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BIOLOGIA Y CULTIVO DE CÉLULAS EUCARIOTAS
Este texto ha sido traducido a partir de las instrucciones originales de EDVOTEK, con la ayuda
de los alumnos de 1º del CFGS de Laboratorio Clínico y Biomédico del I.E.S. Federico
Mayor Zaragoza (Sevilla) y la alumna del MAES (Máster de Enseñanza) Irene González
Ruiz.
6 grupos de estudiantes
1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo de esta práctica es introducir a los estudiantes en el cultivo de células de insectos
mediante un sistema simple y barato. Los conocimientos básicos de los cultivos celulares se
introducirán con una práctica para estudiar la viabilidad y el crecimiento celular.
2. MATERIAL Y REACTIVOS
A.
B.
C.
D.
E.
Componentes
Células de insecto (Sf9).
Medio de cultivo de células de insecto.
Colorante azul tripán.
Colorante Giemsa.
Tampón Fosfato Salino (PBS).
Frasco cultivo celular (estéril, 25 cm 2) (T-25).
Placas de cultivo celular/Petri (estéril, 60 mm).
Cámaras de recuento celular.
Pipetas grandes de transferencia/Pasteur (estériles).
Pipetas pequeñas de transferencia/Pasteur.
Pipetas de 10 y 25 ml.
Tubos de fondo cónico de 15 ml.
Tubos de fondo cónico de 50 ml (estériles).
Tubo de centrifuga de 1,5 ml
CONSERVACIÓN
Tª ambiente
Nevera (4ºC)
Tª ambiente
Tª ambiente
Tª ambiente
2.1 Material requerido









Recipiente grande con cubierta de plástico para su uso como cámara de incubación o
caja de cartón con tapa (la caja EDVOTEK pueden utilizarse para hacer crecer cultivos).
Etanol 70% en botellas de aerosol.
Metanol.
Pipeta con pera de succión o pipeta automática.
Microscopio de contraste de fase invertida / campo brillante (las células se pueden ver
con un microscopio de estudiante en posición vertical).
Jeringa de 10 ml con una aguja o micropipeta de 1000 µl y puntas.
Rotuladores.
Las gafas de seguridad y guantes desechables de laboratorio.
Mascarilla.
3. INTRODUCCIÓN
El cultivo de células animales es el proceso por el que cientos de células eucariotas, de
docenas de especies diferentes, son estabilizadas y se hacen crecer in vitro (Landecker, 2007).
Los cultivos celulares han desempeñando un papel fundamental en la biotecnología,
farmacéutica, y la investigación básica en ciencias biológicas. En la educación de las ciencias,
los cultivos celulares ofrecen una plataforma para la enseñanza de conceptos esenciales de
biología celular, tales como la arquitectura celular, el comportamiento celular y las alteraciones
que se producen en diferentes estados de una enfermedad. En la investigación farmacéutica,
los cultivos celulares han sido una herramienta aún más determinante sustituyendo los
sistemas procariotas por sistemas totalmente automatizados de alto rendimiento, para la
detección de drogas o fármacos. La comprensión de los procesos biológicos a nivel celular
ofrece la oportunidad de aplicar varios aspectos de la biotecnología en animales y, finalmente,
en los seres humanos. Los estudios de cultivos celulares reducen al mínimo el uso de animales
vertebrados (reduciendo así los costes y evitando por completo cualquier sufrimiento de los
animales), y pueden proporcionar respuestas biológicamente significativos en plazos
razonables, incluidos los estudios eficacia de nuevos fármacos, permitiendo que rápida
identificación de aquellos que son prometedores, facilita en gran medida el desarrollo de la
próxima generación de diagnósticos y terapéuticos.
Hasta la fecha los cultivos celulares no estado muy disponibles para las actividades de
enseñanza en laboratorios de centros de secundaria. Aunque hay algunos experimentos de
cultivo celular, todavía hay muy pocos suministros de laboratorios educativos asequibles para
atender las necesidades de la enseñanza de la biología, la fisiología celular, o cursos de
ciencias multidisciplinares. También se puede usar el cultivo de células para demostrar los
efectos biológicos de los agentes ambientales en diversos procesos celulares, de la salud
general de la célula y, la apoptosis, la mitosis y la diferenciación celular. Otras aplicaciones de
la biotecnología de cultivo de células incluyen modelos para el cáncer y otras enfermedades, el
efecto de los fármacos sobre la biología celular y la producción de productos génicos de alto
valor.
El cultivo de células de insecto se originó por el interés en el desarrollo de medidas de
respuesta para las plagas agrícolas y las células de ovario de la Spodoptera frugiperda (Sf9)
han surgido como un excelente sistema modelo para el examen de los procesos celulares que
se producen en eucariotas superiores (Rhee et al, 2002; Aparna et al, 2003; Mohan et al,
2003) y es ahora ampliamente utilizado para expresar proteínas recombinantes a niveles
elevados (Kulakosky et al., 2003; Wu et al., 2004; Pijlman et al., 2006; Gatehouse et al.,
2008).
La ventaja del cultivo de células de insectos es que las células pueden ser cultivadas sin el uso
de caras y complejas incubadoras que regulen de forma muy estricta la temperatura, la
humedad y CO2 como se requiere para el cultivo de células de mamífero. Los cultivos de
células de insectos pueden ser realizarse en placas de cultivo (petri) a temperatura ambiente,
haciendo de este tipo de células un material ideal para las prácticas de los centros de
secundaria.
En los últimos cinco años, la industria de la biotecnología ha experimentado una escasez de
científicos cualificados de nivel alto y medio. Para satisfacer esta demanda se requiere una
nueva generación de técnicos y científicos que poseen un conjunto de habilidades diverso en
las ciencias de la vida (Timerman, 2007). En el contexto de las aplicaciones comerciales, los
cultivos celulares proporcionan una capacidad a gran escala para producir productos
importantes, tales como anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes que pueden ser
utilizados en la medicina y que pueden ser rápidamente purificados para diversos usos
biomédicos. Se espera que este sector continúe siendo un sector en crecimiento y un motor de
la economía de EE.UU. Un gran número de oportunidades, bien remuneradas, estarán
disponible en esta industria para los estudiantes actuales que estudien estas disciplinas
(Timerman, 2007).
En esta práctica, los estudiantes adquirirán algunas las habilidades prácticas básicas para la
manipulación y el crecimiento del cultivo de células de insecto, el mantenimiento y el examen
de las células, así como recuento de células y la viabilidad celular determinaciones.
4. DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO
El objetivo de esta práctica es introducir a los estudiantes en el cultivo de células de insectos
mediante un sistema simple y barato. Los conocimientos básicos de los cultivos celulares se
introducirán con una práctica para estudiar la viabilidad y el crecimiento celular.
4.1 Organización e implementación previas de la práctica
Los factores que deben considerar para planificar y ejecutar esta actividad con sus estudiantes
son: tamaño de la clase, duración de las sesiones de laboratorio y disponibilidad del
equipamiento.
Antes de comenzar con la actividad, comprobar cuidadosamente que tiene todos los
componentes necesarios del experimento y el equipo necesario. Revise las listas de
componentes y requisitos en el apartado 2 para asegurarse de que tiene el inventario completo
para realizar la actividad.
Las directrices que se presentan en este manual se basan en 6 grupos de laboratorio.
4.2 Precauciones
¡¡NOTA IMPORTANTE!!
Los experimentos con cultivos celulares contienen antibióticos que se utilizan para mantener
los cultivos libres de contaminación. Estudiantes con alergias a antibióticos como la
penicilina o estreptomicina NO DEBEN PARTICIPAR en esta actividad.
1. Se requiere usar gafas y guantes en todo momento.
2. Se recomienda usar bata para evitar manchas.
3. Extremar la precaución cuando se use el equipo en conjunto con el calentamiento de los
reactivos.
4. No pipetear con la boca.
5. Lavar las manos después de manejar los reactivos o material biológico.
6. Desechar adecuadamente los materiales al acabar la práctica:
A. Limpiar el área de trabajo con lejía al 10% y etanol al 70%, o desinfectantes de
laboratorio.
B. Todos los materiales que entren en contacto con las células deben desinfectarse antes de
tirarse a la basura. Desinfectar de una de estas formas:
B.1. Autoclave a 121ºC durante 20 minutos:
 Remover el medio y cerrar el tapón (hasta el primer tope) de los matraces.

Introducir todos los materiales contaminados en una bolsa autoclavable y
desechable.
 Cerrar la bolsa y colocarla en la bandeja de metal para prevenir la posibilidad de
salida de restos del medio a la cámara de esterilización.
B.2. Sumergir en lejía al 10%:
 Sumergir los materiales contaminados en un barreño que contenga lejía al 10%.
 Dejarlos en remojo durante la noche y luego desecharlos.
 Usar guantes y gafas trabajando con lejía. Al finalizar desechar los guantes y
lavarse las manos.
4.3 Requisitos de tiempo (aproximado) de los procedimientos de la práctica
PREPARACIONES ANTES DE LA PRÁCTICA
Profesor


Recuperar las células (1 semana).
Preparar los reactivos para todos los experimentos (1 hora).
PREPARACIONES DURANTE LA PRÁCTICA
Estudiantes
Realizar todos los experimentos sugeridos en el manual (2 semanas), los cuales son:





Aprender a realizar las técnicas asépticas básicas y construir los recipientes de
incubación (1 hora).
Cultivar/subcultivar las células y observarlas (experimento de 1 día).
Tinción Giemsa (2 días de actividad).
La tinción de azul tripán (1 día de actividad).
Generación de la curva de crecimiento (una vez al día durante un máximo de 10
días consecutivos).
4.4 Preparaciones y consideraciones previas. INSTRUCTOR
Antes de empezar cualquier actividad de laboratorio o preparación de reactivo, no se olvide de
seguir las técnicas básicas asépticas mencionadas en el apartado 5.1.
ALÍCUOTAR EL MEDIO
De forma aséptica repartir 20 ml de medio de células del insecto en 6 tubos de 50 ml. Cada
grupo debe tener su propio tubo de medio para reducir la posibilidad de contaminación.
Recordar que se deben usar pipetas estériles o pipetas de un solo uso.
PREPARACIÓN DE LA CÁMARA DE INCUBACIÓN
Preparar un recipiente grande de plástico cubierto con papel de aluminio o una caja de cartón
con una tapa.
NOTA: La caja del kit EDVOTEK también funciona para hacer crecer cultivos.
Todo el grupo puede compartir un único contenedor grande o cada grupo puede crear su
propio contenedor de incubación.
NOTA: Una caja de puntas de micropipeta vacía es una buena incubadora.
INICIACIÓN DEL CULTIVO CELULAR DE INSECTO.
Proporcionar suficientes medios y matraces para inocular inicialmente y alimentar las células 6
veces para los 6 grupos (usar 2 ml de medio fresco cada vez). Se proporciona la clase una
cámara de cultivo de células OptiCell (las células se pueden ver unidas a los lados claros de la
cámara de cultivo OptiCell bajo el microscopio). El kit contiene pipetas desechables calibradas
que pueden ser utilizados para cada experimento si no se dispone de pipetas estériles o
micropipetas. Las células requieren de un tiempo para recuperarse del envío y la manipulación.
a. Pre-caliente el medio de cultivo de células de insecto a temperatura ambiente.
b. Las células de insecto crecen débilmente unidas a la superficie. Golpear suavemente en los
lados de la cámara de cultivo OptiCell para liberar las células.
c. Confirmar el desprendimiento de las células de insecto con un microscopio.
d. Limpiar los puertos verdes de la cámara OptiCell con etanol al 70%. Inyecte 4 ml de aire en
la cámara y retire 4 ml de suspensión celular usando una jeringa de 10 ml.
Cámara OptiCell
e.
f.
g.
h.
Transferir la suspensión de células de insecto en un frasco T25 estéril.
Añadir 2 ml de medio de cultivo celular de insecto fresco en el frasco.
Incubar los frascos T25 en las cámaras de incubación.
Después de 24 horas, las células de insecto deberían haberse unido a la superficie del
frasco. Confirmar esta unión bajo el microscopio.
i. Una vez que las células comienzan a crecer, se pueden dividir en 6 frascos para los
estudiantes. Tocar en el lateral del frasco y pipetear arriba-abajo para liberar las células
de los lados. Tomar 1 ml de las células suspendidas y añadirlo a cada nuevo frasco T25 (que
contenga 4 ml de medio de células de insecto fresco) (si los estudiantes quieren dividir las
células, deben seguir este procedimiento). El volumen final debe ser de 5 ml.
j. En este momento, cuando las células parecen haberse estabilizado y están
creciendo bien, iniciar la práctica del cultivo celular con los estudiantes.
TINCIÓN GIEMSA
Se proporcionan los reactivos suficientes para teñir 6 placas de células.
a. Pedir a los estudiantes que dividan las células en placas de cultivo 24 horas antes de la
tinción (dar tiempo a que las células se unan).
b. Repartir 10 ml de solución de PBS en tubos de 15 ml y 1 ml de colorante Giemsa en tubos
con tapa de 1,5 ml para cada grupo (6 en total).
c. Las células teñidas pueden observarse utilizando un microscopio invertido o estándar (ver el
punto siguiente sobre cómo visualizar las células con un microscopio estándar).
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MATERIALES PARA CONTEO CELULAR Y ENSAYOS DE
VIABILIDAD CELULAR
Para generar un gráfico de la curva de crecimiento celular e identificar las fases de crecimiento
de las células, los estudiantes contarán las células una vez al día durante varios días (hasta 10
días para demostrar toda la curva de crecimiento).
a. Alícuotar tubos individuales con 250 µl azul Tripán para los 6 grupos. Cada grupo también
ha de recibir una cámara de recuento.
b. Los recuentos adicionales de la semana siguiente completarán la curva trazada e ilustrarán
las diferentes fases de crecimiento.
TENER PREPARADO UN MICROSCOPIO COMPUESTO
La mayoría de los experimentos requerirán un microscopio compuesto para observar las
células. Las células se pueden ver con un microscopio compuesto estándar invirtiendo el frasco
T25 y colocándolo sobre la platina del microscopio. La mayoría de las células todavía estarán
unidas al fondo del frasco y se podrán visualizar. Antes de invertir el frasco, asegurarse que el
tapón esté bien colocado. Las células en placas de cultivo de tejidos también pueden ser
observadas antes y después de la tinción invirtiendo la placa y observando las células a través
de la parte inferior de la placa. Asegurarse de que la placa está vacía de todo el líquido antes
de invertirla. Cualquier derrame de células o medios requieren una descontaminación rápida
con lejía o etanol al 70%.
4.5 Libreta de prácticas de los estudiantes
Cada estudiante ha de anotar en su libreta de prácticas o en una hoja de trabajo la siguiente
información:
a. Antes de empezar el experimento:
- Escribir los objetivos del experimento.
- Escribir una hipótesis donde predigas el resultado del experimento.
- Anotar el procedimiento detallado que llevarás a cabo en el experimento.
b. Durante el experimento:
- Dibujar tus observaciones y fotografiar los resultados que necesites.
- Preparar gráficas o cifras mostrando tus resultados.
c. A continuación del experimento:
- Formular una explicación de los resultados.
- Hacer una lista de posibles causas de error si las hay.
- Determinar qué podría cambiarse en el experimento si el experimento tuviera que ser
repetido.
- Escribir tus conclusiones basadas en los resultados.
5. PRÁCTICA
5.1 Técnica aséptica básica
El cultivo de células debe estar totalmente libre de contaminación por microorganismo como
bacterias, hongos y virus. Todos los materiales y superficies que mantienen un contacto con el
cultivo deben estar estériles. Preparar un bote con etanol al 70% para limpiar completamente
la superficie de trabajo.
Materiales:
-
Botella de aerosol con etanol al 70%
Contenedor o caja de plástico
Papel de aluminio
A. APRENDE A REALIZAR LA TÉCNICA ASÉPTICA.
Limpieza.
1. Pulverizar la superficie con etanol al 70%.
2. Coger los componentes del medio de cultivo de la nevera o congelador, los botes de
muestra o tubos con etanol al 70%. Coger solo lo que se necesite.
3. El lugar de pipeteado debe estar en un lugar accesible. Coger del cultivo celular T-25 lo
que necesites
4. Ordenar la zona de trabajo para no tener que levantarse y limpiar el centro de la mesa. Si
hay muchas cosas en la mesa puede aumentar el riesgo de contaminación de la pipeta.
5. Limpiar cualquier vertido con etanol al 70% para minimizar la contaminación del medio de
cultivo.
6. Para terminar, elimina los restos de las soluciones manteniendo sólo las botellas que sean
necesarias.
Higiene personal.
1. Se recomienda el uso de batas y mascarillas. Recogerse el pelo y hablar lo mínimo.
2. Rociar los guantes desechables con etanol al 70%.
Pipeteado.
1. Usar dispensador de plástico estéril (puntas desechables) de 10 y 25 ml. Pipetear de la
forma más cómoda.
2. Trabajar dentro del rango de visión. Colocar la punta de la pipeta a la pipeta y asegurarse
de que la mano no interrumpe el campo de visión. La pipeta debe estar inclinada lejos de
ti.
Manejo de botes y frascos.
1. El bote no debe estar vertical pero tampoco en un ángulo que permita el derrame del
contenido.
2. No dejar el reactivo abierto y no trabajar inmediatamente sobre el bote abierto.
3. El frasco de cultivo debería estar fijado horizontalmente cuando está abierto y mantener el
ángulo durante su manipulación.
Trasvase.
1. No trasvases de un contenedor estéril a otro no estéril. Al realizar los trasvases entre
contenedores se puede producir la contaminación del líquido por contacto con la superficie
exterior de las botellas.
Final del experimento.
1. Retirar todas las pipetas, frascos, etc. utilizadas y no utilizadas de la mesa de trabajo.
Limpiar con etanol al 70% toda la superficie.
2. Guardar todos los reactivos a la nevera o congelador.
B. PREPARAR LA CÁMARA DE INCUBACIÓN ESTÉRIL.
Las incubadoras son ampliamente usadas en microbiología y biología celular para cultivar
bacterias y células eucariotas. Las incubadoras se emplean para mantener el control de la
temperatura, la humedad y otras condiciones como el contenido dióxido de carbono y el
oxígeno dentro de la atmósfera. Las ventajas de trabajar con células de insectos es que
pueden crecer a temperatura ambiente. Los frascos de cultivo pueden incubarse en
una caja de plástico a temperatura ambiente.
1. Seleccionar un contenedor de plástico apropiado para el cultivo.
2. Cubrir el cultivo con papel de aluminio para evitar la luz (las células de insecto no crecen
directamente bajo la luz).
3. Rociar el contenedor de la muestra con etanol al 70%. Permitir secar antes de guardar la
placa para su incubación.
4. Después de poner la placa en el contenedor, encontrar en el laboratorio un lugar libre que
tenga una temperatura entre 20 y 25 ºC (un lugar ideal es el armario o en un cajón).
5.2 Examen del cultivo de células de insectos
Materiales:
- Frasco T-25 en estufa de incubación, microscopio.
No se olviden de seguir las técnicas asépticas básicas.
A. SALUD Y CONTAMINACIÓN
La fuente más común de contaminación en células puede ser:
 Bacterias: el medio aparecerá turbio o “nublado” y podría haber una película blanca
sobre la superficie. Bajo el microscopio, en el espacio entre células aparecerán gránulos
con pequeños puntos negros.
 Hongos: los delgados filamentos de las micelas pueden rebasar un cultivo como un
confuso crecimiento (entre blanco y negro). Es visible a simple vista.
 Levaduras: las partículas redondas son más pequeñas que las células del insecto y son
usualmente vista en cadenas de 2 o más partículas.
Las células enfermas muestran un crecimiento granular, vacuolización, contracción celular y
fragmentación celular.
1. Examinar los cultivos de insectos directamente con un microscopio, para ver signos de
contaminación o estado.
2. Mirar el frasco contra una fuente de luz y revisar si el medio está limpio, ya que las células
del medio está creciendo pegadas a la superficie, el medio dentro del frasco debe estar
limpio. Un medio de cultivo turbio indica contaminación microbiana o que las
células están muy unidas, y necesitan ser subcultivadas.
3. Examinar las células con un microscopio. Buscar señales de células enfermas como
granulación, muchas vacuolas en el citoplasma celular flotante, ondulación de la
membrana, células encogidas. Esto indica que el medio celular necesita ser cambiado y las
células necesitan ser subcultivadas.
4. Si el cultivo de células está contaminado añadir inmediatamente 1 ml de lejía al 10%
dentro del frasco y descartar el cultivo.
5. Anotar en el “Registro de datos del subcultivo” los resultados iníciales del examen realizado
a las células de insectos (estado antes del subcultivo: aspecto de las células, claridad del
medio, presencia o ausencia de contaminación).
B. MORFOLOGÍA DE LA CÉLULA
La observación de la morfología es la técnica más simple y directa usada para la identificación
celular.
La morfología de la célula puede ser descrita como:
 Fibroblasto (fibroblastoides) que se refiere a la migración bipolar o multipolar de células
con una longitud que es el doble de su anchura.
 Epitelial (del epitelio) se refiere a las células que son poligonales con dimensiones
regulares.
 Células redondeadas (limfoblastoides) que crecen individualmente o en grupo.
1. Examinar la morfología de las células de los insectos usando el microscopio invertido de
contraste de fases.
2. Anotar tus observaciones en la libreta de prácticas, dibujando la forma de las células.
Describir su morfología y caracterizarlos como fibroblastoides, epiteliales o limfoblastoides.
Comparar la morfología de las células con respecto a su área central y en la periferia.
3. Determinar si las células son sanas. Las células enfermas muestran un incremento de
gránulos, vacuolas, un encogimiento celular, formación de ampollas en la membrana
celular y fragmentación celular. Anotar las observaciones en la libreta de prácticas.
4. Si es posible, tomar microfotografías del microscopio invertido con una cámara digital
conectada. Imprimir las imágenes digitales de las células e incluirlas en los resultados.
5. Observar los cambios en la morfología celular, un aumento de la confluencia celular y
pasan por las fases de crecimiento celular (fase de latencia, crecimiento y estacionaria).
Comparar la morfología de las células en cada una de las fases de crecimiento y anotar las
observaciones en la libreta de prácticas.
C. FASE DEL CICLO DE CRECIMIENTO
Como las células crecen en el cultivo, pasan por 3 fases distintas de crecimiento que puede ser
estimado en términos de confluencia y densidad celular.
 Fase de latencia: después de subcultivar o transferir a nuevos frascos, las células entran
en una fase de latencia del crecimiento donde hay poco o ningún aumento del número de
células, normalmente durante 1-2 días. Durante este tiempo, las células se están
“acondicionando” al medio. Menos del 50% de la superficie está cubierta por células
(menos del 50% de confluencia) y la densidad celular es baja.
 Fase de crecimiento exponencial: el número de células aumenta exponencialmente
durante esta fase, y el crecimiento de las células va a continuar siempre y cuando haya
suficientes nutrientes para mantener el aumento del número de células. Cerca del 5080% de la superficie celular está cubierta por las células (50-80% de confluencia) y hay
una densidad celular intermedia.
 Fase estacionaria: durante esta fase, el número de células permanece constante (aunque
no sea necesariamente viable). Con el tiempo, las células morirán a menos que se haga
un subcultivo o se añada medio fresco. Sobre el 90-100% de la superficie está cubierta
por las células (90-100% de confluencia) y hay una alta densidad celular.
Examinar la fase de crecimiento de las células de insecto e identificar en qué fase están las
células y su densidad. Anotar los datos en el “Registro de datos del subcultivo”: estado antes
del subcultivo (fase del ciclo de crecimiento y la densidad celular).
5.3 Mantenimiento del cultivo
Uno de los fenómenos más comunes de los cultivos celulares es cuando las células parecen
que se están muriendo pero todavía no han alcanzado el 50% de su confluencia. Una de las
principales razones para esto es que los nutrientes del medio se hayan acabado y se hayan ido
acumulado los metabolitos tóxicos de las células. La mejor manera de prevenir que las células
se mueran es cambiar el medio de cultivo.
Materiales:
-
Frasco T-25 con células.
Microscopio.
Alcohol 70%.
Medio de cultivo para células de insectos.
Pipetas.
Frasco T-25 nuevo.
No se olviden de seguir las técnicas asépticas básicas.
A. ALIMENTAR LAS CELULAS DE INSECTOS
1. Sacar el medio de cultivo del frigorífico y dejar que llegue a temperatura ambiente antes
de usarlo.
2. Extraer 4 ml del medio del frasco de cultivo y sustituirlo por 4 ml de medio fresco. Para un
crecimiento óptimo, dejar 1 ml del medio antiguo en el frasco, ya que contiene
factores de crecimiento que han sido secretados por las células (medio
acondicionado).
3. Continuar la incubación de las células de insecto a temperatura ambiente en la estufa de
incubación.
B. SUBCULTIVO DE LA CELULA DE INSECTO
Cuando las células han alcanzado el final del crecimiento de la fase exponencial y están sobre
70-80% de su confluencia, hay que hacer subcultivos en frascos nuevos. Las células siguen
creciendo en la superficie del frasco dando lugar a un cultivo en monocapa, hasta que alcanza
el 100% de la confluencia. En este momento, las células paran de dividirse porque no hay más
espacio. Las células en confluencia experimentan inhibición por contacto, enferman y terminan
por morir.
1. Considerando que las células de insecto crecen poco adheridas a la superficie, golpear
suavemente la parte de abajo del frasco para que se despeguen la mayoría de las células.
2. Con ayuda de una pipeta de 5 ml, resuspender las células (no dejar grumos celulares).
3. Confirmar que las células de insecto se han despegado de la pared el frasco usando un
microscopio.
4. Transfiere 1 ml de los 5 ml de suspensión celular en un frasco estéril T-25 correctamente
identificado que contenga 4 ml de medio de cultivo (mantener siempre el ratio 1:5).
Examinar las células bajo el microscopio. Asegurarse que hay células en el frasco y que se
ven redondas y claras, no arrugadas y oscuras.
5. Anotar el tipo de medio y el factor de dilución del frasco en el “Registro de datos del
subcultivo”.
6. Incubar la célula a temperatura ambiente en una caja de plástico y dejarla en el puesto de
trabajo.
7. Después de 24 horas, las células de insecto se deberían haber pegado a la superficie del
frasco. Confirmar que se han pegado usando el microscopio.
5.4 Ensayo de viabilidad celular mediante azul Tripán
La cámara de recuento celular comúnmente conocida como un hemocitómetro es un
dispositivo ampliamente utilizado para contar las células en un volumen especifico de líquido.
En este caso específico, la cámara se utiliza para diferenciar células muertas y vivas. Teñir de
azul Tripán (que es un colorante vital) excluyendo las células vivas mientras que la muertas
absorben el tinte azul.
Materiales:
-
Frasco celular T25.
Azul Tripán.
Cámara de recuento celular.
Tubos de microcentrífuga.
Microscopio.
No se olviden de seguir las técnicas asépticas básicas.
A.
1.
2.
3.
RECUENTO CELULAR VIVAS Y MUERTAS
Utilizar una cámara de recuento celular de plástico limpia.
Recuperar el frasco de cultivo de la cámara de incubación.
Pipetear arriba y abajo 3 veces y dispersar las células para obtener una suspensión de
células individuales (no grumos celulares).
4. Transferir 10 µl de suspensión dentro de un tubo de microcentrífuga (o 1 gota de una
pipeta pequeña para hacerlo).
5. Añadir 10 µl (una gota) de azul Tripán para manchar las células viables en el tubo e
incubarlas durante 2 minutos. El azul es un colorante que mancha las células muertas y no
las células vivas.
6. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo tocando el fondo del tubo (en este momento las
células están diluidas al 1:2, para una dilución de factor 2).
7. Transferir 20 µl (2 gotas) de células manchadas de azul Tripán en suspensión en la parte
inferior izquierda de la platina del área de contaje de la cámara de recuento. Permitir que
el área de la cámara se llene por acción de capilaridad. No cubrir por completo la cámara.
8. Eliminar el sobrenadante y transferirlo a la platina del microscopio.
9. Seleccionar el objetivo de 10x y enfocar a las líneas de la cuadrícula de la cámara (recontar
las células en la cuadricula de la cámara). Mover la platina hacia el campo exterior de la
cuadricula que se vea (el tamaño de la cuadrícula es de 3 mm x 3 mm y el plato 0,1 mm).
Cada cuadrícula pequeña (es un área que no está dividida por ninguna línea adicional) es
de 0,33 mm x 0,33 mm x 0,1 mm.
10. Contar todas las células (vivas y muertas) dentro de la cuadricula. Mantener separadas las
viables (claras y brillantes) de las células azules no viables. Si resulta difícil contar las
células con un aumento (10x), incrementar a 40x.
Determinar el conteo de células/ml y porcentaje de viabilidad celular del cultivo:

Fórmula células/ml
Célula/ml= número medio de células por pequeñas rejillas x 90 (multiplicación
de los factores) x dilución x 103
Ejemplo: Las células de insectos diluidas 1:5 da un total de 50 células contadas en 10
pequeñas cuadriculas.
Células/ml= 50/10 x 90 (factor) x 5 x 103 = 2,25 x 106

Fórmula porcentaje viabilidad
% viabilidad = (número de células viables / número de células totales) x 100
Ejemplo: Las células observadas en microscopio son 45 células blancas y 5 azules.
% viabilidad= (45/50) x 100 = 90% viabilidad
B. TRAZADO DE CURVAS DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS
1. Realizar un recuento de células y ensayo de viabilidad tal como se describe en la sección
anterior cada 24 horas durante una semana hasta que las células hayan alcanzado una
fase estable donde no hay más cambios en las células/ml del cultivo.
Células/ml= número medio de células por cuadricula pequeña x 90 x dilución x 103
Porcentaje viabilidad= (número de células viables/ número de células total) x100
2. Marcar en una gráfica semilogarítmica, con una escala de tiempo (en días), la
concentración de las células (células/ml) para nuestro cultivo de células.
3. Identificar y marcar la disminución registrada y estabilizar las fases de crecimiento de
nuestro cultivo celular.
4. Seleccionar un periodo de tiempo durante la fase de registro y calcular el tiempo de
duplicación para su cultivo. El tiempo de duplicación es el tiempo necesario durante la fase
de registro para duplicar exactamente el número de células/ml. El tiempo de duplicación
de la población puede ser determinado mediante la identificación de un número de células
a lo largo de la fase exponencial de la curva, trazando la curva hasta ese número que se
ha duplicado, y calculando el tiempo transcurrido entre los dos.
5.5 Tinción diferencial con Giemsa
Las células son teñidas con un tinte que nos permite distinguir detalles concretos de la célula.
La tinción Giemsa, una mezcla de azul de metileno y eosina, permite la tinción diferencial del
núcleo y el citoplasma dependiendo del tipo de célula.
Materiales:
-
Frasco de cultivo.
Placas de Petri de 60 mm.
Giemsa.
PBS.
Metanol.
Pipetas.
Auxiliar de pipeteo o pipeta de transferencia.
No se olviden de seguir las técnicas asépticas básicas.
A. CRECIMIENTO CELULAR EN LA PLACA DE PETRI
1. Golpear suavemente el fondo del frasco de cultivo y pipetar su contenido para resuspender
las células del cultivo.
2. Transferir 1 ml del cultivo celular en una placa de Petri, añadir 2 ml del medio de cultivo
fresco de insectos y rotular la placa.
3. Incubar durante 24 horas en las estufas de incubación.
B. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS TEÑIDAS EN EL MICROSCOPIO
1. Seleccionar una placa con 24 horas de vida de crecimiento. Las células deben adherirse a
la placa. Para este proceso, no es necesario mantener técnicas asépticas.
2. Verter el medio de cultivo en la placa en el fregadero y enjuagar las células con 5 ml de
PBS. Vaciar el PBS en el fregadero.
3. Fijar las células: añadir 2 ml de metanol para cubrir la capa de células. Fijar las células 10
minutos a temperatura ambiente. Cubrir la placa, para prevenir la evaporación. Eliminar el
metanol y dejar secas las células.
4. Teñir las células: Añadir 1 ml de colorante Giemsa a la placa para cubrir las células. Dejar
el colorante Giemsa durante 30 segundos y después eliminarlo.
5. Lavar las células: Añadir 5 ml de PBS para cubrir las células durante 5 minutos: quitar el
PBS y enjuagar las células con los 10 ml de agua del grifo.
6. Examinar la morfología de las células mientras están húmedas, usando un microscopio de
fluorescencia. Tener en cuenta la diferencia entre la tinción del núcleo y la del citoplasma.
Tomar fotografías si es posible.
7. Archivarlas secas y rehumedecerlas para examinarlas. Anotar las observaciones en la
libreta de prácticas.
6. PREGUNTAS DE LA PRÁCTICA
Para las cuestiones 1 y 2: Observa los distintos tipos celulares de estas imágenes de
microscopio.
1.- De las imágenes de la figura de arriba, identifica las células de insecto.
2.- De las imágenes de la figura de arriba, identifica las bacterias.
Para las cuestiones 3-4: Observa la siguiente curva de crecimiento celular.
3.- De la figura de arriba ¿qué fase representa la fase de latencia del cultivo celular?
4.- De la figura de arriba ¿qué fase representa la fase logarítmica del cultivo celular?
5.- Basandonos en esta figura ¿En qué momento del cultivo es mejor realizar un subcultivo
celular?
6.- Basando nos en esta figura ¿En qué momento del cultivo es mejor para renovar el medio
de cultivo celular?
7.- ¿Cual es la mejor temperatura de cultivo de las células de insecto?
8.- Si tu cultivo se vuelve lechoso o turbio durante el experimento ¿Sabrías decir que ha
ocurrido? ¿Cuáles son las posibles causas?
9.- De la imagen siguiente ¿Cual es el porcentaje de viabilidad del cultivo? Incluye el recuento
de células vivas y totales.
Registro de datos del subcultivo
Fecha.....................Hora.....................Alumno.....................
OBSERVACIONES
Designación
Línea celular
Generación o pase nº.
Fase de crecimiento en el ciclo
Estado antes
del subcultivo
Aspecto de las células
Densidad de las células
Claridad del medio
Concentración después de
resuspensión (C,)
Volumen (V,)
Conteo celular
Rendimiento(Y-C,X V,)
Rendimiento por matraz
Número(N) y tipo de recipiente
(matraz , placa, o microplaca)
Concentración final(C,)
Siembra
Volumen por matraz, placa o
microplaca (V,)
Ratio de división(Y/C,XV,X N),o
Número de matraces
sembrados +Número de
matraces trypsinizados
(matraces del mismo tamaño)
Tipo
Lote nº.
Tipo de suero y concentración
Lote nº.
Otros aditivos
Medio/suero
CO2:concentración
Lote nº.
Tipo de suero y concentración
Lote nº.
Otros aditivos