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XV Taller Internacional Sobre Tuberculosis
UITB-2011
Barcelona, España
29 noviembre 2011
Brotes de TB y
Epidemiología Molecular:
Experiencia y Prospectos en EEUU
Kenneth G. Castro, M.D.
Colaboradores
Juliana Grant, M.D.
Anne Marie France, Ph.D.
Thomas Navin, M.D.
National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD & TB Prevention
Division of Tuberculosis Elimination
Indice
Definición de genotipo en M. tuberculosis
Historia del uso de genotipos y métodos
Servicio nacional de genotipado en EEUU
Metodología, uso de datos, y ejemplos concretos
Evolución de genotipado para control y prevención
– y su potencial pronóstico
Direcciones futuras
¿Que es un genotipo de TB?
Análisis de “huellas dactilares” del ADN en cepas de
Mycobacterium tuberculosis obtenidas de personas
con TB y cultivos positivos, para determinar su
relación y variabilidad genética
Requiere casos de TB con
cultivos positivos
Transmisión y Genotipos de TB
Asumimos que los casos en una cadena de
transmisión comparten genotipos iguales
HISTORIA USO DE GENOTIPOS EN
TB
Fagotipo (Phage Typing)
Rado TA, Bates JH, Engel HW, Mankiewicz E, Murohashi T, Mizuguchi Y,
Sula L. World Health Organization studies on bacteriophage typing
of mycobacteria. Subdivision of the species Mycobacterium
tuberculosis. Am Rev Respir Dis. 1975;111(4):459-68
“…Mycobacterium tuberculosis puede ser subdivido en un mínimo
de 3 fagotipos mayores: A, B, y C, y en 2 sujetos: Ax y A2.”
Aplicado a investigaciones de brotes en 1970s –1980s
TB MDR en escuela y comunidad, Mississippi
Albergue de ancianos (vinculó 8 de 11 casos)
Elucidar contaminación intralaboratorio
Limitationes: capacidad discriminatoria y muy
pocos laboratorios capacitados
Fragmentos de Restricción de
Longitud Polimorfa (RFLP) IS6110
Primer método con
capacidad discriminatoria
usado ampliamente
Usado en investigación de
brotes TB en 1990s
Nueva York
San Francisco
Uso de Genotipo RFLP Sirvió para
Elucidar Epidemiología de TB en SF y
NY
31% de casos en San Francisco debido a transmisión
reciente
40% de casos en Nueva York debido a transmisión
reciente, y casi 2/3 de casos TB MDR
Small P, et al N Eng J Med 1994;330:1703-9. Alland D, et al N Eng J Med 1994;330:1710-6
Red Nacional Sentinela de GenotipoTB
Estudio en múltiples ciudades, 1996 – 2000
Evaluó el uso de genotipado para TB a nivel
poblacional
Prueba de concepto
Genotipos basados en RFLP
Decisión de utilizarlo en el país
Emerg Infect Dis 2002;8(11):1188-1191
Valor de Genotipado en TB
Identificar y prevenir transmisión reciente
Mejorar investigación de contactos
Describir lugares de transmisión no comunes
Facilitar identificación de brotes
Mejoras en manejo clínico
Identificar cultivos falsos-positivos
Diferenciar entre relapsos/recaídas y re-infección
Limitaciones del RFLP a Nivel Nacional
Difícil comparar resultados provenientes de diversos
laboratorios
Requiere gran cantidad de ADN de alta calidad
No se presta a ser usado con métodos de alto
rendimiento (demoras en uso de resultados)
Capacidad discriminatoria limitada para cepas con
pocas copias (≤ 5 bandas)
Métodos Basados en Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR)
Resultados pueden ser estandarizados en diversos
laboratorios
Resultados se prestan a análisis semi-cuantitativo
Pruebas pueden ser completadas en 1 dia
(resultados al Programa TB < 1 semana)
Depende de cantidad y calidad menor de ADN que el
RFLP
Genotipado de TB en EEUU
Basado metodología PCR
• Espoligotipo (Spoligotype= Spacer oligonucleotide
typing)
Patrón de bandas
Código binario
Agrupación 14 + 1
Designación octal
• Secuencias repetidas en puntos específicos de Mtb
(MIRU-VNTR= Mycobacterial Interspersed Repetitive
Units – Variable Number Tandem Repeats)*
* Inicialmente conjunto de 12-puntos. En 2009 se expandió a conjunto de 24-puntos (MIRU-24)
Potencial Optimo de Genotipado para
Control y Prevención de TB Requiere
Acceso Universal a PCR
“La visión parcial entraña mas desconocimiento que conocimiento”
http://101cuentosindia.blogspot.com/2011/04/los-ciegos-y-el-elefante.html
Servicio Nacional
de Genotipado
para Cepas
MMWR 2005;54:47
M. tuberculosis
(NTGS)
Envío voluntario de aislado/cepas por Programas de
TB a nivel local/estatal a partir del 2004
CDC costea envío y genotipado
Objectivo: lograr genotipado “universal” de todo
caso TB con cultivo positivo en EEUU
Servicio Nacional de Genotipado TB
(NTGS)
NYC
San SD
Diego
Asignado a lab California
Asignado a lab Michigan
• 2 laboratorios proveen servicio genotipado centralizado
• Basada en PCR (espoligotipo y MIRU-VNTR) para todo primer
aislado de paciente con cultivo + Mycobacterium tuberculosis
• RFLP disponible en casos limitados, basado en pedidos específicos
Servicio Nacional de
Genotipado TB (NTGS)
Plan de implementación
basado en consenso nacional
Guía para usuarios
Se comparten datos de
genotipos a través de las
diversas jurisdiciones
Cobertura del Sistema Nacional de
Genotipado TB (NTGS), EEUU, 2004-2010
% de casos TB notificados con cultivo positivo y resultado
de Genotipo Mtb
100%
90%
80%
80%
2007
2008
86%
89%
2009
2010
80%
70%
60%
64%
68%
51%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
2004
2005
2006
MÉTODOS Y USO DE DATOS
LOCALES Y A NIVEL NACIONAL
Sistema de Manejo de Información de
Genotipos para TB (TB GIMS)
A partir de marzo 2010
Aplicación segura con base en la Web
Mejor acceso, manejo, y uso de información sobre
genotipos por Programas TB a nivel local y estatal
Hasta septiembre 2011
70,683 cepas con resultados de genotipo
58,513 pacientes con resultados de genotipo
~500 usuarios activos
Sistema de Manejo de Información de
Genotipos para TB (TB GIMS)
Funciones del Sistema TB GIMS
Permite recibo y actualización inmediata de
resultados de genotipos proveniente de laboratorios,
cruzados con los datos del paciente contenidos en
registro de vigilancia
Accesible a los Programas locales, por medio de una
aplicación segura con base en la Web
Mapas de geolocalización permiten visualizar
aglomerados de casos a nivel local, estatal, y nacional
Examina y compara características demográficas,
clínicas y factores de riesgo de pacientes en
aglomerados de casos con genotipo común
Datos de Vigilancia y Genotipos
Vinculados para Casos Notificados en
TB GIMS
* Ilustración con fines de entrenamiento
Datos de Vigilancia y Genotipos
Vinculados para Casos Notificados en
TB GIMS (2)
* Ilustración con fines de entrenamiento
Datos de Vigilancia y Genotipos
Vinculados para Casos Notificados en
TB GIMS (3)
* Ilustración con fines de entrenamiento
Ejemplo de Geolocalización de
Aglomerados de Genotipos para la
Detección de Brotes TB
Localiza la distribución geográfica de genotipo PCR
específico (PCR 1201), comparado con:
Distribución en EEUU y distribución total de TB
Aglomerados de casos
de genotipo PCR 1201
concentrados en tiempo
(agosto 2008-agosto 2011)
y espacio probablemente
representan cadenas de
transmisión en Texas
Aglomerado de Genotipo CA_0408*
Rx Start
Age
Sex
LHD
Race/Eth
Country
Site
Sputum
Smear
Sputum
Culture
Cav
CXR
Risks
Drug
R?
60’s
Male
FRESNO
Hispanic
USA
Pulm
Neg
Pos
No
Not Emp,
ND
Mexico
Pulm
Pos
Pos
Yes
Mig Work
No
No
Hispanic
3/2009
30’s
Male
FRESNO
Hispanic
1/2009
20’s
Male
FRESNO
Mexico
Pulm
Pos
Pos
Yes
Alc, NIDU,
Mig Work
Mexico
Pulm
Pos
Pos
No
Mig Work
No
Mexico
Pulm
Pos
Pos
Yes
Alc
No
Yes
Homeless,
NIDU, Mig
Work
No
Hispanic
11/2007
20’s
Male
FRESNO
Hispanic
9/2006
40’s
Male
FRESNO
Hispanic
11/2005
30’s
Male
FRESNO
Mexico
Pulm
Pos
Pos
Individual: Todos hombres hispanos, 5/6 inmigrantes de México, edades
20s – 40s, 5/6 baciloscopía positiva, cepas no farmacoresistentes
Lugar: Unicos casos en EEUU con este genotipo en condado de Fresno
(CA), 5/6 pacientes residen en misma ciudad en perímetro de 2 km2
Tiempo: 3 casos en 2009; 3 casos 2005-2007
* Shaw T. California TB Control Branch, 22 oct 2010
Ejemplo Reportes y Mapas en TB GIMS
* Ilustración con fines de entrenamiento
Geolocalización de Genotipo TB, EEUU
Espologotipo 777776777760601, MIRU 224221153323
3
4
2
1
1
30 9
3
2
1
1
46 Casos en EEUU compartían este genotipo al 31/10/2005
30 (65.2% ) de los casos en EEUU residían en estado de Indiana
(Nota: 1 caso en Florida comparte espoligotipo y vínculo
epidemiológico, aunque carece de resultado MIRU)
Moonan P, Poonja S, Haddad M, et al. Datos no publicados
Distribución en Indiana del Genotipo
Espologotipo 777776777760601, MIRU 224221153323
36 Casos en estado, al 31/oct/2006
7
25
2
1
1
Condado A (n = 25)
• 69.5% del total en estado
• 40.3% del total nacional
• Usuarios metanfetamina
Condado B (n = 7)
• 6 casos vínculo epidemiológico a casos
en Condado A (metanfetamina)
Otros condados – se desconocían
vínculos epidemiológicos con casos de
Condados A y B
Moonan P, Poonja S, Haddad M, et al. Datos no publicados
Distribución Nacional de PCR00629, 2007–2011*
* Hasta 22 sept 2011, basado en TB GIMS (resultados de genotipo
vinculado a registro en sistema de vigilancia)
Powell K, et al. Datos no publicados, CDC, IDOH, 2011
Albergue Para Indigentes, “Condado A”
Powell K, et al. Datos no publicados, CDC, IDOH, 2011
Ejemplo de Análisis Preliminar en
NTGS y TB GIMS
•
6,706 (64.9%) clustered isolates
•
1,974 clusters
– Median of 3 members
– Range: 2 – 687
•
Key characteristics for clustering
Investigaciones de Brotes de TB por
CDC y Programas TB, 2002–2008*
Genotipos (espoligotipo y MIRU) disponibles en 22/27 brotes. Tres brotes debidos
a cepa Beijing (espoligotipo 000000000003771, MIRU 223325173533); 19
restantes con genotipos diversos.
Factores Contribuyentes en 27 Brotes
No. Brotes
Periodo infeccioso prolongado
24
Demoras de proveedor de salud en establecer diagnóstico
12
Tratamiento inadecuado
2
Demoras de pacientes en acudir a atención médica
6
Falta de adherencia a tratamiento
5
Desconfianza en sistema de salud pública
6
Investigación de contactos incompleta
10
Lugares hacinados con población de alto riesgo para la TB
7
* Mitruka K, et al. Emerg Infect Dis 2011;17(3):425-431
EVOLUCIÓN DEL USO DE
GENOTIPADO EN EL CONTROL Y
PREVENCIÓN DE TB
Aplicaciones Prácticas de Genotipos
en el Control y Prevención de TB
Nivel Individual
Distinguir recaída/relapso de nueva infección
Detección de cultivos falsos-positivos
Confirmar o refutar vínculos epidemiológicos
Encontrar vínculos anteriormente desconocidos
Nivel Poblacional
Definir magnitud y escala de brotes
Detección precóz de aglomerados de casos con alto riesgo
de evolucionar a brotes
Prevención de brotes
Dar seguimiento a control de brotes a través del tiempo
Transmisión y Genotipos de TB
Casos de TB con genotipos compartidos pueden:
Alertarnos sobre posible cadena de transmisión no
sospechada
Confirmar posible cadena de transmisión
Vigilancia de Aglomerados de
Genotipos para Pronosticar Brotes TB
¿Podemos identificar cuáles aglomerados de
genotipos se convertirán en brotes futuros?
Hará falta:
“Pronósticar” la probabilidad de crecimiento del
aglomerado de casos en ausencia de medidas
Identificar cadenas de transmisión desconocidas
para aplicar medidas y prevenir evolución a
brotes
Identificar contactos prioritarios para la
investigación e intervenciones preventivas
Métodos Analíticos para Pronosticar
Crecimiento de Aglomerados de Casos
y Brotes de TB
Examina aglomerados de casos “incidentes”
Identifica lo que se conocía al ocurrir el tercer caso
Aplica seguimiento estandarizado por 48 meses
Aplica medida de resultados estandarizados:
¿Evolucionó el aglomerado a un brote?
(Basado en tamaño del aglomerado de casos e
información en el Programa TB)
Define las características de aglomerados de casos
con alta probabilidad de evolucionar a brotes
Logaritmo del Cociente de Probabilidad
“Log-Likelihood Ratio (LLR)”
Genotipo PCR
de interés
Dentro
Fuera
Sí
No
a
b
c
d
N = a+b+c+d
Prevalencia de Genotipo PCR
Observado en condado
Dividido entre
Prevalencia de Genotipo PCR
Esperada en nación*
a / (a+b)
_______
(a+c) / N
Prevalencia de Genotipo PCR
Observada fuera del condado
Dividido entre
Prevalencia de Genotipo PCR
Esperada en nación
c / (c+d)
_____
(a+c) / N
LLR = a*log(Obs_en/Exp) + c*log(Obs_fuera/Exp)
* Basado en intérvalos de 3 años
Nivel de Alerta en TB GIMS
Valor numérico del LLR usado para emitir alertas en
base a umbrales establecidos. Niveles:
Alto
≥ 10
Medio
5–9.99
Ninguno
<5
Umbrales basados inicialmente en consenso por
panel de expertos que revisaron y estudiaron
aglomerados de casos con genotipos comunes
Niveles serán refinados en base a resultados de
evaluaciones y estudios de campo
Ejemplo Detección de Alertas en
Aglomerados de Casos, TB GIMS
Medidas cuantitativas de concentración geográfica generan
puntuación en base al logaritmo del cociente de probabilidad
(Log-Likelihood Ratio)
Traducidos a niveles
de alerta en TB GIMS
Alto, Medio,
Ninguno
Todo Programa TB
tiene acceso a listado
de alertas
Revisión de Aglomerados de Casos TB
Identificados en Base a Concentración
Geoespacial
Asumimos
Rareza de genotipo y concentración geoespacial
correlacionados a transmisión reciente
Nivel de Alerta en TB GIMS
Basada en cifra obtenida del log del cociente de
probabilidad -- Log-Likelihood Ratio (LLR)
Compara concentración geográfica de aglomerado
de casos con genotipo común en condado, con la
concentración del mismo en el país durante 3 años
Detección de Aglomerados de
Genotipos TB con Probabilidad de
Evolucionar a Brotes
Investigación de contactos sugiere un brote de TB
Número inesperado de casos TB en tiempo y lugar
Número inesperado de casos TB con mismo
genotipo y alguna otra conección
Geográfica, temporal, de factores de riesgo
Detección de Brotes de TB en Base a
Aglomerados de Genotipos TB
Identificar aglomerados de casos preocupantes
Brotes activos no identificados de otra manera por
el Programa TB local/estatal
Diferenciar transmisón reciente de
Transmisión en años previos o en otros lugares
(e.j., en extranjero)
Cambios en la población afectada (e.j., llegada de
inmigrates provenientes de alta endemia)
Identificar aglomerados que requieren respuesta
prioritaria e intervenciones dirigidas
Aplicación de Métodos para Pronosticar
Crecimiento de Aglomerados y Brotes
TB GIMS – Listado de Aglomerados de Genotipos PCR, por Condado
Aglomerados de Casos TB con Genotipos
Comunes en Condados de EEUU (n=2033)
Mayo 2008 – Mayo 2011
374
aglomerados de
casos con nivel
alerta alto o
medio
1659
aglomerados de
casos sin alerta
≥ 2 casos con genotipo compartido en un mismo condado
Rango observado: 0–157 aglomerados por condado
TB GIMS envió notificaciones electrónicas a usuarios sobre
aglomerados con nivel de alerta alto o medio
Número de Aglomerados de Casos
Identificados por Genotipo y
Confirmados Como Brotes de TB,
EEUU, 2006-2010*
* Aglomerados de casos nuevos, a partir del 2006.
Nota: Excluye 5 aglomerados con tamaño n≥6 no confirmados como brotes..
Althomson S, Navin T. Datos no Publicados, CDC, 2011
DIRECCIONES FUTURAS EN
GENOTIPADO TB
Direcciones Futuras en la Detección de
Brotes TB
Continuar la validación y refinamiento de los niveles
de alerta
Integrar los valores predictivos de alertas a acciones
del programa
Identificar brotes que cruzan varias jurisdicciones
Establecer acuerdos que permitan la identificación
e investigación rutinaria de brotes que cruzan
jursdicciones diversas
Métodos de Genotipado Futuros
Comparar MIRU-24 y RFLP
Usando datos reales provenientes de
investigaciones de campo
Permitiría uso de datos anteriores al 2004
Secuenciación del genoma de M. tuberculosis
Evaluar su aplicación a investigación de brotes
Determinar factibilidad de su aplicación práctica
y rutinaria
GRACIAS
GRÀCIES/ MERCÈS
¿Cuándo se necesita el RFLP?
Para decidir si las cepas con spoligo y MIRU común
pertenecen a un aglomerado— cuando hace falta
evidencia adicional a favor o en contra en casos
emparejados
No es necesario
En agrupados ’ PCR’ raros con sospecha de estar
verdaderamente vinculados
Si es obvio que las personas con genotipos
comunes aparentan representar una cadena
epidemilógica de transmisión
Mitruka K, et al.
Emerg Infect Dis 2011;17(3):425-431
Aplicación de Métodos para Pronosticar
Crecimiento de Aglomerados y Brotes (2)
TB GIMS – Cambios en Nivel de Alerta de Aglomerados de Genotipos PCR
Aplicación de Métodos para Pronosticar
Crecimiento de Conglomerados y Brotes
TB con Genotipo Común
Uso de resultados para desarrollar un árbol de
decisión
TB GIMS sirve para identificar conglomerados con
alta probablididad de convertirse en brote
Alertas visibles a personal a nivel local, estatal, y
federal
Desarrollo de pautas para intervenciones en
conglomerados de casos en cadena de transmisión
Métodos PCR: Espoligotipo
Examen de patrón de espacios en ADN
Laboratorio asigna número de 15-dígitos basado en
presencia o ausencia de espacios en puntos
específicos
Espoligotipo: 000000000003771
Métodos PCR: MIRU-VNTR
Examina el número de secuencias repetidas en puntos
específicos del MIRU-VNTR
Esquemas estandarizados internacionalmente
consisten de conjuntos de 12, 15 y 24 puntos
EEUU usó conjunto de 12-puntos hasta el 2009,
cuando se expandió a conjunto de 24-puntos (MIRU24)
Número de puntos de secuencias repetidas son
concatenatenados en dos secuencias de 12-dígitos
232234253322 334564611872
Servicio Nacional de Genotipo TB (NTGS)
Comienza en 2004
Dos laboratorios bajo contrato proveen servicio de
genotipo centralizado
Genotipado en base a PCR, rutinariamente aplicada
a todo primer aislado de M. tuberculosis
RFLP disponible en casos limitados, basado en
pedidos específicos
Algoritmo de Laboratorio,
Programa CDC de Genotipo para TB
Pruebas en dos niveles para optimizar el poder
discriminatorio
PCR
Espoligotipo
MIRU–VNTR
RFLP basado en IS6110
Limitado a cepas iguales en ambas pruebas PCR
Depende de solicitud del programa TB