Abordaje y diagnóstico etiológico de la proteinuria
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Abordaje y diagnóstico etiológico de la proteinuria
Programa de Evaluación Externa de Calidad PEEC-Noticias Octubre 2012 PEEC-Orina ABORDAJE Y DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DE LA PROTEINURIA Fisiològicamente la membrana basal glomerular es una barrera para las proteínas, pasando una pequeña cantidad al filtrado glomerular la gran mayoría se reabsorbe en los túbulos proximales. En la rama ascendente del asa de Henle tiene lugar la secreción de la proteína de Tamm-Holfman que se forma exclusivamente en el riñòn. La estructura histológica y molecular de la membrana basal glomerular está diseñada para permitir el paso de moléculas de pequeño tamaño, pero no de macromoléculas como las proteínas, especialmente si tienen carga negativa. Las moléculas de tamaño mayor a 40000 daltons tienen, en condiciones normales un índice de permeabilidad (coeficiente de tamizaje ) cercano a cero. Las proteínas que en definitiva son filtradas desde el glomérulo, pasan al espacio tubular y sufren un proceso de reabsorción que depende de sus características físico-químicas. Estas proteínas son incorporadas al citoplasma de las células tubulares , algunas mediante un proceso de digestión a oligopéptidos o aminoácidos y otras mediante un proceso de pinocitosis. En el citoplasma de las células tubulares, los aminoácidos pasan hacia el polo basal de las células tubulares y de allí al los capilares peritubulares. Los péptidos, incorporados en la vacuola pinocítica, se unen a un lisosoma, contituyendo un fagosoma, que permitirá su digestión hasta la etapa de aminoácidos, incorporándose posteriormente al torrente circulatorio Podemos definir al menos 3 mecanismos mediante los cuales se produce pérdidas anormales de proteínas por la orina : 1.- Sobreproducción 2.- Alteraciones Glomerulares (alteración de la barrera de filtración) (Proteinuria Glomerular) 3.- Alteraciones tubulares, o de los mecanismos de reabsorción (Proteinuria tubular). En el primer mecanismo, existe una producción anormalmente elevada de proteínas, en general de tamaño moderado, conservando la estructura normal del glomérulo y los mecanismos de reabsorción tubular. La cantidad de proteínas que circula por los glomérulos es tan alta que, pese a tener un coeficiente de tamizaje relativamente bajo, filtran en grandes cantidades, que sobrepasan los mecanismos de reabsorción tubular. Un ejemplo característico de este tipo de proteinurias, es la que se produce en condiciones de paraproteinemias, asociadas en su mayoría a enfermedades neoplásicas (v.gr. Mieloma Múltiple). En el segundo mecanismo, existe una alteración de la estructura glomerular, dada por un daño estructural o ultraestructural (por ej. Glomerulonefritis) o por una alteración en las cargas eléctricas de la membrana basal glomerular (por ej. Nefrosis Lipoídea), que determinan una alteración en el proceso de filtración, aumentando patológicamente los coeficientes de filtración de macromoléculas. De esta manera, pese a que la cantidad de proteínas que toma contacto con la barrera de filtración es normal, al estar aumentado el coeficiente, la cantidad de proteínas que filtra es anormalmente elevada. Si existe una alteración en la ultraestructura glomerular, filtrarán proteínas de todo tamaño, grandes, como la 2albúmina (PM 65000) y muy grandes, como las inmunoglobulinas (PM >150000), constituyendo así una Proteinuria de tipo no selectivo, característica de los procesos que cursan con daño en la estructura histológica del glomérulo. Por otra parte cuando existe fundamentalmente una alteración en la barrera eléctrica glomerular, pero no daño en su estructura histológica, filtrarán solamente proteìnas grandes, como la albúmina, pero no las inmunoglobulinas (Proteinuria selectiva) (v.gr. Nefrosis Lipoídea). En el tercer mecanismo, la producción de proteínas es normal, la estructura glomerular es normal, pero ocurre una alteración en los mecanismos de reabsorción y/o procesamiento tubular de las proteínas. Por lo tanto no se producirá filtración de proteínas de alto peso molecular y se recuperarán en la orina aquellas proteínas que normalmente filtran y son reabsorbidas, es decir, de bajo peso molecular. (por ej, fritis intersticial). PROTEÍNAS Y SU SIGNIFICADO CLÍNICO IgG: Aumentada en la proteinuria glomerular no selectiva. Transferrina: Aumentada en la proteinuria glomerular. Albúmina: Mínimas cantidades en nefropatía diabética: >30mg/día pero <300 mg/día. Muy aumentada en proteinuria glomerular. Alfa 1: Antitripsina Aumentada en proteinuria glomerular Alfa 1: Glicoproteína Acida Aumentada en proteinuria glomerular. Alfa 1: Microglobulina Aumentada en proteinuria tubular. Cadenas livianas: Aumentadas en proteinuria tubular (policlonal). Aumentadas en proteinuria de Bence Jones (monoclonal). Proteína ligadora de Retinol: Aumentada en proteinuria tubular. Lizosima: Aumentada en proteinuria tubular. Beta 2 Microglobulina: Aumentada en proteinuria tubular. La orina contiene cantidades mínimas de proteínas ( proteinuria fisiológica) principalmente Albùmina y la proteína tubular de Tamm-Holfman PROTEINA PESO MOLECULAR CONC.NORMAL. EN SUERO (g/l) CONC. NORMAL ORINA EN mg/l IgG 150000 8-17 <10 Transferrina 79550 2.3-4.3 <2.5 Albúmina 66460 37-53 <30 Alfa 1 antitripsina 54000 1.4-3.2 <3.5 Alfa 1 Glicoproteína Acida 41000 0.4-1.3 <10 Alfa 1 Microglobulina 30000-33000 - <12 Cadenas livianas 25000 a 50000 - <10 Proteina ligadora de retinol 20960 0.03-0.06 <0.5 Lisozima 14000 <0.006 <0.3 Beta 2 Microglobulina 11818 0.001-0.003 <0.3 La definición de Proteinuria, corresponde cuando la presencia de proteínas en orina superan los valores fisiológicos > 150mg/24 hs en los adultos y de 140 mg/mg/día en los niños. Ante el hallazgo de proteinuria, que es un factor determinante en el pronóstico de la enfermedad renal, se debe proceder a realizar la Valoración inicial de los pacientes con proteinuria Una vez hallada una proteinuria positiva en la tira reactiva debemos efectuar dos determinaciones más en intervalos de una semana para confirmar los resultados. Así se excluye una proteinuria transitoria. Si hay disparidad de resultados, efectuaremos una tercera determinación. Se debe cuantificar la proteinuria para poder hacer una valoración completa para discernir (nefróticas y no aisladas) de las que podrán controlarse (persistentes e intermitentes). Los aspectos que un grupo de expertos consideró que precisaban investigación con el objetivo de la estandarización de la medida de la albúmina y expresión de resultados fueron: • Los requerimientos preanalíticos en relación al tipo de contenedor utilizado en la recolección del espécimen; la necesidad de profundizar en el conocimiento sobre variabilidad biológica para la selección del momento de obtención del espécimen o la influencia de la sangre, fluido seminal y otros contaminantes fisiológicos presentes en la orina. • Precisar la definición del mesurando e investigación de las formas moleculares de albúmina en orinas recién emitidas y del grado de degradación de la albúmina en función de las condiciones de almacenamiento. • Desarrollar un procedimiento de medida de referencia, así como materiales de referencia primarios y secundarios para la albúmina y la creatinina en orina de conmutabilidad validada y acreditada. • Determinar el procedimiento de medida más adecuado debido a la variable composición de la orina. • Definir los requerimientos clínicos para el error total admisible de los procedimientos de medida, así como los materiales apropiados para utilizar en Programas de Control de Calidad, que permitan la comparación entre los distintos métodos. La cuantificación de proteinuria se debe solicitar en orina de 24 hs. Asimismo, debe instruirse al paciente como debe recoger la orina y los recipientes destinados a tal efecto. Anamnesis Se deben investigar antecedentes personales de enfermedad renal (macrohematurias, nicturia, polaquiuria, edemas, hipertensión, infecciones urinarias, litiasis), enfermedades sistémicas o manifestaciones de las mismas: diabetes, vasculitis cutánea, fiebre, artralgias. Es importante preguntar sobre los fármacos que esté tomando o haya tomado el paciente, ya que algunos pueden ser causa de nefropatía intersticial (AINE, alopurinol, ciprofloxacino, meticilina, sulfamidas, furosemida y tiacidas) o síndrome nefrótico (IECA, penicilamina, sales de oro y probenecid). Se debe tener presentes aquellas situaciones clínicas en las que puede aparecer una proteinuria transitoria. Irá dirigida a la detección de proteinurias transitorias, a encontrar otras manifestaciones de enfermedad renal (HTA, DM, presencia de edemas) y a explorar posibles causas de proteinuria ([por ejemplo a detectar riñones poliquísticos). CLASIFICACIÒN FISIOPATOLOGICA DE LA PROTEINURIA Proteinuria funcional o transitoria reversible Se llama funcional porque no se asocia a enfermedad renal sino que se debe a alteraciones hemodinámicas que aumentan la filtración glomerular de proteínas. Fiebre Ejercicio físico intenso Influencia cardíaca congestiva Estrés emocional Convulsiones Exposición intensa al frìo Proteinuria Ortostàtica Proteinuria que se caracteriza porque es de carácter transitorio y aparece solo cuando el individuo se halla de pie (posición ortostática), pero es negativa en posición de tumbado (decúbito o clinostática). No se asocia a anomalías del sedimento urinario, como hematuria o cilindruria, ni a otros signos de enfermedad renal, por lo que carece de trascendencia clínica. El diagnóstico se efectúa determinando la proteinuria durante el día y tras el reposo nocturno. Proteinuria patològica En función del tipo de proteínas encontradas podemos dividir en dos grandes grupos: 1-SELECTIVA: porque la membrana basal permite el paso de proteínas en función del tamaño de las mismas , pudiendo pasar solo las de pequeño tamaño como la Albùmina. 2-NO SELECTIVA: cuando en la orina aparecen proteínas de pequeño tamaño como la Albùmina y las de mayor tamaño como las inmunoglobulinas. Proteinuria Glomerular Alteración de la estructura glomerular, dada por un daño estructural o ultraestructural (por ejemplo Glomerulonefritis) o por una alteración en las cargas eléctricas de la membrana basal glomerular (por ejemplo Nefrosis Lipoidea = Glomerulopatía de Lesiones Mínimas), que determinan una alteración en el proceso de filtración, aumentando patológicamente los coeficientes de filtración de macromoléculas. De esta manera, pese a que la cantidad de proteínas que toma contacto con la barrera de filtración es normal, al estar aumentado el coeficiente, la cantidad de proteínas que filtra es anormalmente elevada. Si existe una alteración en la ultraestructura glomerular, filtrarán proteínas de todo tamaño, grandes, como la albúmina (PM 65.000) y muy grandes, como las inmunoglobulinas (PM >150.000), constituyendo así una Proteinuria de tipo no selectivo (más de l 80% es albúmina), característica de los procesos que cursan con daño en la estructura histológica del glomérulo (glomerulopatías severas; en la orina la proporción de proteínas refleja la proporción plasmática). La proteinuria no selectiva se suele asociar a mayor riesgo de deterioro de la función renal. Por otra parte cuando existe fundamentalmente una alteración en la barrera eléctrica glomerular, pero no daño en su estructura histológica, filtrarán solamente proteinas grandes, como la albúmina, pero no las inmunoglobulinas (Proteinuria selectiva: menos del 80% es albúmina) (ej: Nefrosis Lipoídea; en general significa síndrome nefrótico puro, cortico-dependiente, y de buen pronóstico). Proteinuria tubular La producción de proteínas y la estructura glomerular son normales, pero ocurre una alteración en los mecanismos de reabsorción y/o procesamiento tubular de las proteínas. Por lo tanto no se producirá filtración de proteínas de alto peso molecular y se recuperarán en la orina aquellas proteínas que normalmente filtran y son reabsorbidas, es decir, de bajo peso molecular. (v.gr. Nefritis intersticial). No hay nada o casi nada de albúmina en orina en estos casos. Métodos de determinación de la proteinuria Para la determinación de la proteinuria se dispone de diversos métodos que pueden agruparse en semicuantitativos, cualitativos e inmunoturbidimètricos. El método que se utiliza habitualmente por su simplicidad es el de las tiras reactivas, siendo este semicuantitativo y de descarte. De los métodos cuantitativos la técnica de mayor uso son las turbidimétricas que usan precipitantes de proteínas, siendo los más conocidos el ácido sulfosalicílico, el ácido tricloroacético. Otros métodos cuantitativos son el colorimétrico de rojo de pirogalol y los métodos inmunoturbidimètricos (Albùmina) Métodos semicuantitativos Las tiras reactivas sirven como método de detección semicuantitativo de la proteinuria, principalmente de Albùmina. La detección de proteínas por este medio, permite estimar el grado de albuminuria según la escala cromática que acompaña al frasco y que varia entre 1+ (que corresponde aproximadamente a 30 mg/dl) y 4+ (>2000 mg/dl). El método es relativamente insensible a las globulinas. Pueden producir falsos positivos, orinas alcalinas (Ph 8), al igual que la Fenozopiridina y la contaminación con antisépticos como la Clorohexidina y algunos detergentes utilizados en la limpieza del material de vidrio, densidad mayor a 1.025, Mioglobina, Hemoglobinuria, infecciones urinaria con producción de urea. Asimismo, orinas diluidas pueden dar falsos negativos La técnica se basa en el principio de error proteico de alterar el color de algunos indicadores ácido-base sin alterar el pH. El color resultante se compara con el modelo. Los resultados pueden expresarse como negativos, indicios o de 1-4 cruces, con sus valores correspondientes según las diferentes marcas de tiras reactivas. Métodos cuantitativos Distintos programas de control externo de la calidad evidencian que existen diferencias entre los resultados obtenidos por distintos laboratorios y en las unidades de expresión de los mismos (86). Ello es consecuencia de la inexistencia de un procedimiento analítico de referencia; de un material de referencia internacional; de la presencia en orina de diferentes formas moleculares de la albúmina, tanto en el espécimen como en los calibradores (moléculas fragmentadas, glicosiladas y formas diméricas); de albúmina degradada o no reactiva a los anticuerpos; de las uniones inespecíficas de la albúmina a los tubos utilizados para la recolección del espécimen, así como de los fenómenos de polimerización y fragmentación que se producen durante su almacenamiento y en los procesos de congelación y descongelación de las muestras (87). Metodo turbidimètricos Los procedimientos turbidimétricos son los más utilizados, esto se debe a la sensibilidad y simplicidad. Por este método, se agrega a la orina un precipitante ( agente desnaturalizante) y la proteína desnaturalizada precipita en forma de una fina suspensión que se cuantifica. La turbidez varía apreciablemente con la naturaleza del agente precipitante y su concentración, el tipo de proteína, la temperatura, y el tiempo que se realiza la lectura una vez agregado el precipitante. La cuantificación fotométrica directa depende de la dispersión de la luz más que de la absorción,por parte de las partículas en suspensión. La longitud de onda se puede utilizar entre 400 y 620 nm, a medida que esta disminuye aumenta la dispersión de la luz. Los más conmumentes utilizados son: Acido sulfosalicílico, presenta un intervalo de sensibilidad de 10-25 mg/L, produciendo una turbidez cuatro veces mayor con albúmina que con gamaglobulina, también precipita polipéptidos presentes en la orina. Presenta poca precisión, no teniendo concordancia de resultados con otros métodos. Acido tricloacético, sensibilidad de 20 mg/L, la turbidez producida no es alterada por la relación Alb/Glob cuando la temperatura no supera el intervalo 20º-25º, a temperaturas mayores la turbidez es mayor con Albúmina. Reaccionan con mayor intensidad con las proteínas cuya carga es negativa (albúmina) que con las de carga positiva (globulinas, proteína de Bence-Jones, proteínas tubulares y mucoproteínas). Por ello, es un método de detección más efectivo para la proteinuria glomerular. Metodo colorimétricos Las proteínas de la muestra reaccionan en medio ácido con rojo pirogalol y aniones molibdato dando un complejo coloreado con pico de absorción a 600 nm. El color desarrollado es directamente proporcional a la concentración de proteínas en la muestra Azul brillante de ComassieEl azul de Coomassie (también llamado Coomassie blue o Coomassie Brilliant blue) es un colorante derivado del trifenilmetano. Originalmente se utilizó en la industria textil, pero actualmente es muy empleado para teñir geles de electroforesis y en la cuantificación de proteína por el método Bradford La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+ En presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. 2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada Metodo inmunourbidimètricos Los método inmunoturbidimètricos detectan Albùmina presente en la orina,con límites de detección entre 2 y 10 mg/L. Los anticuerpos empleados pueden ser monoclonales o policlonales con distinta sensibilidad para la detección de formas anómalas o de fragmentos de albúmina presentes en la orina. No existe actualmente ningún procedimiento de medida ni material de referencia para la determinación de proteína en orina, lo que da lugar a una gran variabilidad entre los resultados obtenidos en diferentes laboratorios. Esta variación afecta, sobre todo, a las concentraciones bajas y disminuye para las más elevadas en parte debido a la mayor concentración relativa de albúmina que presentan estas últimas. La consecuencia del uso de inmunoanálisis específicos para la determinación de la albúmina, es la superioridad en términos analíticos de la medida de albúmina frente a la de proteína. Los datos procedentes del PEEC año 2012 muestran que el 44 % de los laboratorios inscritos determinan la albúmina en orina mediante métodos turbidimétricos, frente al 56 % que utilizan métodos colorimétricos Los coeficientes de variación oscilaron entre 15,4 y 24.6 % (turbidimétricos) y 19.7 % (colorimètricos) para concentraciones de 0.30 g/l.