Secuenciacio´ n de alto rendimiento en el diagno´ stico clınico

Secuenciacio´ n de alto rendimiento en el diagno´ stico clınico

Q&A
Clinical Chemistry 61:1
41–49 (2015)
Secuenciación de alto rendimiento
en el diagnóstico clı́nico:
Experiencias de los primeros usuarios
Moderadors: Elaine Lyon1,2* y Franklin R. Cockerill III3,4,5
Expertos: Sherri J. Bale, Carol Beadling,7 Lynn Bry,8 Jill Hagenkord,9 Shashikant Kulkarni,10 Richard Press,11
y Glenn E. Palomaki12
6
La tecnologı́a de secuenciación de alto rendimiento
(NGS)13, también conocida como secuenciación masiva en paralelo (MPS), está siendo incorporada rápidamente a las pruebas clı́nicas de laboratorio. Las aplicaciones actuales incluyen la detección de variantes de
estirpe germinal en enfermedades hereditarias, variantes somáticas en el cáncer, subpoblaciones de ADN
libre de células circulantes y genomas microbianos o
virales únicos en infecciones o genomas metamicrobianos en la flora humana normal o alterada. Cada aplicación es única y presenta sus ventajas y desventajas. La
complejidad de los procesos de NGS (preparación de
muestras y pruebas y análisis de grandes cantidades de
datos) conduce a los desafı́os en la validación, control
de calidad e interpretación de datos más allá de lo que
han encontrado previamente los laboratorios clı́nicos.
En la presente publicación de Preguntas y respuestas,
diferentes expertos en cada área (enfermedades hereditarias, cáncer, enfermedades infecciosas y pruebas de
embarazo) responden preguntas pertinentes a la adaptación de esta tecnologı́a a las pruebas clı́nicas y sus
respuestas representan sus propios puntos de vista y
experiencias especı́ficas de cada disciplina. Los expertos y sus áreas de interés son: Sherri Bale y Jill Hagenkord (enfermedades hereditarias); Richard Press,
Carol Beadling y Shashikant Kulkarni (oncologı́a);
Lynn Bry (enfermedades infecciosas) y Glenn Palomaki (pruebas genéticas prenatales no invasivas de
plasma materno). Las experiencias y opiniones que estos comparten demuestran la diversidad de los desafı́os
y ofrecen ejemplos de cómo los están abordando.
1
University (Departamento de Patologı́a e Instituto Oncológico Knight, Universidad
de Ciencias y Salud de Oregón), Portland, OR; 12 Department of Pathology and
Laboratory Medicine (Departamento de Medicina de Laboratorio y Patologı́a).
Women & Infants Hospital, Alpert Medical School at Brown University (Hospital para
Mujeres y Lactantes, Facultad de Medicina Warren Alpert de la Universidad Brown),
Providence, RI.
* Dirigir correspondencia para estos autores a: ARUP Laboratories, 500 Chipeta Way, Salt
Lake City, UT 84108. Fax 801-584-5207; correo electrónico [email protected].
Recibido para la publicación el 14 de agosto de 2014; aceptado para la publicación el 9 de
septiembre de 2014.
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
13
Abreviaturas no estándar: NGS, secuenciación de alto rendimiento; MPS, secuenciación
masiva en paralelo; NHGRI, Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano;
NIBSC, Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas; FFPE, incluido en parafina y
fijado en formalina; WES, secuenciación del exoma completo; CNV, variante en el
número de copias; CAP, Colegio Americano de Patólogos; SNV, variante de nucleótido
único; HMP, Proyecto de Microbioma Humano; LIS, sistemas de información para laboratorio; ACMG, Colegio Americano de Genética Médica y Genómica; GUS, gen de significancia incierta; VUS, variantes de significancia incierta; IF: hallazgos casuales;
HGMD: Base de Datos de Mutaciones de Genes Humanos; ccf: libre de células circulantes; NIPD: diagnóstico prenatal no invasivo; NIPT, prueba prenatal no invasiva (NIP);
NIPS, examen de detección prenatal no invasivo (NIP).
Associate Professor of Pathology, University of Utah School of Medicine (Profesora
Asociada de Patologı́a, Facultad de Medicina de la Universidad de Utah), Salt Lake
City, UT; 2 Medical Director, Molecular Genetics, ARUP Laboratories (Directora
Médica, Genética Molecular, Laboratorios ARUP), Salt Lake City, UT; 3 Professor and
Chair, Department of Laboratory Medicine and Pathology (Profesor y Jefe, Departamento de Medicina de Laboratorio y Patologı́a); 4 President and CEO, Mayo Medical
Laboratories, Mayo Clinic (Presidente y Director Ejecutivo, Laboratorios Médicos,
Clı́nica Mayo), Rochester, MN; 5 Afiliaciones actuales: Quest Diagnostics (10/1/14);
6
Managing Director (Directora Ejecutiva), GeneDx, Gaithersburg, MD; 7 Assistant
Director, Pathology Translational Research Laboratory, Knight Diagnostic Laboratories, Oregon Health & Science University (Directora Asistente, Laboratorio de Investigación Traslacional en Patologı́as, Laboratorios Knight Diagnostic Laboratories,
Universidad de Ciencias y Salud de Oregón), Portland, Oregon; 8 Director, Center for
Clinical and Translational Metagenomics, Brigham & Women’s Hospital and Associate Professor of Pathology, Harvard Medical School (Directora, Centro para la Metagenómica Clı́nica y Traslacional, Hospital Brigham y de Mujeres y Profesora Asociada de Patologı́a, Facultad de Medicina de Harvard), Boston, MA; 9 Chief Medical
Officer (Directora General de Sanidad), 23andMe, Inc; 10 Associate Professor, Pathology and Immunology, Pediatrics and Genetics, Director of Cytogenomics and
Molecular Pathology, Washington University School of Medicine (Profesor Asociado,
Patologı́a e Inmunologı́a, Pediatrı́a y Genética, Director de Citogenómica y Patologı́a
Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington), St. Louis, MO;
11
Department of Pathology & Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science
Validación: La validación analı́tica mide las
caracterı́sticas de desempeño de una prueba clı́nica en
términos de exactitud y reproducibilidad (precisión). En
la secuenciación genómica, la sensibilidad analı́tica describe la capacidad del análisis para detectar variantes
genéticas cuando están presentes y la especificidad define
la capacidad para identificar de forma correcta una
secuencia “normal” (natural). Si bien la tecnologı́a de
secuenciación genómica se encuentra avanzada, las regiones del genoma continúan siendo problemáticas.
41
Q&A
1: ¿Cuál ha sido el aspecto más complejo en la validación de un análisis con MPS? ¿Cómo ha logrado el
laboratorio cumplir con estos requisitos?
Sherri Bale: El principal
problema en la validación
de un análisis con MPS es
que este es un proceso iterativo que involucra optimizar tres componentes a
la vez: la plataforma de
secuenciación, el panel o
la prueba de genes
especı́ficos, y la segmentación (pipeline) bioinformática. Cada vez que
una parte del sistema se “ajusta” (por ejemplo, cambio de
la cantidad de ADN de inicio en el paso de enriquecimiento del objetivo o adición/cambio incluso de un imprimador único en un grupo de cientos de genes, o ajuste
de un parámetro en la segmentación bioinformática),
debe volver a validarse el análisis global completo. Dado
que la realización de estas pruebas demora de dı́as a semanas y su costo es considerable, la validación de un
panel de siguiente generación es demandante y costosa.
Jill Hagenkord: Uno de
los aspectos más difı́ciles
de la validación ha sido
encontrar muestras con
indeles más amplios (10 –
100 bp) para determinar
con confianza la sensibilidad y especificidad de
dichas variantes. He utilizado el ADN de genomas correctamente caracterizados
(p.
ej.,
identificación de catálogo NA19240, NA12878) del National Human Genome Research Institute (NHGRI)
Sample Repository for Human Genetic Research, Human Variation Subcollection [Depósito de Muestras del
Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI) para la Investigación Genética Humana, Subgrupo de Variación Humana], almacenado en
el Coriell Institute (Instituto Coriell). Estos genomas
contienen miles de variantes publicadas, que representan
un rango de tipos de variantes en las regiones codificadas
y no codificadas del genoma. Los genomas de individuos
relacionados también están disponibles para posibilitar
los cálculos de concordancia y fases mendelianos. También he usado muestras del National Institute for Biological Standards and Control (Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas, NIBSC). Las variantes
validadas en estos genomas tienden a ser aquellas que son
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más fáciles de detectar y denominar mediante NGS; por
tanto, ampliamos la validación con muestras que presentan resultados positivos conocidos de una variedad de
trastornos genéticos.
Richard Press y Carol
Beadling: En nuestro
laboratorio, que se ha restringido a la NGS de puntos calientes de mutaciones causados por el cáncer,
el desafı́o más complejo de
la validación de análisis ha
sido identificar la “veracidad”; es decir, un conjunto
de muestras o datos de
secuencia de referencia
que contengan una amplia heterogeneidad de variantes
de secuencias conocidas. El ajuste sistemático de varios
parámetros de segmentación del análisis de datos y mesas
de laboratorio por vı́a húmeda para optimizar la generación de denominaciones de secuencias “correctas” de
cada iteración de análisis sucesivos es simple; sin embargo, para identificar la iteración que proporciona la
sensibilidad/especificidad analı́tica óptima, resulta esencial conocer la verdadera denominación de cada base en la
secuencia objetivo. Habitualmente, la comunidad de
laboratorio ha definido como “verdad” al resultado
analı́tico de acuerdo general (es decir, la gran mayorı́a)
que se desprende de un variedad de laboratorios y métodos diferentes. Dado que, para la NGS, la denominación
de secuencias final puede variar según el tipo de muestra
(incluidas en parafina y fijadas en formalina [FFPE] comparadas con frescas), los objetivos de secuenciación previstos (diferentes puntos calientes dirigidos para cada tipo
de tumor), el método de preparación de genotecas (RCP
basada en amplicones comparada con captura de
hı́bridos) y la plataforma de secuenciación, la definición
de un consenso de “secuencia real” se ha convertido en un
desafı́o imponente.
Gracias a nuestro amplio archivo de muestras de
cáncer con mutaciones confirmadas, pudimos determinar la sensibilidad y reproducibilidad de la detección
basada en NGS para estas variantes comunes (y solo estas
variantes) en diferentes tipos de tumor. Asimismo, pudimos confirmar la especificidad de cualquier variante
nueva identificada mediante NGS en una plataforma alternativa (principalmente secuenciación de Sanger). Sin
embargo, dada la limitada cantidad de puntos calientes
de mutaciones anteriormente evaluados, no hubo (y sigue
sin haber) una manera posible de descartar las denominaciones negativas falsas obtenidas mediante NGS en
otras posiciones. De forma similar, dado que hemos ampliado nuestros paneles dirigidos para incluir más genes,
el potencial de denominaciones negativas falsas en posi-
Q&A
ciones anteriormente no dirigidas continúa siendo una
preocupación teórica. Una solución que se encuentra lejos de ser la óptima es determinar la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para distintas “clases” de mutaciones. Por ejemplo, agrupamos los datos de validación
de todos los cambios de nucleótido único, todas las inserciones (de un tamaño máximo) y todas las eliminaciones
(de un tamaño máximo) suponiendo que la segmentación del análisis y la quı́mica de la secuenciación serán
igualmente eficaces en la detección de todas esas mutaciones dentro de cada una de esas clases.
Shashikant Kulkarni: La
secuenciación profunda
con MPS puede detectar
variantes de bajo nivel
(frecuencia alélica ⬍ 5 %).
Los métodos ortogonales
de referencia como la
secuenciación de Sanger
no tienen la capacidad de
verificar estas variantes de
bajo nivel.
La disponibilidad de
muestras de controles positivos para la validación fue el
problema más difı́cil de superar. Nos pusimos en contacto con varios laboratorios homólogos para el intercambio de muestras y resultó difı́cil encontrar controles positivos para diversos genes.
Cuando nuestro laboratorio comenzó a ofrecer las
pruebas de MPS en 2011, no existı́an las estirpes celulares
de referencia con un conjunto de datos de variantes de
referencia que los laboratorios que ofrecı́an MPS pudieran usar para establecer la precisión de sus análisis. Desde
entonces, el programa GetRM (Programa de material de
referencia genética) del CDC y NIST ha publicado conjuntos de datos de referencia hologenómicos en varias
estirpes celulares del mapa de haplotipos que podrı́an
usarse para la validación de análisis. Recientemente, ciertas entidades comerciales han comenzado a ofrecer material correctamente caracterizado preparado a partir de estirpes celulares en varios formatos de muestras (bloques
incluidos en parafina y fijados en formalina, suspensiones
celulares). También se encuentran disponibles en una
variedad de combinaciones de variantes para validar los
lı́mites de detección.
Lynn Bry: Fuera de los análisis de determinación de
genotipos virales, no contamos con herramientas informáticas, equipos o plataformas aprobados por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EE.
UU. para estudios metagenómicos o secuenciación de
genomas patógenos. Asimismo, es posible que no contemos con genomas de referencia o contenido curado de-
sarrollado a un grado que respalde los análisis con el nivel
de las CLIA.
Parámetros de calidad o pruebas de capacidad: Los
laboratorios clı́nicos supervisan las caracterı́sticas de desempeño de sus análisis. Los análisis de secuenciación genómica
pueden requerir parámetros diferentes o adicionales para
garantizar la calidad de los análisis.
2: ¿Qué parámetros de calidad supervisa habitualmente su laboratorio para cada paciente o para cada
serie? ¿Cómo cumplen con los requisitos de las pruebas de capacidad o su evaluación alternativa?
Sherri Bale: Para nuestros paneles NextGen (de siguiente generación), supervisamos la calidad de la secuenciación, la amplitud del alcance y la cantidad de amplicones que requieren relleno de Sanger. Para nuestras
pruebas de secuenciación del exoma completo (WES),
supervisamos la amplitud de las proporciones heterocigótico/homocigótico bajo el alcance (alcance medio
ası́ como el porcentaje del exoma cubierto en 1⫻, 10⫻) y
la detección de variante en el número de copias (CNV).
La prueba de capacidad (o evaluación alternativa) de
los paneles está realizada por el departamento de garantı́a
de calidad (QA)/control de calidad (QC) mediante la
selección de muestras de pruebas clı́nicas internas previas
que representan una amplia variedad de genes y tipos de
variantes, y su posterior envı́o a través del laboratorio en
forma enmascarada debido a que son muestras de capacidad. Para la secuenciación del exoma completo, participamos en intercambios de muestras con un grupo de 5
laboratorios de secuenciación del exoma completo a
través del College of American Pathologists (Colegio
Americano de Patólogos, CAP) y evaluamos la consistencia de la identificación de la variante de nucleótido único
(SNV).
Jill Hagenkord: Para los parámetros de calidad del paciente, usamos huellas de ADN, comprobación de género, comportamiento genómico previsto (como proporción heterocigótico/homocigótico y cociente de
transición/transversión), contaminación y sesgo de GC.
Para las puntuaciones de calidad de las variantes, usamos
porcentajes de lectura alélica y alcance. Para los parámetros de la realización de la serie, usamos métricas de captura y alineación.
Las huellas de ADN y las comprobaciones de género
pueden confirmar que la muestra no se intercambió durante el procesamiento. Se calcula un ı́ndice de contaminación general al evaluar las lecturas de referencia en las
ubicaciones de todas las denominaciones de variantes homocigóticas. Un exceso (más allá de lo que se esperarı́a de
un error aleatorio) en los alelos de referencia indica la
presencia de un segundo genoma que sesga las denomiClinical Chemistry 61:1 (2015) 43
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naciones en desacuerdo. Esta metodologı́a ofrece una adecuada estimación del porcentaje de contaminación en
bajos niveles de contaminación (⬍5 %); sin embargo, la
medición es menos precisa en el caso de mayores niveles
de contaminación. El aumento en las proporciones heterocigótico/homocigótico también indica mayores niveles
de contaminación.
Si bien el genoma humano contiene un rango esperado de los diferentes tipos de variantes genómicas, el
rango esperado puede variar según la etnia, que puede
funcionar como métrica de control de calidad. Habitualmente, los individuos de ascendencia africana presentan
una mayor diversidad de variantes en comparación con
los individuos de ascendencia caucásica. Se necesitan
diferentes rangos previstos para los genomas africanos y
no africanos en relación con recuentos de indeles/SNV,
proporciones heterocigótico/homocigótico y tasas novedosas. Un valor uniforme y especı́fico que puede usarse
para medir la precisión de la denominación es la proporción entre las denominaciones de SNV de transición y las
de transversión, las que en genomas humanos solo
deberı́an variar en un rango muy reducido. Un cambio
perceptible en dicha proporción indica un sesgo de denominación sistemático. Las cifras altamente reducidas
de polimorfismos de nucleótido único son un indicador
de falta de sensibilidad.
La localización del sesgo de GC puede proporcionar
información sobre la calidad de la preparación de muestras y la uniformidad del alcance. El alcance puede
medirse a lo largo de 2 dimensiones: extensión, o qué
porcentaje del genoma se denomina, y amplitud, o qué
cantidad de lecturas superpuestas conforman las denominaciones en cada ubicación. Para la medición de la extensión, se pueden usar las bases seleccionadas porcentuales.
Para la medición de la profundidad, se puede usar el
recuento general de bases asignadas y el porcentaje de
regiones dirigidas en las que la amplitud de la lectura es
⬎20.
Richard Press y Carol Beadling: Inicialmente, las
muestras de ADN obtenidas mediante FFPE (o frescas) se
cuantifican con fluorómetro, dado que las mediciones
espectrofotométricas de A260/280 pueden valorar de
forma excesiva las concentraciones de ADN en un valor
diez veces mayor o superior. Utilizamos paneles de
secuenciación dirigida mediante amplicones de RCP y las
genotecas de secuenciación se cuantifican mediante
qPCR (RCP en tiempo real cuantitativa) para verificar las
cantidades óptimas de plantillas modificadas por adaptador antes de la secuenciación. Después de la secuenciación, controlamos la amplitud de lectura de secuencia
promedio por amplicón, el porcentaje de lecturas en el
objetivo, la amplitud de lectura promedio y la calidad de
lectura para cada muestra. Con base en las estimaciones
estadı́sticas, las 450 lecturas de AQ20 son suficientes para
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detectar un alelo variante en un 5%. Obtenemos aproximadamente 1500 lecturas en promedio por amplicón
(más para muestras de leucemia en fresco), de modo que
⬎95 % de los amplicones presentan ⬎500 lecturas. Las
genotecas de amplicones habitualmente generan ⬎95 %
de lecturas en el objetivo. Asimismo, para cada muestra,
examinamos manualmente la distribución del tamaño de
amplicones secuenciados para detectar valores atı́picos.
Para la prueba de capacidad, hemos realizado intercambios de muestras externas. También usamos muestras enmascaradas que se evaluaron en otras plataformas (o la
misma), ası́ como muestras de referencia (Coriell HapMap) disponibles comercialmente.
Shashikant Kulkarni: Las métricas de calidad se supervisan para cada paciente y se comparan con los promedios
de referencia: total de lecturas, porcentaje asignado al
genoma, porcentaje de lecturas asignadas que están en el
objetivo, cantidad de lecturas totales en el objetivo, porcentaje de lecturas en el objetivo que son únicas, media de
calidad de la asignación, porcentaje de posiciones únicas
con 50⫻, 400⫻ y 100⫻ (amplitud del alcance) y alcance
único promedio.
Lynn Bry: En el caso de los agentes infecciosos, observamos los parámetros de calidad estándar (puntuaciones
Phred, etc.) para la calidad de la secuencia y el alcance, y
añadimos controles conocidos a cada serie para evaluar el
desempeño de los procesos técnicos y bioinformáticos
dentro las series y entre estas. También evaluamos el estado del contenido curado usado en los análisis; es decir,
mediante secuencias de referencia a fin de generar un
árbol filogénico para la asignación de secuencias de un
organismo desconocido como parte de una identificación
microbiana para detectar posibles genes de resistencia y
modificadores de genes de resistencia conocidos. Si bien
el contenido de referencia para virus tales como VIH y
VHC (virus de la hepatitis C) es adecuado desde hace más
de una década de uso clı́nico, la amplitud y calidad del
contenido de otros virus, bacterias y patógenos eucarióticos pueden ser ampliamente variables.
Fuera de la determinación de genotipos virales basados en Sanger, no existen programas de pruebas de capacidad en Estados Unidos para las enfermedades infecciosas con NGS. En diversos casos tomaremos
organismos de referencia que se sometieron a secuenciación genómica o generaremos comunidades definidas
para la caracterización filogenética de genes 16S rARN y
análisis metagenómicos. El Proyecto de Microbioma Humano (HMP) creó ciertos materiales de prueba y el NIST
trabaja activamente en cepas bacterianas correctamente
curadas.
Informática: La informática ha sido esencial en la administración de la cantidad de datos generados y las segmenta-
Q&A
ciones informáticas se han elaborado dentro del laboratorio o
en forma externa mediante compañı́as de desarrollo de programas informáticos.
3: ¿Cuáles percibe usted que son los requerimientos de
las segmentaciones informáticas y cuál es su enfoque?
¿Cómo evalúa la calidad de dichas segmentaciones?
Sherri Bale: Si bien hemos elaborado gran parte de la
segmentación de forma interna, también hemos integrado ciertos programas informáticos de fuente abierta o
con licencia. Hemos evaluado nuestras segmentaciones
mediante el análisis de muestras de pruebas de capacidad
y en comparación con programas informáticos recientemente disponibles (comerciales generalmente) al analizar
nuestros datos con versiones beta de programas informáticos nuevos a medida que están disponibles. No
lanzamos nuestras segmentaciones con programas informáticos actualizados o nuevos hasta que se haya finalizado la validación completa (consulte la Pregunta 1).
Richard Press y Carol Beadling: Evaluamos la calidad
de las segmentaciones informáticas mediante la comparación de la sensibilidad/especificidad para la detección
de variantes conocidas, ası́ como la velocidad y la facilidad de integración de la segmentación en las secuencias
de trabajo de laboratorio actuales. Las nuevas versiones de
cualquier algoritmo de análisis se validan antes del uso
clı́nico mediante (a) un nuevo análisis “con simulación
virtual” de los archivos de datos primarios obtenidos del
secuenciador de archivo y (b) una nueva secuenciación de
muestras en el “laboratorio húmedo” con genotipos
conocidos. Un desafı́o persistente con estas validaciones
frecuentes de segmentaciones de análisis nuevos (presumiblemente mejoradas) continúa siendo nuestra incapacidad para determinar de manera definitiva si las nuevas
variantes identificadas por la nueva segmentación, y no
identificadas previamente por otras metodologı́as o versiones de segmentaciones anteriores son realmente verdaderos positivos. Pueden confirmarse las nuevas variantes supuestas por otros métodos (habitualmente
secuenciación de Sanger) pero solo si otros métodos están
disponibles y son viables. Las nuevas versiones de lı́neas
en desarrollo de análisis dan como resultado una lista más
amplia de mutaciones confirmadas en comparación con
variantes de eliminación de versiones anteriores, particularmente para inserción, de tamaños progresivamente
mayores.
Shashikant Kulkarni: La MPS usa una secuencia de trabajo
informática compleja desde la alineación de la secuencia
conforme al genoma de referencia hasta el uso de varios
algoritmos y herramientas para detectar variantes. Se utilizan
herramientas informáticas independientes para la detección
de translocaciones, inserciones-eliminaciones pequeñas,
inserciones-eliminaciones más amplias y CNV; y además,
las herramientas se optimizan de forma frecuente para la
detección de variantes somáticas en comparación con variantes en la estirpe germinal. Cualquier cambio en la segmentación analı́tica completa, ya sea un cambio de versión
de herramienta, cambio de parámetro, cambio de filtro, etc.,
está sujeto a la nueva validación del análisis o la nueva verificación según la magnitud del cambio (p. ej., un denominador de variante diferente puede requerir una revalidación
más amplia, mientras que una actualización menor puede
requerir una nueva reconfirmación). Luego de la adecuada
revalidación o reconfirmación, se define la versión de la segmentación, se fija y se implementa para la producción
habitual.
Lynn Bry: La informática puede significar varias cosas:
en el contexto de las pruebas de genómica clı́nica para
agentes infecciosos, los aspectos de la “informática para
patologı́a” se relacionan con la forma en que se integran
las pruebas genómicas dentro de los procesos de trabajo
existentes en un laboratorio de diagnóstico molecular o
ClinMicro, dado que los sistemas de información para
laboratorio (LIS) deben tener puntos donde las pruebas
incluirán estos análisis moleculares complejos, registrarán
la lista de tareas de muestras para las pruebas, recibirán un
resultado que puede informarse, integrarán los hallazgos
moleculares o genómicos con otra información
fenotı́pica y manejarán la facturación. Si bien algunos de
estos elementos pueden realizarse en el LIS, ningún sistema clı́nico de proveedor administra actualmente la totalidad de los datos de bioinformática, informática y
almacenamiento/depósito.
La evaluación de la calidad de las segmentaciones
bioinformáticas depende de la cuestión clı́nica o de investigación. Se necesita una comprensión total de las fortalezas y debilidades de los algoritmos y métodos generales.
Las secciones de bioinformática de la lista de comprobación para NGS de CAP proporciona un punto de partida
general para el desarrollo y la administración de segmentaciones, incluidos aquellos para las pruebas de enfermedades infecciosas. Estos elementos cubren requerimientos comunes tales como documentación de
segmentaciones, validación, desarrollo de un programa
de gestión de calidad y contar con un plena trazabilidad
de lo que se realizó en cada muestra/caso, etc.
Desafı́os de los diferentes tipos de muestras:
4: ¿Cuáles son los desafı́os de los diferentes tipos de
muestras: para tejido tumoral (cuestiones de muestreo, tejido preservado comparado con tejido fresco),
para enfermedades infecciosas?
Richard Press y Carol Beadling: El principal desafı́o
con tejido tumoral incluido en parafina y fijado en forClinical Chemistry 61:1 (2015) 45
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malina es la calidad variable, debido a la fragmentación
del ADN y, en el caso de las muestras de la médula ósea,
la desaminación ocasional. Usamos una amplitud
mı́nima de lectura de NGS de 100 lecturas promedio en
el objetivo para definir la 䡠 “falla” en el alcance. También
marcamos las muestras como erróneas cuando existe evidencia de desaminación (una alta frecuencia de variantes
C⬎T/G⬎A).
Shashikant Kulkarni: Puede realizarse una preparación
guı́a a partir del bloque incluido en parafina y fijado en
formalina para marcar de forma precisa el tumor a fin de
permitir la macrodisección del tumor sin tejido circundante. Esto garantiza el enriquecimiento del ADN tumoral y ayuda a superar ciertos problemas relacionados
con la heterogeneidad tumoral.
Lynn Bry: Las muestras para las pruebas de enfermedades infecciosas pueden abarcar el ácido nucleico de
una cepa aislada microbiana pura; lı́quidos o tejidos con
una baja carga microbiana relacionada con células anfitrionas; muestras no estériles, como heces, en las que
la biomasa de la comunidad de microorganismos comensales puede exceder la de un patógeno por órdenes
de magnitud. Asimismo, debemos considerar el rango
de concentraciones de GC porcentuales, longitudes
genómicas, transposones y regiones repetidas en análisis al seleccionar una metodologı́a para detectar
caracterı́sticas distintivas microbianas.
El manejo adecuado de los materiales antes de las
pruebas, particularmente al considerar el material incluido en parafina y fijado en formalina, también resulta
esencial. Abundan oportunidades de contaminación medioambiental por manipulación en el punto de obtención
y más allá. Por lo tanto, siempre es necesario tener cuidado con las posibles caracterı́sticas distintivas, particularmente si se usan métodos metagenómicos amplios, o
incluso la amplificación de objetivos conservados como
por ejemplo 16S rARN.
Notificación e interpretación de la importancia de
genes y variantes: Si bien los laboratorios clı́nicos habitualmente usan un sistema de 5 niveles para clasificar variantes
(patógenas, potencialmente patógenas, inciertas, potencialmente benignas y benignas), estas clasificaciones solo son
útiles para los genes conocidos por su relación con la enfermedad. A pesar de que diferentes variantes somáticas evaluadas de forma habitual han demostrado su importancia en la
evolución de la enfermedad o la respuesta al tratamiento, las
aplicaciones de secuenciación genómica descubrirán variantes
nuevas.
5: ¿Cómo evalúa si una variante o un gen en que se
encuentra una posible variante patógena es relevante
para el fenotipo de la enfermedad? Si su laboratorio
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realiza la detección de mutaciones para variantes
somáticas, ¿cómo interpreta las variantes somáticas
que no se describieron previamente?
Sherri Bale: Utilizamos las directrices del American College of Medical Genetics and Genomics (Colegio Americano de Genética Médica y Genómica, ACMG) para
evaluar la patogenia en genes conocidos por su importancia en enfermedades hereditarias. Modificamos dichas directrices un tanto en el caso de los genes conocidos solo
por su relación con el riesgo de evolución de la enfermedad, pero no al nivel de herencia mendeliana, en cuyo
caso informamos las variantes como “alelos de riesgo”.
Jill Hagenkord: El sistema de clasificación de genes por
niveles compara la nomenclatura de clasificación de variantes: causa la enfermedad, probablemente causa la enfermedad, gen de significancia incierta (GUS) y
probablemente no causa la enfermedad. Como en la
clasificación de variantes, aún existe algo de arte en la
clasificación de genes. En esencia, no se puede tener una
variante patógena o probablemente patógena en un
GUS . . . solo se pueden tener variantes de significancia
incierta (VUS) en los GUS. Al diseñar los paneles de
genes, intentamos no incluir los GUS a pesar de que la
demanda del mercado de información, aunque incierta,
puede conducirnos a incluir genes de “caso lı́mite” en un
panel que aumentará nuestra proporción de VUS. Sin
embargo, hemos observado que los médicos que solicitan
paneles se sienten seguros al explicar a sus pacientes la
falta de certeza.
Richard Press y Carol Beadling: Realizamos pruebas de
mutación somática y usamos bases de datos públicas
(COSMIC, My Cancer Genome, Leiden Open Variation Database, dbSNP, 1000 genomes), documentación
publicada (PubMed) e indicadores de pronóstico de consecuencias de mutaciones (SIFT, PolyPhen2) para interpretar las variantes. También consultamos nuestra propia
base de datos histórica interna de variantes y tumores. La
frecuencia de los alelos determinada mediante lectura de
NGS de una variante con frecuencia nos brinda un indicio adicional sobre la importancia del tumor, en comparación con la “masa tumoral” determinada por la
morfologı́a o la citometrı́a de flujos. Por ejemplo, si observamos una nueva variante de la masa de alelos del 50 %
pero la masa tumoral morfológica es solo del 20 %, nos
inclinarı́amos más a denominar a dicha variante como
“estirpe germinal” y probablemente no relacionada con
un tumor. Asimismo, en los casos de leucemia, en que
supervisamos frecuentemente las repuestas moleculares
posteriores al tratamiento mediante estudios de NGS en
serie, la comparación de las frecuencias alélicas de variantes antes y después del tratamiento es otra indicación
útil de patogenia. Una leucemia posterior al tratamiento
Q&A
con un frecuencia alélica persistente del 50 % de una
variante anteriormente “desconocida” se reclasifica mejor
como una variante de estirpe germinal sin relevancia oncógena, particularmente si la carga de la leucemia se ha
reducido considerablemente conforme a lo documentado
por otros métodos. A pesar de estos recursos interpretativos disponibles, aún descubrimos con frecuencia variantes que no se han descripto anteriormente y habitualmente las informamos como con cierta relevancia
patógena “incierta” a oncógena.
Shashikant Kulkarni: No existen actualmente directrices para la clasificación de variantes somáticas. Hemos
modificado las directrices actuales del ACMG para
abordar especı́ficamente los problemas especı́ficos de
tumores.
Lynn Bry: Clı́nicamente, nos concentramos en los objetivos para asistir la identificación de patógenos, la predicción de susceptibilidad o la resistencia al tratamiento. o
producción de toxinas. En el espacio de investigación, se
usan métodos informáticos y de secuencia para evaluar la
estructura de comunidad microbiana; los cambios
dinámicos en ecosistemas anfitriones en relación con una
enfermedad o perturbación; o los cambios en el contenido genético microbiano, las transcripciones y las correlaciones con metabolitos. El objetivo de la investigación es con frecuencia definir los mecanismos por los
cuales las comunidades microbianas contribuyen a una
enfermedad particular. Esta información ayuda a definir
si tales métodos pueden tener utilidad clı́nica. Sin embargo, dado el estado incipiente de la situación, no contamos con normas sobre cómo informar estos últimos
aspectos de forma clı́nica.
Hallazgos casuales: El ACMG ha proporcionado una lista
mı́nima de genes en los que las variantes patógenas se consideran “verificables” al detectarse de forma casual y no en
relación con el motivo de las pruebas.
6: ¿Cuál es el procedimiento de su laboratorio cuando
se detecta una variante casual? ¿Se buscan dichas
variantes? ¿De qué forma ha implementado su laboratorio el informe de hallazgos casuales (IF)? ¿Van
más allá de las recomendaciones del ACMG?
Sherri Bale: Cumplimos con las actuales recomendaciones y la lista de genes del ACMG para el informe de
hallazgos casuales en un paciente al que realizamos
secuenciación del exoma completo mediante la búsqueda
y el informe de variantes patógenas conocidas y esperadas
si el paciente no ha optado por no recibir el informe. Si
también se realizó la secuenciación a los miembros de la
familia mediante secuenciación del exoma completo
como parte de los análisis del probando, los hallazgos
casuales identificados en el probando también se informan al miembro de la familia si está presente. Sin embargo, no evaluamos cada miembro de la familia de forma
independiente para identificar la presencia de hallazgos
casuales que no estaban presentes anteriormente en el
probando.
Jill Hagenkord: El médico y el paciente deben trabajar
en forma conjunta para decidir el tipo y la cantidad de
información preventiva que cualquier paciente particular
puede desear. Deberı́a estar disponible la posibilidad de
incluirse o excluirse de recibir cierto tipo de información
preventiva, en lugar de recibir toda la información o no
recibir nada.
Un método común para buscar variantes patógenas
en la genética preventiva es realizar la comprobación en
varias bases de datos públicas, como ClinVar y la Base de
Datos de Mutaciones de Genes Humanos (HGMD). Si
se informa la patogenia, la evidencia luego se revisa cuidadosamente para confirmar que se ha clasificado apropiadamente y cumple con los criterios del laboratorio
para la patogenia. Los programas informáticos pueden
realizar análisis teniendo en cuenta los criterios preestablecidos para las nuevas variantes patógenas que también se revisan.
Los genes y las variantes incluidos fuera de las recomendaciones del ACMG, tales como el factor V Leiden, HFE (hemocromatosis),14 y las variantes portadoras
comunesentrastornosautosómicosrecesivos(p.ej.,variantes ACOG en el gen CFTR [regulador de la conductancia
transmembrana de la fibrosis quı́stica (cassette de unión a
ATP subfamilia C, miembro7)]) pueden automatizarse
considerablemente para buscar solo una lista de variantes
y podrı́an ofrecerse en un examen preventivo de
detección.
Glenn Palomaki: Si bien
esta cuestión no es directamente pertinente para los
laboratorios que ofrecen
pruebas de ADN libre de
células circulantes (ccf) de
plasma materno, el concepto de hallazgo incidental como parte de la detección prenatal se está
convirtiendo en un tema
de creciente interés. Con
modificaciones menores en la lı́nea e desarrollo de la
bioinformática, se crea la posibilidad de identificar los
14
Genes humanos: HFE, hemacromatosis; CFTR, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quı́stica (cassette de unión a ATP subfamilia C, miembro7).
Clinical Chemistry 61:1 (2015) 47
Q&A
hallazgos prenatales a los que no se podı́a acceder fácilmente con las anteriores tecnologı́as de detección. Cuatro
laboratorios comerciales ubicados en Estados Unidos han
introducido el suministro de sexado fetal confiable e información sobre aneuploidı́as sexuales como parte de las
pruebas habituales. Sin embargo, los estudios de validez
clı́nica publicados han sido relativamente reducidos y los
debates en relación con los beneficios y peligros son escasos. Los objetivos más recientes de los análisis de detección son las grandes microeliminaciones, tales como el
sı́ndrome 22p11 (DiGeorge), aunque aún no hay publicaciones revisadas por pares disponibles en relación con el
desempeño, especialmente en la población general. La
mayor parte de nuestra información sobre la prevalencia y
el alcance de los sı́ntomas en relación con el sı́ndrome
22p11 proviene de estudios de individuos clı́nicamente
afectados o de cohortes con hallazgos irregulares, tales
como anomalı́as cardiacas fetales. A diferencia de las
pruebas del sı́ndrome de Down, en las que la evolución
natural de dicho trastorno es ampliamente conocida, no
se han informado estudios demográficos sobre la prevalencia del sı́ndrome 22p11. Por lo tanto, es posible que
una proporción desconocida de individuos con este
genotipo pueda presentar hallazgos fenotı́picos relativamente menores. En consecuencia, los laboratorios que
ofrecen pruebas del genoma/exoma completo deben considerar lo que se deberı́a informar; los laboratorios también deben considerar lo que aún podrı́a no estar listo
para informarse de forma habitual.
Richard Press y Carol Beadling: Si bien las recomendaciones sobre hallazgos casuales del ACMG excluyen
especı́ficamente las muestras tumorales, varios de los
genes en nuestros paneles se incluyen en la lista “que se
debe informar” del ACMG. Sin embargo, algunas mutaciones identificadas en las muestras de cáncer pueden de
hecho ser de estirpe germinal y algunos subgrupos reducidos de estas variantes de estirpe germinal pueden ser
patógenas en términos oncogénicos. Si bien con frecuencia contamos con algunos indicadores indirectos respeto
de la naturaleza de la estirpe germinal (en comparación
con la somática) que identificamos (bases de datos, frecuencia alélica, persistencia luego del tratamiento), el enfoque directo hacia este tema (la determinación de
genotipos de una muestra no tumoral coincidente de
cada paciente) no se realiza de forma habitual en nuestro
laboratorio. En la circunstancia poco común de que detectemos una mutación patógena que puede ser de estirpe
germinal, incluimos recomendaciones para la asesorı́a
genética y las pruebas de estirpe germinal en el informe de
acuerdo con el criterio del patólogo encargado de realizar
el informe. Estamos en profundo desacuerdo con la opinión paternalista del ACMG de que el laboratorio
deberı́a estar siempre obligado a informar cualquier hallazgo genético casual, particularmente cuando la pre48
Clinical Chemistry 61:1 (2015)
gunta especı́fica que se formula por el médico de referencia/
paciente está relacionada con el cáncer (como en nuestro
laboratorio) y el fenotipo relacionado de la mutación de
estirpe germinal no guarda relación con el cáncer.
Shashikant Kulkarni: En ocasiones, observamos posibles hallazgos de tumores de estirpe germinal a los que se
les realiza seguimiento en el paciente y los miembros de la
familia en riesgo mediante la evaluación de una muestra
de estirpe germinal sana.
Validez/utilidad clı́nica: Los laboratorios clı́nicos tienen
la responsabilidad de ofrecer pruebas cuya validez clı́nica se
ha demostrado (es decir, el gen está relacionado con la enfermedad). Sin embargo, los pagadores también desean que
estas pruebas demuestren utilidad.
7: ¿Cómo garantizan los laboratorios clı́nicos la validez clı́nica de los análisis de secuenciación genómica?
¿Cómo pueden ayudar los laboratorios clı́nicos a otros
a comprender la utilidad clı́nica de una prueba?
Según su experiencia, ¿tiene alguna sugerencia general para garantizar (o mejorar) el reembolso?
Sherri Bale: Los laboratorios clı́nicos deberı́an estar
preparados para demostrar a los pagadores la evidencia de
la utilidad clı́nica de las pruebas que ofrecen. Esto
incluirı́a múltiples ensayos publicados en revistas de renombre donde se utilizan diferentes pacientes/grupos de
datos. Los pagadores deben comprender la complejidad
de las pruebas, que incluyen el costo de desarrollo, validación, realización, interpretación e informe, para ası́ respetar nuestras solicitudes de reembolso. Siempre que sea
posible, invitar al responsable de la toma de decisiones de
la organización pagadora a su laboratorio y permitirle que
esté al tanto del estado de la realización de estas pruebas.
Jill Hagenkord: La utilidad clı́nica presenta diferentes
definiciones para los diferentes interesados. Los pagadores tienden a definir la utilidad clı́nica en términos de si
el resultado de la prueba cambiará o no el tratamiento.
Sin embargo, en las pruebas de enfermedades hereditarias, la utilidad de una prueba puede variar según el caso.
Realizamos pruebas de diferentes genes en ciertos momentos por motivos diversos; por tanto, no existe una
respuesta única y adecuada respecto de si un gen tiene o
no utilidad clı́nica.
Varios trastornos genéticos no tienen un tratamiento
curativo o de mejoramiento; sin embargo, aún resulta de
gran utilidad obtener el diagnóstico correcto, anticipar el
curso de la enfermedad, tener la oportunidad de evaluar a
los miembros de la familia en riesgo y comprender el
riesgo para los futuros embarazos, ası́ como la información preventiva disponible a través de un examen de
hallazgos casuales. Es posible que los pagadores no estén
Q&A
de acuerdo con que esta información cumple con los
criterios de utilidad clı́nica; sin embargo, esta presenta
una utilidad personal manifiesta para los pacientes y los
miembros de su familia. Asimismo, con los códigos de
CPT moleculares (terminologı́a de procedimientos actuales) que hoy son especı́ficos de los analitos y transparentes, los pagadores niegan cada vez más las demandas de
pruebas de enfermedades hereditarias porque estas pruebas no cumplen con la definición estricta de la utilidad
clı́nica.
La falta de reembolso de los pagadores a los médicos
que reciben a estos pacientes en sus clı́nicas o laboratorios
para la realización de las pruebas podrı́a catalizar un nuevo
modelo impulsado por los consumidores para obtener acceso a la información, similar a lo que Uber o Lyft han hecho
en la industria del taxi. Podrı́amos ver una “Uber-ización”
de la información genética personal por la cual el individuo
puede obtener la misma calidad de información de una
forma más adecuada, rápida y económica. Dado que el costo
de la secuenciación continúa reduciéndose, los consumidores podrı́an obtener su información genómica y compartirla con sus prestadores de asistencia sanitaria según sea
necesario con el tiempo. Esta evolución reducirı́a la tensión
entre las definiciones de utilidad clı́nica centradas en el pagador en comparación con las centradas en el paciente.
Richard Press y Carol Beadling: Existe una gran cantidad de datos publicados y directrices de la sociedad profesional de acuerdo general que confirman los beneficios
clı́nicos de la elaboración de perfiles de mutaciones tumorales para la generación de informes directa de tratamientos para el cáncer o la definición de categorı́as de
diagnóstico o pronóstico que afectan el tratamiento de
forma indirecta. A medida que la cantidad de estas mutaciones genéticas “verificables” especı́ficas (y tratamientos orientados dirigidos hacia estas mutaciones) prolifera
rápidamente, ya no se trata de si es necesaria la elaboración de perfiles de mutación para la atención óptima de
los pacientes (claramente lo es) sino que se trata más bien
de escoger los métodos particulares y la cantidad de genes
que se evaluarán. La NGS ofrece la oportunidad de
evaluar diversos genes simultáneamente a un costo comparable al de la realización de solo unos pocos análisis de
gen único y; por tanto, proporciona mayor información
clı́nica verificable por un menor costo general. La secuenciación mediada por NGS de estos genes verificables adicionales (a un costo adicional mı́nimo) también permite
la detección de (a) variantes poco comunes clı́nicamente
relevantes que no serı́a posible con las pruebas de gen
único y (b) mutaciones inesperadas o resistentes a los
fármacos (o sensibles a estos) poco frecuentes que pueden
informar de forma directa el tratamiento o permitir la
participación en ensayos clı́nicos dirigidos en términos
moleculares. Resulta esencial fijar la máxima cobertura
posible para detectar variantes poco comunes, dado que
estas pueden afectar de forma directa el tratamiento y en
forma conjunta dan cuenta de una considerable proporción del total de casos. En lugar de usar múltiples análisis
de gen único para probar de forma colectiva solo una
cantidad limitada de genes, tiene sentido fiscal (y clı́nico)
usar la NGS para secuenciar regiones de objetivos amplios y usar filtros de segmentaciones para revelar solo los
genes “verificables” clı́nicamente relevantes para ese tipo
de tumor especı́fico. Un beneficio adicional de tal enfoque de “red amplia” hacia la elaboración de perfiles de
mutaciones del tumor es la utilización del método de
quı́mica por vı́a húmeda con NGS idéntico en todos los
tumores independientemente del origen del tumor (pero
con una segmentación de análisis especı́fica del tumor).
Dada la frecuencia relativamente baja de una mutación X especı́fica en un tipo de tumor Y especı́fico, no
resulta factible esperar, en forma previa a la decisión de
reembolso de un pagador, la generación de datos basados
en respuestas de ensayos clı́nicos prospectivos, aleatorizados y estadı́sticamente significativos (con datos de
economı́a sanitaria relacionados) para cada uno de los
miles de escenarios de genes/cáncer individuales). En su
lugar, los pagadores deberı́an permitir el uso de una diversidad de datos más amplia en la correlación entre mutaciones de genes y patogenia del cáncer, evolución, diagnóstico, pronóstico y tratamiento, y no necesariamente la
vinculación a un tipo de tumor especı́fico, para tomar
decisiones de reembolso fundamentadas.
Shashikant Kulkarni: Considero que la formación adecuada de los pagadores es inmensamente importante para
garantizar que existe una comprensión adecuada de la
validez y utilidad clı́nicas de la prueba. Esto puede
lograrse mediante el suministro de declaraciones de acuerdo general generadas por sociedades profesionales y
múltiples lı́neas de prueba tales como ensayos publicados
en revistas revisadas por pares, especialmente aquellas que
se focalizan en los estudios centrados en los resultados de
pacientes y la rentabilidad de las pruebas de la NGS.
Lynn Bry: Necesitamos un motivo clı́nico claro para
realizar la prueba y delinear las acciones médicas que se
verán impulsadas por los resultados de la NGS. En el caso
de las pruebas de enfermedades infecciosas, el ejemplo
más claro serı́a la transición de la determinación de
genotipos virales mediante secuenciación Sanger a la
NGS. La indicación clı́nica sigue siendo clara. Asimismo,
un método NGS tiene el potencial de aumentar la sensibilidad de la detección de resistencia, mejorar el desempeño y, como se espera, reducir los costos por prueba.
De lo contrario, la NGS debe considerarse con los
métodos existentes al evaluar la detección de patógenos.
Un pagador no cubrirı́a los costos de un genoma
patógeno cuando la misma información útil en términos
médicos puede obtenerse con métodos moleculares o miClinical Chemistry 61:1 (2015) 49
Q&A
crobiológicos estándar que son actualmente más rápidos
y económicos de realizar. Las oportunidades para la
secuenciación de objetivos múltiples o de genomas
patógenos involucran casos en los que carecemos de
análisis adecuados, como por ejemplo micobacterias de
evolución lenta o detección múltiple de diferentes clases
de patógenos en una muestra.
Hemos obtenido beneficios de la secuenciación de
genomas patógenos para alcanzar los esfuerzos de control
de infecciones, pero dichas pruebas no están asociadas a
los reembolsos. Más bien, debe presentarse el caso ante la
dirección superior sobre los beneficios del uso de métodos fundados en términos genómicos para brindar asistencia en la supervisión y las actividades de control de
infecciones.
presentar una afección susceptible de detección. Sin embargo, dichas pruebas se evaluaron en comparación con las
pruebas invasivas y el cariotipado en lugar de compararse
con las tecnologı́as de detección actuales (pruebas combinadas o integradas). Por lo tanto, algunos médicos dedicados a
este área se sorprendieron al observar los resultados positivos
falsos ocasionales en lugar de impresionarse con la amplia
proporción de mujeres con embarazos de alto riesgo a
quienes se les brindaron de forma correcta estimaciones de
riesgos altamente reducidos y se evitaron los procedimientos
invasivos. Si, en su lugar, las pruebas se hubieran aplicado en
la población general, el mayor desempeño se hubiera
aceptado como el avance real que representa. El obstáculo
más evidente para los exámenes de detección de la población
general es el alto costo de dichas pruebas.
Aceptación de médicos y pacientes de la nueva
tecnologı́a:
Richard Press y Carol Beadling: Si bien se observa un
despliegue publicitario excesivo de esta nueva tecnologı́a, los
comentarios que hemos recibido han sido positivos. Como
resultado de nuestra elaboración de perfiles de mutaciones
del tumor, diversos pacientes con cáncer han recibido tratamientos atención clı́nica eficaces que de lo contrario no hubieran recibido o han reunido los requisitos para participar
en ensayos clı́nicos de estos nuevos tratamientos dirigidos.
Notablemente, varias de estas mutaciones verificables se observaron en genes que habitualmente no se hubieran evaluado mediante análisis de gen único. Una utilidad adicional (y
popular) de estas pruebas ha sido el control en serie (mediante NGS) de las “respuestas moleculares” después del tratamiento“ tradicional (o dirigido), particularmente en pacientes con leucemia mieloide. Dada la gran profundidad de
lectura que brinda la NGS, puede alcanzarse una detección
de enfermedad mı́nima residual sensible y cuantitativa, que
luego permite contar con mayor información sobre opciones de tratamiento.
8: ¿Qué comentarios han recibido de médicos o pacientes sobre estas pruebas? ¿Se “exagera” mucho o el
desempeño de la secuenciación genómica ha satisfecho
o superado las expectativas?
Sherri Bale: Orientamos nuestra comercialización a los
genetistas con amplio dominio de la literatura. No considero que estén desilusionados en absoluto con la información que están recibiendo de los paneles de genes orientados NextGen o WES.
Jill Hagenkord: Es posible que haya una tendencia en los
expertos en áreas ajenas a la genética a considerar que
comprendemos más sobre el genoma que lo que comprendemos. Es responsabilidad de los expertos en genética en las clı́nicas y los laboratorios el determinar las
expectativas, lo que se está realizando de forma responsable. Los médicos que solicitan exomas o paneles de
genes especı́ficos de un trastorno comprenden que
podrı́an obtener una repuesta más rápida que las pruebas
iterativas y podrı́an obtener un diagnóstico que no tuviera alta seguridad en su diagnóstico diferencial original
pero probablemente obtengan más VUS y GUS. La falta
de certeza no es exclusiva de las pruebas genéticas.
Glenn Palomaki: Los intentos iniciales consideraban las
pruebas de ADN libre de células circulantes una prueba de
diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD). Este acrónimo se
ha cambiado a NIPT (prueba prenatal no invasiva) y NIPS
(examen de detección prenatal no invasivo), lo que causa
más confusión dado que los actuales exámenes de detección
en suero/por ultrasonido también cumplen con las definiciones de NIPT/NIPS. Las recomendaciones de las organizaciones profesionales consolidaron la prueba para el uso
actual solo en mujeres a quienes también se les ofreció realizar pruebas de diagnóstico por encontrarse en alto riesgo de
50
Clinical Chemistry 61:1 (2015)
Shashikant Kulkarni: Nuestros médicos, especialmente
los oncólogos clı́nicos, están entusiasmados por tener finalmente las esperanzas de encontrar posibles tratamientos dirigidos u otros cambios en el tratamiento del cáncer
para ofrecer a los pacientes que no responden al tratamiento. Pareciera que aún existe una expectativa poco
realista de lo que estas pruebas pueden proporcionar entre los pacientes y los colegas clı́nicos. Como profesionales de laboratorio, es nuestra mayor obligación transmitir su potencial realista. Necesitamos describir
claramente las plataformas tecnológicas, los métodos de
análisis de datos, los avances consolidados y las posibles
aplicaciones futuras clı́nicas y de investigación de esta
técnica innovadora y emocionante. Finalmente, es necesario reunir evidencia que demuestre las ventajas de valor
y ahorro de costos de la secuenciación.
Lynn Bry: Hace más de 10 años, la determinación de
genotipos del VIH mejoró nuestra capacidad para di-
Q&A
rigir el TARGA (tratamiento antirretrovı́rico de gran
actividad). A pesar de haberse realizado a través de los
métodos basados en Sanger, este continúa siendo el
mejor ejemplo de cómo un enfoque genómico favoreció considerablemente la atención de los pacientes.
Por otra parte, recuerdo las expresiones universales
de emoción la primera vez que revisamos genomas de
patógenos, evaluados bajo un protocolo de investigación
con nuestros colegas en el control de infecciones. Esto
arrojó información nueva en las causas directas de la resistencia microbiana y además nos dejó pensando en
cómo aprovechar de forma eficaz esta información en
actividades de supervisión dentro de las instituciones y
entre estas.
En la era de la NGS, existe sin duda alguna un factor
de admiración en su uso para el diagnóstico. Ante el
despliegue publicitario excesivo, debemos asegurarnos de
la continuidad del diálogo sobre el modo de utilización a
medida que se desarrolla el ámbito.
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que han
contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con
los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la con-
cepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación de
estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación con su contenido
intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo publicado.
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la
presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de
declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de interés:
Empleo o liderazgo: E. Lyon, Universidad de Utah y Association for
Molecular Pathology (Asociación de Patologı́a Molecular); F. Cockerill, Mayo Medical Laboratories, Quest Diagnostics (10/1/14) y editor
invitado, Clinical Chemistry, AACC; J. Hagenkord, 23andMe.
Papel del consultor o asesor: E. Lyon, Complete Genomics y Health
Advantages; F. Cockerill, Roche Diagnostics; S. Kulkarni, Swift Biosciences y Bina Technologies.
Propiedad de acciones: S. Bale, BioReference Laboratories; J. Hagenkord, Invitae y 23andMe.
Honorarios: S. Kulkarni, Novartis, Affymetrix y Agilent; R. Press, Life
Technologies.
Financiamiento de la investigación: E. Lyon, financiamiento institucional del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano; L.
Bry, NIH; G. Palomaki, financiamiento institucional de Natera, Inc.
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: No se declara.
Otras remuneraciones: F. Cockerill, derechos de autor de Roche
Diagnostics.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2014.222687
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