Capillary Electrophoresis in DNA Analysis

Transcripción

NEAFS CE-DNA Workshop (Butler and McCord)
Sept 29-30, 2004
Introducción a STRs
Adaptado de:
Taller NEAFS
Mystic, CT
Septiembre 29-30, 2004
Dr. John M. Butler
Dr. Bruce R. McCord
Materiales de Entrenamiento en STRBase
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase
Análisis de Identidad Humana
• Casos Forense -- establecer compatibilidad
de sospechoso con evidencia
• Pruebas de Paternidad -- identicando al
padre
• Investigaciones históricas
• Investigaciones de personas
desaparecidas
• Desastres en Masa -- uniendo las piezas
• ADN Militar “etiqueta canina”
canina”
• Base de datos de ofensores convictos
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm
1
Sept 29-30, 2004
Perspectiva histórica en el análisis de ADN
Creación de Base
de Datos Nacional
EU (NDIS)
Creación de base
de datos nacional
UK
Identifiler 5-dye kit
y ABI 3100
2002
PowerPlex® 16
CODIS loci
defined
(16 loci en una amp)
2000
1998
Análisis de STR
por EC es rutina
FSS
Quadruplex
1990
1985
1996
1994
Desarrollo de
primer STRs
1992
Comercialización de
rimer multiplex de STR
Introducción de
electroforesis capilar
Desarrollo de
PCR
Pasos en Análisis de ADN
Colección
Slot Blot
1 ng
0.3 ng
No ADN
Almacenamiento
0.5 ng
Extracción
Cuantificación
0.5 ng
0.7 ng
Mancha de
sangre
1 ng
Isopo bucal
Colección y
Almacenamiento
1 ng
Extracción Cuantificación
de ADN
de ADN
Amplificación PCR
Separación
Amplificación Múltiple PCR
Interpretación
de resultados
Análisis STR
Base de Datos
Almacenaje y
Búsqueda
Male: 13,14-15,16-12,13-10,13-15,16
Interpretación de resultados
Base de Datos
de ADN
Conceptos Básicos
PCR (polymerase chain reaction) – método de
amplificar regiones específicas del genoma – desde 1
hasta sobre un billón de copias en 2-3 horas
Locus región del genoma a ser examinada
Alelo el estado de la variación genética siendo examinada
(STRs = número de unidades repetitivas)
(SNPs = secuencia de bases en el lugar)
Cromosomas son pareados por lo tanto…
Homocigoto – Alelos son idénticos en cada cromosoma
Heterocigoto - Alelos diferentes en cada cromosoma
2
Sept 29-30, 2004
Amplificación de ADN por Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Componentes de PCR
3’
5’
Polimerasa termo estable
5’
dNTPs
MgCl2
Buffer
3’
3’
Primers (específicos al lugar)
3’
Starting DNA
Template
5’
5’
Separación de
cadenas
(denaturación)
Forward primer
Añadir primers
(recueza)
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Hacer copias
(extender
primers)
3’
5’
Reverse primer
En
En32
32ciclos
ciclosaa100%
100%eficiencia,
eficiencia,1.07
1.07billones
billonesde
de
copias
copiasde
deregión
regiónde
deinterés
interésen
enADN
ADNson
soncreadas
creadas
Parámetros del Termociclizador
Paso en Protocolo
Estuches AmpFlSTR®
(Applied Biosystems)
Encubación inicial
95 oC por 11 minutos
Ciclos termales
Denaturación
28 ciclos
94 oC por 1 minuto
Estuche de STR PowerPlex®
(Promega Corporation)
30 ciclosa
94 oC por 30 segundos (ciclo 1-10)
90 oC por 30 segundos (ciclo 11-30)
60 oC por 30 segundos
Recueza
59 oC por 1 minuto
Extensión
72 oC por 1 minuto
70 oC por 45 segundos
Extensión Final
Asimiento Final
25 oC
(hasta remover muestras)
4 oC
(hasta remover muestras)
a)
Los primeros 10 ciclos son una corrida a una temperatura de denaturación de 94 oC y los últimos 20 ciclos son
una corrida a 90 oC. Los estuches PowerPlex 1.1 y 2.1 de Promega tambien utilizan tiempos rampantes especificos
entre los diferentes pasos de temperatura que difieren del convencional 1 oC/second.
Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Table 4.3, ©Academic Press
Ventajas de PCR
• Mínimas cantidades de ADN inicial
• ADN degradado puede ser utilizado
• Se pueden amplificar diferentes regiones de ADN
simultáneamente utilizando multiplex
• ADN contaminante no amplificará (ej.,hongos,
bacterias)
– primers específicos para humanos
• Estuches comerciales disponibles
– fácil de preparar y amplificar
Adapted from: Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Chapter 4, p. 50, ©Academic Press
3
Sept 29-30, 2004
Posibles Desventajas de PCR
• El ADN de interés puede no amplificar debido a la
presencia de inhibidores de PCR en el ADN
extraído
• Amplificación puede no funcionar por posibles
cambios en la secuencia de la región de enlace
de los "primers" en el ADN genómico inicial
• Contaminación por fuentes de ADN humano que
no son evidencia forense
– se necesitan cuidadosas técnicas de laboratorio y
protocolos validados para minimizar el problema
Adapted from: Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Chapter 4, pp. 50-51, ©Academic Press
Consejos para Prevenir
Contaminación
• Áreas de pre- y post procesamientode
PCR
• Pipetas dedicadas y reactivos de PCR
separados de otros materiales de lab
– Puntas de pipeta resistentes a aerosol y
cambiadas entre muestras
•
•
•
•
Guantes desechables
Preparación de reacción en un "hood"
Reactivos preparados cuidadosamente
Irradiación de área de preparación de PCR
con luz UV
• Limpiar áreas de trabajo e instrumentos
con cloro
Adapted from: Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Chapter 4, pp. 49-50, ©Academic Press
ADN en la Célula
cromosoma
22 pares + XX ó XY
núcleo celular
Molecula de ADN
de cadena doble
Total de ~3 billones
de bases
Región de Interés para
PCR
Nucleotidos
individuales
4
Sept 29-30, 2004
Genoma Humano
23 Pares de Cromosomas + mtDNA
Localizados en el núcleo celular
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/
Autosómicos
2 copias
por célula
Localizados en
mitocondria
(múltiples copias
en citoplasma
celular)
mtDNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
ADN Nuclear
3.2 billones de bases
Y
Cromosomas
sexuales
16,569 bp
ADN
Mitocondrial
Cientos de
copias por célula
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 2.3, ©Elsevier Science/Academic Press
Qué Tipo de Variación Genética?
•Variación en tamaño
'short tandem repeats' (STRs)
CTAGTCGT(GATA)(GATA)(GATA)GCGATCGT
•Variación en secuencia
'single nucleotide polymorphisms' (SNPs)
inserciones/deleciones
GCTAGTCGATGCTC(G/A)GCGTATGCTGTAGC
Porqué son los STRs los marcadores
genéticos preferidos?
•
•
•
•
•
•
•
•
Procesamiento rápido
Abundante en el genoma
Altamente variables en varias poblaciones
Tamaño pequeño facilita desarrollo de 'multiplex'
Alelos discretos permiten archivo de data digital
Marcadores alélicos simplifican interpretación
PCR permite uso de pequeñas cantidades de ADN
Pequeñas cantidades compatible con ADN degradado
5
Sept 29-30, 2004
'Multiplex' PCR
(Procesamiento de muestras en paralelo)
• 'Primers' compatibles son la
llave para una amplificación de
PCR por 'multiplex' exitosa
• 10 ó mas locus de STR pueden
ser amplificados
simultáneamente
• Estuches de STR disponibles
comercialmente
Desafíos de 'Multiplexing'
–Diseño de primer para encontrar
'primers' compatibles (no existe
programa)
–Optimización de reacción es
Ventajas de 'Multiplex' PCR
empírica y a veces requiere meses
–Aumenta información obtenida por unidad de tiempo (aumenta poder de
discriminación)
–Reduce labor para obtener resultados
–Reduce cantidad de ADN inicial necesario (requiere pequeña cantidad de
muestra)
Métodos para Procesamiento de Muestras en
Paralelo
'Multiplex'
'Multiplex' por
por color
color
'Multiplex'
'Multiplex' por
por Tamaño
Tamaño
Blue
Green
Yellow
Internal sizing standard in red
Combined
'Multiplex'
'Multiplex' por
por Número
Número de
de Capilares
Capilares
Información es unida con análisis de data de 'multiplex' PCR
AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)
D8S1179
D3S1358
TH01
VWA
D19S433
AMEL
D21S11
D5S818
D7S820
D13S317
TPOX
CSF1PO
D16S539
D2S1338
D18S51
FGA
11 análisis
análisis integrado
integrado vs.
vs. 16
16
corridas
corridas separadas
separadas
6
Sept 29-30, 2004
Short Tandem Repeats (STRs)
Tinte
fluorescente
AATG
Tinte
Tintefluorescente
fluorescente crea
crea
un
unproducto
productode
dePCR
PCR
rotulado
rotulado
AATG
primer1
primer1
7 repeticiones
8 repeticiones
primer2
primer2
La región de repetición varía entre muestras mientras
que las regiones que la flanquean son constantes
Homocigoto = ambos alelos son del mismo largo
Heterocigoto = alelos difieren y pueden ser separados el uno del otro
Posiciones de 'primers' definen el tamaño
del producto de PCR
Tipos de Repeticiones de STRs
Microsatélite = repetición de secuencia simple (SSR) =
short tandem repeat (STR)
High stutter
Low stutter
•
•
•
•
•
Dinucleotido
Trinucleotido
Tetranucleotido
Pentanucleotido
Hexanucleotido
(CA)(CA)(CA)(CA)
(GCC)(GCC)(GCC)
(AATG)(AATG)(AATG)
(AGAAA)(AGAAA)
(AGTACA)(AGTACA)
Requiere separación basada en ADN para diferenciar
entre alelos; repeticiones de dinucleotidos requieren
mayor resolución
Imágen
de
gelatina
8 repeats
9 repeats
Electroferograma Capilar
7
Sept 29-30, 2004
Análisis de STR es logrado comparando
data de muestra con marcadores alélicos
Alelo
microvariante
Formación de Marcador Alélico
Separar productos de PCR de varias
muestras amplificadas con 'primers'
dirigidos a un locus en particular
Gelatina de Poliacrilamida
Combinar
Re-amplificar
Encontrar alelos
representativos que acapare la
variación de la población
Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Figure 5.3, ©Academic Press
Compañías Proveen Marcadores Alélicos en
Estuches de STR Para Ayudar a Mantener
Consistencia entre Laboratorios
Profiler Plus kit allelic ladders (Applied Biosystems)
D3S1358
AMEL
VWA
D8S1179
D5S818
FGA
D18S51
D21S11
D13S317
D7S820
Estándar interno GS500 ROX
8
Sept 29-30, 2004
Importancia de Formatos Estandarizados
• Bases de Datos de ADN funcionan porque
todo el mundo somete data de los mismos
marcadores genéticos (6 SGM loci ó 13
CODIS STR loci) para asegurar
“comunicación” entre todas las muestras
• Internet funciona porque las computadoras
están conectadas con protocolos comunes
(TCP/IP) y “hablan” el mismo idioma
•Reporte publicado en Nov 2000
•Se pidió estimara cual sería el
estatus de análisis de ADN en 2,
5, y 10 años futuros
Conclusiones
Análisis de STR está
aquí para quedarse
por algunos años
gracias a las bases de
datos
http://www.ojp.usdoj.gov/nij/pubs-sum/183697.htm
'National DNA Index System' (NDIS)
http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/index1.htm
'Combined DNA Index System' (CODIS)
Creado en 1998 ahora conecta a todos los 50 estados
Utilizado para conectar crimenes en serie y casos no resueltos con
ofensores repetitivos
Ofensores convictos y muestras de casos forense en adición a
índice de personas desaparecidas
Requiere 13 marcadores de STR
Ha ayudado en >18,000 investigaciones a través de la nación hasta
Junio 2004
Contiene más de 1.8 millones de perfiles de ADN
9
Sept 29-30, 2004
Posición de Marcadores Forenses
STR en Cromosomas Humanos
13 CODIS STR Loci
TPOX
D3S1358
D5S818
FGA
CSF1PO
D2S1338
TH01
D8S1179
VWA
D7S820
AMEL
D13S317
Penta E
D16S539
Determinación de
sexo
D19S433
D18S51
D21S11
AMEL
Penta D
Información en 13 STRs de CODIS
Nombre de Localización
Localización Cromosomal
CSF1PO
5q33.1
Formato de
repetición
Accesión a
GenBank
Alelo en
GenBank
Rango
alélico
Número de
Alelos Visto
TAGA
X14720
12
5-16
20
80
*
FGA
4q31.3
CTTT
M64982
21
12.2-51.2
TH01
11p15.5
TCAT
D00269
9
3-14
20
TPOX
2p25.3
GAAT
M68651
11
4-16
15
VWA
12p13.31
[TCTG][TCTA]
M25858
18
10-25
28
D3S1358
3p21.31
[TCTG][TCTA]
NT_005997
18
8-21
24
D5S818
5q23.2
AGAT
G08446
11
7-18
15
D7S820
7q21.11
GATA
G08616
12
5-16
30
D8S1179
8q24.13
[TCTA][TCTG]
G08710
12
7-20
17
D13S317
13q31.1
TATC
G09017
13
5-16
17
D16S539
16q24.1
GATA
G07925
11
5-16
19
D18S51
18q21.33
AGAA
L18333
13
7-39.2
D21S11
21q21.1
Complex
[TCTA][TCTG]
AP000433
29
12-41.2
*
Butler, Forensic DNA Typing (2
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Table 5.2, ©Elsevier Science/Academic Press
51
82
nd
edition), Appendix I
Estuches Comerciales de STRs
Contenido del Estuche:
Marcadores Alélicos
Mezcla de componentes de
PCR
Mezcla de 'Primer'
Control Positivo de ADN
Costo al Usuario: $15-30
por muestra de ADN
analizada
2 Suplidores al momento: Applied Biosystems y Promega Corporation
10
Sept 29-30, 2004
Valor de los Estuches de STR
Ventajas
• Control de calidad de materiales está en manos del
manufacturero
• Mejora la consistencia en resultados entre
laboratorios – mismos marcadores alélicos utilizados
• Localizaciones comunes y condiciones de PCR
utilizadas – ayudan en los esfuerzos de las bases de
datos de ADN
• Es más fácil para los usuarios obtener resultados
Desventajas
• Contenidos pueden no ser completamente conocidos
para el usuario (Ej. Secuencias de 'primer')
• Precio más alto para obtener resultados
FSS:
FSS:Costo
Costo55veces
veces
más
másalto
altoque
queel
el
estuche
estucheSGM
SGMPlus
Plus
Misma muestra de ADN analizada
con los diferentes estuches de STR
de ABI
Tamaño de Producto de PCR (bp)
D3S1358
vWA
FGA
Poder de Discriminación
Blue
TH01
Amel
1:5000
CSF1PO
TPOX
Green I
TH01
D13S317
D3S1358
Amel
D5S818 vWA TPOX FGA
D13S317
Amel D8S1179 vWA
D3S1358 D5S818
D21S11 FGA
TH01
D3S1358
Amel
D7S820
D7S820
D18S51
D7S820
CSF1PO
TPOX
D16S539
D3S1358
vWA
Amel
D8S1179 TH01
D21S11
D19S433
1:410
CSF1PO
D16S539 D18S51
D2S1338
FGA
Profiler™
1:3.6 x 109
Profiler Plus™
1:9.6 x 1010
COfiler™
1:8.4 x 105
SGM Plus™
1:3.3 x 1012
PCR 'Multiplex' Requiere QC y Balanceo de Diferentes
'Primers' (24 'primers' utilizados en análisis '12plex' felino)
6FAM
(azul)
F53
C08
0.9 µM
VIC
(verde)
SRY
FCA441
0.04 µM
0.6 µM
NED
(amarillo)
0.9 µM
B04
0.9 µM
G11
1.4 µM
D09
F124
C12
0.2 µM
0.6 µM
0.6 µM
C09
F85
1.2 µM
1.4 µM
Mezcla
Final de
'primer'
D06
1.2 µM
11
Sept 29-30, 2004
Impacto de Cantidad de ADN en PCR
Razón por la cual la Cantidad de ADN es importante antes de una amplificación 'multiplex'
Generalmente 0.5 – 2.0 ng de ADN
es mejor para estuches de ADN
• Demasiado ADN
• Muy poco ADN
– Picos fuera de escala
– Picos divididos (+/-A)
– Desbalance entre 'locus'
– Desbalance de picos heterocigotos
– Decaimiento de alelos
– Desbalance entre 'locus'
Tamaño de ADN (bp)
Relative Fluorescence (RFUs)
Tamaño de ADN (bp)
-A
100 pg
template
+A
10 ng de ADN
(sobrecargado)
D3S1358
5 pg
template
2 ng de ADN
(nivel sugerido)
Efecto estocástico cuando se
amplifican bajos niveles de ADN
produce decaimiento de alelos
Recursos de Información Accesibles por la Red
Ha sido utilizado en casos de corte para apoyar la aplicación de tecnología
forense de ADN
Información actualizada es necesaria en una disciplina tan cambiante como el análisis de ADN
STRBase
Base de Datos de ADN de
Short Tandem Repeat
Información General Data de Interés Forense
•Intro a STRs
(PowerPoint)
•Hojad de hechos de
STR
•Información de
secuencias
•Estuches de 'multiplex'
de STR
Info Suplementaria
•FBI CODIS Core Loci
•Lista de Referencia 2172
•Estándares de DAB
•Repaso de Tecnología
•NIST SRM 2391
•Direcciones para
científicos
•'Primers' publicados
•STRs del cromosoma Y
•Enlaces a otros lugares en
la red
•Data de población
•Estudios de Validación
•Reportes de alelos
variantes
12
Sept 29-30, 2004
Biología de STR
"Artefactos" Biológicos de
Marcadores STR
•
•
•
•
•
Productos 'Stutter'
Adición de nucleotidos 'Non-template'
Microvariantes
Alelos Nulos
Mutaciones
Capítulo
Capítulo66cubre
cubre
estos
temas
estos temasen
en
detalle
detalle
Productos 'Stutter'
• Picos que están presentes usualmente una repetición
menos que el alelo verdadero
– Es el resultado de 'strand slippage' durante la síntesis de ADN
• 'Stutter' es menos pronounciado con unidades de
repetición más grandes
(dinucleotidos > tri- > tetra- > penta-)
• Regiones de repetición más grandes generan más
'stutter'
• Cada producto de 'stutter' consecutivo es menos
intenso que el anterior
(alelo > repetición-1 > repetición-2)
• Picos de 'stutter' hacen el análisis de mezclas más
complicado
13
Sept 29-30, 2004
Alelos de STR con Productos 'Stutter'
Unidades de Fluorescencia Relativa
Tamaño de ADN (bp)
D8S1179
D18S51
D21S11
Allele
Stutter
Product
6.3%
6.2%
5.4%
Esquema del Proceso de Formación
de Productos 'Stutter'
Replicación Normal de Alelos de STR
1
2
3
4
5
6
Modelo de no-pareación de cadena
1
2
4
3
5
Unidad de repetición forma
'chichón' cuando la cadena
'respira'
Walsh et al (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2807-2812
(A) Replicación Normal
1
2
3
5’
GATA
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
4
5
6
5’
(B) Inserción causada por 'backward slippage'
2’
1
2
5’
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
4
5
6
5’
(C) Canceladura causada por 'forward slippage'
Mecanismo Primario en la
5
2
3
1
formación de productos
GATA
GATA
GATA
GATA
5’
'stutter'
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
3’
5’
1
2
3
C
TA
T
5
6
4
Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 6.2, ©Elsevier Science/Academic Press
14
Sept 29-30, 2004
Adición 'Non-template'
• La polimerasa usualmente añade un nucleotido
adicional al final de un producto de PCR,
usualmente una "A"
• Dependiente en el extremo 5’ del 'primer' de reversa
• Puede ser realzado con un proceso de extensión
alargado al final del ciclo de PCR (Ej. 15-45 min @
60 o 72 oC)
• Puede ser reducido con una nueva polimerasa
• Mejor si no hay mezcla de picos “+/- A”
A
A
Demasiado ADN Lleva a Adenilación
Incompleta
Relative Fluorescence (RFUs)
Tamaño de ADN (bp)
-A
off-scale
+A
10 ng template
(overloaded)
D3S1358
VWA
FGA
2 ng template
(suggested level)
Adapted from: Butler, J.M. (2001) Forensic DNA Typing, Figure 6.4, ©Academic Press
Impacto del nucleotido 5’ en
Adición 'Non-Template'
+A
+A
5’-ACAAG…
Última Base para
'Primer' tiene rotulación
fluorescente opuesta
+A
+A
-A
-A
5’-CCAAG…
15
Sept 29-30, 2004
Alelos Microvariantes
• Microvariantes: alelos que no son múltiplos
exactos del la repetición básica o variantes de
secuencia de la repetición o ambos
• Alelos con unidades repetitivas parciales son
designados por el número de repeticiones completas
y luego un punto decimal seguido del número de
bases en la repetición parcial
• Ejemplo: Alelo TH01 9.3: [TCAT]4 -CAT [TCAT]5
Deleción de T
Variación en las Regiónes Adyacentes
pueden Causar Alelos Variantes
Ejemplo D7S820
GATAGAACACTTGTCATAGTTTAGAACGAACTAACGATAGATAGATAGATAGATAGATAG
CTATCTTGTGAACAGTATCAAATCTTGCTTGATTGCTATCTATCTATCTATCTATCTATC
x.3
TTTTTTTT
13 unidades de repetición = (GATA)13
TTTTTTTTTT x.1
ATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGACAGATTGATAGTTTTTTTTTAATCTCACTAAA
TATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTGTCTAACTATCAAAAAAAAATTAGAGTGATTT
Los alelos comunes observados x.3 y x.1 son principalmente el resultado de una variación en el número de
T's encontrado en una linea poly(T) 13 bases mas abajo que el área de repetición GATA. Alelos "en el
marcador" contienen 9 Ts mientras los alelos x.3 contienen 8 Ts y los alelos x.1 contienen 10 Ts (Egyed, B.
et al. Forensic Sci. Int. 2000, 113, 25-27).
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_d782.htm
Designación Tamaño Instrumento Amp Kit*
Contribuyente
de Alelo de Alelo
12.1 [3]
281.65
ABI 310
PR
Kelly Duffy/R.Rubocki
12.1 [4]
12.1 [5]
12.3
13.1
13.1 [2]
281.5
283.85
285.43
286.8
287.58
ABI 310
ABI 377
ABI 377
ABI 310
ABI 377
Verification/Conformation
Method(s)
Notas
Frecuencia
Observed both from suspect
PR
Gintautas Svilpa
1
and crime scene stain
PS
Catherine Allor
Reamplified and Reanalyzed Muestras de Paternidad 1 en 11100
CO
Kelly Solis, Texas DPS
Re-extraction
Ofensores Convictos
1 en 68000
PR, MP
Margaret Kline
Reamplified with two kits.
1 en 600 muestras
CO, PS
Nicole Swinton
Re-extracted and Reamplified
Detección de un Alelo Microvariante
en el 'locus' FGA
δ1 = S25-L25 = 244.34 - 244.46 = -0.12 bp
δ2 = SOL - L28 = 257.51-256.64 = +0.87 bp
c = |δ1 -δ2| = |-0.12-0.87| = 0.99 bp
28.1
28.1
16
Sept 29-30, 2004
Alelos Variantes Catalogados en
STRBase
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm
Alelos fuera de Marcador
Patrones Tri-Alelicos
224 al
momento
56 al
momento
en 13/13 'loci' de
CODIS
en 13/13 'loci' de
CODIS
Patrón de Tres-Picos en D18S51
AMEL
D8S1179
D21S11
D18S51
Patrones de Tres-Picos
D21S11
“Tipo 1”
Alturas de
picos
Balanceadas
Más común en TPOX
y D21S11
D18S51
“Tipo 2”
Suma de picos de
dos de los picos es
igual al tercer pico
Más común en
D18S51 y …..
17
Sept 29-30, 2004
Alelos Nulos
• Alelo está presente en la muestra de ADN pero no es amplificada
debido a un cambio en nucleótido en el lugar de enlace de uno de
los 'primers'
• Decaimiento alélico es un problema porque muestras de
heterocigotos aparecen como falsos homocigotos
• Diferentes grupos de 'primers' pueden dar diferentes resultados en
muestras que se originaron de la misma fuente
• Este fenómeno impacta las bases de dato de ADN
• Estudios extensos de concordancia son típicamente llevados a
cabo antes de utilizar un nuevo estuche de STR
Impacto de Variación en Secuencia de ADN
en el lugar de Enlace de 'Primers' en el PCR
Heterozygous alleles
are well balanced
6 8
Imbalance in allele
peak heights
6
8
*
No mutación
Mutación en el
centro del lugar
de enlace de
'primers'
8
*
Allele 6 amplicon
has “dropped out”
Mutación en el
extremo 3’ del lugar
de enlace de 'primer'
(decaimiento alélico)
Alelos Nulos Aparentes Observados durante Estudios de
Concordancia
10/13 'loci' de CODIS afectados hasta el momento
Locus
Estuches de STR
comparados
Resultados
Referencia
VWA
PP1.1 vs
ProPlus
Pérdida de alelo 19 con ProPlus;
intacto con PP1.1
Kline et al. (1998)
D5S818
PP16 vs ProPlus
Pérdida de alelos 10 y 11 con PP16;
intacto con ProPlus
Alves et al. (2003)
D13S317
Identifiler vs
miniplexes
Movimiento de alelos 10 y 11 debido a
deleción fuera del análisis de miniplex
Butler et al. (2003),
Drabek et al. (2004)
D16S539
PP1.1 vs PP16
vs COfiler
Pérdida de alelos con PP1.1; intacto
con PP16 y COfiler
Nelson et al. (2002)
D8S1179
PP16 vs ProPlus
Pérdida de alelos 15, 16, 17 y 18 con
ProPlus; intacto con PP16
Budowle et al. (2001)
FGA
PP16 vs ProPlus
D18S51
SGM vs SGM
Plus
Pérdida de alelo 22 con ProPlus;
intacto con PP16
Pérdida de alelos 17, 18, 19 y 20 con
SGM Plus; intacto con SGM
Budowle and
Sprecher (2001)
Clayton et al. (2004)
CSF1PO
PP16 vs COfiler
PP16 vs COfiler
D21S11
PP16 vs ProPlus
Pérdida de alelo 14 con COfiler; intacto
con PP16
Pérdida de alelo 9 con COfiler; intacto
con PP16
Pérdida de alelo 32.2 con PP16; intacto
con ProPlus
TH01
18
Sept 29-30, 2004
Recuperación de Alelos Nulos
Utilizando 'Primers' "Degenerados"
(Applied Biosystems STR Kits)
J Forensic Sci 2002;47(1):52-65.
D16S539-R
Forensic Sci Int 2001;119:1-10
VWA-R
Forensic Sci Int 2003;133:220-227
D8S1179-R
'Primer' D8S1179-R extra ahora
presente en estuches Identifiler y
Profiler PlusID
19
Sept 29-30, 2004
Concordancia entre grupos de
'primers' de STR es importante para
bases de datos de ADN between
PowerPlex 16
Base de
datos de
ADN
Profiler Plus
Decaimiento Alélico
Búsqueda de resultados en
un falso negativo (no se
ven muestras que deben
ser compatibles)
e.g., VWA
Mutación Observada en Trio Familiar
padre
madre
14,18
15,17
hijo
14,18
15,17
13,17
15,18
Transmisión Normal de Alelos
(No Mutación)
Mutación Paterna
Porcientos de Mutación de STR
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/mutation.htm
Meiosis Materna (%)
Meiosis Paterna (%)
CSF1PO
70/179,353 (0.04)
727/504,342 (0.14)
303
1,100/683,695
0.16%
FGA
134/238,378 (0.06)
1,481/473,924 (0.31)
495
2,110/712,302
0.30%
29/346,518 (0.008)
13 CODIS core loci
STR Locus
Cualquier padre
23
Mutaciones Totales
Porciento
TH01
23/189,478 (0.01)
75/535,996
0.01%
TPOX
16/299,186 (0.005)
43/328,067 (0.01)
24
83/627,253
0.01%
VWA
133/400,560 (0.03)
907/646,851 (0.14)
628
1,668/1,047,411
D3S1358
37/244,484 (0.02)
429/336,208 (0.13)
266
732/580,692
0.13%
D5S818
84/316,102 (0.03)
537/468,366 (0.11)
303
924/784,468
0.12%
D7S820
43/334,886 (0.01)
550/461,457 (0.12)
218
811/796,343
0.10%
396/264,350 (0.15)
0.16%
D8S1179
54/237,235 (0.02)
225
675/501,585
D13S317
142/348,395 (0.04)
608/435,530 (0.14)
402
1,152/783,925
0.15%
D16S539
77/300,742 (0.03)
350/317,146 (0.11)
256
683/617,888
0.11%
0.13%
D18S51
83/130,206 (0.06)
623/278,098 (0.22)
330
1,036/408,304
0.25%
D21S11
284/258,795 (0.11)
454/306,198 (0.15)
423
1,161/564,993
0.21%
Penta D
12/18,701 (0.06)
10/15,088 (0.07)
21
43/33,789
0.13%
Penta E
22/39,121 (0.06)
58/44,152 (0.13)
55
135/83,273
0.16%
D2S1338
2/25,271 (0.008)
61/81,960 (0.07)
31
94/107,231
D19S433
22/28,027 (0.08)
16/38,983 (0.04)
37
75/67,010
0.11%
F13A01
FES/FPS
1/10,474 (0.01)
3/18,918 (0.02)
37/65,347 (0.06)
79/149,028 (0.05)
3
Ninguno reportadp
41/75,821
82/167,946
0.05%
0.05%
F13B
LPL
SE33 (ACTBP2)
2/13,157 (0.02)
0/8,821 (<0.01)
0/330 (<0.30)
8/27,183 (0.03)
9/16,943 (0.05)
330/51,610 (0.64)
1
4
Ninguno reportado
11/40,340
13/25,764
330/51,940
0.03%
0.05%
0.64%
0.09%
*Data used with permission from American Association of Blood Banks (AABB) 2002 Annual Report.
20
Sept 29-30, 2004
Resumen de Mutaciones de STR
• Mutaciones ocurren y tienen que ser
consideradas
• Usualmente 1 en ~1000 meiosis
• Paterna normalmente mayor que materna
• VWA, FGA y D18S51 tienen niveles más altos
• TH01, TPOX y D16S539 tienen niveles más
bajos
Mutaciones impactan pruebas de paternidad e
investigaciones de personas desaparecidas
pero no afecta compatibilidad forense entre
evidencia y sospechoso…
Ventajas de Marcadores STR
• Productos pequeños son generalmente compatibles
con ADN degradado y PCR permite la recuperación
de pequeñas cantidades del material
• Amplificación 'multiplex' con detección fluorescente
permite alto poder de discriminación en un solo
análisis
• Disponibles comercialmente en estuches fáciles de
utilizar
• Uniformidad en grupos de 'loci' de STR provee
capacidad para intercambio de perfiles de ADN de
criminales nacional e internacionalmente
Detección Fluorescente Multi-Color
Imágen de gelatina deSTRs
(Múltiples Muestras y Marcadores)
Ventajas:
Ventajas: Detección
Detección puede
puede ser
ser
automatizada
automatizada yy grandes
grandes multiplexes
multiplexes
pueden
pueden ser
ser analizados
analizados debido
debido aa la
la
detección
detección de
de multi-canales
multi-canales que
que permite
permite
traslapo
traslapo de
de tamaños
tamaños de
de productos
productos de
de PCR
PCR
con
con diferentes
diferentes 'etiquetas'
'etiquetas' fluorescentes
fluorescentes
Desventajas:
Desventajas: Equipo
Equipo costoso
costoso requerido,
requerido,
artefactos
artefactos fluorescentes
fluorescentes pueden
pueden interferir
interferir
con
la
interpretación
con la interpretación
Electroferograma de CE (Muestra con Múltiples STRs)
Marcador de Tamaño en Rojo
21
Sept 29-30, 2004
22

Capillary Electrophoresis in DNA Analysis

Transcripción

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