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Síntesis y caracterización de nanopartículas de sílice asimétricas como
vehículos de vectorización para tratamiento de cáncer
INTRODUCCIÓN
El cáncer es una enfermedad que, en la actualidad, sufren gran cantidad de personas
pero los tratamientos actuales provocan una gran toxicidad en los pacientes y no aseguran la
eliminación completa de la enfermedad. La mortandad en los casos de cáncer más comunes en
España ha disminuido en los últimos años gracias a la creciente investigación e inversión en
tratamientos, en los cuales se incluyen los sistemas de liberación de fármacos como el de este
proyecto.
El cáncer es un conjunto de enfermedades producidas por un crecimiento anormal y
descontrolado de un grupo de células. La trasformación de células normales en células
cancerosas es consecuencia de daño en el material genético en forma de mutaciones que afectan
a los procesos de proliferación y división celular. Como consecuencia, las células continúan
creciendo y dividiéndose aunque no sea necesario. Cuando su descendencia hereda dicha
tendencia, resulta un clon que se expande y forma el tumor primario, que es benigno. Pero si
sufren nuevas mutaciones puede desarrollarse en un tumor maligno.
En el proyecto, una vez es conocido el origen y el proceso de formación de una célula
cancerosa, se pretende esbozar una idea general de dichas células y su ambiente. Porque los
tumores pueden considerarse órganos cuya complejidad se acerca o supera a la de los tejidos
normales y sanos. Las células cancerosas que son capaces de sobrevivir y su herencia se
benefician del microentorno del tumor y reclutan células sanas, conocidas como estroma, que
contribuirán al desarrollo de la enfermedad.
El tumor, durante todo su desarrollo y con la participación de las diferentes células que lo
forman, adquiere ciertas capacidades que son sus señas de identidad: mantenimiento de la señal
proliferativa, evadir los supresores del crecimiento, la resistencia a la muerte celular, la
inmortalidad replicativa, la angiogénesis, la activación de la invasión y la metástasis. No entraré
en detalle, pero conocer cada una de ellas es muy importante a la hora de comprender la
enfermedad. Y el estudio de las moléculas relacionadas con dichos procesos nos brinda la
oportunidad de enfocar los tratamientos hacia las células tumorales.
Uno de los procesos que se aprovechan en este proyecto es el (EPR) efecto de aumento de la
permeabilidad y retención. Este efecto se basa en que los tumores tienen la capacidad de formar
nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), sin embargo, estos nuevos vasos son aberrantes y sus
paredes presentan perforaciones con tamaños de poro de hasta varios cientos de nanómetros. En
consecuencia, la permeabilidad vascular es significativamente mayor que en los tejidos sanos.
De esta forma, este efecto se puede aprovechar ya que nanopartículas con tamaños de 100 a 200
nm cargadas con los fármacos pueden extravasarse a través de dichas fenestraciones a los
tumores sólidos y liberar su carga en ellos, sin afectar al resto de los tejidos. A este hecho se le
denomina selectividad pasiva:
Figura 1. Diferencias entre tejido sano y tumoral.
Pero la selectividad del nanotransportador se puede mejorar con la fijación de agentes de
vectorización en su superficie, sustancias afines a las células cancerosas o a su microambiente
relacionadas con los procesos citados anteriormente, proporcionándolas un enfoque activo. Para
conseguir este aumento de la especificidad, en este proyecto las nanopartículas (esféricas) han
sido decoradas con Transferrina y con Ácido Fólico.
La Transferrina (Tf), que es la principal proteína de transporte de hierro en la sangre de los
mamíferos, ha sido elegida ya que los receptores de Transferrina se encuentran en niveles
elevados en diferentes tipos de células cancerígenas (próstata, mama, pulmón…) y están
relacionados con la habilidad proliferativa de dichas células tumores.
El Ácido Fólico (FA), la vitamina B9, es esencial para la síntesis de ADN y para su reparación
se ha elegido ya que el receptor de folato (FR) normalmente tiene una expresión baja en las
células sanas pero aumenta durante la activación y proliferación celular. Por tanto, la expresión
de receptores de folato aumenta en los tumores humanos.
ESTADO DEL ARTE
En la actualidad, los tratamientos contra el cáncer utilizados son la cirugía, la
quimioterapia y la radioterapia, que se usan de forma mixta. Ninguno de ellos discierne las
células sana de las enfermas, de forma que es inevitable que produzcan una toxicidad en el
paciente. Además, son necesarias dosis altas primero para asegurar la eliminación completa de
las células cancerosas y segundo porque su eliminación de la circulación sistémica es muy
rápida, de forma que en ocasiones estos tratamientos se basan en suministrar la dosis máxima
tolerable por el paciente, que a veces supera la relación riesgo-beneficio.
Con el fin de disminuir esta toxicidad, se buscan tratamientos que permitan explotar las
diferencias entre las células sanas y las enfermas, uno de los cuales son las mencionadas
nanopartículas. En el tratamiento del cáncer estos nanotransportadores presentan ciertas
ventajas: la encapsulación de los fármacos antitumorales en partículas, los protege contra la
degradación enzimática, por su tamaño son capaces de evitar los mecanismos de eliminación
orquestados por el sistema inmune y acumularse en el tejido enfermo debido al efecto EPR y la
selectividad nanotransportador se puede mejorar mediante la fijación agentes de
direccionamiento en su superficie.
Figura 2. Diagrama esquemático demostrando el posible mecanismo de acumulación de nanopartículas
no funcionalizadas con un agente de vectorización (izq.) vs si funcionalizadas (dcha.)
La novedad de este proyecto es que se opta por una doble funcionalización, ya que el tumor se
entiende como una masa compleja y heterogénea, donde cada tipo de célula sobreexpresa
receptores distintos. Así, la doble funcionalización permite que los nanotransportadores se
dosifiquen de forma más uniforme al verse atraídos por un mayor número de células y evitando
así que se puedan quedar en una primera línea celular sin llegar al resto del tumor.
En concreto, los nanovehículos usados en este proyecto son nanopartículas de 100-200 nm de
Sílice esféricas, con poros ordenados en su interior, denominadas mesoporosas MCM-41.
Presentan propiedades muy interesantes para usos biomédicos; una alta superficie específica,
tamaño fácilmente modificable, los poros y la superficie pueden se funcionalizados de diferente
forma, su producción es rentable y escalable y, además, los poros se pueden cargar con
fármacos antitumorales. Y, por otra parte, este material presenta grupos silanol en su superficie
que proporcionan muchas opciones para el desarrollo de materiales multifuncionales a través de
uniones covalentes.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El primer paso en la síntesis fue marcar covalentemente con un fluoróforo (FITC) las
nanopartículas de sílice (un precursor de sílice, APTES) para poder realizar estudios de
internalización celular en un futuro.
El siguiente paso fue la síntesis de las nanopartículas con la ayuda de un surfactante catiónico,
CTAB, y otro precursor de sílice, TEOS. Lo que ocurre es que el compuesto APTES- FITC y el
TEOS en un medio básico son capaces de co-condensarse integrándose covalentemente en la
red inorgánica final mediante una reacción de policondensación. El proceso por el que se
forman los poros ordenados se basa en que a cierta concentración las moléculas tensoactivas
forman agregados micelares, que forman estructuras supramicelares dando lugar a una fase
hexagonal, característica del MCM-41.
Figura 3. Formación de los materiales mesoporosos por agentes directores de estructura
Ya que estos poros ordenados más tarde serán utilizados para cargar los fármacos antitumorales
es necesario eliminar el CTAB en forma de micelas. Para ello, se tratan las partículas con nitrato
de amonio y etanol al 95% que, por medio de un intercambio iónico, sustituirá el surfactante.
Se sintetizaron 4 lotes de partículas con el fin de observar su reproducibilidad, a los que se
llamarán V1, V2, V3 y V4. Y se procedió a su caracterización.
El potencial Z promedio de las nanopartículas, que nos da una idea de la carga superficial de las
nanopartículas, en esta etapa del proceso es -25 mV. La comparación de estas medidas con las
siguientes medidas de potencial nos ayudará a saber si las sucesivas funcionalizaciones de la
superficie han teniendo lugar. El tamaño promedio, medido por DLS, de las nanopartículas en
este estado resulta 160 nm, adecuado para aprovechar el efecto EPR.
La termogavimetría (TG) medirá la pérdida de masa entre 110°C y 500°C para saber cuánta
cantidad de materia orgánica tienen las nanopartículas, es decir, para saber si el surfactante ha
sido eliminado correctamente. Para lo cual, la cantidad de materia orgánica no debería ser
mayor a un 5 o 6 % del peso de la muestra lo que cuadra con los resultados.
La espectroscopia de transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) se emplea
para identificar los grupos funcionales presentes en las muestras, obteniendo espectros donde las
bandas características son: 1100 cm-1 que corresponde al enlace Si-O de extensión (streching) y
la 800 cm-1 que concierne al enlace Si-O-Si de flexión (bending), ambas indican la presencia
del APTES y el TEOS; la banda cercana a 2980 cm-1 atañe al enlace C-H sp3 que muestra la
presencia de un mínimo resto de surfactante y las bandas de 3400 y 1630 cm-1 son debidas a
que las muestras tienen algo de agua.
La técnica de adsorción de gases nos da una curva que representa la cantidad de gas adsorbido
para distintas presiones relativas de gas, denominada isoterma tipo IV, que es característica de
los mesoporosos ya que presenta un incremento de la cantidad adsorbida a presiones relativas
intermedias. Además no presenta histéresis entre adsorción y desorción lo que indica que los
poros no son interconectados. Y la superficie específica y el volumen y tamaños de poro,
cercano al 1 cm³/g, son los adecuados.
Finalmente se observaron las partículas por SEM, donde se pudo observar que la síntesis se ha
realizado correctamente porque las nanopartículas son esféricas, no muestran agregados, son
uniformes y con tamaños de alrededor 130 nm.
Siguiente paso de la síntesis: para conseguir la buscada funcionalización asimétrica, se incrustan
las nanopartículas en gotículas de parafina fundida con la ayuda de un Vortex a una agitación
específica, dejando un hemisferio de cara al exterior. Una vez conseguido, se procede a
funcionalizar ese hemisferio mediante otra reacción de policondensación en un medio básico
entre el APTES y el TEOS para conseguir grupos amino en esta parte de su superficie.
Para liberar las partículas de la parafina hay que sonicar un matraz con la masa con Heptano,
que es un disolvente totalmente apolar y disuelve la parafina.
Figura 4. Proceso de asimetrización
Por lo tanto se vuelve a caracterizar para comprobar si la asimetrización ha tenido lugar. En el
potencial Z, a diferencia de las medidas en el paso anterior, éstas son positivas. El simple
cambio de potencial ya indica que hay algo diferente en la superficie a lo que había antes. La
medición del tamaño se presenta más complicada ya que, aunque la parafina se haya eliminado
completamente, se observa una mayor agregación de las partículas.
Al observar que las muestras V3 y V4 dan resultados muy buenos, parecidos se juntan para
tener más cantidad en los siguientes pasos. La unión de éstas muestras será llamada V3’.
El análisis termogavimétrico muestra que el promedio de materia orgánica aumenta de un
5,75% a un 12.6%, por lo que se puede suponer, teniendo en cuenta los resultados de potencial,
que la funcionalización ha sido efectiva.
Es necesario observar las muestras por FTIR para comprobar si la parafina ha sido eliminada
correctamente. La diferencia con los espectros anteriores se encuentra en las bandas cercanas a
1650 y 1560 cm-1 que corresponden a vibraciones de torsión (bending) de NH2 libre y una
banda cercana a 1470 cm-1 que pertenece a vibraciones de deformación de CH2 (región
alifática) que puede deberse al grupo propilo del APTES ya que no son muy intensas, si lo
fueran indicaría la presencia de parafina (fórmula general CnH2n+2).
Fotos de SEM con la parafina de las muestras V1 y V2 muestran unas gotículas de parafina de
entre 30 y 40 µm. La internalización de las nanopartículas en las gotículas es bastante uniforme.
Sin embargo, la muestra V3’ se internaliza en las gotículas de parafina más de lo debido. Esto
puede deberse a varios motivos: el tiempo de agitación en el Vortex no ha sido el adecuado, la
cantidad de CTAB no se ha medido adecuadamente o que el calentamiento del recipiente no ha
sido homogéneo.
Finalmente se cuantifican las aminas por el método explicado en el proyecto. Se advierte
claramente que el grado de funcionalización con aminas de la muestra V3’ es mucho menor a
las muestras V1 y V2. Esto puede deberse a que, como se observa en las imágenes de SEM de la
muestras V3’, las nanopartículas se internalizan demasiado en las gotículas de parafina,
provocando que la superficie de la nanopartícula expuesta al exterior para ser funcionalizada sea
mucho menor.
El siguiente paso es la transformación de los grupos silanol restantes en grupos tioles mediante
una reacción de policondensación entre MPS y el TEOS.
En la caracterización se observa como vuelve a variar el potencial Z que vuelve a ser negativo.
Por lo que, en mayor o menos medida, la segunda funcionalización ha tenido lugar. En el TG se
advierte un aumento del 12,6 al 22,5% de materia orgánica. Esto, teniendo en cuenta los
resultados del potencial Z, sugiere que la funcionalización se ha desarrollado correctamente.
Finalmente se cuantifican los tioles por el método explicado en el proyecto, y se observa que en
las muestras donde la primera funcionalización ha sido de un grado alto (V1 y V2), la segunda
funcionalización ha resultado ser menor y viceversa (V3’). Por lo tanto, todas las muestras
tienen un grado de funcionalización total similar, del orden 150 µmol/g partícula. Esto da a
entender que la funcionalización ha sido asimétrica y no aleatoria. El grado de funcionalización
queda únicamente dependiente del grado de internalización de las nanopartículas en las
gotículas de parafina. Por tanto, el objetivo de una funcionalización asimétrica ha sido
conseguido
El siguiente paso es anclar los agentes de vectorización. Primeramente el ácido fólico se unirá
(mediante un proceso químico explicado en el proyecto) a los grupos amino ya que la
Transferrina es de mayor tamaño (60 kDa).
Sólo se realiza en la muestra V3’, que tenía un grado de funcionalización de las aminas
pequeño y alto el de los tioles, ya que no hay cantidad suficiente de las demás para realizarlo.
El potencial Z de la muestra V3’ aumenta ligeramente tras introducir el agente de vectorización,
es un aumento discreto, ya que la superficie está mayoritariamente cubierta por grupos tioles. El
tamaño de las nanopartículas disminuye por lo que parece que siguen siguen disgregándose. El
porcentaje de materia orgánica varía muy discretamente, en este caso únicamente aumenta un
1%.
Finalmente, el agente de vectorización de la Transferrina se une a los grupos tiol libres mediante
un cross-linker. Así finalmente, se obtienen las nanopartículas finales con los dos agentes de
vectorización.
En este caso el potencial de la muestra no aumenta demasiado con respecto a la muestra que
tenía Ácido Fólico únicamente. Que la carga de la superficie haya variado indica que el proceso
ha tenido lugar, en mayor o menor parte. El tamaño promedio de las partículas disminuye a los
120 nm. Teniendo en cuenta que la Transferrina es una macromolécula pesada, el aumento de
materia orgánica en la muestra puede mostrar que el proceso de unión de la Transferrina haya
sido exitoso.
Se compara el espectro de FTIR con respecto a la muestra anterior y se observa un aumento en
la banda de 1650 cm-1 que es característica del enlace amida, es decir, del enlace peptídico, por
lo que se puede suponer que la funcionalización con la proteína de Transferrina ha tenido éxito.
CONCLUSIONES
Todas las caracterizaciones que se observan a medida que se desarrollaba la síntesis
mostraban unos resultados adecuados que daban a entender que la síntesis se ha desarrollado de
forma correcta.
Aunque el tamaño haya variado a lo largo del proceso debido a la formación de agregados, el
resultado obtenido al final de la síntesis es un tamaño promedio de 120 nm adecuado para
aprovechar el efecto EPR.
Tanto el cambio de potencial Z como el aumento del porcentaje de materia órganica de las
nanopartículas obtenidos tras cada funcionalización junto con los FTIR, demuestran que cada
paso se ha desarrollado correctamente.
La funcionalización se realiza de forma asimétrica, aunque de forma no proporcionada. Esto se
debe a que la internalización de las gotículas en la parafina es un proceso difícilmente
controlable. Sin embargo, se trata de un procedimiento novedoso, que satisface lo objetivos
perseguidos de funcionalización asimétrica no realizados por ningún grupo anteriormente.
Se puede concluir que los resultados obtenidos en este proyecto demuestran que la síntesis
practicada es adecuada para los fines perseguidos.
nm
mV
DLS
400
300
200
120
100
POTENCIAL Z
40
MCM SIN
SURFACTANTE
FUNC AMINAS
(SIN PARAFINA)
FUNC AMINAS Y
TIOLES
TARGETING FA
20
0
-20
TARGETTING FA Y
TF
-40
0
Figura 5. Evolución del tamaño
Figura 6. Evolución del potencial Z
GRADO DE FUNCIONALIZACIÓN
%
40
TGA
µmol/g
part
200
30
20
10
0
Figura 7. Evolución del % de materia orgánica
150
AMINAS
TIOLES
V1
V2
100
V3'
50
0
Figura 8. Grado de funcionalización con aminas
y tioles de V1, V2 y V3’
TRABAJO FUTURO
Con respecto al desarrollo de este proyecto en un principio debería optimizarse el
proceso de internalización de las partículas en las gotículas de parafina. Después, una vez
tengamos unas nanopartículas homogéneas podrían hacerse estudios de internalización en las
células cancerosas comparando partículas con un solo agente y con los dos. Si se obtuvieran
buenos resultados ya solo quedaría cargar los poros con fármacos y estudiar la mortandad de la
misma forma y finalmente, si todo saliera bien, estudiarlo en tumores reales en ratones.