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Análisis y anotación de genomas
Fernán Agüero
23 September 2010
Fernán Agüero
Historia
• Primer proyecto de secuenciación de un genoma: Escherichia coli (US +
Japón). Comenzó en 1992 y terminó en 1997. 4.6 MB
• Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae (1995). 1.83 MB
• Primer genoma (archaea): Metanococcus jannaschii (1996). 1.6 MB
• Primer genoma (eukarya): Caenorhabditis elegans (1998). 97 MB
– http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_elegans/Science98
– Hoy
– ~ 140 Eukaryotic genomes
– ~ 1100 Bacterial genomes
– ~ 100 Archaeal genomes
23 September 2010
Fernán Agüero
Qué es un genoma?
• Una colección de
– genes
• que codifican productos proteicos
• que codifican RNAs
– pseudogenes
– regiones no codificantes
• regulatorias (expresión)
• estructurales
– attachment a matriz nuclear
– mitosis / meiosis
– elementos repetitivos
23 September 2010
Fernán Agüero
Qué es anotar?
• Agregar información, de la manera más
confiable y actualizada que se pueda para
describir una secuencia
• Información asociada a coordenadas
genómicas (comienzo..fin), a distintos
niveles
• Interpretar la información cruda de
secuencia en un marco biológico
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación genómica
• Dos niveles de anotación
– Estructural: encontrar genes y otros sitios con
relevancia biológica. Armar un modelo del genoma:
cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición
en el genoma
– Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas
(y experimentos). El objetivo es atribuir información
biológica relevante a los objetos.
23 September 2010
Fernán Agüero
Más niveles de anotación
• Organismo: fenotipo: morfología, fisiología,
comportamiento, respuestas ambientales
• Celula: vías metabólicas, cascadas de
señalización, localización subcelular.
• Molecula: sitios de binding, actividad
catalítica, estructura tridimensional
• Dominio
• Motif
• Residuo
23 September 2010
Fernán Agüero
De donde proviene la anotación?
• Fuentes utilizadas en la anotación:
– publicaciones que reportan nuevas secuencias
– reviews que actualizan periódicamente la anotación
de familias o grupos de proteínas
– expertos externos
– análisis de secuencia
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación genómica
ab initio gene
prediction
Genomic DNA
transcription
Unprocessed RNA
RNA processing
Mature mRNA
Gm3
AAAAAAA
translation
Comparative gene
prediction
Nascent polypeptide
folding
Active enzyme
Functional
identification
Function
23 September 2010
Reactant A
Product B
Fernán Agüero
Annotation & functional genomics
La anotación del genoma es esencial en el desarrollo de
estrategias funcionales (functional genomics)
proteome based functional genomics
RNAi phenotypes
Gene
Knockout
Expression Microarray
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación: busqueda de genes
• Buscar genes en el genoma
– RNA
• ribosomal RNAs
• tRNAs
– protein coding
• ab initio gene prediction
• similarity
BLASTN
tRNAscan
ORFs, codon usage, frecuencia de
hexámeros, modelos, etc.)
BLASTX, otros
• Buscar regiones no codificantes
– regulatorias
• ab initio
• similarity
– repetitivas
• similarity
• ab initio
• En todos los casos
23 September 2010
Gibbs sampling
patterns, profiles
literatura!
Fernán Agüero
Integrar resultados
BLASTX
BLASTN
Secuencia
genoma
DB
RepeatMasker
tRNASCan
flatfiles
gene prediction
Visualización
23 September 2010
Fernán Agüero
Genome annotation: C. elegans
• C. elegans, 1997
• Se utilizaban métodos
basados en un único
algoritmo
• Tendencia actual:
• Integrar predicciones
de distintos algoritmos
23 September 2010
Fernán Agüero
Genome annotation: hoy
23 September 2010
Fernán Agüero
Genome annotation
• Automated genome annotation
•
•
Pipelines
•
Usan scripts (small programs)
•
They run in Unix
Store results in databases
•
•
Or in flat files
Graphical workflows
•
Taverna, http://taverna.sf.net
•
Escrito en Java
•
Corre en PCs/Macs
•
No es necesario instalar bases
de datos o software adicional
•
Utiliza estos recursos en forma
remota
23 September 2010
Taverna: a tool for building and running workflows of services.
Nucleic Acids Research 2006 34:W729
http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkl320
Fernán Agüero
Workflows / Taverna
23 September 2010
Fernán Agüero
Resumir resultados de análisis
• Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits,
alineamientos) es demasiado
• Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizan
sobre DNA o proteínas para anotar un genoma pueden
resumirse en:
– secuencia
– cromosoma1
start end
1723
3456
• Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger)
Secuencia metodo programa
Contig1 similarity blastx
Contig1 cds
glimmer 85
Contig1 similarity blastn
23 September 2010
start end frame score extra
100 1000 +1 132 gi|12345|AF34093 casein kinase ...
1201 +1 1321 ORF0001; overlap with ORF0002
80 1300 . 136 gi|54321|AF09990 complete genome
Fernán Agüero
Anotación: herramientas
• Artemis
– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
– Permite visualizar
• secuencia, con sus traducciones virtuales (6)
• tracks de anotación (entries)
• plots (built-ins y creados por el usuario)
– Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank
– Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF,
MSPcrunch, BLAST
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: main window
Sequence view
Sequence view
Feature list
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: plots
%GC plot
AA properties
plot para un
CDS
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: display de análisis
Frameplot
BLASTX
BLASTN
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis:
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: zoom
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: spliced genes
23 September 2010
Fernán Agüero
Artemis: comparar análisis
23 September 2010
Fernán Agüero
Otras estrategias
• Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o
para pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.)
• En genomas más grandes, la tendencia es a
distribuir la anotación
• Los tracks de anotación son generados en distintos
centros
• Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma
humano, ratón).
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación automática: TrEMBL
• La anotación de TrEMBL (translated
EMBL) se hace por métodos automáticos.
– Requerimientos para anotar automáticamente
• Una base de datos de referencia bien anotada (ej.
Swissprot)
• Una base de datos que sea altamente confiable (en el
sentido diagnóstico) en la asignación de proteínas a
grupos o familias (ej CDD, InterPro)
• Una serie de reglas de anotación
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación automática
• El problema
– SwissProt vs TrEMBL (2003)
• Human, chromosome by chromosome
100
• http://www.ebi.ac.uk/proteome/HUMAN/
90
70
% in Swiss-Prot
60
50
49%
40
30
20
10
0
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
23 September 2010
Total number of entries (SP+Tr)
80
1: 1'640
2: 1'044
3: 879
4: 630
5: 745
6: 969
7: 752
8: 549
9: 617
10: 594
11: 976
12: 852
13: 275
14: 508
15: 469
16: 706
17: 538
18: 229
19: 1'121
20: 554
21: 179
22: 405
X: 645
Y:
61
Chromosome
Fernán Agüero
Anotación automática
• Exceso de información
– ~ 136,000 secuencias en SwissProt
– Pero mas de 1 millón esperando en TrEMBL para ser
incorporadas, luego de pasar por curación manual
– El número de secuencias en TrEMBL crece
exponencialmente
• Soluciones
– Aumento en la calidad de las anotaciones
automáticas
• HAMAP
– Mejor integración de datos funcionales
– Explorar automatica de la literatura
23 September 2010
Fernán Agüero
Transferencia directa de anotación
• Realizar una búsqueda
en la base de datos de
referencia y transferir
la anotación
XDB
Target
23 September 2010
• Ejemplo: FASTA contra
una base de datos de
secuencias y
transferencia de la línea
DE del mejor hit
Fernán Agüero
Anotación a partir de múltiples fuentes
• Generalmente se
usa más de una
base de datos
externa
XDB
• Hay que combinar
los resultados
Target
23 September 2010
Fernán Agüero
Conflictos
• Contradicción
• Inconsistencia
• Sinónimos
• Redundancia
23 September 2010
Fernán Agüero
Traducción de anotaciones
• Es necesario utilizar un
traductor para mapear el
lenguaje utilizado en la base
de datos externa (XDB) al
lenguaje utilizado en la base
de datos target que queremos
anotar
XDB
Target
23 September 2010
Fernán Agüero
Traducciones: algunos ejemplos
ENZYME TrEMBL
CA L-ALANINE=D-ALANINE
CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE=
CC
D-ALANINE.
PROSITE TrEMBL
/SITE=3,heme_iron
FT METAL
IRON
Pfam TrEMBL
FT DOMAIN
FT ZN_FING
23 September 2010
zf_C3HC4
C3HC4-TYPE
Fernán Agüero
Requerimientos de un sistema de anotación automática
•
•
•
•
•
•
Corrección
Escalable
Actualizable
Poco redundante
Completo
Vocabulario controlado
23 September 2010
Fernán Agüero
Cómo funciona?
• Una proteína en TrEMBL es reconocida
como un miembro de cierto grupo o
familia de proteínas
• Este grupo de proteínas en Swissprot
comparten entre sí partes de la anotación
• La anotación común es transferida
automáticamente a la proteína en TrEMBL
y marcada como „annotated by similarity‟
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación: evidencias
• Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la
evidencia en la que se basa la anotación
• Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL:
– EMBL: la información fue copiada del original (EMBL/GenBank/DDBJ)
– TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o para adecuarse a
la sintaxis propia de Swissprot
– Curator: juicio del curador
– Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del curador
– Experimental: evidencia experimental de acuerdo a una referencia, que
usualmente es un paper.
– Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia, usualmente con
poca o ninguna evidencia experimental
– Rulebase: información derivada del uso de una regla de anotación
automática
– SignalP: programa de predicción
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación: manual vs automática
• La anotación de un genoma ocurre en
etapas
– anotación automática
• correr todos los análisis sobre el genoma
• generar un primer borrador con todos los datos
organizados. Por ejemplo en páginas web o integrando
todos los datos en un display unificado (Artemis)
– anotación manual: cura de los datos
• una persona (curador) revisa la anotación, gen por
gen, verificando la anotación automática, agregando
anotaciones manuales, corriendo eventualmente algún
programa particular
23 September 2010
Fernán Agüero
Qué herramientas se usan?
• Oakridge Genome Annotation Channel
– http://compbio.ornl.gov/channel
• ENSEMBL
– http://ensembl.ebi.ac.uk
• Artemis
– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
• GeneQuiz
– http://www.sander.ebi.ac.uk/genequiz
• Genome browsers: varios
– cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo
(FlyBase, Drosophila), AceDB (C. elegans),
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación: fuentes de error
• Transferencia transitiva de anotaciones
– gen1 mal anotado como „casein kinase‟ presente en
los bancos de datos
– gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado
como casein kinase
• Solución:
– usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot
– revisar la anotación de más de un hit
– verificar que las anotaciones de todos los hits
concuerden
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación confiable: proyecto HAMAP
• High-quality Automated Microbial Annotation of
Proteomes
– Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European
Bioinformatics Institute)
– CNRS Lyon
– INRIA Grenoble
– INRA Toulouse
– CNRS Marseille
– Pasteur Institute
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP
• Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a haber
muchos más en los próximos años
• El número de proteínas bacterianas proveniente de estos
genomas llegará al millón muy rápidamente
• Pero el análisis funcional y una caracterización detallada van a
exsitir sólo en unos pocos casos:
– todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B. subtilis)
– proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e
industrial)
– proteínas involucradas en vías metabólicas específicas (interés
biotecnológico)
23 September 2010
Fernán Agüero
Prioridades del proyecto HAMAP
• Anotación de proteínas huérfanas
• Pre-anotación de proteínas pertenecientes a
familias grandes/complejas (transportadores ABC,
HTH, sistemas de dos componentes, SDH)
• Anotación de alta calidad de proteínas
pertenecientes a familias bien caracterizadas
• Anotación manual de proteínas caracterizadas
experimentalmente en ese organismo
• Anotación manual de proteínas no caracterizadas
que muestren similitud con otras proteínas
23 September 2010
Fernán Agüero
Estrategia HAMAP
ORFans
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: ORFans
• No tienen similitud con otras proteínas (excepto
tal vez otras proteínas de organismos muy
cercanos)
• No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS,
Pfam, ProDom, SMART)
• Qué se hace:
–
–
–
–
Predicción de señales
Predicción de regiones trans-membrana
Predicción de coiled-coils
Anotación de repeticiones
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: ORFan antes
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: ORFan después
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: large/complex families
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: anotación automática
• Transferencia automática de anotación
– Usando reglas específicas para cada famila de proteínas
– Usando reglas específicas para un organismo particular
• La transferencia de anotación puede ir
acompañada de advertencias para el curador
– Por ejemplo:
• WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not
MF_00016 (ruvB)
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: ejemplo reglas
23 September 2010
Fernán Agüero
HAMAP: Escherichia coli
• De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas
–
–
–
–
–
60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa)
120 muy probablemente no existan
50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser fusionados
719 con errores en la asignación del codón de inicio
~1800 todavía sin caracterización bioquímica
(aproximadamente una asignación funcional por semana)
23 September 2010
Fernán Agüero
Annotation of phenotypes in TDR Targets
TDR Targets is an online [resource, database, tool] that integrates genomic
information relevant for drug discovery on pathogens that cause human diseases.
TDR Targets facilitates the prioritization of targets in complete genomes by allowing
users to search for targets using defined criteria AND to weight these searches.
Malaria
African trypanosomiasis (Sleeping sickness)
Plasmodium falciparum & vivax
Leishmaniasis
Tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Leprosy
Toxoplasma gondii
Leishmania major
American trypanosomiasis (Chagas Disease)
Mycobacterium leprae
Toxoplasmosis
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
http://tdrtargets.org
Schistosomiasis
Schistosoma mansoni
Filariasis
Brugia malayi
Agüero F. et al. (2008) Nat Rev Drug Discov 7: 900
Curation of phenotype data
• Human curator
– Reads the literature
– Extracts knowledge about target validation
– Is target essential for growth / survival?
– Is target assayable?
– Is target expressed in a relevant stage?
– Is target druggable?
– Incorporates these data into the database using a
controlled ‘pheno-syntax’
• Pheno-syntax
– Uses controlled vocabularies (ontologies)
– Builds easily readable phenotype descriptions
– Mungall C. et al. (2010) Genome Biol 11: r2
Annotation using pheno-syntax
Ontologies
Phenotype Desctiption
GO:Catalytic activity
PATO:Decreased
MI: in vitro
ECO: inferred from specific
protein inhibition
Decreased catalytic activity in vitro, inferred from specific protein inhibition
53
Fernán Agüero
Annotation using pheno-syntax
Normal gene expression in amastigotes, inferred from protein expression
Decreased catalytic activity in vitro, inferred from specific protein inhibition
54
Fernán Agüero
Annotation using pheno-syntax
• cAMP raising drugs
– Decreased growth in promastigotes, inferred from bioassay
– Disrupted cell differentiation in promastigotes, inferred from bioassay
• Antimicrotubule agents
– Abnormal morphology in promastigotes, inferred from visible phenotype
– Discontiunous cytokinesis in promastigotes, inferred from visible phenotype
• Double knockout
– Disrupted autophagy in metacyclic form, inferred from loss-of-function mutant
phenotype
• Some numbers
– 737 genes with annotated phenotypes
– 407 genes with phenotypes corresponding to ‘genetic validation’
– 306 genes with phenotypes corresponding to ‘pharmacological validation’
55
Fernán Agüero
56
Fernán Agüero
Chromosome browsers
• UCSC Genome Browser
– provee un display rápido de cualquier región genómica
– con varios “tracks” de anotación alineados al genoma
– Por el momento sólo: Human & Mouse
• Annotation tracks
–
–
–
–
–
–
–
–
–
genes conocidos (RefSeq, GenBank)
predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly)
spliced ESTs
CpG islands
assembly gaps
cobertura
bandas cromosómicas
elementos repetitivos
etc
23 September 2010
Fernán Agüero
23 September 2010
Fernán Agüero
UCSC Genome browser
• UCSC sólo genera la mitad de los tracks
• El resto proviene de la comunidad biomédica
• El Genome Browser es una herramienta de
visualización
• No saca conclusiones! Simplemente integra en
forma gráfica toda la información que posee
sobre una región, dejando la exploración y la
interpretación al usuario.
23 September 2010
Fernán Agüero
UCSC Genome Browser: gene expression
23 September 2010
Fernán Agüero
UCSC Genome browser: alternative splicing
23 September 2010
Fernán Agüero
UCSC Genome browser: complex transcription
23 September 2010
Fernán Agüero
UCSC Genoma browser: user tracks
•
•
•
•
Ustedes pueden agregar sus propios tracks
Pueden ser públicos o privados
No necesitan saber programar
Tienen que proveer información en formato
GFF (u otros similares: GTF, BED)
chrom start
end
[name strand score]
chr1 1302347 1302357 SP1 +
800
chr1 1504778 1504787 SP2 –
980
23 September 2010
Fernán Agüero
Ejemplo
• Secuenciación de
ESTs de Tupaia
belangeri
– Mamífero pequeño
– Bibliotecas de cDNA
sustractivas de
hipocampo
Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702
23 September 2010
Fernán Agüero
Anotación ESTs
• Anotación y
clasificación
funcional de los
ESTs
Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702
23 September 2010
Fernán Agüero
ESTs Tupaia
• ESTs que mapean en intrones de genes
conocidos
23 September 2010
Fernán Agüero
ESTs Tupaia
• ESTs que mapean dentro de intrones de
genes conocidos
23 September 2010
Fernán Agüero
Acknowledgements
• Nicola Mulder, EBI
• Daniel Lawson, Sanger Centre
23 September 2010
Fernán Agüero