Utililización de columnas sax para limpieza de extractos

Utililización de columnas sax para limpieza de extractos

UTILILIZACIÓN DE CDLUMNAS
CDNTAMlNAIDS
S. Resnik
Gonzale7
POR
SAX PARA LIMPIEZA
FUMONISINAS:
PH ÓPTIMO.
(J,2
, M.S.
Neira
(1,3),
'4)
y A. Pacin
(1,3).
V.
DE EX'TRACTOS
Anca-ola
(1)
ele
(2)Deptos
Qu1mica
Orgánica
e
Industrias.FCEyN.
Universitaria
1428.Bs.AS.
(3)
CIM.
Depto.
de
Tecnología.Universidad
Luján,CC221,
6700 Luján,
Argentina.
(4)
CONlCET.
Facultad
de Ingenierla.
UBA.
1
(2),
H.H.L.
UBA.edad
Nacional
de
INTRODUCCION
Las
fumonisinas
constituyen
un
grupo
de
micotoxinas
recientemente
a~sladas
y caracterizadas
producidas
diferentes
cepas
de
Fusarium
moniliforme,
proli
feratum,
F. nygamai,
F. anthophilum,
F. dlaminiy
nap1. forme
entre
otros.
Por una parte
el F. mon1.11. forme.
el
principal
contaminante
de ma1z
en la
mayor1a
de
por
F.
F.
es
los
paises
productores
y ha - sido
asociado
a en fermedades
en
animales,
como la
leucoencefalomalacia
equina(l),
y
el
edema
pulmonar
en
cerdos
(2);
ambas
reproducidas
bajo
condiciones
experimentales
con
la
administracion
de
Fumonisina
B1 (3-5).Por
otra
parte,
existe
una
asociación
epidemiológica
entre
la
incidencia
de
cáncer
esofágico
humano
y la contaminación
de alimentos
por
mico toxinas
,
en
Africa
(6)
.Es
necesario
tener
en
cuenta,
que
el
malz
es
uno
de
los
principales
cultivos
en
Argentina
y
la
contaminaciÓn
fúngica
predominante
en el mismo
corresponde
a
cepas
de
Fusarium
potenciales
productoras
de
fumonisinas.
Además,
estas
toxinas
han sido detectadas
en
muestras de ma1z
provenientes
de
la
Provincia
de
Buenos
Aires
(7),
asi
como,
se
comprobaron
casos
de
leucoencefalomalacia
equina
(8).
Por
estas
razones
es
importante
disponer
de
una
metodología
de
fácil
acceso
para
el
análisis
de
las
fumonisinas.
Uno
de
los
aspectos
fundamentales
de
la
metodologia
es
la
limpieza
del
extracto,
previa
a
la
detecciÓn
y cuanti
ficaciÓn.
Esta
etapa
se
puede
llevar a
cabo
por
medio
del
pasaje
del
extracto.
a
traves
de
columnas
de intercambio
aniónico
fuerte
(SAX).
El
objetivo
del
presente
trabajo
fue determinar
el valor
de
pH para
una
recuperación
óptima
de
las
fumonisinas,
utilizando dos
marcas
comerciales
de
columnas
SAX.
accesibles
en nuestro
país.
2
METODOLOGIA
Las
columnas
utilizadas
anion)
Merck
Adsorvex
Fisons
(6 mI.
1000mg)
fueron:
cato
19345
Accubond
81
SAX
(Bond
(400mg).
Q/A
No
elut
strong
y J&W Scientits
1601,
denominadas
como
columnas
M y A respectivamente.Las
placas
para
cromatografla planar (TLC) fueron:
RP-18 F 254 S 20x20 cm
Merck Art. no 15389. Y se midieron
en un densi tómetro
Desaga CD-60.
Cepas
productoras: se
utilizaron
cepas
de
Fusaríum'
moníliforme
y F. proliferatum
para
la producción
de
fumonisinas. Se desarrollaron.
en agar papa durante 7 días
a ~50C. conidios mantenidos en tierra estéril provenientes
de cultivos monospÓricos.
Una vez desarrollado
el micelio
se cosecharon
las esporas
con 5 ml de una solución de
Tween 80 para obtener un inÓculo de aproximadamente
107
conidios
por mI. Con esa suspensión
se inocularon
20
muestr~s
de SO 9 de harina
de maiz.
40% de humedad.
esterilizadas
durante 30 minutos a 120°C Se incubaron en
forma estática. las dos primeras semanas a 25°C y las dos
siguientes a 15°C.
Obtención
del
extracto
fún~ico
y
ajuste
del
pH:La
obtención del extracto se realizó a partir de cada una de
las muestras de maiz contaminado a las que se les agregó
100 mI de metanol-agua
(3:1); se licuaron a alta velocidad
durante 5 minutos. se centrifugaron
durante 10 minutos a
3000 rpm y se filtraron a través de papel Whatman No.4.
Los
extractos
obtenidos
se
reunieron
previo
al
fraccionamiento para el ajuste del pH(9).
Previo al pasaje del extracto a traves de las columnas SAX
se ajustó el pH del mismo a los siguientes valores: 4. S;
6. 7. 8 Y 9. con ácido clorhídrico
(3.26 M) o hidróxido de
sod i o
(1. O O
M).
Limpieza
del
extracto
y
siembra
en
cromato~rafia
planar:Las
columnas
SAX se adaptaron
a tubos Manifold
conectados con manguera de vacio a una trampa de agua. Las
mismas
se activaron
con 5 mI de metanol
y 5 .ml de
metanol:agua
(3:1). Se filtraron 10 mI de cada extracto a
una velocidad de filtración de 1 mI por minuto. se lavaron
con 5 mI de metanol: agua (3:1) Y 3 mI de metanol. Las
toxinas se eluyeron con 10 mI de ácido acético al 1% en
metanol. El el uido se evaporó a sequedad en rotavapor a
60°C. se resuspendió en metanol. se trasvasó a un vial. se
evaporó nuevamente y se mantuvo seco hasta el momento de
la siembra,Los residuos secos fueron resuspendidos
en 100
ul de metanol y se sembraron
10 ul de cada muestra. La
placa se desarrollÓ
en cuba saturada y se utilizó como
sistema de solvente para la corrida metanol: KCl al 4 % en
sol acuosa
(60:
40) .Las fumonisinas
fueron reveladas
una solución
de vainillina
(150mg en 20
sulfúrico concentrado:etanol
(8:2).
CuantificaciÓn:
Se determinaron
los espectros
entre 200-700 nm para cada fumonisina en el
La longitud de onda óptima para la medición
las fumonisinas
Bl. B2 Y B3 fue de 280
definida la longitud de onda se procedió a
mI
de
con
ácido
de absorción
densitómetro.
'simultánea de
nm .Una vez
la lectura de
las placas.
3.RESULTADOS
Y CONCLUSION
La recuperación de las toxinas varió según la columna
utilizada en función del pH de la muestra; asi. en el caso
de columnas M el pH que permitió la mejor recuperación
82
tanto de FB1.
FB2 Y FB3
fue
pH=5,
en
cambio.
para
las
columnas
A el
pH=7
fue
óptimo
para
FB1 y FB2 mientras
que
para
FB3 la mayor
recuperaciÓn
correspondiÓ
a pH=5.
pH
FBI-A
FB1-M'
FB3-A
FB3-M
FB2-A
FB2-M
8
207.5
149.6
154.5
61.1
131.6
33.3
71
6
408.91
258.3
122.9
160.6
122.9
198.2
83.3.1
63.4
5
4
349.6,
28.7
408.21
56.6
423.21333.8
61.6
43.9
396.41
144.S
I
58.8\
20.3
212.S
133.2
264.61
68.3
Un aspecto
a destacar
es que
los
extractos
provenientes
columnas
M resultaron
más limpidos.
La
elecciÓn
del
pH depende
de
las
columnas
SAX que
utilicen.
y es
fundamental
ajustar
el
pH del
extracto
previo
al pasaje
por
las
mismas.
de
se
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83