(Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)

Transcripción

[ES]
ELPHA
(Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)
[IVD]
For In Vitro Diagnostic Use
ELPHA HLA-AB SL LowRes 48
[REF] 826 603
| 0197
ELPHA HLA-AB DL LowRes 48
[REF] 826 613
| 0197
ELPHA HLA-C SL LowRes 16
[REF] 826 621
|
ELPHA DRB SL LowRes 16
[REF] 826 641
| 0197
ELPHA DRB1 DL All 48
[REF] 826 673
| 0197
ELPHA DQB SL LowRes 16
[REF] 826 681
|
ELPHA DQB DL Extend 16
[REF] 826 691
|
ELPHA Primer HLA-AB LowRes
[REF] 826 604
| 0197
ELPHA Primer HLA-C LowRes
[REF] 826 624
|
ELPHA Primer DRB SL LowRes
[REF] 826 644
| 0197
ELPHA Primer DRB HiRes
[REF] 826 674
| 0197
ELPHA Primer DRB1 DL HiRes
[REF] 826 675
| 0197
ELPHA Primer DRB1 DL All
[REF] 826 677
| 0197
ELPHA Primer DQB SL LowRes
[REF] 826 684
|
ELPHA Primer DQB DL Extend
[REF] 826 694
|
ELPHA Reagent 48
[REF] 826 503
| 0197
ELPHA Reagent Supp 48
[REF] 826 513
| 0197
189779/08 – 06/2010
-2-
ELPHA
Indicaciones importantes para el usuario:
ELPHA TYPING SETS WITH TAQ-POLYMERASE - LIMITED LICENSE:
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Chain Reaction ("PCR") Process described in said patents solely for the HLA Typing applications of the
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Grenzacherstr. 124, CH-4070 Basel, Switzerland.
ELPHA TYPING SETS WITHOUT TAQ-POLYMERASE - DISCLAIMER OF LICENSE:
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under these patents to use the PCR Process is conveyed expressly or by implication to the purchaser by
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by contacting, in the United States, the Director of Licensing at Roche Molecular Systems, Inc. 1145
Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, and outside the United States, the PCR Licensing Manager,
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GB
DE
ES
IT
[REF]
FR
NL
DK
CZ
GB
DE
ES
IT
[MT_P]
FR
NL
DK
CZ
GB
DE
ES
IT
[PRIMER]
FR
NL
DK
CZ
GB
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IT
[BUF]__A10x]
FR
NL
DK
CZ
GB
DE
ES
IT
[SSC]__20x]
FR
NL
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CZ
GB
DE
ES
IT
[SDS]__1%]
FR
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GB
DE
ES
IT
[CONJ]__FITC] FR
NL
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ES
[BLOC__ _ REA] IT
FR
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ELPHA
Article number
Artikelnummer
Artíkulo número
Codice prodotto
Référence du produit
Artikelnummer
Artikelnummer
Katalogové čislo
Microtest plate
Mikrotestplatte
Placa microtest
Micropiastra
Test en microplaque
Microtiterplaat
Mikrotestplade
Mikrotestovací destička
Primer mix
Primermix
Mezcla cebadores
Miscela di primer
Melange d’amorce
Primer mix
Begyndelsesblanding
Směs primerů
Buffer A 10x concentrated
Puffer A 10x konzentriert
Buffer A concentrado 10x
Tampone A concentrato 10x
Tampon A concentrèe 10x
Buffer A 10x geconcentreerd
Buffer A 10x koncentreret
Pufr A 10x koncentrovaný
20xSSC buffer
20xSSC-Puffer
Tampón 20xSSC
Tampone SSC 20x
Tampon SSC 20x
Buffer SSC 20x
Buffer SSC 20x
Pufr pro SSC 20x
1% SDS solution
1%ige SDS-Lösung
Solución 1% SDS
Soluzione di SDS 1%
Solution de SDS à 1%
1% SDS oplossing
1% SDS opløsning
1% SDS roztok
Conjugate (FITC)
Konjugat (FITC)
Conjugado (FITC)
Conjugato (FITC)
Conjugué (FITC)
Conjugaat (FITC)
Konjugat (FITC)
Konjugát (FITC)
Blocking reagent
Blockierungsreagenz
Reactivo blocqueante
Reagente bloccante
Réactif d'arrêt
Blocking reagens
Blokerende reagens
Blokující reagencie
[IVD]
[PCR__ _BUF]_ABC]
[PCR__ _BUF]_DR]
[NEUTRAL]
[DENAT]
[BUF]__A]
[CONJ]_D]
[BUF]__B]
GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
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GB
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IT
FR
NL
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GB
DE
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FR
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NL
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CZ
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DE
ES
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NL
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GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
CZ
GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
CZ
For in vitro diagnostic use
Nur zur in-vitro Diagnostik
Sólo para el diagnóstico in vitro
Solo per la diagnostica in vitro
Pour le diagnostic in vitro
Voor in vitro gebruik
Til diagnostik brug i glas
Použití pro in vitro diagnostiku
PCR buffer for HLA-ABC typing
PCR Puffer zur HLA- ABC-Typisierung
PCR buffer para el tipaje de HLA-ABC
Tampone PCR per tipizzazione HLA-ABC
Tampon de PCR pour le typage HLA-ABC
PCR buffer voor HLA-ABC typering
PCR buffer til HLA-ABC typning
PCR pufr pro HLA-ABC typizaci
PCR buffer for HLA-DRB/DQB typing
PCR Puffer zur HLA-DRB/DQB-Typisierung
PCR buffer para el tipaje de HLA-DRB/DQB
Tampone PCR per tipizzazione HLA-DRB/DQB
Tampon de PCR pour le typage HLA-DRB/DQB
PCR buffer voor HLA-DRB/DQB typering
PCR buffer til HLA-DRB/DQB typning
PCR pufr pro HLA-DRB/DQB typizaci
Solution for neutralization
Neutralisierungslösung
Solución para la naturalizacion
Soluzione di neutralizzazione
Solution de neutralisation
Neutralisatie-oplossing
Opløsning til neutralisering
Roztok pro neutralizaci
Solution for denaturation
Denaturierungslösung
Solución para la desnaturalizacion
Soluzione di denaturazione
Solution de dénaturation
Denaturatie-oplossing
Opløsning til denaturering
Roztok pro denaturaci
Buffer A, working solution
Puffer A, Gebrauchslösung
Buffer A, solución de trabajo
Tampone A, soluzione di lavoro
Tampon A, soluzion de travail
Buffer A, werkoplossing
Buffer A, arbejdsopløsning
Pufr A, pracovní roztok
Conjugate (D)
Konjugat (D)
Conjugado (D)
Conjugato (D)
Conjugué (D)
Conjugaat (D)
Konjugat (D)
Konjugát (D)
Conjugate dilution buffer
Konjugatverdünnungspuffer
Buffer de dilción del conjugado
Tampone per la diluizione del conjugato
Tampon de dilution du conjugué
Conjugaat verdunningsbuffer
Konjugat fortyndings buffer
Pufr pro ředěni konjugátu
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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[SUBS]__TMB]
ELPHA
GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
CZ
Substrate solution TMB
Substratlösung TMB
Solución substrato
Soluzione substrato (TMB)
Solution de substrat (TMB)
TMB substraatoplossing
Substrat opløsning TMB
Roztok substrátu TMB
[INHIB]
[BUF]__SSC/SDS]
GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
CZ
GB
DE
ES
IT
FR
NL
DK
CZ
POD inhibitor
POD-Inhibitor
POD inhibidor
POD inhibitore
POD inhibiteur
POD inhibitor
POD hæmmer
POD inhibitor
Buffer 2xSSC/ 0.1% SDS
Puffer 2xSSC/ 0.1% SDS
Tampón 2xSSC/ 0,1%SDS
Tampone di SSC 2x/ 0,1% SDS
Tampon de SSC 2x/ 0,1% SDS
Buffer 2xSSC/0,1% SDS
Buffer 2x SSC/0,1% SDS
Pufr pro SSC 2x/0,1% SDS
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
ÍNDICE
1
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 6
1.1
1.2
1.3
2
ÁMBITO DE APLICACIÓN ...................................................................................................................... 6
INTRODUCCIÓN GENERAL ................................................................................................................... 6
PRINCIPIO DEL TEST ........................................................................................................................... 6
MATERIAL .............................................................................................................................................. 7
2.1
JUEGO DE MICROPLACAS ELPHA ....................................................................................................... 7
2.2
COMPOSICIÓN DEL JUEGO DE MICROPLACAS ELPHA .......................................................................... 7
2.3
ELPHA PRIMERSETS ......................................................................................................................... 8
2.4
COMPOSICIÓN DEL PRIMERSETS ELPHA............................................................................................ 9
2.5
CONTENIDO DEL JUEGO DE REACTIVOS ELPHA REAGENT 48 ........................................................... 10
2.6
CONTENIDO DEL JUEGO DE REACTIVOS ELPHA REAGENT DL SUPP 48 ............................................ 10
2.7
ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN ............................................................................................... 10
2.8
AVISOS GENERALES ......................................................................................................................... 11
2.9
MATERIAL ADICIONAL NECESARIO ..................................................................................................... 11
2.9.1
PCR ........................................................................................................................................ 11
2.9.2
Electroforesis de gel .............................................................................................................. 11
2.9.3
ELPHA SL .............................................................................................................................. 12
2.9.4
ELPHA DL .............................................................................................................................. 12
2.9.5
Valoración .............................................................................................................................. 12
3
PREPARACIÓN DE LOS ENSAYOS ................................................................................................. 12
3.1
3.2
3.3
4
AISLAMIENTO DE ADN...................................................................................................................... 12
MATERIAL DE PRUEBA ...................................................................................................................... 12
CANTIDAD Y CALIDAD DE ADN ......................................................................................................... 13
REALIZACIÓN...................................................................................................................................... 13
4.1
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) ............................................................................. 13
4.1.1
Medidas de precaución.......................................................................................................... 13
4.1.2
Elaboración de una solución primaria de nucleótidos (dNTPs) ........................................... 13
4.1.3
Elaboración de mezclas maestras de PCR (Mastermix) ...................................................... 13
4.2
ELECTROFORESIS DE GEL ................................................................................................................ 15
4.2.1
Elaboración de reactivos ....................................................................................................... 15
4.2.2
Realización ............................................................................................................................. 15
4.3
ELPHA (ENZYME LINKED PROBE HYBRIDISATION ASSAY) ................................................................ 16
4.3.1
Elaboración de reactivos ....................................................................................................... 16
4.3.2
Realización de ensayo de una tipificación ELPHA SL ......................................................... 17
4.3.3
Realización de ensayo de una tipificación ELPHA DL ......................................................... 19
4.4
INDICACIONES DE REALIZACIÓN......................................................................................................... 21
4.5
CONTROLES DE CALIDAD .................................................................................................................. 22
4.6
CARACTERIZACIÓN ESPECÍFICA ........................................................................................................ 22
5
BÚSQUEDA DE ERRORES ................................................................................................................ 23
6
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 24
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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1
ELPHA
Introducción
1.1 Ámbito de aplicación
El ensayo ELPHA (Ensayo de hibridización de sonda ligada a enzimas del inglés Enzyme Linked Probe
Hybridization Assay) y el ensayo ELPHA-DL (Ensayo de hibridización de sonda ligada a enzimas del
inglés Enzyme Linked Probe Hybridization Assay Double Labeled) consiste en un ensayo de
hibridización de ADN para determinar los alelos del antígeno HLA Clase I ó Clase II.
1.2 Introducción general
El sistema HLA es un sistema de antígeno codominante hereditario que juega un gran papel en el
sistema inmune en el proceso de reconocimiento de „lo propio“ y „lo no propio“. En los transplantes de
órganos la compatibilidad de los antígenos HLA entre el donante y el receptor revisten una importancia
fundamental para la supervivencia del transplante. Por esta razón, en la selección de donante / receptor
se parte de la coincidencia de los antígenosHLA.
Gracias a la introducción de sistemas de ensayo biológico-moleculares se han abierto nuevas
perspectivas. Los antígenos HLA de distinta especifidad se diferencian en parte sólo en un aminoácido
en la cadena de polipéptidos. A menudo no se puede diferenciar estas estructuras en gran parte
idénticas mediante métodos de prueba serológicos puesto que la capacidad de resolución de los
métodos serológicos resulta limitada.
El análisis de ADN permite, en cambio, la identificación de todas las diferencias genéticas.
Entretanto ya se conocen las secuencias de ADN de los alelos de antígeno HLA más frecuentes. Las
variaciones en la secuencia de ADN se pueden determinar con ayuda de oligonucleótidos sintéticos.
Mediante una amplificación de un ADN genómico (PCR siglas en inglés de reacción en cadena de la
polimerasa, Polymerase Chain Reaction) y la posterior hibridización con oligosondas seleccionadas
(SSO: Sequence Specific Oligonucleotides) se puede determinar cualquier alelo de antígeno HLA.
1.3 Principio del test
Para diferenciar los motivos de secuencia polimórficos se aplican sondas de oligonucleótidos de
secuencia específica (SSO) cuya formación se puede determinar siguiendo un principio derivado de una
proteína ELISA. El formato en microplacas de ensayo permite realizar y valorar el test mediante
aparatos estandarizados, El estudio, en cambio, se puede realizar incluso a mano.
El ADN genómico que se emplea como material de referencia se puede aislar de manera sencilla a
partir de sangre total . Mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) con cebadores marcados con
biotina se amplifican regiones polimórficas en el segundo exón de los genes de clase II y en el segundo
y tercero exones de los genes de clase I. Los productos de PCR se desnaturalizan y se unen como
cadenas individuales a través de su marcación de biotina en las cavidades cubiertas de estreptavidina a
capas de las microplacas de ensayo. Al aplicar los productos de PCR diluidos en la placa, se disuelven
las sondas SSO marcadas con antigen que se han introducido y secado en las cavidades, de tal modo
que se produce simultáneamente la combinación de los productos de PCR en la placa y la hibridización
con las sondas SSO. Para la especificidad del proceso resulta decisivo el siguiente paso de lavado de
precisión (stringency) en el que se separa las sondas con una homología de secuencia insuficiente de
los productos de PCR. Las sondas ligadas se determinan a continuación en una reacción cromática
mediante fragmentos de anticuerpo antigen-específicos que están combinados con peroxidasa de
rábano picante (POD). El patrón de reacciones positivas se puede averiguar mediante un lector de
ELISA. La valoración de los resultados se realiza o bien mediante el software de tipificación HLA Typing
Software ([REF] 847 070) con la información de lote disponible en la página de web www.biorad.com o
teniendo en cuenta los esquemas de reacción anexos.
Para aumentar la capacidad de resolución se efectúan dos reacciones de amplificación por separado en
el ELPHA DRB HiRes y en el ELPHA DQB.
En el ELPHA DQB-Typing se separan los alelos correspondientes al grupo serológico denominado DQ1
de los alelos del grupo DQ2-4 con ayuda del proceso de PCR.
En el ELPHA DRB HiRes se utiliza el polimorfismo en el aminoácido 86 en el segundo exón DRB para
dividir el alelo en dos grupos de amplificación aproximadamente del mismo tamaño. Los productos de
ambas amplificaciones se dividen y se analizan en dos juegos de sondas de oligonucleótidos idénticas.
En el ensayo de ELPHA-DL cada cavidad contiene dos sondas diferentes marcadas que reconcen sus
propios motivos de secuencia. Como antígeno para la marcación de una de las dos sondas se emplea
digoxigenina y para la marcación de la otra sonda fluoresceína. En este caso, ambas secuencias se
pueden determinar en dos reacciones de prueba POD seguidas con conjugados de la especificidad
correspondiente. Para que los resultados derivados de la segunda reacción POD se puedan determinar
independientemente a los de la primera reaccion, una vez realizada la valoración de la primera reacción
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
se inactiva totalmente la enzima mediante un inhibidor y se retira el producto de reacción aplicando un
paso de lavado. En el ELPHA-DL se obtiene un modelo completo de reacciones positivas añadiendo los
resultados de ambos desarrollos cromáticos. El patrón de las reacciones positivas se pueden determinar
en un lector de ELISA. La valoración se efectúa o bien mediante el software de tipificación HLA Typing
Software ([REF] 847 070) con la información de lote disponible en la página de web www.bio-rad.com o
bien por medio del esquema de reacciones adjunto.
2
Material
Para efectuar las tipificaciones de HLA se requieren los siguientes juegos:
2.1
Juego de microplacas ELPHA
Juego de placas de
ensayo ELPHA
REF
Juego de reactivos
REF
Set
Tipificaciones
múltiples
1 ELPHA HLA-AB SL 826 603 1 ELPHA Reagent 48
LowRes 48
826 503 826 603 900 48 HLA-AB
low resolution
1 ELPHA HLA-AB DL 826 613 1 ELPHA Reagent 48
LowRes 48
+ 1 ELPHA Reagent Supp 48
826 503 826 613 900 96 HLA-AB
826 513
low resolution
1 ELPHA HLA-C SL
LowRes 16
826 623 1/3 ELPHA Reagent 48
826 503 --
48 HLA-C
low resolution
1 ELPHA DRB
SL LowRes 16
826 503 --
64 HLA-DRB
low resolution
1 ELPHA DRB1
DL All 48
826 673 1 ELPHA Reagent 48
+ 1 ELPHA Reagent Supp 48
826 503 826 673 900 192 HLA-DRB1
826 513
medium resolution
1 ELPHA DQB
SL LowRes 16
826 503 --
64 HLA-DQB
1 ELPHA DQB
DL Extend 16
826 503 --
96 HLA-DQB
medium resolution
Para el procesar manualmente las placas microtest ELPHA, se requieren adicionalmente las folios
cobertores (Cover MTP 96, [REF] 826 550).
2.2
Composición del juego de microplacas ELPHA
•
MTP, Por cada placa hay 12 tiras con 8 cavidades marcadas con números en negro. Las cavidades
contienen diferentes sondas secas de oligonucleótidos.
•
[PCR__BUF]ABC] contiene 500 mM Tris/HCl, 150 mM (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2.
•
[PCR__BUF]DR] contiene 100 mM Tris/HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2.
•
Más información sobre los lotes, actualizaciones de software, esquemas de reacción y una visión
general de las secuencias de las sondas oligonucléotidos, así como una detallada información
sobre el uso está disponible en el internet (www.bio-rad.com).
•
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
Componentes del envase
[MT_P]
[PCR__BUF]ABC]
HLA-AB
SL LowRes 48
HLA-AB
DL LowRes 48
HLA-C
SL LowRes 16
DRB
SL LowRes 16
DRB1
DL All 48
48
3x1,0 ml
48
3x1,0 ml
16
1x1,0 ml
DQB
SL LowRes 16
DQB
DL Extend 16
16
Test
2.3
[PCR__BUF]DR]
16
48
16
1x1,0 ml
3x1,0 ml
1x1,0 ml
1x1,0 ml
[PRIMER]
[PRIMER]
HLA-A (rojo)
3x180 µl
HLA-A (rojo)
3x240 µl
HLA-C (naranja)
1x300 µl
C (grün)
1x640 µl
DRB1 All
(orange)
3x640 µl
A (azul)
1x160 µl
DQB DL (rojo)
1x480 µl
HLA-B (azul)
3x180 µl
HLA-B (azul)
3x240 µl
B (rojo)
1x160 µl
ELPHA Primersets
ELPHA Primerset
[REF]
ELPHA juego de microplacas
[REF]
Número de tipajes
1 ELPHA Primer
HLA-AB LowRes
826 604
1 ELPHA HLA-AB SL LowRes 48
o
1 ELPHA HLA-AB DL LowRes 48
826 603
48 HLA-AB
resolución baja
826 613
1 ELPHA Primer
HLA-C LowRes
826 624
1 ELPHA HLA-C SL LowRes 16
826 623
48 HLA-C
resolución baja
1 ELPHA Primer
DRB SL Low Res
826 644
1 ELPHA DRB SL LowRes 16
826 641
64 DRB
resolución baja
1 ELPHA Primer
DRB HiRes
826 674
1 ELPHA DRB1 DL All 48
826 673
96 DRB
resolución alta
1 ELPHA Primer
DRB1 DL HiRes
826 676
826 673
96 DRB1
resolución alta
1 ELPHA Primer
DRB1 DL All
826 677
826 673
192 DRB1
resolución media
1 ELPHA Primer
DQB SL LowRes
826 684
1 ELPHA DQB SL LowRes 16
826 681
64 DQB
resolución baja
1 ELPHA Primer
DQB DL Extend
826 694
ELPHA DQB DL Extend 16
826 691
826 693
96 DQB
medium resolution
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2.4
ELPHA
Composición del Primersets ELPHA
Contenido
Primerset
[PCR__BUF|ABC] [PCR__BUF|DR] [PRIMER]
ELPHA Primer HLA-AB LowRes
1x1,0 ml
ELPHA Primer HLA-C LowRes
1x1,0ml
ELPHA Primer DRB SL LowRes
1x1,0 ml
ELPHA Primer DRB HiRes
1x1,0 ml
ELPHA Primer DRB1 DL HiRes
1x1,0 ml
ELPHA Primer DRB1 DL All
1x1,0 ml
ELPHA Primer DQB SL LowRes
1x1,0 ml
ELPHA Primer DQB DL Extend
1x1,0 ml
•
[PRIMER]
HLA-A (rojo)
1x180 µl
HLA-C (orange)
1x300 µl
C (verde)
1x640 µl
G (azul)
1x300 µl
DRB1 G
(amarillo)
1x320 µl
DRB1 All (orange)
1x640 µl
A (azul)
1x160 µl
DQB DL (rojo)
1x480 µl
HLA-B (azul)
1x180 µl
T (rojo)
1x320 µl
DRB1 T (negro)
1x320 µl
B (rojo)
1x160 µl
Mezclas de cebadores (primer) para conseguir la amplificación genérica:
[PRIMER] HLA-A contiene 2 pares de cebadores genéricos que amplifican el exón 2 y el exón 3
completos del gen HLA-A.
[PRIMER] HLA-B contiene 2 pares de cebadores genéricos que amplifican el exón 2 y el exón 3
completos del gen HLA-B.
[PRIMER] HLA-C contiene 2 pares de cebadores genéricos que amplifican el exón 2 y el exón 3
completos del gen HLA-B.
[PRIMER] C contiene 1 par de cebadores genérico que amplifica el exón 2 completo del gen HLADRB y un par de cebadores específico DR2 con el que se amplifica un fragmento de 339bp de
longitud del primer intrón. Dentro de este intrón existen secuencias específicas DR15 y DR16 que
en caso del ADN positivo DR2 reaccionan con las sondas específicas D3 y E3 permitiendo de este
modo la tipificación de DR15 y DR16.
[PRIMER] A contiene 1 par de cebadores genérico para determinar los alelos DQB1*05 y *06 que
amplifica el exón 2 completo del gen HLA-DQB.
[PRIMER] B contiene 1 par de cebadores para determinar los alelos DQB1*02, *03 y *04 que
amplifica el exón 2 completo del gen HLA-DQB.
[PRIMER]DQB_DL] amplifica alelos del gen HLA-DQB1
[PRIMER] G amplifica alelos del gen HLA-DRB que codifican una glicina en la posición 86.
[PRIMER] T amplifica alelos del gen HLA-DRB que codifican una valina en la posición 86.
[PRIMER|DRB1_G] amplifica alelos del gen HLA-DRB1 que codifican una glicina en la posición 86.
[PRIMER|DRB1_T] amplifica alelos del gen HLA-DRB1 que codifican una valina en la posición 86.
[PRIMER|DRB1_All] amplifica alelos del gen HLA-DRB1.
Los [PRIMER] A, B, G, T, DRB1G y DRB1T contienen además de los pares de cebadores
específicos un par de cebadores de control con el que se amplifica un fragmento de 422 bp de
longitud de la hormona de crecimiento humana (hGH). Esta amplificación sirve para controlar el
proceso de PCR y se debería de poder determinar en las pruebas en las que no existe ningún
producto de PCR específico.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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2.5
ELPHA
Contenido del Juego de reactivos Biotest ELPHA Reagent 48
1. [DENAT]
Listo para su uso, 0,1 M NaOH
2. [NEUTRAL]
Listo para su uso, 0,1 M HCl
3. [SSC]__20x]
Solución primaria concentrada 10x
(3 M NaCl; 0,3 M Citrato de sodio)
4. [SDS]__1%]
(1% dodecilsulfato sódico)
5. [BUF]__A10x]
(1 M Tris/HCl pH 7,5; 1,5 M NaCl; 0,5% Tween 20)
6. [BLOC__REA]
Sustancia seca
7. [CONJ]__FITC]
IgG de carnero purificada por afinidad, anti-fluoresceína, conjugado con
peroxidasa
8. [SUBS]__TMB]
Listo para su uso
Solución 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina(TMB)
120 ml
120 ml
2 x 500 ml
2 x 500 ml
3 x 500 ml
7 x 500 mg
400 µl
27 x 13 ml
Cuidado: El TMB es una sustancia venenosa. Evite la inhalación de los vapores y el contacto
de la solución con la piel o los ojos. ¡Mantenga la solución alejada de los rayos
solares! Elimine los residuos quemándolos.
2.6
Contenido del Juego de reactivos ELPHA Reagent DL Supp 48
1. [BUF]__A10x]
(1 M Tris/HCl pH 7,5; 1,5 M NaCl; 0,5% Tween 20)
2. [BLOC__REA]
Sustancia seca
3. [SUBS]__TMB], Listo para su uso
Solución 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina(TMB)
4. [INHIB], Listo para su uso
2 M tiocianato amónico
3 x 500 ml
7 x 500 mg
27 x 13 ml
2 x 500 ml
Cuidado: El TMB es una sustancia venenosa. Evite la inhalación de los vapores y el contacto de
la solución con la piel o los ojos. ¡Mantenga la solución alejada de los rayos solares!
Elimine los residuos quemándolos.
Cuidado: El tiocianato amónico es una nocivo para la salud. Debe evitar la inhalación de los
vapores y el contacto con la piel o los ojos. ¡En contacto con ácidos generan gases
muy venenosos!
Puede solicitar a Bio-Rad los pliegos de datos de seguridad de todos los reactivos.
2.7 Almacenamiento y Conservación
La temperatura de almacenamiento está comprendida entre los 2ºC y los 8ºC para todos los reactivos y
componentes de juegos. En la etiqueta exterior figura la fecha de caducidad. Después de abrir el
empaque, las placas microtest tienen que ser utilizadas en un período de 6 semanas.
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ELPHA
2.8 Avisos generales
Reactivos de uso exclusivo en el diagnóstico in vitro. IVD
Cuidado: El ensayo se debe realizar exclusivamente por personal especializado instruido y
autorizado.
Cuidado:
Emplee los reactivos y el material correspondiente a los pacientes respetando las medidas
de seguridad habituales en laboratorios. No pipetee con la boca.
Cuidado:
No emplee ningún reactivo una vez pasada la fecha de caducidad señalada en la etiqueta.
Cuidado:
No emplee ningún reactivo que sospeche que pueda estar contaminado con microbios.
Cuidado:
Las pipetas procedentes de la zona Post-PCR no se deben usar en la zona Pre-PCR.
Cuidado:
El bromuro de etidio que se emplea para colorear el ADN en la electroforesis de gel es
potencialmente cancerígeno. Utilice siempre guantes de protección cuando trabaje con
geles coloreados. Elimine los residuos quemándolos.
Cuidado:
Todos los productos sanguíneos se deben manejar como sustancias potencialmente
infecciosas y, por lo tanto, se deben adoptar las medidas de precaución pertinentes.
Cuidado:
Las microplacas de ensayo usadas se deben manejar como elementos potencialmente
infecciosos y, por lo tanto, se tienen que eliminar según las directrices nacionales vigentes
correspondientes.
Cuidado:
Al valorar las bandas de ADN en el gel no mire directamente hacia la luz ultravioleta.
¡Emplee una protección en la cara que bloquee la radiación UVA!
2.9 Material adicional necesario
2.9.1 PCR
Taq ADN polimerasa ( 5 U/µl, por ejemplo, Perkin Elmer )
Soluciones de nucleótidos (10 mM): dATP, dGTP, dCTP, dTTP o dUTP
Tubos de PCR de 0,2 ml, de pared fina ( por ejemplo, Perkin Elmer )
Termorregulador con tapa térmica (por ejemplo, Perkin Elmer)
Pipetas regulables
Puntas de pipeta con filtro
2.9.2 Electroforesis de gel
Agarosa ( para biología molecular)
Cámara de gel (minigel, por ejemplo, 8 x 10 cm)
1 x Buffer TBE
Solución de bromuro de etidio (1 mg/ml)
Cuidado: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena y venenosa. Lleve guantes
de protección cuando emplee bromuro de etidio (incluso en forma diluída).
En caso de contacto con la piel aclare con abundante agua.
Longitud de ADN estándar (por ejemplo, de 50 a 1000 bp marcadores) (no es
imprescindible)
Agitador magnético con placa térmica o un microondas.
Pipetas regulables
Cámara Polaroid (no es imprescindible)
Buffer de carga de gel
Transiluminador de UV (~ 200 - 300 nm)
Aparato de alimentación
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2.9.3
ELPHA
ELPHA SL
Baño maría (a 46° C)
1 N Ácido sulfúrico
Cuidado: El ácido sulfúrico es un compuesto altamente corrosivo. Evite el contacto
con los ojos, la ropa o la piel. Lleve guantes protectores.
Lavador Elisa (Elisa Washer) (por ejemplo, el lavador Bio-Rad Elisa III, [REF] 840 370)
Dispensador alternativo con peine de lavado
Pipetas combinadas Eppendorf con adaptador de 2,5 ml
Pipetas regulables
Pipeta multicanal
Tubos Eppendorf de 2 ml para HLA-C, DRB LowRes, DRB1 Basic y DQB-Typing
Tubitos de 5-10 ml para HLA-AB y DRB HiRes
-
2.9.4
ELPHA DL
Baño maría (a 46° C)
Lavador Elisa (Elisa Washer) (por ejemplo, el lavador Bio-Rad Elisa III, [REF] 840 370)
Dispensador alternativo con peine de lavado
Pipetas combinadas Eppendorf con adaptador de 2,5 ml
Pipetas regulables
Pipeta multicanal
Tubos Eppendorf de 2 ml
-
2.9.5 Valoración
Lector Elisa (450 nm y 620 nm)
Impresora
Software de Bio-Rad HLA Typing, [REF] 847 070
Sistema operativo Windows 2000
(El programa de software puede ser utilizado con otros sistemas operativos Windows pero
no han realizado tests sobre esto.)
Capacidad de disco duro mínima disponible: 100 MB
Capacidad de memoria RAM mínima: 128 MB
3
Preparación de los ensayos
3.1 Aislamiento de ADN
El ADN genómico se puede extraer de cualquier célula con núcleo. El método más sencillo consiste en
aislar el ADN a partir de suspensiones de células ( sangre EDTA o sangre citrada, Buffy Coat o células
mononucleares de cultivo, células de cultivo).
En principio se pueden emplear todos los procedimientos de aislamiento de ADN (por ejemplo, lisis
secuencial de la membrana, métodos de precipitación por medio de sal o juegos comerciales) que
produzcan ADN en cantidad y calidad suficientes (OD260/OD280 1,7-1,8) para aplicarlo en el
procedimiento de PCR.
3.2 Material de prueba
El ADN se puede extraer a partir de sangre anticoagulada periférica (EDTA o sangre citrada).
Cuidado:
La sangre siempre se tiene que manipular como una sustancia potencialmente
infecciosa y empleando las medidas de precaución correspondientes.
¡No pipetee la sangre con la boca! ¡Lleve guantes de protección! Evite la formación
de aerosoles al pipetear. Las superficies de trabajo se tienen que descontaminar
diariamente y hay que esterilizar los materiales contaminados antes de elimininar los
residuos.
La contaminación del ensayo de ADN con un inhibidor de PCR puede afectar significativamente el éxito
de la amplificación. Por lo tanto, no se puede utilizar sangre con heparina para cualquier procedimiento
de extracción de ADN. Por esta razón, se recomienda emplear por lo general EDTA o sangre citrada. En
caso de que el paciente esté tratado con heparina se debe elegir un procedimiento de extracción de
ADN que también sea apropiado para la sangre con heparina.
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ELPHA
3.3 Cantidad y Calidad de ADN
El ensayo de ADN empleado se debe volver a suspender en agua destilada estéril y regular a una
concentración de aprox. 50-200 ng/µl. El ADN no se debe resuspender en soluciones que contengan
quelantes, como por ejemplo EDTA, en una concentración DNA > 0,5 mM.
La concentración de ADN se determina por medición de la densidad óptica (DO) a 260 nm (A260). El
valor A260 = 1 (= DO 1,0) corresponde aproximadamente a 50 ng/µl de ADN de doble cadena.
Para determinar la contaminación de los ensayos de ADN con proteína se puede realizar una medición
adicional a 280 nm y calcular el cociente A260/A280. Un ADN puro obtiene un cociente de 1,8 o superior.
Si el cociente es inferior a 1,8 indica que el ADN está contaminado con proteínas. El ADN empleado en
el ensayo debe presentar un cociente de 1,7 o superior.
Â
La pureza y concentración del ADN empleado son fundamentales para lograr un resultado
de ensayo óptimo.
Los ensayos de ADN se deben seguir tratando inmediatamente después del aislamiento de ADN o
guardarlos a una temperatura mínima de – 20ºC.
4
Realización
4.1 PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
4.1.1 Medidas de precaución
Debido a la gran eficacia del método PCR resulta necesario controlar las contaminaciones de un modo
seguro y evitarlas lo máximo posible. Las contaminaciones se pueden detectar por la evidencia de más
de 2 alelos en ELPHA. En genomas homocigóticos existe, en cambio, el riesgo de que pasen
inadvertidas tipificaciones erróneas.
Para evitar contaminaciones se recomienda respetar los siguientes requisitos mínimos:
1.
Todos los trabajos previos al procedimiento de PCR (elaboración y conservación de reactivos y
soluciones, aislamiento de ADN y almacenamiento, elaboración de precipitados de PCR) se
deben realizar en una sala separada de los trabajos post-PCR (análisis, almacenamiento y
eliminación de residuos de los productos de PCR).
2.
Los aparatos y materiales de uso procedentes de la zona post-PCR no se deben introducir en la
zona pre-PCR. En el caso de los termorreguladores recomendamos su instalación en la zona
post-PCR.
3.
Para la elaboración de los precipitados de PCR se debe emplear un juego diferente de
micropipetas y puntas de pipeta con filtro.
Para detectar una contaminación precozmente, recomendamos supervisar regularmente todos los
reactivos de PCR mediante precipitados de control sin ADN genómico en la electroforesis de gel. Los
reactivos contaminados se tienen que destruir inmediatamente.
4.1.2 Elaboración de una solución primaria de nucleótidos (dNTPs)
Las soluciones de nucleótidos de 10 mM se diluyen para conseguir una solución primaria lista para su
uso:
400 µl agua destilada se mezclan con 100 µl dATP (10 mM), 100 µl dGTP (10 mM), 100 µl dCTP (10
mM) y 100 µl dTTP (10 mM).
En soluciones de nucleótidos de 100 mM se modifican los volúmenes respectivamente como figura a
continuación: 10 µl dATP, 10 µl dGTP, 10 µl dCTP y 10 µl dTTP se mezclan en 760 µl de agua destilada.
La solución primaria de nucleótidos (1,25 mM) se conserva a una temperatura mínima de – 20ºC.
4.1.3 Elaboración de mezclas maestras de PCR (Mastermix)
De cada preparación de ADN a analizar se precipitan 1 mezcla maestra (HLA-C, DRB LowRes, DRB1
Basic) o 2 mezclas maestras diferentes (HLA-AB, DRB HiRes, DQB-Typing) para las reacciones de
PCR. En la tabla 1 y en la tabla 2 figuran los esquemas de pipeteado de las diferentes mezclas
maestras.
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ELPHA
Tabla 1: Ensayo ELPHA SL
HLA-AB
SL LowRes
Reactivos
dH2O
HLA-C
SL
LowRes
DRB
SL
LowRes
DQB
SL LowRes
Ensayos ADN
93,2 µl
15 µl
24 µl
HLA-A
9 µl
0,8 µl
8 µl
93,2 µl
15 µl
24 µl
HLA-B
9 µl
0,8 µl
8 µl
64,5 µl
10 µl
16 µl
HLA-C
5 µl
0,5 µl
4 µl
60,5 µl
10 µl
16 µl
C
8 µl
0,5 µl
5 µl
32,5 µl
5 µl
8 µl
A
2 µl
0,5 µl
2 µl
32,5 µl
5 µl
8 µl
B
2µl
0,5 µl
2 µl
Volumen total
150 µl
150 µl
100 µl
100 µl
50 µl
50 µl
[PCR__ _BUF]_ABC]
[PCR__BUF]_DR]
dNTPs (1,25 mM)
[PRIMER]
Taq ADN polimerasa
Tabla 2: Ensayo ELPHA DL
HLA-AB
Reactivos
DL LowRes
dH2O
DRB
DL HiRes
DRB1
DL All
62,5 µl
10 µl
16 µl
HLA-A
6 µl
62,5 µl
10 µl
16 µl
HLA-B
6 µl
60,5 µl
10 µl
16 µl
G
8 µl
60,5 µl
10 µl
16 µl
T
8 µl
60,5 µl
10 µl
16 µl
DRB1 All
8 µl
Ensayos ADN
0,5 µl
5 µl
0,5 µl
5 µl
0,5 µl
5 µl
0,5 µl
5 µl
Volumen total
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
[PCR__ _BUF]_ABC]
[PCR__ _BUF]_DR]
dNTPs (1,25 mM)
[PRIMER]
Taq ADN polimerasa
Â
DRB1
DL HiRes
DQB
DL Extend
60,5 µl
60,5 µl
67,5 µl
10 µl
16 µl
DRB1 T
8 µl
10 µl
16 µl
DQB DL
4 µl
0,5 µl
5 µl
10 µl
16 µl
DRB1
G
8 µl
0,5 µl
5 µl
0,5 µl
5 µl
0,5 µl
2 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Para realizar el test ELPHA-DL DRB1 HiRes se recomienda también preparar el PCR para el test
DRB1. En aquellos casos donde sólo un de los DRB1 HiRes primer mixes es positivo, al utilizar el
DRB1 All amplificate (3 tiras, ver DRB1 All protocol, tabla 2) se logrará la misma resolucion que al
utilizar el DRB1 HiRes amplificate.
Sin embargo, si ambos DRB1 HiRes amplificates son positivos, el tipaje DRB1 HiRes utilizando 6
tiras tiene que ser realizado.
Este procedimiento también asegura que todas las muestras que fallaron con la reacción de DRB1
HiRes PCR reaction no sean malinterpretadas como homocigote.
Si se emplean soluciones de ADN de concentración inferior se deben regular las correspondientes
cantidades de ADN y dH2O.
En caso de realizar varias tipificaciones simultáneamente, recomendamos que precipite varias veces la
mezcla maestra para garantizar las mismas condiciones en todos los precipitados. La mezcla maestra
se debe precipitar siempre de nuevo.
El programa de PCR que figura a continuación está adaptado en el termorregulador de la empresa
Perkin Elmer. El porcentaje de calentamiento / enfriamiento en los ensayos asciende a una media de
1ºC/ segundo para un PE 9700 y los datos de precisión de temperatura se proporcionan con una media
de 6 0,25ºC en el margen comprendido entre los 35ºC y los 100ºC. Otros termorreguladores distintos a
los recomendados se deben autorizar por el usuario. Algunos termorreguladores tienen un límite de
volumen de PCR de 100 µl. Volúmenes de PCR superiores se deben dividir para lograr una
amplificación óptima.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
Programe el termorregulador de la manera siguiente:
Temp.
⎡
⎢
⎣→
⎡
⎢
⎣ →
Tiempo
95° C
5 min.
95° C
↓
55° C
↓
72° C
15 seg.
72° C
6 min.
4° C
15 seg.
15 seg.
∞
Ciclos
1x
⎤
⎢
⎢
⎢
⎦
30 x
1x
1x
4.2 Electroforesis de gel
La calidad y la cantidad de los productos PCR se deben controlar en un gel de agarosa al 1%.
4.2.1 Elaboración de reactivos
•
5xTBE (0,445 M Tris-Borato, 0,0125 M EDTA):
54 g
Tris(hidroximetil)-aminometano (Base)
27,5 g Borsäure ( H3BO3 )
4,65 g Na2EDTA
ad 1000 ml con agua destilada, almacenamiento a temperatura ambiente
•
Solución de bromuro de etidio (1 mg/ml)
Disuelva 10 mg bromuro de etidio en 10 ml dH2O y conserve a una temperatura comprendida
entre los 2ºC y los 8ºC evitando la radiación solar.
•
Buffer de carga de gel (0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno de cianol, 25% Ficoll 400)
25 mg Azul de bromofenol
25 mg Xileno de cianol
2,5 g
Ficoll 400
añadir 10 ml de agua destilada, se conserva a una temperatura de 2ºC-8ºC.
1xTBE
1:5 Dilución final del buffer 5xTBE en agua desmineralizada.
•
4.2.2 Realización
Se elabora un gel de agarosa al 1% en el que 1 g de agarosa se calienta hasta que hierva en 100 ml
1xTBE hasta que la solución se vuelva transparente. Se enfría la solución a < 60° C y se mezcla con 4
µl de solución de bromuro de etidio. En el vehículo de gel estanco se introduce la solución de agarosa
en la medida de lo posible sin burbujas y un peine para elaborar bolsas de aprox. 10 μl. Una vez
polimerizado el gel (aprox. 30 minutos a temperatura ambiente) se introduce en la cámara de gel rellena
con 1xTBE. Se retira el peine y las bolsas de gel se tienen que cubrir con un buffer. 5 µl de cada
precipitado de PCR se mezclan con 2 µl de buffer de carga y se pipetean en las bolsas de gel. Para
realizar el control de tamaño de los productos PCR, recomendamos introducir un estándar adecuado de
peso molecular (por ejemplo, marcadores de 50-1000 bp) en la electroforesis. La electroforesis se
efectúa a 8 V/cm (distancia entre electrodos) durante 15-20 minutos.
Las bandas de ADN se pueden observar en un transiluminador UV (llevando una protección en la cara
adecuada contra rayos UVA). Para documentar el ensayo se puede fotografiar el gel con una cámara
Polaroid.
La amplificación de HLA-A proporciona productos de 359 bp y 317 bp y la amplificación de HLA-B
productos de 424 bp y 438 bp.
De la amplificación HLA-C se obtienen productos de 418 bp y 468 bp.
La amplificación DRB LowRes facilita un producto de 277 bp. En la actualidad, en el ADN DR2 positivo
aparece un producto adicional de 339 bp.
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ELPHA
De la amplificación de HiRes DRB se obtiene un producto de 268 bp y una banda de control a una
longitud de 422 bp para la amplificación G y T respectivamente.
Las amplificaciones DQB suministran un producto de 246 bp (Q1) y de 231 bp (Q2) así como una banda
de control cada una de 422 bp.
De la amplificación de DQB DL se obtiene un producto de 270-285 bp.
De la amplificación de DRB1 All se obtiene un producto de 273 bp.
De la amplificación de DRB1 HiRes se obtiene un producto de 270 bp y una banda de control a una
longitud de 422 bp para la amplificación G y T respectivamente.
4.3 ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridisation Assay)
4.3.1 Elaboración de reactivos
Elaboración de reactivos (juego de reactivos ELPHA Reagent 48)
1. [BUF]__ SSC/SDS]
1 Frasco (= 500 ml) [SSC]__20x]
+ 4000 ml Agua destilada
+ 1 Frasco (= 500 ml) [SDS]__1%]
2. [BUF]__A]
1 Frasco (= 500 ml) [BUF]__A10x]
3. [BUF]__B]
(Tampón de dilución de conjugado)
Para elaborar [BUF]__B] se calienta la cantidad requerida de [BUF]__A]
justo antes de que alcance el punto de ebullición y se trasvasan 10 ml
en un frasco de [BLOC__REA] (liofilizado). Agite bien la mezcla para
que [BLOC__REA] se disuelva por completo. 6 ml de [BUF]__B] bastan
para 1 placa. ¡Enfríe el [BUF]__B] a temperatura ambiente antes de
diluir el conjugado!
4. [CONJDIL]__FITC]
Antes de de su primer uso, centrifugue [CONJ]__FITC] a gran número
de revoluciones. [CONJ]__FITC] se diluye en una relación de 1:1000 en
[BUF]__B] (temperatura ambiente), es decir, para una placa se
pipetean 6 μl de [CONJ]__FITC] en 6 ml de [BUF]__B] y se mezclan
bien.
(Aplíquelo siempre fresco)
Â
En caso de que no se vaya a utilizar toda la placa, le
recomendamos que aplique únicamente la cantidad requerida
de [CONJDIL]__FITC] y guarde la cantidad restante de [BUF]__B]
a una temperatura mínima de – 20ºC.
5. [DENAT], [NEUTRAL] y [SUBS]__TMB] están listos para su uso.
Elaboración de los Reactivos (Juego suplementario de Reactivos ELPHA Reagent DL Supp 48)
1. [BUF]__A]
1 Frasco (= 500 ml) [BUF]__A10x]
Para elaborar [BUF]__B] se calienta la cantidad requerida de [BUF]__A]
2. [BUF]__B]
(Tampón de dilución de conjugado) justo antes de que alcance el punto de ebullición y se trasvasan 10 ml
en un frasco de [BLOC__REA] (liofilizado). Agite bien la mezcla para
que [BLOC__REA] se disuelva por completo. 6 ml de [BUF]__B] bastan
para 1 placa. ¡Enfríe el [BUF]__B] a temperatura ambiente antes de
diluir el conjugado!
3. [CONJDIL]_D]
(Aplíquelo siempre fresco)
Antes de de su primer uso, centrifugue [CONJ]__D] a gran número de
revoluciones. [CONJ]__D] se diluye en una relación de 1:1000 en
[BUF]__B] (temperatura ambiente), es decir, para una placa se
pipetean 6 μl de [CONJ]__D] en 6 ml de [BUF]__B] y se mezclan bien.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
189779/08 – 06/2010
-17-
ELPHA
Â
En caso de que no se vaya a utilizar toda la placa, le
recomendamos que aplique únicamente la cantidad requerida
de [CONJDIL|__D] y guarde la cantidad restante de [BUF|__B] a
una temperatura mínima de – 20ºC.
4. POD inhibidor [INHIB] y solución substrado [SUBS|__TMB] están listos para su uso.
4.3.2 Realización de ensayo de una tipificación ELPHA SL
Previamente al inicio del ensayo deben estar todos los reactivos a temperatura ambiente.
(1)
En la Tabla 2 figura el número de tiras necesario para cada tipificación.
(2)
Vierta el producto PCR x µl en un tubo de reacción y añadir x µl [DENAT] (lista para su uso).
Los productos de PCR de doble cadena se transfieren a cadenas simples.
(3)
Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
En caso de que no se vaya a continuar trabajando, recomendamos que coloque los ensayos en hielo para evitar la
renaturalización de la doble cadena.
(4)
Añada x µl [NEUTRAL] (lista para su uso).
(5)
Añada x µl de agua destilada y mezcle.
El volumen necesario (x µl) para cada tipificación figura en la tabla 2.
Â
(6)
Pipetee 50 µl del producto PCR diluido (pipeta combinada Eppendorf con 2,5 ml de adaptador) en
las cavidades correspondientes a cada ensayo de [MTP]. Para la disposición de las tiras véase la
tabla 2.
Tabla 3:
HLA-AB
SL LowRes
HLA-C
SL LowRes
12 Tiras
HLA-A en
tiras
A1 – A5;
4 Tiras
Productos PCR
diluídos pipeteados
en:
C1 – C4
Producto PCR
HLA-B en
tiras
B1 – B7
135 µl
80 µl
90 µl
90 µl
40 µl
750 µl
480 µl
400 µl
400 µl
200 µl
Tiras por ensayo:
[DENAT]
DRB
SL LowRes
DRB1
SL LowRes
DQBSL LowRes
3 Tiras
3 Tiras
1–3
D1 – D3
3 Tiras
„A“ en tiras 1 + 2
(Pos. A1 – E2);
„B“ en tiras 2 + 3
(Pos. G2 – H3)
[NEUTRAL]
750 µl
480 µl
400 µl
400 µl
200 µl
Agua destilada
1500 µl
960 µl
800 µl
800 µl
400 µl
(7)
Cierre las tiras con lámina autoadhesiva (incluidas en el juego) e incúbelas durante 45 minutos al
baño maría a 46 ± 1° C.
Las placas se tienen que incubar exactamente en agua temperada. Dado que la temperatura para la hibridización y el
posterior paso de lavado de precisión (stringency) se tiene que mantener exacta, consideramos imprescindible que controle
la temperatura con un termómetro calibrado colocado en el agua.
Â Durante el periodo de incubación, suelte BLOC REA (=[BUF]__B], preparación véase capítulo
4.3.1). El [BUF]__B] que no se necesite, consérvelo a –20°C o incluso a una temperatura más
fría.
(8)
Extraiga MTP del baño maría y retire la lámina.
Â
Continúe con el paso de lavado inmediatamente. Un descenso prolongado de la
temperatura puede originar una hibridización inespecífica y / o un fondo aumentado.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
Descarte la solución de hibridización y lave [MTP] dos veces con 200 µl [BUF]__SSC/SDS]
(preparación véase capítulo 4.3.1) por cada cavidad. Después de cada paso de lavado retire los
restos de líquido sacudiéndolos ligeramente en un un papel absorbente. Una vez efectuado el
segundo paso de lavado introduzca 200 µl de [BUF]__SSC/SDS] en cada cavidad.
En este paso de lavado se retiran las sondas no ligadas.
Â
(9)
De manera alternativa se puede proceder al lavado con el Elisa Washer III. Al aplicar esta
lavador (washer) se puede introducir el [MTP] directamente en el lavador (washer) una vez
incubado al baño maría e iniciar el programa „ELPHA_SSC“.
Pegue el [MTP] a una nueva lámina e incúbelo durante 15 minutos a 46 ± 1° C al baño maría.
En este paso de lavado de precisión (stringency) no se liberan las suficientes sondas homólogas del ADN. Por esta razón,
resulta decisivo mantener la temperatura exacta. Por lo tanto, contrólela de nuevo.
(10)
(11)
Una vez transcurrido el periodo de incubación, elimine el [BUF]__SSC/SDS] y lave tres veces el
[MTP] con 200 µl [BUF]__A] (preparación véase capítulo 4.3.1) por cavidad siguiendo el
procedimiento descrito anteriormente.
Â
El enfriamiento de las placas puede provocar una hibridización inespecífica (reacciones
positivas falsas) y/o un fondo aumentado. Por lo tanto, si va a trabajar con varias placas
realice los pocedimientos de modo escalonado.
Â
incubado al baño maría e iniciar el programa „ELPHA_A“.
Añada 50 µl por cavidad del [CONJDIL]__FITC] preparado fresco (preparación véase capítulo 4.3.1)
con una pipeta multicanal e incúbelos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
En las sondas ligadas, marcadas con FITC se conservan los anticuerpos FITC copulados con POD.
(12)
Descarte el [CONJDIL]__FITC] y lave tres veces el [MTP] con 200 µl [BUF]__A] por cavidad.
Â
(13)
De manera alternativa se puede proceder al lavado con el Elisa Washer III. Se inicia
directamente con el programa „ELPHA_A“.
Añada 50 µl de [SUBS]__TMB] (lista para su uso)por cavidad con una pipeta multicanal e incúbelos
durante 15 minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro.
La enzima (POD) copulada con los anticuerpos transforma el sustrato (TMB): cambia de incoloro a azul.
Â
Â
(14)
El [SUBS]__TMB] se debe calentar a temperatura ambiente. Los restos de [SUBS]__TMB] no
los devuelva al frasco. Evite pipetear con frecuencia del frasco (riesgo de contaminación).
Atención: Mantenga el periodo y la temperatura de incubación exactos después de añadir
el substrato.
Añada 50 µl por cavidad de 1 N ácido sulfúrico con una pipeta multicanal.
La reacción se interrumpe y el color cambia de azul a amarillo.
(15)
Los resultados del ensayo se valoran fotométricamente en el lector ELISA midiendo la absorción
en 450 nm (con un filtro de referencia en 620 nm)
Todos los valores DO superiores a 0,200 se deben considerar como resultados positivos. La
interpretación de los resultados se puede llevar a cabo utilizando el software HLA Typing ([REF] 847
070) o realizando una comparación del modelo de reacción con los esquemas de valoración. Mediante
el internet se puede desplegar el software de valoración de carga dependiente. Algunas sondas indican
un cut-off que se desvía de 0,200. Este cut-off se debe deducir a partir de la hoja de información de
carga y se despliega automáticamente al aplicar el software de tipificación HLA mediante el internet
(www.bio-rad.com).
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
Â
En casos muy raros donde todos los alelos (incl. alelos de pseudogenes) pertenecen a
alguno de los grupos de amplificación (GGT o GTG) , la amplificación con reacciones no
positivas puede dar resultados negativos tambien con el control positivo . En estos casos
la interpretación del control positivo debe ser corregida manualmente en el "software"
como positivo para obtener un resultado sin perder la posición "
Los componentes de ensayo están ajustados de tal modo que todos los valores DO
superiores a 0,200 se deben valorar por regla general como resultados positivos. No
obstante, dado que la intensidad de señal dependede una serie de parámetros que no
están influenciados por los reactivos incluidos en el juego (por ejemplo, aislamiento de
ADN, realización de PCR), no se debe descartar el hecho de que se originen variaciones
en la intensidad. En caso de existir un fondo lo suficientemente bajo (por ejemplo, DO <
0,090), las señales positivas de amplificados más débiles (por ejemplo, DO ≥ 0,130) se
pueden reconocer incluso más nítidamente que otras señales. Para las evaluaciones
automáticas se puede variar el valor de corte en el software para cada sonda ó se puede
utilizar la función valor de corte automática (descrita en el manual del sofware para tipaje
HLA).
Â
4.3.3 Realización de ensayo de una tipificación ELPHA DL
Previamente al inicio del ensayo deben estar todos los reactivos a temperatura ambiente.
(3)
En la Tabla 2 figura el número de tiras necesario para cada tipificación.
(4)
Vierta el producto PCR x µl en un tubo de reacción y añadir x µl [DENAT] (lista para su uso).
Los productos de PCR de doble cadena se transfieren a cadenas simples.
(3)
Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
En caso de que no se vaya a continuar trabajando, recomendamos que coloque los ensayos en hielo para evitar la
renaturalización de la doble cadena.
(4)
Añada x µl [NEUTRAL] (lista para su uso).
(5)
Añada x µl de agua destilada y mezcle.
Â
(6)
El volumen necesario (x µl) para cada tipificación figura en la tabla 2.
Pipetee 50 µl del producto PCR diluido (pipeta combinada Eppendorf con 2,5 ml de adaptador) en
las cavidades correspondientes a cada ensayo de [MTP]. Para la disposición de las tiras véase la
tabla 2.
Tabla 4:
HLA-AB
DL LowRes
Tiras por ensayo
Productos PCR
diluídos pipeteados
en:
Producto PCR
[DENAT]
DRB
DL HiRes
6 Tiras
2x3 Tiras
HLA-A en las
G en el primer
cavidades
juego de tiras
A1 – D3
1 – 3;
(rojo);
DRB1
DL All
3 strips
strip 1-3
DRB1
DL HiRes
2x3 strips
Gen el primer
juego de tiras
1 – 3;
DQB
DL Extend
2 strips
strip 1-2
HLA-B en las
cavidades
E3 – H6
(azul)
90 µl
T en el segundo
juego de tiras
1–3
90 µl
90 µl
90 µl
90 µl
400 µl
400 µl
400 µl
400 µl
250 µl
T en el segundo
juego de tiras
1–3
[NEUTRAL]
400 µl
400 µl
400 µl
400 µl
250 µl
Agua destilada
900 µl
800 µl
800 µl
800 µl
400 µl
(7)
Cierre las tiras con lámina autoadhesiva (incluidas en el juego) e incúbelas durante 45 minutos al
baño maría a 46 ± 1° C.
Las placas se tienen que incubar exactamente en agua temperada. Dado que la temperatura para la hibridización y el
posterior paso de lavado de precisión (stringency) se tiene que mantener exacta, consideramos imprescindible que controle
la temperatura con un termómetro calibrado colocado en el agua.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
Â
Durante el periodo de incubación, suelte BLOC REA (=[BUF]__B], preparación véase capítulo
4.3.1). El [BUF]__B] que no se necesite, consérvelo a –20°C o incluso a una temperatura más fría.
(8)
Extraiga MTP del baño maría y retire la lámina.
Â
Continúe con el paso de lavado inmediatamente. Un descenso prolongado de la
temperatura puede originar una hibridización inespecífica y / o un fondo aumentado.
Descarte la solución de hibridización y lave [MTP] dos veces con 200 µl [BUF]__SSC/SDS]
(preparación véase capítulo 4.3.1) por cada cavidad. Después de cada paso de lavado retire los
restos de líquido sacudiéndolos ligeramente en un un papel absorbente. Una vez efectuado el
segundo paso de lavado introduzca 200 µl de [BUF]__SSC/SDS] en cada cavidad.
En este paso de lavado se retiran las sondas no ligadas.
Â
(9)
incubado al baño maría e iniciar el programa „ELPHA_SSC“.
Pegue el [MTP] a una nueva lámina e incúbelo durante 15 minutos a 46 ± 1° C al baño maría.
En este paso de lavado de precisión (stringency) no se liberan las suficientes sondas homólogas del ADN. Por esta razón,
resulta decisivo mantener la temperatura exacta. Por lo tanto, contrólela de nuevo.
(10)
Una vez transcurrido el periodo de incubación, elimine el [BUF]__SSC/SDS] y lave tres veces el
[MTP] con 200 µl [BUF]__A] (preparación véase capítulo 4.3.1) por cavidad siguiendo el
procedimiento descrito anteriormente.
Â
Â
(11)
El enfriamiento de las placas puede provocar una hibridización inespecífica (reacciones
positivas falsas) y/o un fondo aumentado. Por lo tanto, si va a trabajar con varias placas
realice los pocedimientos de modo escalonado.
incubado al baño maría e iniciar el programa „ELPHA_A“.
Añada 50 µl por cavidad del solución diluida del conjugado (D) preparado fresco con una pipeta
multicanal e incúbelos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
En las sondas ligadas, marcadas con digoxigenina se conservan los anticuerpos DIG copulados con POD.
(12)
Descarte el solución diluida del conjugado (D) y lave tres veces el [MTP] con 200 µl [BUF]__A] por
cavidad.
Â
(13)
Añada 50 µl de [SUBS]__TMB] (lista para su uso) por cavidad con una pipeta multicanal e incúbelos
durante 15 minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro.
Â
Â
El [SUBS]__TMB] se debe calentar a temperatura ambiente. Los restos de [SUBS]__TMB] no
los devuelva al frasco. Evite pipetear con frecuencia del frasco (riesgo de contaminación).
Atención: Mantenga el periodo y la temperatura de incubación exactos después de añadir
el substrato.
(14)
Transcurridos exactamente 15 minutos de incubación del sustrato se realiza la primera medición
de
absorción fotométrica en el lector de ELISA a 370 nm (con un filtro de referencia de a 492 nm).
(15)
Añada 50 μl [INHIB] por cavidad (lista para su uso) con una pipeta multicanal e incúbelos durante
4-6 minutos a temperatura ambiente.
La enzima (POD) acoplada al anticuerpo anti-DIG se inhibe.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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(16)
ELPHA
Lave la placa tres veces con 200 µl [BUF]__A] por cavidad.
Â
(17)
Añada 50 µl por cavidad del solución diluida del conjugado (FITC) preparado fresco (preparación
véase capítulo 4.3.1) con una pipeta multicanal e incúbelos durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
En las sondas ligadas, marcadas con FITC se conservan los anticuerpos FITC copulados con POD.
(18)
por
Descarte el solución diluida del conjugado (FITC) y lave tres veces el [MTP] con 200 µl [BUF]__A]
cavidad.
Â
(19)
Añada 50 µl de [SUBS]__TMB] por cavidad con una pipeta multicanal e incúbelos durante 15
minutos a temperatura ambiente en un lugar oscuro.
(20)
Transcurridos exactamente 15 minutos de incubación del sustrato se realiza la secondo medición
de
absorción fotométrica en el lector de ELISA a 370 nm (con un filtro de referencia de a 492 nm).
Todos los valores DO superiores a 0,160/0,140 se deben considerar como resultados positivos. La
interpretación de los resultados se puede llevar a cabo utilizando el software HLA Typing ([REF] 847
070) o realizando una comparación del modelo de reacción con los esquemas de valoración. Mediante
el internet se puede desplegar el software de valoración de carga dependiente. Algunas sondas indican
un cut-off que se desvía de 0,160/0,140. Este cut-off se debe deducir a partir de la hoja de información
de carga y se despliega automáticamente al aplicar el software de tipificación HLA mediante el internet
(www.biorad.com).
Â En casos muy raros donde todos los alelos (incl. alelos de pseudogenes) pertenecen a
alguno de los grupos de amplificación (GGT o GTG) , la amplificación con reacciones no
positivas puede dar resultados negativos tambien con el control positivo . En estos casos
la interpretación del control positivo debe ser corregida manualmente en el "software"
como positivo para obtener un resultado sin perder la posición "
Â Los componentes de ensayo están ajustados de tal modo que todos los valores DO
superiores a 0,160/0,140 se deben valorar por regla general como resultados positivos. No
obstante, dado que la intensidad de señal dependede una serie de parámetros que no
están influenciados por los reactivos incluidos en el juego (por ejemplo, aislamiento de
ADN, realización de PCR), no se debe descartar el hecho de que se originen variaciones
en la intensidad. En caso de existir un fondo lo suficientemente bajo (por ejemplo, DO <
0,090), las señales positivas de amplificados más débiles (por ejemplo, DO ≥ 0,130) se
pueden reconocer incluso más nítidamente que otras señales. Para las evaluaciones
automáticas se puede variar el valor de corte en el software para cada sonda ó se puede
utilizar la función valor de corte automática (descrita en el manual del sofware para tipaje
HLA).
4.4
1.
2.
3.
4.
Indicaciones de realización
La intensidad de las reacciones positivas depende directamente de la calidad (contenido) del
producto PCR. En caso de que se produzca una amplificación muy débil se debe repetir el
ensayo.
El ADN que se haya almacenado durante más de 1 semana a una temperatura comprendida
entre los 2ºC y los 8ºC puede estar degradada y, por lo tanto, no se puede amplificar lo suficiente.
La prolongación del periodo de incubación del sustrato (>15 minutos) conlleva un foco
aumentado (véase el apartado 5. Búsqueda de errores).
La exactitud de los resultados sólo se puede garantizar si se respetan estrictamente las
instrucciones de uso.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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ELPHA
4.5 Controles de calidad
En cada ensayo hay una sonda de control positiva. El control positivo reacciona con una secuencia
existente en todos los alelos del locus correspondiente. La posición exacta figura en el modelo de
reacción adjunto. El control positivo tiene que reaccionar positivamente, de lo contrario, se deberá repetir
el ensayo.
Como control de calidad de cada carga, se efectúan tipificaciones con células heterocigóticas conocidas
que garantizan que cada oligosonda en el juego reacciona correctamente.
Ejemplo: Control de calidad de un juego de ELPHA DRB SL LowRes.
DRB3
DRB1
0101
1501
04
0701
04
03011
0401
0701
1102
1001
1201
1401
09012
1601/02
0801
1302
DRB4
DRB5
02
01
02
02
01
01
01
01
02
01
01
03
4.6 Caracterización específica
El juego ELPHA DRB SL LowRes se ha comparado con otros juegos serológicos comerciales. Se
realizaron 406 ensayos (receptores de transplantes al azar y donantes potenciales) de tres regiones
separadas geográficamente. Estos ensayos han dado como resultado un 90% de coincidencias entre
los resultados obtenidos con ELPHA DRB SL LowRes y los ensayos serológicos utilizados.
N
%
Coincidencias
365
90%
No coincidencias
41
10%
Total
406
%
100
N = Número de ensayos
Con el objetivo de seguir controlando las no-coincidencias se realizaron ensayos adicionales (métodos
estandarizados de ADN en laboratorio). Una vez efectuados, se obtuvo un 100% de coincidencias
(406/406).
Se alcanzó un 100% de coincidencias (406/406) entre los resultados interpretados visualmente y los
resultados obtenidos por medición fotométrica.
N
Coincidencias
406
No coincidencias
0
Total
406
%
100
0
100
N = Nº de ensayos
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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-23-
5
ELPHA
Búsqueda de errores
Problema
Causa
Solución
No se observa ninguna banda.
Falta bromuro de etidio en el gel.
No se observan las bandas en
el estándar MW. No se observa
el producto PCR.
Se observa el estándar MW
pero no el producto PCR.
No se ha aplicado o se ha aplicado muy
poco estándar MW.
Tiña el gel en baño cromático (50 µl de la
solución primaria de bromuro de etidio / 100
ml buffer 1xTBE).
Revise la concentración del ADN estándar
MW.
Falta componentes en el precipitado de
PCR.
Repita el precipitado de PCR y procure
añadir todos los componentes.
1. Electroforesis de gel
Bandas de intensidad débil del
producto de PCR.
Los nucleótidos son demasiado viejos o no Repita el precipitado de PCR con una nueva
solución primaria de nucleótidos.
se han almacenado a una temperatura
mínima de –20ºC.
Programa de termorregulador
Verifique el programa de PCR en el
termorregulador.
Termorreguladores diferentes a los
recomendados pueden presentar unos
porcentajes de calentamiento / enfriamiento
más rápidos (Porcentaje de calentamiento
≥1,5°/segundos). Por lo tanto, se recomienda
prolongar los periodos de 15 a 30 segundos..
ADN aislado a partir de sangre con
Verifique si se debe utilizar sangre con
heparina.
heparina para el protocolo de extracción de
ADN. Emplee eventualmente otros métodos
de extracción de ADN.
Mala calidad del ADN.
Aplique el test ELPHA.
Amplificación insuficiente.
En caso de que el test ELPHA indique
también resultados de intensidad débil véase
abajo el apartado ELPHA.
Se ha aplicado una cantidad incorrecta de Un método sencillo de aplicar para controlar
ADN genómico.
la cantidad de ADN en la preparación es el
siguiente: Se debería de poder comprobar de
manera nítida 1µl de ADN en un gel.
El ADN no debe tener inhibidores como, por
ejemplo, hemoglobina, sales, proteínas,
etanol o heparina.
Aplique eventualmente otros métodos de
extracción de ADN.
3. ELPHA
No se detecta ninguna señal.
No se ha aplicado ningún producto PCR.
Sólo es positivo el control
positivo.
Se ha aplicado el producto PCR erróneo.
Controle el producto PCR en el gel de
agarosa.
El valor de pH del producto PCR diluído no
es neutral: Repita el ensayo y procure añadir
la solución 1 y 2.
Controle la temperatura del baño maría
mediante un termómetro externo.
Compruebe la actividad de peroxidasa en
una mezcla de 1 μl [CONJDIL]__FITC] y 50 μl
[SUBS]__TMB]. El sustrato incoloro tiene que
cambiar a azul en un breve periodo de
tiempo.
Siempre y cuando no se haya añadido ácido
sulfúrico, se puede lavar el [MTP] con
[BUF]__A] (200µl/cavidad). Aplique
[CONJDIL]__FITC] y siga procediendo como de
costumbre.
Repetir el ensayo.
Problema
Causa
Solución
Error al desnaturalizar y neutralizar.
Error al hibridizar y / o en las condiciones
de lavado de precisión (stringency).
Error en el desarrollo del color.
Se ha olvidado añadir [CONJ]__FITC] en el
buffer B.
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
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-24-
ELPHA
Señales débiles.
Amplificación insuficiente.
Algunas señales son débiles.
La temperatura del baño maría es
demasiado alta.
Transmisión por error al pipetear.
Contaminación.
La temperatura del baño maría es
demasiado baja.
Malas condiciones de lavado.
Señales positivas falsas.
Los valores de fondo son por
término medio superiores a
0,100.
Toda la placa es positiva.
6
Compruebe los parámetros de amplificación
y la calidad del ADN. Para también poder
realizar interpretaciones de señales bajas,
se puede reducir el valor de corte a 0,150,
cuando la señal de fondo es ≤ 0,070 se
puede utilizar el valor de corte automático.
Compruebe la temperatura del baño maría
mediante un termómetro externo.
Repita el ensayo.
Compruebe la temperatura del baño maría.
Procure que la placa esté seca con [BUF]__A]
después del lavado. Compruebe la
regulación del lavador.
Modifique las condiciones de incubación del
sustrato.
El periodo de incubación del sustrato es
demasiado prolongado, más caliente que
la temperatura ambiente o no se realiza en
un lugar a oscuras.
[CONJDIL]__FITC] no se ha eliminado con
Verifique el paso de lavado [BUF]__A].
el lavado.
Siempre y cuando no se haya añadido ácido
sulfúrico, vuelva a lavar 3 veces con [BUF]__A]
y continue el procedimiento añadiendo el
sustrato.
Bibliografía
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Transplantation 64: 1505-1513.
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Bulletin 5: 539-551.
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reaction. Meth. Enzym. 155: 335-350.
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., and Erlich, H.A.
1988. Primer directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science 239:
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Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (eds.) 1990. PCR protocols - A guide to methods
and applications. Academic Press. ISBN 0-12-372181-4.
Erlich, H.A. and Arnheim, N. 1992. Genetic analysis using the polymerase chain reaction. Annu. Rev.
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Immunol. 30: 190-201.
Bugawan, T.L. and Erlich, H.A. 1991. Rapid typing of HLA-DQB1 DNA polymorphisms using
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Gebuhrer, L., Javaux, F. Cheneau, M.L., and Bignon, J.D. 1997. Evaluation of the Biotest ELPHA for
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Nomenclature and sequence information
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Hansen, J.A., Mach, B.; Mayr, W.R., Parham, P., Petersdorf, E.W., Sasazuki, T., Schreuder, G.M.Th.,
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Tissue Antigens 57: 236-283, 2001.
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Nomenclature:
http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/nomenc.html
Exon sequences:
http://www.anthonynolan.com/HIG/data.html
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
189779/08 – 06/2010

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