una única especie de PI. Bien, lo que se hace ahora es analizar el comportamiento de cada una de ellas durante la activación celular. Lo que esperamos es que todas ellas bajen con el tiempo. Se muestran los time-courses de las diferentes clases de fosfolípidos, PC (Slide 22 – Time-dependent Changes of Major AA-containing PC Species After Zymosan Stimulation), PI (Slide 23 - Time-dependent Changes of Major AA-containing PI Species After Zymosan Stimulation), y PE (Slide 24 – Time-dependent Changes of Major AA-containing PE Species After Zymosan Stimulation) y se enfatiza la aparición de especies que muestran un comportamiento inusual, ya que aumentan. Estudios con otros estímulos indican que uno de ellos es específico de estímulo; estas especies podrían ser pues marcadores de estados específicos de activación, ya que se producen bajo determinadas condiciones, pero no por todas (Slide 25 – What About Other Stimuli?). Como conclusión de estos experimentos se hace notar el interés en estudiar qué papel pueden tener estos lípidos inusuales durante la activación celular, cuál es su función biológica (Slide 26 – Conclusions). Pero aparte de su valor como posibles biomarcadores, podemos intentar ir un poco más allá y tratar de estudiar su funcionamiento a nivel molecular, qué es lo que hacen en las células. Una estrategia para estudiar esto sería aislar estos lípidos e introducirlos en las células para así mimetizar la situación de activación. Para explicar esto, nos centramos en PI(20:4/20:4) porque es aniónico y por tanto se puede transfectar tal como se haría con DNA o RNA (Slide 27 – Intracellular Delivery of Anionic Phospholipids). Como prueba de que esta estrategia funciona muy bien mostramos el movie de PIP2 marcado con Texas Red (Slide 28 – Incorporation of PI(20:4/20:4) Into Cells). Pues bien, el protocolo para estudiar acciones biológicas se muestra en la siguiente figura (Slide 29 – Incorporation of PI(20:4/20:4) Into Cells). En un primer lugar estudiamos efectos sobre expresión génica pero no observamos nada relevante (Slide 30 – PI(20:4/20:4) Does Not Regulate Gene Expression), lo que nos llevó a centrarnos en respuestas más tempranas tales como la producción de metabolitos reactivos de oxígeno. Al probar el efecto del PI(20:4/20:4) se vio que la respuesta está incrementada en las células cargadas con este lípido (Slide 31 – PI(20:4/20:4) Regulates Superoxide Anion Production). Al probar otra respuesta de inmunidad innata como es la secreción de lisozima observamos un comportamiento similar (Slide 32 – PI(20:4/20:4) Regulates Lysozyme Release). Todo ello nos lleva a postular que este lípido pudiera regular respuestas inmunes innatas en macrófagos (Slide 33 – 1,2-Diarachidonyl-sn-glycero-3phosphoinositol). Bien, hasta este momento hemos hablado de análisis lipidómicos de fosfolípidos que contienen ácido araquidónico; entonces, qué pasa con los que no tienen araquidónico? (Slide 34 – What about phospholipids without arachidonate?). Para estudiar esto usamos un protocolo idéntico al mostrado anteriormente, de hecho es la misma diapositiva, pero con una importante variación. En este caso analizamos no solo los efectos de pirrofenona, sino de un inhibidor de iPLA2-VIA, FKGK18, con el fin de analizar la posible contribución de esta enzima (Slide 35 – Lipidomic Profiling of Phospholipids Without AA). En esta figura se muestra un análisis por LC/MS de algunas de las especies más abundantes de PC sin araquidónico y el efecto de los inhibidores pirrofenona y FKGK18 (Slide 36 – Major PC Species Without AA in Zymosan-stimulated Macrophages). Observamos que algunas de estas especies disminuyen con la activación, lo que indica que son hidrolizadas y que pirrofenona no hace nada, lo que no es extraño ya que este es un inhibidor de una enzima que hidroliza lípidos con araquidónico. Sin embargo, FKGK18 sí revierte la hidrólisis de algunas de estas especies. Ejemplos donde la reversión es total incluyen las especies mayores PC(32:0) y PC(34:1), que pudieron ser identificadas en experimentos de fragmentación como PC(16:0/16:0) and PC(16:0/18:1). También se observó reversión total en otras dos especies menores, PC(32:1) and PC(34:2), las cuales se identificaron como PC(16:0/16:1) and PC(16:0/18:2). Es muy llamativo pues que de las cuatro especies identificadas como más que probables sustratos de iPLA2, todas ellas poseen 16:0 en posición sn-1. Estos datos serían consistentes con un papel preponderante de esta enzima en generar palmitoil-lisopC lo que demuestra ser correcto al analizar directamente los lisolípidos (Slide 37 – Lysophospholipid Production in Zymosan-stimulated Macrophages). Nótese que los niveles de la otra especie principal de lisoPC, la que contiene 18:0, no se afectan por la presencia del inhibidor FKGK18 y sí por pirrofenona. Así que, como conclusión de estos datos, parece que in vivo la iPLA2-VIA manifiesta cierta especificidad por fosfolípidos que portan palmítico (16:0) en posición sn-1 y esto puede tener una importancia en activación celular por cuanto conduciría a la formación de palmitoil-lisoPC, un liso que participa en diferentes acciones biológicas (Slide 38 – iPLA2 may have preference for sn-1 palmitoyl PC). Me gustaría enfatizar en este momento uno de los fosfolípidos sustrato de esta enzima, PC(16:0/16:1), porque voy a volver a él en un momento. Cuando examinamos los lípidos de inositol nos encontramos con que algunos de ellos mostraron un comportamiento inesperado, es decir aumentaron con la activación en lugar de disminuir. Lo interesante es que estos aumentos fueron bloqueados por FKGK18 pero no por pirrofenona, sugiriendo de nuevo la participación de iPLA2β (Slide 39 – Minor PI Species Without AA in Zymosan-stimulated Macrophages). Dos aspectos importantes a considerar en esta figura. El primero es que todas las especies contienen 16:1 en la posición sn-2, y la segunda que hay dos de estos compuesto que no se detectaron en células en reposo y sí en activadas, lo que indica que son perfectos marcadores de un estado de activación y que, obviamente si la células los produce es porque los necesitará para algo, no? Ello nos lleva a la siguiente pregunta lógica, que es, de dónde procede este 16:1? (Slide 40 – Where Does 16:1-PI Come from?). Para responder a esta pregunta, lo que hicimos fue medir todos los fosfolípidos celulares que contienen 16:1 (Slide 41 – 16:1-containing Phospholipids in Resting Macrophages), y lo que vimos es que la grana mayoría de este ácido graso están PC. Mirando especies moleculares nos encontramos que la principal especies es precisamente PC(16:0/16:1), aquella que señalé anteriormente y que identificamos como un sustrato de iPLA2β en células activadas. Bien, y que pasa entonces durante la activación? Que la única especie que pierde cantidades significativas de ese ácido graso es precisamente PC(16:0/16:1) y las únicas que lo ganan son la dos especies preexistentes de PI y las dos que se forman de nuevo, y me gustaría insistir de nuevo en que tanto el descenso de una como el aumento de otras es sensible al inhibidor de iPLA2β (Slide 42 – 16:1-containing Phospholipids in Stimulated Macrophages). Con esto, podríamos pues sugerir la existencia de una ruta de transferencia de 16:1 de PC a PI regulada de algún modo por iPLA2β. (Slide 43 – Where Does 16:1-PI come from?).El problema de esta interpretación es que la mas de 16:1 que se pierde de PC es bastante menor de la que se acumula en PI, lo que sugiere que, con independencia de que exista o no esa ruta de transferencia de 16:1 entre fosfolípidos, debe existir al menos otra fuente de este ácido graso. Así que entonces decidimos ampliar nuestros análisis de contenido celular de 16:1 no solo a fosfolípidos, sino también a lípidos neutros, lo que se hizo usando GC/MS. Se observó de modo inesperado y sorprendente que, dependiendo de la muestra de partida, aparecía uno (lípidos neutros) o dos (fosfolípidos) picos de 16:1 (Slide 44 – Two 16:1 Isomers in Macrophages). Al comparar con patrones comerciales se comprobó que uno de los isómeros era 16:1n-7 o ácido palmitoleico, y el otro sería 16:1n-10 o 16:1n-9 (Slide 45 – Two 16:1 Isomers in Macrophages). Para discernir entre ambos se prepararon los derivados de dimetiloxazolina (DMOX) de ambos ácidos grasos y los analizamos por MS de impacto electrónico, indicando que el isómero buscado es 16:1n-9, sobre la base de la aparición de un pico característico a m/z 168 (Slide 46 – The Second 16:1 Isomer Is 16:1n-9). Como se acaba de mencionar, hay una diferencia fundamental en la distribución de estos dos isómeros entre clases de lípidos, el isómero n-9 se localiza tanto en fosfolípidos como lípidos neutros, mientras que n-7 sólo aparece en fosfolípidos (Slide 47 – Distribution of 16:1 Isomers Between Lipid Classes). Esta distribución de n-9 es bastante peculiar puesto que ningún otro ácido graso se distribuye de manera similar (Slide 48 – Distribution of 16:1 Isomers Between Lipid Classes). Cuando analizamos la distribución de n-9 en células estimuladas, encontramos que aumenta en todas las clases de lípidos, pero los aumentos más altos son en lípidos neutros (Slide 49 – Distribution of 16:1 Isomers Between Lipid Classes). El 16:1n-7 solo está en fosfolípidos, donde aumenta. Así pues, tenemos un ácido graso inusual cuyos niveles aumentan durante la activación celular y que se incorpora preferentemente en lípidos neutros. Estas dos características sugieren un papel biológico específico para esta inusual ácido graso. Con el fin de estudiar esta cuestión, preparamos las células enriquecidas en 16:1n9 por incubación con el ácido graso exógeno (10 µM, 2 h) en medio libre de suero. Posteriormente, las células fueron estimuladas con LPS y se investigaron los efectos sobre la expresión de un número de genes proinflamatorios (Slide 50 – Assessing the Biological Effects of 16:1n-9). Como control de estos experimentos, se utilizaron células enriquecidas en 16:1n-7 y DHA (22:3n-6). Se observó que el enriquecimiento con 16:1n-9 produjo una disminución general de la expresión de estos marcadores de activación que en muchos casos fue comparable a la producida por DHA y en general, superior a la observada con 16:1n-7, que solo demostró efectos significativos en dos marcadores, Tnf y Nos2 (Slide 51 – 16:1n-9 Possesses Anti-inflammatory Properties in vitro). Así pues, estos datos demuestran que 16:1n-9 tiene un espectro de actividad biológica que es claramente distinguible de de 16:1n-7. También se llevaron a cabo experimentos con ratones (Slide 52 – 16:1n-9 Possesses Anti-inflammatory Properties in vivo). En estos experimentos, el ácido graso fue administrado i.p. a ratones 1 h antes de la inyección de LPS. Después de 6 h, los animales fueron sacrificados, se cosecharon las células peritoneales y se estudiaron los niveles de expresión de Il6. Tanto 16:1n-9 como 22:6n-3 inhibieron la expresión del gen Il6 en células peritoneales estimuladas con LPS. El análisis de proteína Il-6 en suero confirmó la fuerte disminución inducida por 16:1n-9. En este experimento 22:6n-3 no redujo el nivel de IL-6 circulante, algo para lo que no tenemos explicación en este momento. Por lo tanto, como conclusión final de mi charla, enfatizar la utilidad de nuestra aproximación lipidómica para buscar marcadores de activación y en general nuevas moléculas con papeles hasta ahora desconocidos en inflamación tales como PI(20:4/20:4) y 16:1n-9, y siempre con la idea en mente de esta frase que ya introduje anteriormente, “if we are going to solve…” (Slide 53 – Lipid Markers of Activation). Y en ese sentido, permitidme tomarme una pequeña licencia histórica porque este tipo de estudios y la información que obtenemos de ellos no hace sino cumplir con algo que un señor profetizó hace más de 100 años, Johan Ludwig Thudichum (Slide 54 – The Need for Metabolomics)… y lo que la ciencia pensó de Thudichum al poco de su muerte (Slide 55 – Thudichum). Fin de la charla con la diapo de agradecimientos (Slide 56 – Acknowledgments). REFERENCES 1. Pérez-Chacón, G., A. M. Astudillo, D. Balgoma, M. A. Balboa, and J. Balsinde. 2009. 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