docProcesos Biotecnológicos Integrados
download 
Demanda Transcripción
Procesos Biotecnológicos Integrados
Procesos Biotecnológicos Integrados Bioprocesos Integrados • Acoplar adecuadamente las operaciones del USP con las de bioreactor y las del DSP. • Metaintegración: optimización desde el gen hasta el producto final. Ventajas de la Integración de Bioprocesos Reduce el número de operaciones. Reduce el tiempo del proceso. Facilita la separación. Mejora el rendimiento del producto y la calidad. • Mejora la productividad y economía de los procesos y reduce el impacto ambiental. • • • • Diseño de Biosistemas Evolución de la producción de penicilina Date Yield (units/mL (units/ mL)) Development 1929 2-20 Wild--type (P. Wild notatum) 1941 40--80 40 Better WT 1943 80--100 80 New WT 1944 100--200 100 Colony selection 1944 300--500 300 X-irradiation 1945 800--1000 800 UV--irradiation UV 1949 1500--2000 1500 Chemical mutagenesis 1951 2400 Chemical mutagenesis 1953 2700 Strain selection 1960 5000 Strain selection 1970 10000 Strain selection (P. chrysogenum) PROCESS STAGES OPERATIONS Raw Material Pretreatment Bioreaction Downstream Processing Product Sorting Sieving Comminution Hydrolysis Medium formulation Sterilization Biomass production Metabolite biosynthesis Immobilized enzyme and Cell catalysis Biotransformations Filtration Centrifugation Sedimentation Flocculation Cell Disruption Extraction Ultrafiltration Precipitation Crystalization Chromatography Evaporation Drying Packaging Operaciones del USP • Elección del agente biológico. • Optimización del medio de fermentación. Agente Biológico • Capacidad productora. • Características del metabolito de interés. Capacidad Productora • “Per-se” • Vinculadas al medio. • Optimización de las condiciones de operación • Características del producto. Capacidad Productora • “Per-se”: -características del agente biológico. -estabilidad Agente biológico: características Información genética: -Información en el genoma. -Información en plásmidos. -Mutantes regulatorias. Estabilidad Empleo de secuencias regulatorias Diferentes sistemas de expresión Promotores específicos Enhancers de traducción Secuencias 5’ y 3’ UTR Secuencias señales secreción espacio periplásmico (bacterias, levaduras). secreción al medio de cultivo (bacterias, levaduras, células animales). expresión en compartimentos celulares (plantas y células mamíferos) Capacidad Productora • Vinculadas al medio: -Selección de los sustratos. -Optimización del medio de cultivo. Optimización: formas de conducir el proceso • • • • • • Velocidad de crecimiento. Producto ligado al crecimiento. Producto no ligado al crecimiento. Efectos del producto. Características del crecimiento: floculación. Inducción de lisis. Capacidad Productora • Optimización de las condiciones de operación: • (Formas de conducción de procesos) Batch Batch alimentado Continuo Semicontinuo Reciclado. Ingeniería de la fisiología microbiana No solo mejorar la capacidad productora Incrementar la robustez y estabilidad de los Organsimos en bioprocesos Requerimiento Característica Fisiológica Alto titulo Tolerancia a altas concentraciones de producto y substrato Huésped Clostridium acetobutylicum Sobreexpresión genes groESL Lactobacillus plantarum WCFS1 Sobreproducción de 3 proteínas del heat shock Saccharomyces cerevisiae Crecimiento con hidrolizados celulósicos sin diluir Alta resistencia a inhibidores Estrategia Pichia stipitis Resultado Incremento 40% producción butanol Tolerancia a concentraciones de etanol del 12% Mutagénesis factor transcripción Spt15p para incrementar la tolerancia a etanol Incremento 69% producción etanol Adaptación a altas concentraciones de furfural y sulfato Rendimiento de etanol de 0.45 g/g. En hidrolizados sin detoxificar Requerimiento Baja probabilidad de contaminación Característica Fisiológica Crecimiento a altas T y condiciones de acidez Huésped Bacillus sp. strain 2-6 Bacillus coagulans Lactobacillus strain LB-WT Separación sencilla para la purificación Floculación Saccharomyces cerevisiae Estrategia Aislado de la naturaleza Aislado de la naturaleza Manipulación del genoma Introducción de genes de floculación Resultado 55oC;L-lactico= 182 g/L; Qp= 3 g/ L h en fermentadores sin esterilizar 50 °C; pH 5.0; producción de láctico a partir de azúcares derivados de biomasa Crecimiento a bajos pH Aumento de 3 veces la producción de láctico Perfecto control y regulación de la floculación Requerimiento Estabilidad de la cepa Característica Fisiológica Robustez a condiciones de cultivo y estabilidad genética Huésped Estrategia Resultado Lactococcus lactis Toma de glutation del medio o producido por Ing. Metabolica Resistencia a estrés oxidativo y ácido Escherichia coli K-12 Reducción del 15% del genoma Estabilidad de genes recombinantes Factores Efectos Fisiológicos Intracelular Presencia de vectores multicopia Toxicidad de la proteína recombinante Altos niveles de expresión Desbalance metabólico e inhibición del crecimiento Inhibición del crecimiento y muerte celular Desbalance metabólico e inhibición del crecimiento Extracelular Acumulación de productos tóxicos Secreción de metabolitos (acetico) Nutrientes limitantes Reducción de la actividad celular Limitación de oxígeno Causa anaerobiosis e inhibe el crecimiento Soluciones Factores Efectos Fisiológicos Genes de respuesta a estrés Incrementa la respuesta celular al estrés Chaperonas Rescate de proteínas mal foldeadas Factores metabólicos Reducir el desbalance metabólico redireccionando el flujo metabólico Genes de fase estacionaria Reducir respuestas fisiológicas de la fase estacionaria e incrementa la actividad celular Capacidad Productora • Características del producto. Características del producto • Concentración. • Ubicación: -Acumulación en la biomasa (cuerpos de inclusión, proteínas solubles). -Liberación al medio. Efectos del Producto • Efecto inhibitorio sobre estructuras vitales y/o sistemas enzimáticos. • Degradación. • Formación de subproductos. Integración del Biorreactor con las operaciones del DSP • Productos intracelulares • Productos extracelulares Condiciones que facilitan la separación • Floculación. • Inducción de lisis celular. • Aumento de la secreción. Ventajas de la Integración de Bioprocesos Reduce el número de operaciones. Reduce el tiempo del proceso. Facilita la separación. Mejora el rendimiento del producto y calidad. • Mejora la productividad y economía de los procesos y reduce el impacto ambiental. • • • • Remoción de producto in situ (ISPR) • Líquido-líquido: Compuestos inmiscibles en agua, como solventes orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico). Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano. Compuestos miscibles en agua, como sales o soluciones de polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG. • Sólido-líquido: La segunda fase es un material sólido como resinas u otros absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc. • Requerimientos: - Autoclavables - No tóxicos - Fácil separación del producto de interés de la segunda fase - No modificación del medio de cultivo - Permanencia de las células en la fase acuosa Diferentes configuraciones: ISPR Fermentation & Gas Stripping: Producción Acetona, Butanol y Etanol Fig. Schematic diagram of fed-batch acetone butanol ethanol (ABE) production by Clostridium beijerinckii BA101 and recovery by gas stripping. A, B and C are pumps for feed, gas recycling and product removal, respectively. Recuperación de producto por Diálisis Fig. 3 a, b Membrane dialysis reactor: a for suspended cells, culture and dialysis chamber equipped with stirrers; b for immobilized cells, especially mammalian cells, culture chamber with integrated radial-flow fixed bed. Adaptaciones para la extracción in situ del producto Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997. Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado para operar con remoción in situ del producto 1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador; 12: marco de la malla Diagrama de un bioreactor de agitación por líquido con loop externo Pervaporación Un liquido con varios componentes es puesto en contacto con una membrana polimérica de un lado mientras del otro lado se aplica una purga de vacio u otro gas. Los compuestos presentes en el liquido atraviesan la membrana de acuerdo a su permeabilidad selectiva y se evaporan en la fase gaseosa. Perextraccion Igual al anterior solo que del otro lado de la membrana circula otro líquido. Liquid Liquid Remoción in situ de producto (cristalización) Esquema del proceso continuo de producción de etanol con pervaporación Remoción de producto in situ (ISPR) Ventajas Inhibición por feed-back negativo del producto Efecto tóxico del producto Se evita la degradación del producto Solubilidad del producto Limitaciones Económicas Competencia con proceso convencional Riesgo de inversión Sin necesidad de incrementar la productividad (monopolio) Limitaciones Legales Utilización de material GRAS GMP, condiciones de seguridad Protecciones de Patentes Limitaciones Proceso Separación externa o interna Batch o continuo Necesidad de equipamiento adicional Scale –up Control y robustez Generación de productos no deseados Limitaciones Biológicas Contacto directo o indirecto, toxicidad Células en crecimiento Proceso aeróbico o anaeróbico Cantidad total de ISPR De acuerdo a propiedades del producto Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Integración con la etapa de purificación: Proteínas Recombinantes Viejas y nuevas estrategias Empleo de secuencias especiales Clivado y liberación de proteína de fusión Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Polihidroxibutirato : PHBsystem Afinidad de las Phasinas por gránulos de PHB Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Polihidroxibutirato : PHBsystem Afinidad de las Phasinas por gránulos de PHB Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Elastin-like polypeptide, ELP Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Elastin-like polypeptide, ELP Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Elastin-like polypeptide, ELP Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Fusión a Hidrofobinas, HFB Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Fusión a Hidrofobinas, HFB Proteína de interés linker Dominio hidrofóbico Dominio hidrofílico Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Fusión a Hidrofobinas, HFB Lipoplastos en semillas ( Oleosinas, Brassica napus). El sistema puede ser aplicado también sin la necesidad de expresarlo en semillas que acumulen estos liposomas. Integración con la etapa de purificación Viejas y nuevas estrategias Inteins (Intervening ProtEINS) Proteínas, auto-clivaje o auto-splicing Inteins (Intervening ProtEINS) Inteins (Intervening ProtEINS) Inteins (Intervening ProtEINS) Esquema del proceso de purificación con Inteins Inteins (Intervening ProtEINS) Inteins (INTervening ProtEINS) L-tert-leucina NADPH con Formato Dehidrogenasa 2-octanol 1,2-naftiletanol 4-cloro3-hidroxibutanoato Producción de alcoholes quirales por reducción Fuente: Liese et al. (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:595-603.
