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TECO DIAGNOSTICS
BILIRRUBINA DIRECTA
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REACTIVOS DE BILIRRUBINA DIRECTA:
Para la determinación cuantitativa de Bilirrubina directa en suero humano.
INTRODUCCION.
La Bilirrubina es un metabolito de la porción hemo de las hemoproteínas,
principalmente la hemoglobina. Normalmente es excretada del hígado, al
intestino y a la bilis. El sitio del catabolismo de la hemoglobina es el sistema
reticuloendotelial (RES). Luego, la bilirrubina se libera al torrente sanguíneo
donde se une a la albúmina y se transporta al hígado. Una vez captada por el
hígado, se conjuga con el acido glucorónico para formar bilirrubina mono y
diglucorónido los cuales son metabolitos solubles en agua. Los metabolitos
reaccionarán con un reactivo diazo acuoso comúnmente llamado “bilirrubina
directa”1.
La elevación de la bilirrubina total en suero puede ocurrir por 1) hemólisis
excesiva o destrucción de células sanguíneas p.e. enfermedad hemolítica del
recién nacido, 2) enfermedades del hígado, p.e. hepatitis y cirrosis 3) obstrucción
del tracto biliario p.e. cálculos biliares1. Existe información que indica la
elevación del nivel de bilirrubina en pacientes con enfermedades del tracto biliar
o del hígado: aun así, los niveles de bilirrubina total son normales2. De esta
manera, el valor diagnostico de la bilirrubina directa proviene de su capacidad de
indicar enfermedades ocultas del hígado.
La mayoría de los métodos químicos para la determinación de bilirrubina total se
basan en la reacción entre acido sulfanil diazotizado y bilirrubina para producir
azobilirrubina, que absorbe a 560 nm. Tales pruebas se realizan en presencia o
ausencia de solvente orgánico p.e. metanol para distinguir la bilirrubina libre de
la bilirrubina conjugada en base a un diferencial de solubilidad3.
PRINCIPIO.
El acido sulfanílico reacciona con la bilirrubina para producir azobilirrubina, que
tiene una absorbancia máxima a 560 nm en solución acuosa. La intensidad del
color producido es directamente proporcional a la cantidad de la concentración
de bilirrubina directa presente en la muestra.
REACTIVOS
1.- Reactivo Bilirrubina Directa: Acido sulfanílico 32 mM, Acido Clorhídrico,
165 mM.
2.- Reactivo de Nitrito de Sodio; Nitrito de Sodio 60 mM.
3.- Calibrador para Bilirrubina: 5 mg/dL de Sal de Dihidrocloruro de N-1naftiletilendiamina.
PRECAUCIONES.
1.- El reactivo se usa solo para diagnostico in Vitro solamente.
2.- Los especimenes se deben considerar infecciosos y tratarse apropiadamente.
3.- No pipetee los reactivos con la boca. Evite el contacto con la piel y la ropa.
No lo ingiera. Lávese las manos después de usarlo.
PREPARACION DEL REACTIVO.
Reactivo de trabajo de bilirrubina Directa. Agregue 0.005 mL (5µL) de reactivo
de nitrito de sodio por 1.0 ml de reactivo de bilirrubina directa y mezcle.
Ejemplo: 0.05 ml de nitrito/10 ml de reactivo de bilirrubina directa o 0.1 ml de
nitrito de sodio/20 ml de reactivo de bilirrubina directa, etc.
ALMACEN Y ESTABILIDAD
1.- Almacene el reactivo y el calibrador a temperatura ambiente (15-30°C)
2.- El reactivo de trabajo combinado se puede almacenar hasta por 8 horas,
cuando se mantiene en una botella ámbar a temperatura ambiente.
3.- No congele los reactivos.
4.- Evite la exposición directa a la luz solar.
DETERIORO DEL REACTIVO.
No se use si:
1.- El reactivo de nitrito de sodio tiene una decoloración amarilla.
2.- El reactivo de trabajo falla al compararlo contra los valores del suero control.
COLECTA Y ALMACENAJE DEL ESPECIMEN.
1.- La hemólisis interfiere con la prueba p.e. las muestras hemolisadas deberán
evitarse ya que pueden dar valores falsamente bajos4.
2.- Las muestras deberán de protegerse cuidadosamente de la luz1.
3.- La bilirrubina en suero es estable por 4-7 días si se almacena refrigerada (28°C) y se protege de la luz1.
INTERFERENCIAS
1.- Cierta cantidad de drogas y sustancias afectan el nivel circulante de
Bilirrubina.5 Consultar a Young et.al.
2.- El material de trabajo debe estar libre de contaminación por metales pesados,
detergentes y otros químicos.
MATERIALES PROPORCIONADOS:
1.- Reactivo de Bilirrubina.
2.- Reactivo de Nitrito de Sodio.
3.- Calibrador de Bilirrubina.
MATERIALES REQUERIDOS Y NO PROPORCIONADOS:
1.- Instrumentos de pipeteo.
2.- Cubetas
3.- Reloj
4.- Espectrofotómetro con capacidad de lectura de 560 nm
5.- Tubos/Gradilla
PROCEDIMIENTO AUTOMATICO.
Consulte la aplicación apropiada para el instrumento.
PROCEDIMIENTO MANUAL.
1.-Etiquete los tubos Blanco, Estándar, Control, Paciente. Cada tubo requiere un
tubo “blanco”.
2.- Pipetee 1.0 ml de reactivo de bilirrubina directa a todos los tubos “blanco”.
3.- Prepare el reactivo de trabajo. Consulte “Preparación de reactivos”.
4- Pipetee 1.0 ml de reactivo de trabajo a todos los tubos de prueba.
5.- Agregue 0.1 ml (100 µL) de cada estándar, control y muestra a su tubo
respectivo. Mezcle.
6.- Coloque todos los tubos en una gradilla por cinco minutos a temperatura
ambiente.
7.- Calibre el espectrofotómetro a cero con el blanco de reactivo a 560 nm.
(Rango de longitud de onda: 500-560 nm)
8.- Lea y registre la absorción de todos los tubos.
NOTAS DEL PROCEDIMIENTO:
1.- El color final es estable por sesenta (60) minutos.
2.- Para instrumentos que requieren un volumen superior a 1.0 ml para
proporcionar lecturas exactas, use 3.0 ml de reactivo y 0.2 ml (200 µL) de
muestra.
VOLUMENES PEDIATRICOS.
Para muestras pediátricas con bilirrubina superior a 3.0 mg/dL, use 0.05 ml (50
µL) de muestra y multiplique el resultado por dos (2)
CALCULOS:
Abs=Absorbancia
Abs muestra – Abs blanco no conocido x Conc.
= BD(mg/dL)
Abs. Calibrador - Abs blanco calibrador
Calibrador
Ejemplos:
Abs. muestra
Abs. Blanco no conocido
Abs. Calibrador
Abs. Blanco Calibrador
Concentración del calibrador
=
=
=
=
=
0.132
0.120
0.450
0.000
5.0 mg/dL
Entonces:
0.132 - 0.120
0.012
------------------- x 5 = --------------- x 5 = 0.13 mg/dl.
0.450 - 0.000
0.450
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BILIRRUBINA DIRECTA
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LIMITACIONES.
1.- Sueros con valores superiores a 20 mg/dL deben ser diluidos en proporción
1:1 con salina isotónica. Evalúe de nuevo y el resultado final multiplíquelo por
dos (2).
2.- Los niveles de hemoglobina en el suero superiores a 1.0 g/dL no interfieren
con los resultados.
CONTROL DE CALIDAD:
La integridad de la reacción se debe monitorear mediante el uso de sueros
control (normal y anormal) con concentraciones de bilirrubina directa conocidas.
VALORES ESPERADOS1, 6:
Adultos e Infantes (un mes o más): 0.0 – 0.5 mg/dL.
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales.
DESEMPEÑO.
1. Linealidad: 20 mg/dl
2. Sensibilidad: Basado en un instrumento con resolución de A= 0.001 este
procedimiento tiene sensibilidad A=0.01 mg/dL.
3.- Comparación: La comparación entre este método y otro comercialmente
disponible usando 40 muestras de suero fresco y dos controles comerciales con
rango de 0.10 mg/dL a 0.67 mg/dL arrojó un coeficiente de correlación de 0.98
con una ecuación de regresión de y=0.99x + 0.01.
4.- Precisión.
Precisión día a día: Dos sueros control comerciales fueron evaluados por un
periodo de 21 días y se obtuvo la siguiente precisión:
Nivel 1 Nivel 2
Media (mg/dL) N=16
0.13
0.33
Desviación estándar
0.01
0.04
Coeficiente de variación
7.0%
12.0%
Precisión dentro de pruebas: Se evaluaron do s sueros control comerciales 20
veces y se obtuvo la siguiente precisión:
Nivel 1 Nivel 2
Media (mg/dL) N=20
0. 10
0.23
Desviación estándar
0.01
0.03
Coeficiente de variación
10.0%
13.0%
REFERENCIAS.
1. Tietz, N.W.: Fundamentals of Clinical Chemistry. W. B.
Saunders Co., Philadelphia, p. 1208 (1976).
2. Gambino, S.R., et al., JAMA 201:1047 (1967).
3. Walters, M. Gerand, H., Microchem J. 15; 231 (1970).
4. Michaelson, M.: Scand. J., J. Clin. Lab. Invest. (Suppl. 49)
13, 1 (1961).
5. Young, D.S., et. al.: Clin. Chem. 21, 10 (1975).
6. Gambino, S.R., et. al.: Bilirubin Assay (Revised), Commission
on Continuing Education. Am. Soc. of Clin. Path., Chicago
(1968).
B538: 12/01
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Grupo Tecnología y Laboratorios S.A de C.V.
T. (81) 8370 7992
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