Análisis comparativo de diferentes primers de consenso para la

Transcripción

VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
de Anatomía Patológica — Octubre de 2006
José M. Godinez Martínez
Alejandro Pascual Martín (*)
Macarena Pariente Martín (**)
Enrique Poblet Martínez (***)
Unidad de Investigación
(*) Dpto. de Anatomía Patológica
(**) Dpto. de Microbiología
Hospital General Universitario
(***) Facultad de Medicina
Universidad de Castilla La
Mancha, Albacete
Correspondencia:
Depto. de Anatomía Patológica
Hospital General Universitario
C/ Hermanos Falcó s/n
02006 Albacete, España.
Telf: +34 967 59 71 92
Fax: +34 967 24 39 52
E-mail: [email protected]
http://conganat.cs.urjc.es
Patología Molecular
Análisis comparativo de diferentes primers de
consenso para la detección de Papilomavirus
Humano en carcinomas de pene
INTRODUCCIÓN: El carcinoma de pene es un tumor raro con una incidencia anual en nuestra comunidad que sobrepasa la de otras regiones europeas.
El objetivo de nuestro estudio es detectar Papilomavirus Humano (HPV) en
carcinomas de pene y comparar los resultados obtenidos usando tres grupos
diferentes de primers de consenso. MATERIAL Y MÉTODOS: Se seleccionaron muestras de 49 pacientes con carcinoma de pene. Las muestras se
obtuvieron de los archivo del Servicio de Anatomía Patológica de nuestro
hospital y habían sido fijadas en formol e incluidas en parafina. Se extrajo
DNA de los bloques de parafina y a estos extractos se les realizó la prueba de PCR, siempre en condiciones que evitaran la posible contaminación
de las muestras. Se utilizaron tres sets diferentes de primers de consenso:
GP5+/GP6+, FAP59/FAP64, y My09/My11. Los casos positivos se secuenciaron para determinar los genotipos implicados. RESULTADOS: Se detectó HPV en 40 de los 49 pacientes estudiados (81, 6 %). En 32 pacientes el
genotipo detectado fue HPV16, en 5 HPV 18 y en 3 la secuenciación no
pudo concluir ningún genotipo específico. El juego de primers más sensible
para la detección de HPV en carcinomas de pene fue el My09/My11. Los pacientes con más de una muestra presentaron el mismo tipo de HPV en todas
ellas. En ninguno de los casos de carcinoma de pene se detectaron genotipos
de HPV diferentes de 16 y 18, aunque sí en lesiones benignas de pene que
se estudiaron paralelamente (HPV 6 and 11). DISCUSIÓN: Se detectó HPV
en el 81,6 % de los carcinomas de pene, siendo HPV16 el genotipo prevalente. El uso de diferentes sets de primers aporta un aumento significativo
de la sensibilidad de la técnica. My09/My11 fue el más sensible de los tres
juegos de primers probados a lo largo del estudio.
Palabras clave: HPV; cancer; pene; uropatología
INTRODUCCIÓN
El carcinoma de pene es un tumor raro que, sin embargo,
presenta una incidencia anual elevada en nuestra comunidad. La tasa de incidencia que nosotros hemos encontrado es de 3 nuevos casos por 100.000 habitantes y año,
frente a los 0,6 nuevos casos que aparecen de media en
el resto de países europeos. La etiopatogenia del carcinoma de pene se ha relacionado con diversos factores,
entre ellos la fimosis o no circuncisión y el número de
parejas sexuales. La presencia de papilomavirus humano (HPV) y su implicación en esta patología es uno de
los aspectos más debatidos recientemente.
El objetivo de nuestro estudio es detectar Papilomavirus
Humano (HPV) y determinar los genotipos implicados
en carcinomas de pene. Se compararán los resultados
obtenidos usando tres grupos diferentes de primers de
consenso.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se recogieron 100 muestras de lesiones de pene malignas o sospechosas de malignidad de los archivos de Anatomía Patológica del Hospital General Universitario de
Albacete entre los años 1994-2004. De un bloque de parafina representativo de cada lesión se cortaron tres secciones de 5 micras que se introdujeron en tubos esterilizados. Con el fin de evitar contaminaciones el microto-
—1—
mo se esterilizó con etanol 95 % y se cambió la cuchilla
después de cortar cada bloque,. El material se sometió
a proteolisis después de desparafinarlo mediante incubación con proteinasa K y se sometió a un protocolo de
extracción de ADN con el kit QIAmp DNA Mini Kit
(Quiagen) y luego se extrajo el ADN mediante filtración
y elución.
CONCLUSIONES
Para determinar la cantidad y pureza del ADN extraído se usó espectrofotometría (NanoDrop) y todas aquellas muestras con menos de 15 ng/µ l fueron desechadas. Para asegurar que existía un ADN con una adecuada
conservación se realizó amplificación del gen de la Hemoglobina con primers Hg063/064. De las 100 muestras iniciales se obtuvo ADN valorable en 72. De éstas 72 muestras, 64 fueron diagnosticadas como carcinomas epidermoides tras un estudio histológico retrospectivo. Se comprobó que algunas muestras correspondían
al mismo paciente (10 pacientes con 2 muestras, 1 con
tres y 1 con 4), por lo que el total de pacientes estudiados
fue de 49.
My09/My11 fue el más sensible de los tres juegos de
primers probados a lo largo del estudio.
Todas las muestras se procesaron para PCR utilizando tres juegos de primers de consenso, Gp5+/6+,
FAP59/FAP64 y My09/11. Las muestras positivas se secuenciaron utilizando el método desarrollado por Sanger
y col. (1977), las reacciones se realizaron con el Kit Big
Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing y las secuencias
se determinaron en un secuenciador capilar ABI Prism
3130 Genetic Analyzer.
RESULTADOS
Se detectó HPV en 40 de los 49 pacientes estudiados (81,
6 %). En 32 pacientes el genotipo detectado fue HPV16,
en 5 HPV 18 y en 3 la secuenciación no pudo determinar ningún genotipo específico. El juego de primers más
sensible para la detección de HPV en carcinomas de pene fue el My09/My11, según se puede ver en la Figura
5.
Los pacientes con más de una muestra presentaron el
mismo tipo de HPV en todas ellas. En ninguno de los
casos de carcinoma de pene se detectaron genotipos de
HPV diferentes de 16 y 18, aunque sí en lesiones benignas de pene que se estudiaron paralelamente (HPV 6 y
11).
Se detectó HPV en el 81,6 % de los carcinomas de pene,
siendo HPV16 el genotipo prevalente.
El uso de diferentes set de primers aporta un aumento
significativo de la sensibilidad de la técnica.
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—3—
ICONOGRAFÍA
Figura 1.- Carcinoma epidermoide de pene de tipo común.
—4—
Figura 2.- Carcinoma epidermoide de pene de tipo verruciforme, con cambios coilocíticos.
Figura 3.- Gel de agarosa que muestra el resultado de la amplificación de algunos casos utilizando primer My09/11.
Línea 1: Marcador de peso molecular; línea 2 (H2O): Control negativo. Línea 14: Control negative (células Hacat);
Línea 15: Control positive (células HeLa); líneas 3 a 13: Muestras clínicas.
—5—
Figura 4.- Gel de agarosa que muestra el resultado de la amplificación de algunos casos utilizando primer
GP5+/GP6+. Línea 1: Marcador de peso molecular; línea 2 (H2O): Control negativo. Línea 14: Control negative
(células Hacat); Línea 15: Control positive (células HeLa); líneas 3 a 13: Muestras clínicas.
My09/My11
Gp5+/Gp6+
Fap59/Fap64
% HPV (+)
59,7 %
35,5 %
3,1 %
Figura 5.- Tanto por ciento de casos que resultaron positivos con los diferentes primers de consenso analizados.
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