Lineamientos EFE 2012 - Dirección General de Epidemiología

Transcripción

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
DE LA ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMÁTICA POR
LABORATORIO
DGE-InDRE-RNLSP
2014
EFES-RNLSP/InDRE
Versión No. 01
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PRIMERA EDICIÓN, 2014
ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMÁTICA–RNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el grupo
Técnico Interinstitucional del Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica (CoNaVE).
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© INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD
SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LA ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMÁTICA POR LABORATORIO” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2014.
COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:
ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS.
Francisco P Miranda 177 bis, Col. Lomas de Plateros Del. Álvaro Obregón, C. P. 01480, México,
D. F.
www.indre.salud.gob.mx
Tel. (55)53-42-75-50
LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO
ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DE:
DRA. MA.
DEL
CARMEN GUZMÁN BRACHO, DR. JOSÉ
EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ
IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ
SECRETARIO DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUÍZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
DRA. MARÍA EUGENIA JIMÉNEZ CORONA
DIRECTORA GENERAL ADJUNTO DE EPIDEMIOLOGÍA
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
M. EN C. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO
SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY
ASESORA TÉCNICA DE LA DIRECCIÓN
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M. EN C. MAYRA GISELA MELÉNDEZ HERNÁNDEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M. EN C. JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. EDITH CRUZ RAMÍREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMÁTICAS (EFE)
COORDINADORA DE LA RED DE EFE
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AUTORES
QFB. EDITH CRUZ RAMÍREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMÁTICAS (EFE)
COORDINADORA DE LA RED DE EFE
M. EN C. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
QFB. SILVIA GONZÁLEZ MATEOS
ADSCRITA AL LABORATORIO DE ENFERMEDADES FEBRILES EXANTEMÁTICAS
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE LA ENFERMEDAD
FEBRIL EXANTEMÁTICA POR
LABORATORIO
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 8
ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
FEBRILES EXANTEMÁTICAS (EFES) .......................................................................................... 8
RED NACIONAL PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMÁTICA............................................................................................................................. 10
MARCO LEGAL ................................................................................................................................ 11
OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 11
Objetivo general .................................................................................................................................... 11
Objetivos específicos.............................................................................................................................. 11
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD
FEBRIL EXANTEMÁTICA ............................................................................................................. 12
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMÁTICA............................................................................................................................. 12
Funciones del laboratorio nacional de referencia .................................................................................. 12
Funciones de los laboratorios estatales .................................................................................................. 13
Funciones de la coordinación de la RNLSP ......................................................................................... 14
DEFINICIONES OPERACIONALES DE ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMÁTICA ... 14
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .............................................................................. 15
ALGORITMOS DE DIAGNÓSTICO ............................................................................................ 17
ESTÁNDARES DE CALIDAD........................................................................................................ 23
Captura de datos y emisión de resultados ............................................................................................. 23
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) .......................... 24
Criterios para la liberación del diagnóstico de Sarampión y Rubéola ................................................... 25
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO ........................................................................................ 26
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES........................................................................................... 28
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................. 29
ANEXOS .............................................................................................................................................. 31
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS......................................................................................................... 32
CARACTERÍSTICAS DE LOS EQUIPOS COMERCIALES ..................................................... 33
PREPARACIÓN DE REACTIVOS ................................................................................................. 34
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INTRODUCCIÓN
En los años 1990’s, la Organización Mundial de la Salud (OMS) señaló que el mundo estaba a un
paso de la eliminación del sarampión, una enfermedad altamente infecciosa. Hoy esta perspectiva se
ve seriamente amenazada por el resurgimiento de este padecimiento en varios países. De acuerdo a
la información de esta organización, en el periodo de enero a mayo del 2011 se han presentado
brotes de sarampión en 24 países de Europa donde se han notificado más de 6,500 casos. Entre los
países con brotes destacan Francia que enfrentó un brote con un acumulado de cerca de 5,000 casos
y España que reportó más de 800 casos en brotes desde octubre del 2010.
La situación del incremento del sarampión ha sido revisada en la Asamblea Anual de la OMS,
organización que ha adoptado como objetivos concretos relacionados con el sarampión para el 2015,
alcanzar una cobertura del 90% en las campañas de inmunización a nivel nacional y del 80% en cada
distrito, lo que reduciría los casos de sarampión a menos de cinco por un millón y la mortalidad en
un 95%, comparado con cifras del 2000.
En México, el decremento de casos y defunciones por sarampión ha sido extremadamente notorio al
pasar de 68,782 casos en 1990 a solo dos en 1996, de 1997 a 1999 no se registró ningún caso y del
2000 a la fecha se han identificado un total de 167 casos de sarampión considerados como
importados. A partir del año de 2007 no se han presentado casos de sarampión en el país.
El 42% de los casos de sarampión en el último año en América Latina han sido debido a la visita de
personas a países con transmisión activa. No obstante la ausencia de casos en los últimos cuatro años
en México, existe un incremento en el riesgo epidemiológico de una reintroducción del virus al país
debido al aumento que se ha observado en otros países.
La función permanente y primordial del Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemáticas
(LEFE) del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) (LEFE-InDRE), es
mantener la vigilancia epidemiológica de las Enfermedades Febriles Exantemáticas en nuestro país,
identificando casos probables de tener la enfermedad y confirmarlos mediante pruebas de
laboratorio especializadas.
Antecedentes de la RNLSP para el Diagnóstico de Enfermedades Febriles Exantemáticas (EFES)
El Laboratorio de Enfermedades Virales se constituyó en 1972 dentro del Instituto de Salubridad y
Enfermedades Tropicales (ISET), como resultado de un programa organizado por la Organización
de las Naciones Unidas (ONU) para el desarrollo de Laboratorios en América Latina.
En 1973 quedó estructurado con los siguientes laboratorios: virus exantemáticos, enterovirus,
teratogénicos, hepatitis A y B, respiratorios y Rickettsia sp. Fue hasta 1983 que se transformó en
Departamento de Diagnóstico de Enfermedades Virales.
A partir de 1992, México pertenece a la red de laboratorios para el diagnóstico de sarampión y
rubéola donde el órgano rector es la Organización Panamericana de la Salud (OPS). En diciembre
de ese mismo año se estructuró la “Red Nacional de Laboratorios de Diagnóstico Etiológico de
Enfermedad Febril Exantemática” (RNLEFE) en el InDRE con la finalidad de promover el
diagnóstico etiológico de los cuadros de enfermedad febril exantemática principalmente sarampión y
rubéola, así como para apoyar los programas de control epidemiológico de las mismas,
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particularmente el Programa de Eliminación del Sarampión en México. Inicialmente, se integraron
a la red 7 laboratorios periféricos (Estatales) en los estados de Guerrero, Jalisco, México, Nuevo
León, Sonora, Veracruz y Yucatán; el Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemáticas
(EFES) como laboratorio de referencia ubicado en el Departamento de Virología Diagnóstica del
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) y la Subdirección de Apoyo a la
Red Nacional de Laboratorios.
A partir de 1993 se realizaron actividades de capacitación al personal operativo de diferentes
disciplinas de los laboratorios restantes con la finalidad de que incorporaran a la red de laboratorios,
en este período la última capacitación se realizó en 1998.
El laboratorio de enfermedades febriles exantemáticas de forma conjunta con la Dirección General
Adjunta de Epidemiología (DGAE) son los responsables de la vigilancia epidemiológica del
sarampión y la rubéola, en el ámbito federal.
En el 2002 la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) se incorporó al Programa
Caminando a la Excelencia, programa cuya finalidad es evaluar el desempeño analítico de los
estados en relación a los programas prioritarios de salud.
A partir del 2006 se preparan y envían los paneles de eficiencia a los laboratorios estatales para
medir el indicador “evaluación del desempeño”. Esta actividad se ha venido realizando año con año
desde entonces y hasta la fecha.
En el año 2007 en el InDRE se realizó el taller sobre técnicas para el aislamiento y detección del
virus de sarampión y rubéola a nivel internacional en colaboración con los Centros de Control y
Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) y La Organización Panamericana de
la Salud (OPS).
A partir de 2008 se realiza el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) dos veces
por año mediante la ejecución de un panel serológico. Este laboratorio efectúa la evaluación a
aquellos laboratorios estatales que tienen implementado el diagnóstico serológico de Sarampión y
Rubeola para ratificar el desempeño técnico de los mismos.
Fue en 2009 cuando se retomaron los cursos de actualización para el diagnóstico de Sarampión y
Rubéola con la finalidad de apoyar el proyecto para eliminar el Sarampión y la Rubéola en 2010 en
Latinoamérica.
Durante 2010 se integró a la red de laboratorios de enfermedad febril exantemática el último
laboratorio estatal, para quedar conformada como se encuentra actualmente, por 31 Laboratorios
Estatales y un Laboratorio Nacional de Referencia (InDRE). También se realizó un taller de
actualización en apoyo a las actividades a realizar para cumplir con el objetivo de la eliminación del
sarampión y la rubéola en México.
En el curso de actualización para la red de laboratorios, que se impartió en 2011, se dieron a conocer
las modificaciones a los lineamientos de la enfermedad febril exantemática para la vigilancia
epidemiológica y se capacitó a los asistentes en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction, PCR, por sus siglas en inglés) en tiempo real, para que cada
laboratorio estatal lo implementara como parte de la metodología de diagnóstico en sus respectivos
laboratorios.
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A lo largo del brote de sarampión que afectó a nuestro país en el año 2011, se realizaron diversas
actividades de diagnóstico para dar respuesta inmediata a los requerimientos del momento. En la
actualidad, el laboratorio de EFES está realizando técnicas serológicas para el diagnóstico de
sarampión y rubéola, además de la serología para parvovirus B-19, Epstein Bar, varicela y parotiditis
como diagnóstico diferencial, además del diagnóstico molecular de sarampión y rubéola por técnicas
de biología molecular. Es así como han quedado consolidadas a través de estos años las funciones de
referencia para la Red de Laboratorios de Enfermedad Febril Exantemática, conformada por 31
Laboratorios Estatales mediante la evaluación de concordancia y desempeño.
Por último, en el 2012 el LEFE-InDRE fue la sede del taller sobre identificación y genotipificación
de los virus de sarampión y rubéola por técnicas de RT-PCR en tiempo real y secuenciación, siendo
anfitrión de diez países de América Latina. El evento fue auspiciado y coordinado por la OPS, el
CDC de Atlanta, Estados Unidos y el InDRE. El objetivo de este taller fue revisar el estatus de la
eliminación del sarampión y la rubéola en Latinoamérica.
RED NACIONAL
EXANTEMÁTICA.
PARA
LA
VIGILANCIA
DE
ENFERMEDAD
FEBRIL
N
Laboratorios estatales que están integrados a la red de EFES
Laboratorio de EFES del InDRE (Órgano rector)
Figura. 1. Conformación de la Red de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP)
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MARCO LEGAL
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917,
Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF
7/02/1984, Última Reforma D.O.F. 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica. DOF:
19/02/2013.
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental-salud
ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-clasificación y especificaciones de
manejo.
5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las características,
el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos.
DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de
los laboratorios clínicos. (DOF del 27 de marzo de 2012).
7. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la Federación
DOF: 12/12/2013.
8. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación, DOF: 20/05/2013,
www.dof.gob.mx
9. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema Nacional de
Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
10. Lineamientos para programas de evaluación externa del desempeño de la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública, InDRE- Secretaría de Salud, 2014.
11. Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRESecretaría de Salud, 2014.
OBJETIVOS
Objetivo general
Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico para la Enfermedad
Febril Exantemática y establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a
través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la vigilancia
epidemiológica de sarampión y rubéola.
Objetivos específicos
 Mantener la vigilancia virológica de los agentes biológicos causantes de las enfermedades febriles
exantemáticas.
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


Identificar la circulación del virus de sarampión o rubéola en México.
Caracterizar la secuencia genómica de los virus identificados en caso aparición por importación
del virus o en caso de brote.
Delimitar las responsabilidades, ámbito de competencia de las diferentes áreas que integran la
red de laboratorios y, a su vez, servir de apoyo en la capacitación del personal de laboratorio,
personal de nuevo ingreso (servidores públicos de otros laboratorios locales) y de otras entidades
del sector salud o sector privado.
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD
FEBRIL EXANTEMÁTICA
La RNLSP para el diagnóstico de Enfermedad Febril Exantemática está basada en los siguientes
niveles de organización:
1. Laboratorio Nacional de Referencia (InDRE)
2. Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP)
3. Coordinación de la Red de LESP (CNRLSP)
Laboratorio de Enfermedades Febriles Exantemáticas (LEFE)-InDRE
(Laboratorio Nacional de Referencia)
Muestras
Resultados
Control de calidad o Referencia de EFES
(Laboratorios Estatales)
Figura. 2 Interacción dela RNLSP para el Diagnóstico de Enfermedades Febriles Exantemáticas
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD FEBRIL
EXANTEMÁTICA
Funciones del laboratorio nacional de referencia
1. Realizar la determinación de anticuerpos IgM e IgG antisarampión y antirubéola por la técnica
de Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) para
diagnóstico de sarampión, rubéola y rubéola congénita, siendo la capacidad instalada para 250
muestras semanales con un estándar de servicio de 4 días según algoritmo.
2. Realizar la determinación de anticuerpos IgM antisarampión y antirubéola como control de
calidad a los Laboratorios Estatales (2% de muestras negativas y 100% de muestras positivas).
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3. Realizar el aislamiento viral para sarampión en células Vero Slam como prueba de referencia.
Capacidad instalada 80 muestras semanales.
4. Realizar el aislamiento viral para rubéola en células Vero y Vero Slam como prueba de referencia
para rubéola y rubéola congénita. Capacidad instalada 80 muestras semanales.
5. Realizar el diagnóstico de sarampión y rubéola mediante pruebas de biología molecular (RT
PCR punto final y RT PCR tiempo real) a partir de muestras biológicas como orina y exudado
faríngeo. Capacidad instalada 60 muestras semanales.
6. Realizar la secuenciación genómica por biología molecular para sarampión y rubéola, en los
casos confirmados.
7. Realizar el diagnóstico serológico diferencial por ELISA para Epstein Barr, Parvovirus B−19,
Parotiditis y Varicela.
8. Reportar resultados serológicos de sarampión y rubéola en un lapso no mayor a 4 días naturales a
los usuarios.
9. Evaluar el desempeño técnico de los laboratorios integrantes de la Red de EFES que realizan el
diagnóstico serológico de sarampión y rubéola.
10. Actualizar a los laboratorios estatales por medio de capacitaciones para el diagnóstico serológico
de EFES así como en los lineamientos vigentes.
11. Participar en la evaluación internacional del desempeño para diagnóstico serológico de
sarampión y rubéola mediante el procesamiento de un panel de sueros enviado por los
organismos internacionales como OPS y CDC por ser país colaborador en la región de América.
12. Enviar 20 muestras negativas, 20 muestras positivas y 20 muestras indeterminadas al CDC
como parte de la evaluación externa por parte de la red de laboratorios para sarampión y rubéola
de la región de América (OPS).
13. Realizar talleres de actualización en el diagnóstico de sarampión y rubéola dirigido a la red de
LESP de EFES.
14. Asistir a reuniones internacionales para presentar los resultados de la RNLSP de enfermedad
febril exantemática.
15. Asistir a reuniones nacionales para el dictamen de los casos de rubéola y rubéola congénita como
parte de la vigilancia epidemiológica.
16. Proporcionar reactivos (medio de transporte viral y controles positivos a sarampión) a los
laboratorios estatales o jurisdicciones sanitarias que lo soliciten.
17. Elaborar el boletín “Caminando a la Excelencia” con los resultados de concordancia y evaluación
del desempeño para sarampión y rubéola.
18. Realizar evaluaciones de estuches comerciales para el diagnóstico de sarampión y rubéola.
Funciones de los laboratorios estatales
1. Realizar el diagnóstico serológico de sarampión mediante la determinación de anticuerpos IgM
por ELISA
2. Realizar el diagnóstico serológico de rubéola mediante la determinación de anticuerpos IgM por
ELISA, para el diagnóstico de rubéola y rubéola congénita.
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3. Enviar al InDRE muestras de exudado faríngeo y orina para la RT-PCR y el aislamiento viral
para sarampión y rubéola.
4. Enviar al InDRE el 2% de muestras negativas y el 100% de muestras positivas para el control de
calidad por serología de sarampión y rubéola y RT-PCR de sarampión.
5. Reportar resultados en un lapso de 4 días naturales al departamento de epidemiología de los
servicios estatales de salud y al usuario.
6. Enviar al InDRE un informe semanal del procesamiento de muestras para ambos diagnósticos.
7. Procesar un panel de sueros para el diagnóstico de sarampión y rubéola como parte de la
evaluación del desempeño enviado por el InDRE.
8. Realizar RT-PCR en tiempo real para sarampión.
Funciones de la coordinación de la RNLSP
1. Mantener una relación permanente con los laboratorios estatales de la red LESP de EFES y el
laboratorio nacional de referencia.
2. Coordinar el envío de paneles de sueros como parte de la evaluación del desempeño de los
laboratorios estatales pertenecientes a la red.
3. Coordinar la entrega de medio de transporte viral y controles positivos a los laboratorios
estatales o jurisdicciones sanitarias que lo soliciten.
4. Elaborar el boletín “Caminando a la Excelencia” para sarampión y rubéola.
5. Enviar documentación oficial con información relevante para la red de EFES.
DEFINICIONES OPERACIONALES DE ENFERMEDAD FEBRIL EXANTEMÁTICA
Caso Sospechoso: Toda persona de cualquier edad con cuadro de fiebre y exantema.
Caso probable: Persona de cualquier edad que presente fiebre, exantema maculopapular sin importar
la duración del mismo y uno o más de los siguientes signos y síntomas: tos, coriza y/o conjuntivitis.
Caso confirmado: Todo caso probable en el que se demuestre infección reciente mediante técnicas
de laboratorio, Defunción de caso probable en el que no se disponga de resultado de laboratorio y
que esté asociado epidemiológicamente a otro caso confirmado.
Caso descartado: Todo caso probable en el que se descarte infección reciente mediante técnicas de
laboratorio. Todo caso probable que no contando con muestras para diagnóstico por laboratorio,
cuenta con evidencia clínico-epidemiológica suficiente para establecer un diagnóstico diferente a
sarampión o rubéola.
Caso de Sarampión confirmado como temporalmente relacionado con la vacunación: Es aquel caso
probable de Sarampión que se ha presentado dentro de los 30 días posteriores a la administración de
la vacuna AS, y que después de haber terminado la investigación del caso:

No se logra identificar alguna entidad nosológica específica, ajena a la vacunación, como causa
de los signos y síntomas presentados.
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

Los signos y síntomas presentados pueden ser explicados por el efecto de la o las vacunas
aplicadas.
Los signos y síntomas presentados están reportados en la literatura mundial como evidencias que
favorecen o establecen una relación causal con la o las vacunas aplicadas.
Definición operacional de caso de Síndrome de Rubéola Congénita (SRC)
Caso Sospechoso: Lactante de un año en quien se sospecha de SRC debido a que:
a. Se detecta una o más de las anormalidades: patología ocular congénita (de tipo catarata,
disminución de la visión, nistagmus, estrabismo, micro-oftalmos, glaucoma), defectos cardiacos
congénitos, púrpura o hipoacusia y/o.
b. Historia de infección por rubéola (confirmada o sospechosa) de la madre durante el embarazo.
Caso confirmado: Un caso podrá ser confirmado por clínica o por laboratorio.
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS
 Suero
Para el diagnóstico de enfermedad febril exantemática enviar el suero de 0-35 días de evolución, de
1.0 a 3.0 mL, no lipémico y no contaminado en un tubo con tapón de rosca. Con información
completa (fecha inicio del exantema, fecha de toma de la muestra, sintomatología y fecha de
vacunación). Para control de calidad, enviar marca del estuche, fecha de caducidad, resultado con
lecturas e interpretación (negativos o positivos) y la información completa del paciente. Para
referencia, enviar las muestras indeterminadas con información completa del paciente como se
mencionó anteriormente. En caso de una segunda muestra, tomarla 15 días después de la primera
toma. Enviar en condiciones de refrigeración (4-8 °C).
 Líquido cefalorraquídeo (LCR)
Para el diagnóstico de Sarampión, Rubéola, Epstein Barr, Varicela y Parvovirus B-19, enviar el
LCR con el formato de envío de muestra debidamente completado con fecha de inicio de síntomas,
fecha de toma y sintomatología. En un tubo con tapón de rosca. Transportar en condiciones de
refrigeración (4-8 °C).
 Exudado faríngeo
Para diagnóstico de enfermedades exantemáticas tomar la muestra durante los 5 días inmediatos a la
aparición del exantema. Enviar en medio de transporte viral en un tubo con tapón de rosca, con el
formato de envío de muestra completado con fecha de inicio del exantema, fecha de toma,
sintomatología y fecha de vacunación. Enviar las muestras a 4-8 °C en un lapso no mayor a 24 horas
después de la toma de la misma.
 Orina
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Para el diagnóstico de enfermedades exantemáticas tomar la primera muestra de la mañana entre el
día 0 y 5 después de la aparición del exantema. Para tratar la orina, centrifugar a 1500 rpm durante
10 minutos, decantar y al sedimento adicionar 2.0 mL de medio de transporte viral en un tubo con
tapón de rosca. Enviar la muestra con el formato de envío de muestra completado con fecha de
inicio de exantema, fecha de toma, sintomatología y fecha de vacunación. Se envía en condiciones
de refrigeración (4-8 °C) y el tiempo de llegada al laboratorio no debe exceder de 24 horas después
de haber tomado la muestra.
Para rubéola congénita
Tipo de muestra Condiciones de toma
Suero
Del nacimiento hasta 12 meses
Transportar en condiciones de refrigeración dentro de
las primeras 48 horas
Exudado
Del nacimiento hasta los 12 meses.
faríngeo o
Hisopo en medio de transporte viral(MTV)
nasofaríngeo
Orina
Del nacimiento hasta los 12 meses
10-50 mL. en recipiente estéril
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Técnica
Determinación de
anticuerpos por
ELISA IgM e IgG
rRT-PCR y
aislamiento viral y
secuenciación
rRT-PCR y
aislamiento viral y
secuenciación
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Algoritmos de diagnóstico
MARCO JURIDICO NORMA
Oficial Mexicana NOM-017SSA2-2012
Figura. 3. Algoritmo para el diagnóstico de enfermedad febril exantemática Claves del tabulador:
1A35110-02, 1A35110-03, 1A35130-01, 1A35130-02
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RESULTADOS 30 DIAS
Figura. 4. Algoritmo para el aislamiento viral de Sarampión y Rubeola Claves del tabulador:
1A35110-01, 1A35130-03
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Algoritmos realizados en los laboratorios de apoyo al LEFE
Registro en
el laboratorio
Recepción de la
muestra
Registro en
La Red InDRE
Muestras de cultivo celular, exudado faríngeo u orina
Extracción de RNA
RT-PCR
PCR ANIDADO
Positivo
Electroforesis
Negativo
SECUENCIACIÓN
Reportar al
Laboratorio de
EFES
MARCO JURIDICO
NORMA Oficial Mexicana
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 5. Algoritmo de diagnóstico molecular de Rubéola Clave de tabulador: (1A3513004)
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Recepción de
la muestra
Registro en
el laboratorio
Registro en
La Red InDRE
Muestras clínicas: Exudado faríngeo, orina o cultivo celular
Extracción de RNA
RT PCR con iniciadores
59 y 63
Electroforesis
RT PCR con iniciadores
41 y 44
PCR Anidado con
iniciadores 59 y 63N
Electroforesis
Negativo
Reportar al
laboratorio de
EFES
Positivo
Secuenciación
Enviar al Laboratorio
Genoma de patógenos
(GNMP)
MARCO JURIDICO
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 6. Algoritmo de diagnóstico molecular de sarampión Clave de tabulador: (1A3511004)
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Muestra
Exudado faríngeo y orina
Tratamiento de muestras
RT PCR en Tiempo Real
a) Sarampión
b) Rubéola
Resultado
Negativo
Positivo
Enviar muestra a
LPMS
Negativo
Procesar muestra
PCR Punto final
sarampión y
rubéola LPMS
Positivo
Realizar Informe de
Resultados
Enviar informe a
LEFE
Verificar y aprobar
Informe de resultados
Enviar muestra a
GNMP
¿El Informe de
Resultados cumple
con los requisitos?
Si
Entregar Informe de
Resultados y Expediente
a REMU/InDRE
No
Corregir
informe
Realizar
Secuenciación
Genómica
Figura. 7. Algoritmo de diagnóstico molecular de Sarampión y Rubéola por RT PCR tiempo real.
Clave de tabulador: (1A3511004)
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DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
LABORATORIO DE GENOMA DE PATÓGENOS
Genotipificación de patógenos de importancia en salud pública
Muestras a analizar
(Producto de PCR)
Envió de
resultados a
LEFE
Purificación de Ac. Nucleicos
(ExoSap IT)
Genotipo
Verificar/cuantificar
(DNA CHIP)
PCR secuencia
(BigDye 3.1)
Repetir
purificación de
Ácidos Nucleicos
Negativo
Analizar e interpretar
(secuencias de referencia)
Negativo
Editar secuencia
Electroforesis capilar y
lectura de datos
Resultado
Positivo
MARCO JURIDICO
NOM-017-SSA2-2012
Figura. 8. Algoritmo de diagnóstico para genotipificación de patógenos de importancia en salud
pública. Clave del tabulador: 1J635128
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ESTÁNDARES DE CALIDAD
La funcionalidad de la red de diagnóstico para la vigilancia epidemiológica de enfermedad febril
exantemática se evalúa por:
Desempeño técnico
Se envían a los LESP, Paneles de Eficiencia para diagnóstico serológico de Sarampión y Rubéola,
así como un cuestionario, 2 veces por año.
Indicador de diagnóstico confiable
Paneles aprobados con el 90% o más ÷ Paneles recibidos x 100 = 90%
Indicador de diagnóstico oportuno
Resultados de diagnóstico informados en tiempo estándar (4 días a partir de la recepción de
muestras) ÷ No. de muestras recibidas para diagnóstico X 100 = 90%
Captura de datos y emisión de resultados
Aceptación y registro de muestras
La captura de datos y su emisión son actividades que cubren, desde la entrega de oficios para
solicitud de diagnóstico de acuerdo al Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras para el
Diagnóstico del InDRE (REMU/InDRE), al área de Recepción de Muestras del LEFE (REMULEFE), la aplicación de los criterios de aceptación/rechazo de las muestras, el registro de las mismas
a una base de datos con número InDRE, la distribución de muestras ya identificadas para
realización del proceso correspondiente, el tratamiento específico y almacenamiento temporal previo
a su procesamiento, hasta el almacenamiento definitivo para el resguardo de muestras en el
laboratorio.




El personal asignado al área de recepción de muestras del Departamento de Virología recibe las
solicitudes registradas en el Infolab por parte de REMU/InDRE.
El personal asignado al área de recepción de muestras del Departamento de Virología revisa que
los datos descritos en la solicitud de estudio e historia clínica perteneciente a cada muestra
correspondan a los descritos en la Base de datos Infolab, para que posteriormente se lleve a cabo
la captura de resultados.
Una vez que los resultados han sido liberados, el Jefe de laboratorio solicita la base de EFE y
Base de Virología Diagnóstica (VID) en Excel al personal de la Dirección de Servicios y Apoyo
Técnico.
El personal del laboratorio mantiene las muestras de suero a -20 °C y las muestras de exudado
faríngeo y orina tratadas a -70 °C durante un año, para la posterior selección de muestras para
banco de muestras.
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Emisión de resultados
La emisión de resultados concernientes al diagnóstico de sarampión y rubéola involucra varias
etapas, actividades y personal a cargo de ellas en el laboratorio de enfermedades febriles
exantemática:
ETAPA
ACTIVIDAD
1
Realizar la revisión de los datos capturados en el sistema Infolab.
2
Obtener y validar los resultados de las pruebas diagnósticas (sarampión, parvovirus B-19,
parotiditis y varicela RT-PCR en tiempo real sarampión, RT-PCR en tiempo rubéola,
aislamiento viral de sarampión y aislamiento viral de rubéola)
3
Registrar los resultados en las bitácoras correspondientes de acuerdo a las pruebas
diagnósticas
4
Supervisar los resultados de las pruebas diagnósticas
5
Capturar los resultados en el Infolab
6
Imprimir los informes de prueba
7
Autorizar y libera los informes de prueba
9
Entrega los informes de prueba a recepción de muestras InDRE
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED)
Alcance
Este programa se aplica a los 31 LESP que pertenecen a la Red de EFES, así como al laboratorio
central de epidemiología perteneciente al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) ya que
realizan el diagnóstico serológico de sarampión y rubeola utilizando los estuches comerciales
(SIEMENS) para determinación de anticuerpos IgM e IgG (No. catálogo OWLI G15 y OWBO
G15, respectivamente).
El envío del Panel de sueros a los LESP se realiza dos veces al año. Además del panel, se envía la
notificación oficial vía electrónica a la coordinación de la red del InDRE para su posterior envío a
los laboratorios integrantes de la RNLSP quienes de esta forma conocen a su vez la fecha en que
deberán enviar los resultados (impresos y electrónicamente) a la dirección electrónica que se indica,
así como la fecha en la cual los LESP recibirán la notificación de resultados. El informe oficial de
resultados se enviará de manera impresa posteriormente.
Preparación del panel
Selección de las muestras
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Se seleccionan 50 muestras de suero, previamente caracterizadas y con resultados para la
determinación de anticuerpos IgM contra sarampión y/o rubéola, deben tener un volumen mínimo
de 1.5 mL, el suero debe ser transparente y no presentar contaminación, hemólisis ni lipemia.
Se preparan bloques de cinco, haciendo todas las combinaciones posibles para que en el bloque se
incluyan muestras positivas y negativas a sarampión y/o rubéola. Estas combinaciones siempre
deberán ir en relación al volumen de la muestra que se tenga en existencia, ya que no se permite
hacer mezcla de ellas.
 Evaluación
El panel está compuesto por cinco muestras serológicas que representan el 90% para el diagnóstico
de sarampión y rubéola.
Cada muestra concordante equivale al 9%.
El cuestionario tiene un valor del 10%.
El porcentaje obtenido en la calificación del cuestionario más el porcentaje obtenido en el
procesamiento panel de sueros harán un total de 100%.
La calificación final del laboratorio estatal corresponderá a la sumatoria de las muestras
concordantes más el porcentaje de respuestas correctas del cuestionario.
No se califican los errores pre-analíticos, analíticos y pos-analíticos a los laboratorios estatales, solo
se hacen recomendaciones para mejorar su desempeño.
El laboratorio de EFES realiza un análisis de evaluación para detectar las áreas de oportunidad y
mejora; tomando en cuenta las sugerencias hechas por la RNLSP.
Criterios de evaluación
La concordancia de los resultados emitidos por el LESP e InDRE de las muestras serológicas para
diagnóstico de sarampión y rubéola se clasifica como el índice del desempeño:




Sobresaliente: Concordancia >90%
Satisfactorio: Concordancia entre 70-89%. Se solicitan medidas correctivas al proceso y su
cumplimiento en máximo 2 meses mediante supervisión.
Mínimo: Concordancia entre el 50 y 69%. Se suspende el diagnóstico por 6 meses y se dan
recomendaciones para cumplimiento en un plazo no mayor a 6 meses para incorporación a la
red. Esto será documentado oficialmente por las instancias pertinentes.
Precario: Concordancia menor al 50%. Se suspende el diagnóstico por 12 meses y se dan
recomendaciones para cumplimiento hasta la incorporación a la red. Esto será documentado
oficialmente por las instancias pertinentes.
Criterios para la liberación del diagnóstico de Sarampión y Rubéola
Laboratorios que requieren ingresar a la Red de EFE
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El procedimiento para la evaluación inicial del desempeño de los laboratorios solicitantes se hará de
la siguiente forma:






Se enviará un primer panel de eficiencia (previa solicitud oficial), para evaluar el desempeño en
la determinación de anticuerpos IgM contra sarampión y rubéola.
Como parte del proceso de control de calidad, deberán enviar al InDRE el 100% de los
positivos y el 2% de los negativos durante 3 meses.
Si con estos parámetros se obtiene la clasificación de sobresaliente o satisfactoria durante el
periodo de evaluación, se suspenderá el envío de muestras para control de calidad y únicamente
serán evaluados a través de paneles de eficiencia dos veces por año.
Si se obtiene un resultado No aceptable se procederá a solicitar un plan de mejora que deberán
enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana, se realizará una auditoría para evaluar
la competencia técnica, posterior a esto se enviará un segundo panel, a petición y compra del
LESP, que de nuevo servirá para la evaluación del desempeño, si se obtiene nuevamente
resultado No aceptable entonces se procederá a solicitar el cambio del analista para el
diagnóstico de sarampión y rubéola en el LESP y el nuevo analista recibirá capacitación en el
InDRE durante una semana y no podrá realizar el diagnóstico en tanto no compruebe la
competencia técnica en el laboratorio.
Derivado del punto anterior y únicamente mientras dure el proceso de mejora deberán enviar
para control de calidad el 100% de positivos y 2% de negativos de todas las muestras de
probables a sarampión y rubéola.
Como seguimiento en el proceso de control de calidad, el InDRE solicitará al nuevo laboratorio
cada 4 meses a través de correo electrónico, el envío de los registros de las corridas realizadas
junto con las lecturas obtenidas para cada una de las determinaciones que realizan durante una
semana continua, esto con el fin de evaluar la reproducibilidad y repetitividad de cada técnica
empleada.
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO
El LEFE-InDRE utiliza material biológico para mantener el banco de muestras serológicas que se
usan en la elaboración de los paneles de eficiencia, por lo tanto:
Los LESP que tengan el diagnóstico liberado enviarán semestralmente:
 El 100% de muestras séricas con resultado positivo a IgM contra sarampión
 El 2% de muestras séricas con resultado negativo a IgM contra sarampión.
 El 100% de muestras séricas con resultado positivo a IgM contra rubéola
 El 2% de muestras séricas con resultado negativo a IgM contra rubéola
LESP que no tengan el diagnóstico liberado enviarán mensualmente como parte de las muestras
enviadas para control de calidad:
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



El 100% de muestras séricas con resultado positivo a IgM contra sarampión.
El 2% de muestras séricas con resultado negativo a IgM contra sarampión.
El 100% de muestras séricas con resultado positivo a IgM contra rubéola.
El 2% de muestras séricas con resultado negativo a IgM contra rubéola
Las especificaciones para el ingreso de muestras al banco de sueros son:
 Las muestras séricas deben estar libres de lipemia, hemólisis y contaminación, con un volumen
mínimo de 500 µL (µL = microlitros).
 Utilizar material plástico (tubos de polipropileno o criotubos) rotulado con el número de folio
correspondiente.
 Sellar la tapa del tubo con papel Parafilm®.
 Enviar las muestras acompañadas del oficio indicando el motivo de envío (banco de muestras
para EFES) así como una relación con los datos de las muestras que se muestran en el siguiente
cuadro:
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Cuadro 1. Base de datos para banco de sueros LEFE
Folio
Fecha de
inicio de
síntomas
Fecha de
toma de
muestra
Sexo
Edad Localidad
Resultado
de IgM
Sarampión
(Densidad
óptica)
Resultado
de IgM
Rubéola
(Densidad
óptica)
Interpretación
(positivo/negativo)
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD
ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
Curso teórico-practico
Envío del primer panel a
los Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
Recepción de resultados
del Panel en el InDRE
Envío de resultados a la
RNLSP
Envío del segundo panel a
los Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
Recepción de resultados
del Panel en el InDRE
Envío de resultados a la
RNLSP
29
13
27
30
14
28
Nota: Si alguna fecha corresponde a un día no laborable, la actividad se realizará el siguiente día
hábil.
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BIBLIOGRAFÍA
1. Organización Panamericana de Salud. Eliminación de la rubéola y del síndrome de rubéola
congénita. Guía práctica. Washington. 2005.
2. Organización Mundial de la Salud. Manual para el diagnóstico de Laboratorio para los virus del
sarampión y la rubéola. 2da. Ed, 2006.
3. Organización Panamericana de la Salud. Sarampión, Rubéola y SRC Rubella Watch.
Washington. 2009.
4. Norma Oficial Mexicana NOM 017-SSA-2-2012. Para la vigilancia epidemiológica.
5. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. Secretaria de Salud. Manual para la
Toma, Envío y Recepción de muestras para Diagnóstico. México. 2012.
6. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. Secretaria de Salud. Manual de
Procedimientos para el diagnóstico de Laboratorio de Parálisis Flácida Aguda y Enfermedad
Febril Exantemática. México. 2000.
7. Dirección General de Epidemiología. Manual Simplificado de Enfermedades Prevenibles por
Vacunación, México. 2005.
8. Tipples G, Hamkar R, Mohktari T. Evaluation of Rubella IgM Enzyme Immunoassay. J. Clin.
Virol. 2004. 30(3):233-238.
9. Tipples G, Hamkar R, Mohktari T. Assessment of Immunoglobulin M Enzyme Immunoassay
for Diagnosis of Measles. J. Clin. Microbiol.2003. 41(10):4790-4792.
10. Reef S. MD, Reed S, Aberhathy E. MS, Icenogle J Ph.D. Manual for the Surveillance of
Vaccine-Preventable Diseases. Centers for Disease Control and Prevention. 4ta. ed. 2009.
11. Rota P.A, KHAN A.S, Durigon E, Yuran T, Villamarzo Y.S. y Bellini W.J., Detection of
measles virus: RNA in urine specimens from vaccine recipients; J. Clin. Microbiol, 1995, 33:
2485-2488.
12. Bellini W.J. y Rota P.A. Genetic diversity of wild-type measles viruses: Implications for global
measles elimination programs. Emerging Inf. Dis., 1998, 4:1-7.
13. Riddell M. A., Chibo D, Kelly H, Catton M. G, y Birch C.J., Investigation of Optimal
Specimen Type and Sampling Time for Detection of Measles Virus RNA during a Measles
Epidemic. Received 13 July 2000/returned for modification 13 September 2000/Accepted 23
October 2000.
14. Rota P.A., Liffick S.L., Rota J.S., Katz R. R., Redd S., Papania M. y Bellini W.J.M, Molecular
Epidemiology of Measles Viruses in the United States, Emerging Inf. Dis. 1997-2001, Sep 8
(9):902-908.
15. Chomezynski P. and N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159.
16. Bosma TJ, Corbett KM, O’Shea S, Banatvala JE, Best JM. PCR for Detection of Rubella Virus
RNA in Clinical Samples. J Clin. Microbiol, 1998, 33:5, 1075-1079.
17. Bosma TJ, Corbett KM, Eckstein MB, O’Shea S, Vijayalakshmi P, Banatuala JE, Morton K,
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Microbiol, 1997, 33: 2881-2887.
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Detection of Rubella Virus in Clinical Specimens, J Clin Microbiol, 2005, 43: 2, 879-885.
19. Zhang D, Nikkari S, Vainionpää R, Luukkainen R, yli-Kerttula U y Toivanen P, Detection of
Rubella, Mumps and Measles Virus Genomic RNA in Cells from Synovial fluid and Peripheral
Blood in Early Rheumatoid Arthritis, The Journal of Rheumatology, 1997, 24:7,1260-1264.
20. Revello MG, Baldanti F, Sarasini A, Zavattoni M, Torsellini M y Gerna G, Prenatal Diagnosis
of Rubella Virus Infection by detection and Semiquantitation of Viral RNA in Clinical Samples
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thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162: 156-159.
22. Shyamala G, Malathi J, Moses Y.S., Therese KL y Madhavan HN, Nested reverse transcription
polymerase chain reaction for the detection of rubella virus in clinical specimens, Indian J Med
Res, 1997, 125: 73-78.
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ANEXOS
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Anexo I
Técnicas diagnósticas
La capacidad técnica para las instituciones involucradas en la red de EFE es:
InDRE




Determinación de anticuerpos IgM e IgG para sarampión y rubéola en suero humano por
ELISA.
RT-PCR tiempo real para sarampión y rubéola.
PCR punto final para sarampión y rubéola.
Secuenciación de productos.
Laboratorios Estatales de Salud Pública


Determinación de anticuerpos IgM para sarampión y rubéola en suero humano por ELISA.
RT-PCR tiempo real para sarampión.
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Anexo II
CARACTERÍSTICAS DE LOS EQUIPOS COMERCIALES
Resultado de la evaluación de estuches comerciales para determinación de anticuerpos IgM contra
sarampión:
Resultado de la evaluación de estuches comerciales para determinación de anticuerpos IgM contra
rubéola:
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Anexo III
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Determinación de anticuerpos IgM contra sarampión en suero humano por ELISA.
Enzygnost ®Anti-measles virus/IgM
MEASLES IgM
SIEMENS OWLIG15C0502
Preparación de soluciones









Antes de realizar la prueba, asegurarse que los reactivos y las muestras a analizar están a
temperatura ambiente (18-25 °C).
No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene.
Las tiras de la placa que no se utilizarán en el ensayo, deben retirarse del soporte y guardarse en
la bolsa de polietileno para su uso posterior.
Si es necesario mezclar los reactivos o las soluciones de uso de los mismos, se debe evitar la
formación de espuma.
Para cada placa de prueba, diluir 20 mL de solución de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 mL. Una vez preparada la solución puede almacenarse entre 2-8
°C de temperatura (permanece estable durante una semana).
Colorear el tampón para muestras POD para la pre-dilución de las muestras, no como base para
la placa de microtitulación. Añadir 2.5mL de solución colorante azul a 50 µL de tampón para
muestras POD, tomando del reactivo adicional para Enzygnost*/TMB. Mezclar suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgM humana/POD en relación 1+50 con tampón microbiológico para
conjugado. Para una placa de prueba añadir 0.25 mL del conjugado Anti-IgM humana/POD
diluido a un frasco de 12.5 mL de tampón microbiológico para conjugado. Mezclar agitando
suavemente.
Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromógeno TMB con 10 mL de tampón/sustrato
TMB en el frasco de plástico vacío adjunto y mantener protegido de la luz. Después de su uso,
enjuagar cuidadosamente el frasco con agua bidestilada. La solución permanece estable durante
5 días entre 2-8 °C y 8 horas a temperatura ambiente (18-25 °C).
Disolver el contenido del frasco absorbente de factor reumatoide (FR) con 5.0 mL de agua
destilada estéril; la solución está lista para su uso. Esta solución permanece estable una vez
disuelto el factor durante una semana a temperatura entre 2 y 8 °C y 3 meses a -20 °C si es
dividido en alícuotas (fraccionado).
Desarrollo de la técnica
Preparación de la muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, así como los controles Anti-virus del sarampión P/P
(positivo) y Anti-virus del sarampión P/N (negativo) en proporción 1+20 con el Tampón para
muestras POD coloreado, por ejemplo colocar 20 µL de muestra en un tubo de dilución y adicionar
400 µL de Tampón de muestras POD, mezclar cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede
conservarse durante toda la noche entre 2-8 °C (refrigerada) en recipientes cerrados con baja
formación de proteína.
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1. Absorción del factor reumatoide (FR)
Tomar de cada una de las muestras pre-diluidas 1 + 20 de la solución absorbente (FR) lista para su
uso (dilución de la muestra 1:42). Dejar incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (entre
15 y 25 °C) o durante la noche entre 2 y 8 °C (refrigerada).
Nota: Los controles no son tratados con el absorbente (RF). Para la validación de la prueba el
control anti-virus del sarampión P/P debe estar entre los valores de tolerancia proporcionados en la
cuadro de valores bar-code (código de barras) incluida en el estuche.
2. Esquema de distribución
Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a analizar + cantidad de
determinaciones de control P/N o P/P = cantidad de pollos necesarios). El control P/N se coloca
una vez como control negativo al comienzo de la serie a analizar (pocillos A1/A2) o de la placa de
prueba. El control P/P se coloca como segunda (pocillo B1/B2) y última muestra de la serie a
analizar o de la placa de prueba.
3. Distribución de las muestras
En cada uno de los primeros pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, según el plan de
distribución, agregar 150 µL de control P/P y P/N pre-diluidos. Con ello la dilución de la prueba es
de 1:21.
Agitar bien las muestras tratadas con el absorbente RF y agregar 150 µL de cada muestra en un
pocillo recubierto con Ag y Ag-Control. Con ello la dilución de la prueba es de 1:42. La colocación
de las muestras en la placa de prueba debe efectuarse sin interrupciones en un plazo máximo de 15
minutos para cada placa de prueba.
4. Incubación de las muestras
Cubrir con una lámina adhesiva las placas de la prueba por un lapso no mayor de 15 minutos
después de terminar la distribución de muestras e incubar durante 60 minutos (± 2 min) a 37 ± 1 °C;
lavar a continuación como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lámina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos, con ayuda de un lavador de
placas automático o por aspiración manual o bien desechar el líquido volteando la placa. Lavar
cuatro veces con solución de lavado POD pre-diluida. Al finalizar la etapa de lavado continuar
inmediatamente con la siguiente distribución de los reactivos, para evitar la sequedad y perder la
actividad de los compuestos.
6. Distribución del conjugado
Colocar en cada pocillo 100 µL de la dilución lista para su uso del Anti-IgM humana/ POD. Al
finalizar, cubrir la placa con la nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
7. Incubación del conjugado
Incubar durante 60 min (± 2 min) a 37 ± 1 °C; lavar inmediatamente después.
8. Lavado
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Como se describe en el punto 5.
9. Distribución del sustrato
Agregar en cada pocillo 100 µL de solución de uso del cromógeno. Cubrir la placa de
microtitulación con una nueva lámina adhesiva.
10. Incubación del sustrato
Inmediatamente después de finalizar la distribución del sustrato incubar durante 30 ± 2 minutos a
temperatura ambiente (entre 18 y 25 °C), protegido de la luz.
11. Reacción de paro
Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µL de solución de parada POD, mantener
el mismo ritmo que para la distribución del sustrato.
12. Medición
Leer las absorbancias en el lector de pacas a 450 nm en un plazo máximo de una hora. Como
longitud de onda de referencia se aconseja 650 nm o, longitudes de onda entre 615 y 690 nm.
Cálculo del factor de corrección
Para una reproducibilidad óptima de los resultados es indispensable utilizar un factor de corrección
de los resultados tanto para la valoración cuantitativa, como para la cualitativa.
Calcular a partir de las diferencias entre las lecturas de extinción de la control Anti-virus del
sarampión P/P, el valor promedio. El valor teórico dado para esto en la tabla de valores [código de
barras (bar-code)], se divide por el valor promedio ∆A obtenido para la diferencia P/P y así se
determina el factor de corrección:
∆A valor nominal
Factor de corrección= Media ∆A valor del suero control P/P
Los resultados se expresan según los siguientes criterios:
Negativo
<0.100
Positivo
>0.200
Indeterminado
(0.100-0.200), solicitar una segunda muestra
Interpretación por laboratorio


Un resultado negativo significa que no se detectaron anticuerpos IgM específicos del virus. El
sujeto no ha sido infectado de forma aguda con el virus del sarampión a pesar de haber estado
expuesto a una infección o haya sido vacunado no tiene (aún) la capacidad de producir IgM
específica del virus. En personas que a pesar de estar vacunados se enfermen de sarampión, con
frecuencia, no se puede reconocer ninguna IgM específica del virus, se debe tomar una segunda
muestra por lo menos 7 días más tarde y analizar junto con la primera.
La valoración de la muestra como positiva significa que se determinaron anticuerpos IgM
específicos contra el virus y que el paciente cursa con una infección aguda. En el primer día de la
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


aparición de las erupciones de la piel ya se puede encontrar IgM específica contra el virus en más
de la mitad de los pacientes.
En el caso de una infección del hígado crónica activa, que no haya sido ocasionada por el virus de
la hepatitis B, pueden aparecer IgM específicos del virus del sarampión.
La IgM específica del virus no se puede tomar como un marcador para una panencefalitis
esclerosante subaguda (PEES).
Cuando las muestras son valoradas como indeterminadas después de una repetición de la prueba,
se hace necesario tomar una segunda muestra por lo menos 7 días después e investigar junto con
la primera.
Determinación de anticuerpos IgG contra sarampión en suero humano por ELISA
Enzygnost ® Anti-measles virus/IgG
MEASLES IgG
SIEMENS OWLNG15C0502
 Antes de iniciar la prueba, asegurarse que todos los reactivos y las muestras a analizar se
encuentran a una temperatura ambiente entre 18-25 °C.
 No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene.
 Si es necesario mezclar los reactivos o las soluciones de uso de los mismos, se debe evitar la
 Para cada placa de prueba diluir 20 mL de solución de lavado POD con agua destilada o
°C y permanecer estable durante una semana.
 Colorear el Tampón para muestras POD para la pre-dilución de las muestras, no como base
para la placa de microtitulación. Añadir 2.5 mL de solución colorante azul a 50 µL de Tampón
para muestras POD, tomando del reactivo adicionales para Enzygnost*/TMB. Mezclar
suavemente.
 Diluir el conjugado Anti-IgG humana/POD en relación 1+ 50 con Tampón microbiológico
para conjugado. Para una placa de prueba añadir 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5 mL
de Tampón microbiológico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
 Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromógeno TMB con 10 mL de Tampón/sustrato
5 días a una temperatura entre 2-8 °C y 8 horas a temperatura ambiente (18-25 °C).
1. Preparación de las muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, así como el control Anti-sarampión P/N (positivo) en
proporción 1+20 con el Tampón para muestras POD coloreado, por ejemplo añadir con pipeta 20
µL de muestra en un tubo de dilución y adicionar 400 µL de Tampón de muestras POD, mezclar
cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede conservarse durante toda la noche a una temperatura
entre 2 y8 °C (refrigeración) en recipientes cerrados, con baja formación de proteína.
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El número necesario de pocillos de la placa de microtitulación se deduce del número de muestras a
investigar más el número de determinaciones (N=2) del control Anti-sarampión P/N.
En cada uno de los pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, se adicionan 200 µL de Tampón
para muestras sin colorear. Adicionar según el plan de distribución, 20 µL de control P/N prediluidos en cada uno de los dos primeros pocillos recubierto con Ag y Ag-control. En los siguientes
pocillos distribuir 20 µL de cada una de las muestras problema. En los dos últimos pocillos de la
serie o de la placa, pipetear una vez más 20 µL del control P/N pre-diluido.
No se debe añadir primero el P/N al inicio y al final de la serie y después las muestras problema,
sino que debe seguirse el orden de la serie. Después de agregar el control y la muestras en el orden
correspondiente, mezclar por lo menos dos veces por aspiración y expulsión con ayuda de la
micropipeta. Para cada muestra debe utilizarse una punta diferente.
después de terminar la distribución de muestras e incubar durante 60 minutos (± 2 min) a 37 ± 1 °C;
lavar a continuación como se indica en el siguiente punto (6).
6. Lavado
Retirar la lámina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos con ayuda de un lavador de
placas automático o por aspiración manual o bien desechar el líquido volteando la placa. Lavar
Colocar en cada pocillo 100 µL de la dilución lista para su uso del Anti-IgG humana/ POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
Incubar durante 60 min (± 2 min) a 37 ± 1 °C; lavar inmediatamente después.
9. Lavado
Como se describe en el inciso 6.
10. Distribución del sustrato:
microtitulación con nueva lámina adhesiva.
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13. Medición
Evaluación cuantitativa de la prueba
Para la evaluación, las diferencias de las extinciones, obtenidas por placa de prueba y la placa control
Anti-Virus de sarampión P/N para las medidas con el antígeno control virus de sarampión, deben
encontrarse como valor único dentro de los límites superiores e inferiores de tolerancia dados en la
tabla de valores del código de barras (valor que se incluye en cada estuche) dependiente del lote:
Valor de tolerancia inferior ≤ valor de tolerancia límite de tolerancia superior.
Además las diferencias de las señales de los valores aislados (control Anti-Virus de sarampión P/N,
al comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser más de ± 20% del
valor promedio de ellas.
Evaluación cualitativa de la prueba
Para la valoración cualitativa se deben aplicar los siguientes criterios:
Antivirus sarampión /IgG, negativo
Antivirus sarampión /IgG, positivo
Antivirus sarampión /IgG, valor indeterminado
A <0.100 (valor límite)
A >0.200
0.100≤ A ≥0.200
Valoración cuantitativa con el método α
Las muestras que presentan anticuerpos IgG por encima del valor límite pueden ser valoradas con
ayuda del método α.
No se deben emplear en el cálculo
Lecturas (A) corregidas <límite
Lecturas (A) no corregidas >2.5
El cálculo en UI/mL se realiza según la siguiente fórmula:
Log 10 UI/mL = (α) x (∆A)
Los valores para las constantes α y β y se deben tomar de la tabla del código de barras incluido en
cada estuche.
El proceso del cálculo se hace para una dilución de muestra de 1+230. Para las diluciones de las
muestras 1+2309 se debe multiplicar por 10 el resultado y no la densidad óptica.
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Los resultados de las muestras se expresan en mUI/mL de suero.
Negativo
Positivo
Indeterminado
<0.100
>0.200
(0.100-0.200), solicitar una segunda muestra
Estas densidades ópticas deben ser expresadas en UI/mL utilizando el método α, los valores
obtenidos son considerados como el valor de corte de la prueba.
Interpretación por laboratorio
 Los resultados son analizados en conjunto con los datos clínicos del paciente.
 Un resultado negativo en la valoración cualitativa significa que no fue posible reconocer
anticuerpos IgG específicos para el virus de sarampión. Si a pesar de obtener un resultado
negativo se sospecha que el paciente se expuso al virus se debe tomar una segunda muestra, dos
o tres semanas después del tiempo en que se sospecha que estuvo expuesto al virus, debe
analizarse en conjunto con la primera toma.
 Muestras con resultados indeterminados después de haber repetido la prueba, indica una
infección, en este caso debe tomarse una segunda muestra, por lo menos 7 días después de la
primera muestra y analizarse junto con la primera.
 Una muestra positiva significa que se encontraron anticuerpos IgG específicos contra el virus
de sarampión y si en esta misma muestra no se encuentran anticuerpos IgM específicos para el
virus se puede asumir que el paciente estuvo previamente expuesto al virus.
 Un aumento significativo en la actividad de anticuerpos en un par de muestras tomadas en un
periodo de 7 días indica una reactivación del virus.
 Madres de recién nacidos vacunadas presentan por lo general una actividad de IgG contra el
virus de sarampión menor que en mujeres con una infección por virus silvestre, en el caso de
abortos se encuentran por lo general niveles bajos de anticuerpos.
Determinación de anticuerpos IgM contra rubéola en suero humano por ELISA
Enzygnost ® Anti-Rubella virus/IgM
RUB IgM
SIEMENS OWBOG15C0503




Antes de iniciar la prueba cerciórese que todos los reactivos y las muestras a analizar están a
temperatura ambiente; 18-25 °C.
No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene.
Si es necesario mezclar los reactivos o las soluciones de uso de los mismos, se debe evitar la
Para cada placa de prueba diluir 20 mL de solución de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 mL. Una vez preparada la solución, ésta puede almacenarse entre
2-8 °C de temperatura y permanece estable durante una semana.
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



Colorear el Tampón para muestras POD para la pre-dilución de las muestras, no como base
para la placa de microtitulación. Añadir 2.5 mL de solución colorante azul a 50 µL de tampón
para muestras POD, tomando del reactivo para Enzygnost*/TMB. Mezclar suavemente.
Diluir el conjugado Anti-IgM humana/POD en relación 1 + 50 con el tampón microbiológico
para conjugado. Para una placa de prueba añadir, 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5
mL de Tampón microbiológico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromógeno TMB con 10 mL de Tampón/sustrato
5 días si se mantiene a una temperatura de entre 2 y 8 °C y 8 horas, a temperatura ambiente (1825 °C).
Disolver el contenido del frasco absorbente de factor reumatoide (FR) con 5.0 mL de agua
destilada estéril; la solución está lista para su uso. Esta solución permanece estable por una
semana entre sí se almacena a 2-8 °C y por 3 meses a -20 °C si es dividido en alícuotas
(fraccionado).
1. Preparación de las muestra
Pre-diluir todas las muestras de sueros, así como también los controles Anti-virus de rubéola P/P
(positivo) y Anti-virus de rubéola P/N (negativo) en proporción 1 + 20 con el Tampón para
muestras POD coloreado, por ejemplo añadir con micropipeta 20 µL de muestra en un tubo de
dilución y adicionar 400 µL de Tampón de muestras POD, mezclar cuidadosamente. La muestra
pre-diluida puede conservarse durante toda la noche a temperatura de entre 2 y 8 °C en recipientes
cerrados, con baja formación de proteína.
Absorción del factor reumatoide (FR)
Tomar 200 µL de cada una de las muestras pre-diluidas y añadirles 200 µL de la solución
absorbente (FR) lista para usar (dilución final de la muestra 1:42). Dejar incubar durante 15
minutos a temperatura ambiente (entre 15 y 25 °C) o durante la noche entre 2 y 8 °C.
Nota: Los controles no son tratados con el absorbente (RF). Para la validación de la prueba el
control anti-virus de rubéola P/P debe estar entre los valores de tolerancia dados en la Tabla de
valores del código de barras (bar-code) incluida en el estuche.
Esquema de distribución
Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras a analizar + cantidad de
determinaciones de control P/N o P/P=cantidad necesaria de pocillos). El control P/N se coloca
una vez como control negativo al comienzo de la serie a analizar (pocillos A1/A2) o de la placa de
prueba. El control P/P se coloca como segunda (pocillo B1/B2) y última muestra de la serie a
analizar o de la placa de prueba.
Distribución de las muestras
En cada uno de los primeros pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, según el plan de
distribución, adicionar 150 µL de control P/P y P/N pre-diluidos. Con ello la dilución de la prueba
es de 1:21. Agitar bien las muestras tratadas con absorbente RF, adicionar 150 µL de cada muestra
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en un pocillo recubierto con Ag y Ag-Control. Con ello la dilución de la muestra es de 1:42. La
colocación de las muestras en la placa de prueba debe efectuarse sin interrupciones en un plazo
máximo de 15 minutos para cada placa de prueba.
Cubrir con una lámina adhesiva las placas de la prueba en un lapso no mayor de 15 minutos después
de terminar la distribución de muestras, e incubar durante 60 minutos (± 2 min) a 37 ±1 °C; lavar a
continuación como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lámina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos (con ayuda de un lavador de
placas automático, por aspiración manual o bien desechar el líquido volteando la placa). Lavar
Colocar en cada pocillo 100 µL de la dilución lista para su uso del Anti-IgM humana/POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocarla en el incubador.
Incubar durante 60 min (± 2 min) a 37 ± 1 °C; lavar inmediatamente después de que finalice la
incubación.
8. Lavado
9. Distribución del sustrato:
10. Incubación del sustrato:
12. Medición
Leer las absorbancias en el lector de placas a 450 nm en un plazo máximo de una hora. Como
Para la evaluación, las diferencias de las extinciones, obtenidas por la placa de prueba y la placa
control anti-Virus de rubéola P/P y para las medidas con el antígeno control virus de rubéola, deben
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encontrarse como valor único dentro de los límites superiores e inferiores de tolerancia
proporcionados en la tabla de valores del código de barras dependiente del lote:
Valor de tolerancia inferior ≤ ∆A control P/P ≤ límite de tolerancia superior.
Además las diferencias de las señales de los valores aislados (control Anti-Virus de rubéola P/P, al
comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser más de ± 20% del
El valor de ∆A para la control Anti-Virus de rubéola P/N debe ser en todos los casos menor que 0.1
(≤0.099).Si las condiciones anteriores no se cumplen, no se puede valorar la prueba.
Cada preparado del control Anti-Virus de rubéola P/P debe alcanzar o superar un valor de extinción
mínimo de 0.2 ∆A.
∆A control P/P ≥0.2
Corrección de las medidas
Para una reproducibilidad óptima de los resultados es indispensable utilizar un factor de corrección
de los resultados tanto para la valoración cuantitativa, como para la cualitativa.
Calcular a partir de las diferencias entre las lecturas de extinción del control Anti-virus de la rubéola
P/P, el valor promedio. De la siguiente manera:
El valor teórico proporcionado, en la tabla de valores del código de barras se divide entre el valor
promedio ∆A obtenido para la diferencia P/P y así se determina el factor de corrección, es decir:
Factor de corrección**=
∆A Valor nominal
Media de ∆A valor del suero control P/P
Con este factor de corrección se deben multiplicar todas las diferencias de extinción que fueron
determinadas en la serie. Si se tienen varias placas de prueba se debe determinar para cada placa de
prueba su factor de corrección y utilizarse.
Para la interpretación son válidos los siguientes criterios:
Antivirus rubéola /IgM, negativo
Antivirus rubéola /IgM, positivo
Antivirus rubéola /IgM, valor indeterminado
∆A <0.100 (valor límite)
∆A >0.200
0.100 ≤∆A ≥0.200 Solicitar segunda muestra.
Determinación de anticuerpos IgG contra rubéola en suero humano por ELISA
Enzygnost ®Anti-Rubella virus/IgG
RUB IgG
SIEMENS OWBFG15C0502
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 Antes de empezar la prueba verificar que todos los reactivos y las muestras a analizar están a
temperatura ambiente (18-25 °C).
 No retirar la placa de pruebas del envase que la contiene.
 Si es necesario mezclar los reactivos o las soluciones de uso de los mismos, se debe evitar la
 Para cada placa de prueba diluir 20 mL de solución de lavado POD con agua destilada o
°C de temperatura. La solución permanece estable durante una semana.
 Colorear el Tampón para muestras POD para la pre-dilución de las muestras, no como base
para la placa de microtitulación. Añadir 2.5 mL de solución colorante azul a 50 µL de Tampón
para muestras POD, tomando del reactivo adicional para Enzygnost*/TMB. Mezclar
suavemente.
 Diluir el conjugado Anti-IgG humana/POD en relación 1 + 50 con Tampón microbiológico
para conjugado. Para una placa de prueba añadir 0.25 mL del conjugado a un frasco de 12.5 mL
de Tampón microbiológico para conjugado. Mezclar agitando suavemente.
 Para cada placa de prueba diluir 1.0 mL de cromógeno TMB con 10 mL de Tampón/sustrato
TMB en el frasco de plástico vacío adjunto y mantenerlo protegido de la luz. Después de su uso,
5 días a una temperatura de entre 2 y 8 °C y 8 horas, a temperatura ambiente (18-25 °C).
1. Pre-diluir todas las muestras de sueros, así como también el control Anti-rubéola P/N (positivo)
en proporción 1+20 con el Tampón para muestras POD coloreado, por ejemplo agregar 20 µL
de muestra en un tubo de dilución y adicionar 400 µL de Tampón de muestras POD, mezclar
cuidadosamente. La muestra pre-diluida puede conservarse durante toda la noche entre 2-8 °C
de temperatura en recipientes cerrados con baja formación de proteína.
El número necesario de pocillos de la placa de microtitulación se deduce del número de
muestras a investigar más el número de determinaciones (N=2) del control Anti-rubéola P/N.
En cada uno de los pocillos recubiertos con Ag o con Ag-control, se adicionan 200 µL de
Tampón para muestras sin colorear. Añadir con micropipeta según el plan de distribución, 20
µL de control P/N pre-diluidos en cada uno de los dos primeros pocillos recubierto con Ag y
Ag-control. En los siguientes pocillos distribuir 20 µL de cada una de las muestras problema.
En los dos últimos pocillos de la serie o de la placa, agregar una vez más 20 µL del control P/N
pre-diluido.
No se debe adicionar primero el P/N al inicio y al final de la serie y después las muestras
problema, sino que debe seguirse el orden de la serie. Después de añadir el control y las
muestras, mezclar por lo menos dos veces por aspiración y expulsión con ayuda de la
micropipeta. Para cada muestra debe utilizarse una punta diferente.
EFES-RNLSP/InDRE
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después de terminar la distribución de muestras e incubar durante 60 minutos (± 2 min) a 37 ± 1
°C; lavar a continuación como se indica en el siguiente punto (5).
5. Lavado
Retirar la lámina adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos (con ayuda de un lavador
de placas automático, por aspiración manual o bien desechar el líquido volteando la placa).
Lavar cuatro veces con solución de lavado POD pre-diluida. Al finalizar la etapa de lavado
continuar inmediatamente con la siguiente distribución de los reactivos, para evitar la sequedad
y perder la actividad de los componentes.
Colocar en cada pocillo 100 µL de la dilución lista para su uso del Anti-IgG humana/ POD. Al
finalizar cubrir la placa con la nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocarla en el
incubador.
Incubar durante 60 min (± 2 min) a 37±1 °C; lavar inmediatamente después.
8. Lavado
9. Distribución del sustrato
Inmediatamente después de finalizar la distribución del sustrato incubar durante 30±2 minutos a
temperatura ambiente (entre 18 y 25 °C), protegiéndolo de la luz.
Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µL de solución de parada POD,
mantener el mismo ritmo que para la distribución del sustrato.
12. Medición
Para la evaluación, las diferencias de las extinciones, obtenidas por placa de prueba y la placa control
Anti-Virus de rubéola P/N para las medidas con el antígeno control virus de rubéola, deben
encontrarse como valor único dentro de los límites superiores e inferiores de tolerancia dados en la
tabla de valores del código de barras (valor que se incluye en cada estuche) dependiente del lote:
EFES-RNLSP/InDRE
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Valor de tolerancia inferior ≤ valor de tolerancia límite de tolerancia superior.
Además las diferencias de las señales de los valores aislados (control Anti-Virus de rubéola P/N, al
comienzo y al final de la serie de medidas o de la placa de prueba) no deben ser más de ± 20% del
Para la valoración cualitativa se deben aplicar los siguientes criterios:
Interpretación
Antivirus rubéola /IgG, negativo
Antivirus rubéola /IgG, positivo
Antivirus rubéola /IgG, valor indeterminado
∆A <0.100 (valor límite)
∆A >0.200
0.100 ≤ ∆A <0.200
Valoración cuantitativa con la ayuda del método-.
Las muestras que presentan anticuerpos IgG por encima del valor límite pueden ser valoradas con
ayuda del método-.
No se deben emplear en el cálculo:
Lecturas (A) corregidas < límite
Lecturas (A) no corregidas >2.5
El cálculo en UI/mL se realiza según la siguiente fórmula:
Log 10 UI/mL = (α) x (∆A)
Los valores para las constantes α y β, se deben tomar de la tabla del código de barras incluido en
cada estuche.
Detección del virus de rubéola mediante RT PCR Tiempo Real
CDC protocols for the molecular epidemiology of measles virus and rubella virus; version of
03/06/2012
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR, por sus siglas
en inglés) tiene la facultad de producir una gran cantidad de copias de Ácido Desoxirribonucleico
(ADN) [DNA, Desoxyribonucleic Acid, por sus siglas en ingles] de doble cadena y en conjunto con
la reacción de retro-transcripción (RT) es posible obtener además moléculas de Ácido
Desoxirribonucleico complementario (ADN), a partir de una muestra de Ácido Ribonucleico
(ARN) [RNA, Ribonucleic Acid, por sus siglas en ingles]. El ADN extraído de las muestras clínicas
o de un cultivo de células es convertido en cADN y posteriormente amplificado para obtener una
gran cantidad de copias.
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La RT-PCR en tiempo real, es un ensayo que tiene la capacidad de monitorear el progreso de la
amplificación. Los datos son colectados desde el primer ciclo de reacción hasta el último,
permitiendo realizar cuantificación de ADN o ARN. La detección de la amplificación de una
secuencia específica es monitoreada mediante la captación de señales de fluorescencia emitida
durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de ARN o de número de copias
de material genético evidenciará un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la
reacción. Por lo contrario, bajas concentraciones de ARN permitirán obtener un incremento de
fluorescencia en los últimos ciclos de la reacción.
El virus de rubéola se encuentra en circulación en concentraciones detectables durante la fase aguda
de la enfermedad (0-5 días) y esta característica hace que este ensayo sea utilizado únicamente
durante esta fase.

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Gabinete de Bioseguridad para PCR
Estación de trabajo con Flujo Laminar
Refrigerador de 2 puertas
Congelador
Ultracongelador
Microcentrífuga
Agitador magnético
Micropipeta de volumen variable entre 0.5-10 µL
Micropipeta de volumen variable entre 20-200 µL
Micropipeta de volumen variable entre 100-1000 µL (2)
Termociclador en tiempo real
Materiales
 Puntas con filtro, estériles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 0.5-10 µL
 Puntas con filtro, estériles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 2-20 µL
 Tubos tipo eppendorf, estériles, libres de ARNsa y ADNsa con capacidad de 1.7 mL
 Gasas estériles
 Guantes de nitrilo (libres de talco)
 Batas desechables
 Papel aluminio
 Gradillas de unicel para tubos tipo eppendorf
 Estaciones para trabajo en frío para tubos tipo eppendorf
 Placas de polipropileno con 96 pozos claros especiales para PCR en tiempo real con capacidad
de 5.0-125 µL.
 Tiras con 8 tubos especiales para PCR en tiempo real con capacidad de 0.2 mL.
 Tiras con 8 tapas ópticas ultra claras especiales para PCR en tiempo real.
 Marcadores indelebles de punto fino.
 Contenedores y bolsas para desecho de material biológico-infeccioso.
 Pinzas
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Reactivos y materiales biológicos
 Cepa de Referencia utilizada como control positivo.
 Estuche para extracción de ARN viral, (QIAamp® Viral ARN Mini Kit) Marca QIAGEN,
catálogo 52906.
 Enzima para amplificación: SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum, Marca Invitrogen,
catálogo 11372-088 o Marca Bio-Rad, catálogo 170-8894.
 Agua calidad PCR libre de ARNsa, Marca Roche, catálogo: 033 159 32 001.
 Iniciador Rubéola Forward (RV11): 5’ CAA CAC GCC GCA CGG ACA AC 3’
 Iniciador Rubéola Reverse (RV12): 5’ CAA CAC GCC GCA CGG ACA AC 3’
 Iniciador Rubéola Reverse (RV12-2): 5’ CCA CGA GCC GCG AAC AGT CG 3’
 Sonda Rubéola: 5’ FAM – AG GTC CAG GTC CCG CCC GAC -BHQ 3’
 Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-F): 5’ AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3’
 Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-R): 5’ GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 3’
 Sonda (BHQ1 HURNASE-P):5’FAM TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1
3’
 Etanol al 75%.
 Etanol grado biología molecular (96-10%)
 Hipoclorito de sodio al 5%.
 Solución para eliminación de ADN, ADNZap, Marca Ambion, catálogo 9892G.
Notas:
 Las cepas de referencia fueron donadas por los Centros para el Control y Prevención de
Enfermedades (CDC).
 Los fluoróforos pueden ser cambiados por otros, siempre y cuando se encuentren en el mismo
canal de adquisición. Esto dependerá de la disponibilidad en la síntesis, de cada empresa.
Procedimiento
Preparación del área de trabajo
Cada una de las áreas de trabajo debe contar con material, equipo, reactivos y personal exclusivo.
Antes de empezar, el gabinete de bioseguridad o flujo laminar de cada una de las áreas de trabajo
(extracción de ARN, preparación de mezcla maestra de reacción y de ARN’s de muestras
problemas) deberá limpiarse con hipoclorito de sodio al 5%, agua bidestilada y etanol al 75%,
siguiendo ese orden. Irradiar con luz ultravioleta durante 20 minutos antes y después de a trabajar.
Si se cuenta con soluciones inhibidora de ARN’s y ADN’s se recomienda realizar la limpieza con
estas soluciones antes y después de trabajar. El material necesario que se va a usar debe estar listo en
cada área de trabajo.
Extracción de ácidos nucleicos
El estuche de extracción simplifica la extracción de ARN viral a partir de fluidos libres de células
mediante un procedimiento rápido de centrifugación en columna. No se requiere utilizar fenolcloroformo. El ARN se une específicamente a la membrana de sílica-gel, por la cual pasan todos los
contaminantes. Los inhibidores de PCR como los cationes divalentes y proteínas, son
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completamente removidos durante los pasos de lavado dejando el ARN puro y listo para ser
desprendido de la membrana con la solución de elución.
Preparación de reactivos
a. Agregar 310 µL de solución amortiguadora AVE (solución para eluir ARN) al tubo que
contiene 310 µg de acarreador de ARN liofilizado, para obtener una solución de trabajo de
1.0µg/µL.
b. Disolver perfectamente, realizar alícuotas en volúmenes suficientes para trabajar 5-10 muestras y
almacenar a –20 °C.
c. Evitar ciclos de congelación-descongelación más de tres veces.
d. Preparar solución AVL (solución amortiguadora para lisis viral), agregando acarreador de ARN
en relación de: 0.56 mL de AVL + 5.6 µL de acarreador de ARN por cada muestra a procesar
(máximo 24 muestras).
e. La solución de lavado 1 (AW1), debe ser preparada agregando 125 mL de etanol (96-100%)
grado biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol.
f. La solución de lavado 2 (AW2), debe ser preparada agregando 160 mL de etanol (96-100%)
grado biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol.
Obtención de ARN
a. Elaborar la bitácora de trabajo correspondiente para la realización de extracción.
b. Etiquetar los tubos tipo eppendorf de 1.7 mL necesarios, dependiendo del número de muestras
a procesar.
c. Añadir 560 µL de solución AVL/acarreador de ARN a cada uno de los tubos tipo eppendorf.
d. Agregar 140 µL de suero o plasma y agitar durante 15 segundos.
e. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar brevemente a 1500 rpm por 30
segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
f. Adicionar 560 µL de etanol grado biología molecular, agitar durante 15 segundos y centrifugar
brevemente a 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
g. Remover del empaque las columnas/tubo colector a utilizar y etiquetarlas.
h. Tomar 630 µL de la solución anterior (paso f) y agregarlos cuidadosamente dentro de la
columna, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 °C.
i. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y repetir el paso anterior.
j. Cambiar otra vez la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 µL de solución de lavado
AW1, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 °C.
k. Cambiar nuevamente la columna a un tubo colector limpio y agregar 500 µL de solución de
lavado AW2, centrifugar a 14,000 rpm durante 3 minutos a 4 °C.
l. Cambiar la columna a otro tubo tipo eppendorf de 1.7 mL, limpio, estéril, libre de ARNsa y
ADNsa, etiquetado (con el número de muestra correspondiente) y agregar 60 µL de solución de
elución (AVE) a cada una de las columnas. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto
y centrifugar a 8000 rpm por un minuto a 4 °C.
m. Descartar la columna y cerrar el tubo tipo eppendorf que contiene el ARN de interés.
n. Almacenar a -20 °C si se lleva a cabo la amplificación dentro de las primeras 48 horas, de no ser
así, se almacena a -70 °C, hasta su análisis.
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Notas:
 Todos los desechos de los tubos colectores se deben descartar en un recipiente exclusivo para su
posterior eliminación.
 Las soluciones de extracción AVL y AW1 contienen sales de guanidina, las cuales pueden
formar compuestos altamente reactivos cuando se combinan con cloro.
 En caso de incorporar un control interno, este deberá adicionarse junto con el acarreador a la
solución AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucleótidos, moléculas más pequeñas
no promueven un buen rendimiento de ARN.
 En caso de que se requiera realizar la extracción de más de 30 muestras, se deberá usar el equipo
automatizado, siguiendo el Instructivo de extracción automatizada de ácidos nucleicos y el
Instructivo de Operación del Equipo MagNA Pure LC 2.0. En este caso se deberá utilizar la
bitácora de trabajo de extracción automatizada.
AMPLIFICACIÓN
Calculo de reactivos y ubicación de muestras.
a. Con base al número de muestras y controles (positivos y negativos) se realizan los cálculos
correspondientes para preparar la mezcla maestra de reacción, estos datos se deben anotar en la
bitácora de trabajo correspondiente. La persona encargada de realizar la mezcla maestra de
reacción, determinará el número requerido de tubos/pozos, de acuerdo al número de muestras
problema y controles.
b. Realizar los cálculos de cada uno de los reactivos, de acuerdo al número de muestras y controles.
Considerar un excedente para una muestra más.
c. Anotar la ubicación de las muestras y controles en la bitácora de trabajo así como todos los datos
solicitados en la misma. La ubicación de los controles debe estar lo más alejado posible de las
muestras problema.
d. Abrir el programa del termociclador para crear un nuevo documento (placa) basándose en el
formato existente (“Plantilla Rubéola”); para ubicar en la misma posición las muestras y
controles en la placa del programa así como en la bitácora de trabajo.
e. Guardar el documento elaborado con el formato de fecha (dd/mm/aa) en la carpeta
correspondiente.
Preparación de mezcla maestra de reacción
a. Limpiar el área como se indicó anteriormente y sacar del congelador los reactivos a utilizar,
manteniéndolos en frío en un contenedor con cama de hielo.
b. Trabajar siguiendo las buenas prácticas de laboratorio para biología molecular.
c. Agregar a un tubo tipo eppendorf de 1.7 mL cada uno de los reactivos que conforman la mezcla
maestra de reacción en base a la bitácora de trabajo realizada.
d. Agregar 22.5 µL de la mezcla maestra de reacción a cada tubo/pozo a utilizar.
e. Agregar 2.5 µL de agua calidad biología molecular al tubo/pozo que contendrá el control
negativo de reactivos y taparlo.
f. Pasar al área de adición de ARN los tubos/pozos que contienen la mezcla maestra de reacción
evitando exponerlos al ambiente, para ello se deben trasladar en una caja limpia, cerrada y libre
de ARNas y ADNas.
Adición de los ARN de muestras problemas
a. Limpiar el área como se indicó anteriormente.
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b. Agregar 2.5 µL del ARN de la muestra problema a cada tubo/pozo siguiendo la ubicación de la
bitácora de trabajo correspondiente, en primer lugar se agrega el ARN de la muestra problema,
al final los controles positivos y estándares (en caso de cuantificación). Al terminar de colocar
una hilera esta deberá de taparse usando tiras de tapas. Evitar el contacto directo de los guantes
al momento de tapar.
c. Ingresar los tubos/pozos al termociclador, seleccionar en el programa el protocolo de
amplificación (“Rubéola”) e iniciar la corrida.
Interpretación de las curvas de amplificación
a. Los valores de amplificación se expresan en valores de Ct (del inglés Cycle threshold), donde un
Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa rebasan el punto de corte o
umbral. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN presente en la
muestra.
b. A cada uno de los fluoróforos se le asignó un color para diferenciar el ARN viral del ARN del
RP (ARNsa P humana) , como se indica a continuación:
c. Fluoróforo FAM (5 o 6-carboxifluoresceina), color verde para identificar al RP de las muestras
clínicas.
d. Fluoróforo FAM color azul para identificar al ARN viral de las muestras clínicas.
e. Para que la muestra sea considerada positiva deberá presentar curvas sigmoides.
f. Muestras con valor de Ct menor o igual a 40 son positivas para Sarampión.
g. Muestras con valor de Ct mayor o igual a 40 son negativas.
h. Muestras con Ct menores a 35, pero con curvas no sigmoides (artefactos), no deben reportarse y
deben repetirse las muestras por duplicado.
i. Muestras con valor de Ct entre 36 y 38, se deberán repetir por duplicado. Si se obtiene
nuevamente el mismo resultado se debe repetir el ensayo desde la extracción de ARN y en caso
de obtener el mismo resultado se reporta como positivo.
Notas:
 En caso de incorporar un control interno se deben seguir las instrucciones de uso del fabricante.
 Los controles positivos y negativos sirven para monitorear alguna falla en alguno de los reactivos
del ensayo y para validar el ensayo per se.
El ensayo se debe repetir si alguno de los controles positivos no amplifica o si estuvieran fuera del
rango esperado o sí el control negativo amplificara.
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Figura. 9. Resultados de amplificación. Gráficas de amplificación presentadas en formato
logarítmico
Detección del virus de rubéola mediante RT PCR tiempo real
CDC protocols for the molecular epidemiology of measles virus and rubella virus; version of
03/06/2012
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR por sus siglas
en inglés) tiene la facultad de producir una gran cantidad de copias de ADN de doble cadena y en
conjunto con la reacción de retro-transcripción (RT) es posible obtener moléculas de ADN
complementario, a partir de una muestra de ARN. El ARN extraído de las muestras clínicas o de un
cultivo de células es amplificación. Los datos son colectados desde el primer ciclo de reacción hasta
el último, permitiendo realizar cuantificación de ADN o ARN. La detección de la amplificación de
una secuencia específica es monitoreada mediante la captación de señales de fluorescencia emitida
durante los ciclos de la PCR. La presencia de altas concentraciones de ARN o de número de copias
de material genético evidenciará un incremento en la fluorescencia en los primeros ciclos de la
reacción. Por lo contrario, bajas concentraciones de ARN permitirán obtener un incremento de
fluorescencia en los últimos ciclos de la reacción.
El virus de la rubeola se encuentra en circulación en concentraciones detectables durante la fase
aguda de la enfermedad (0-5 días) y esta característica hace que este ensayo sea utilizado únicamente
durante esta fase.
Equipo
 Gabinete de bioseguridad para PCR
 Estación de trabajo con flujo laminar
 Refrigerador de 2 puertas
 Congelador
 Ultracongelador
 Microcentrífuga
 Agitador magnético
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



Micropipeta de volumen variable entre 0.5-10 µL
Micropipeta de volumen variable entre 20-200 µL
Micropipeta de volumen variable entre 100-1000 µL (2)
Termociclador en tiempo real
Materiales
 Puntas con filtro, estériles, libres de ARNsa y ADNsa, con capacidad de 0.5-10 µL
 Tubos tipo Eppendorf, estériles, libres de ARNsa y ADNsa con capacidad de 1.7 mL
 Gasas estériles
 Guantes de nitrilo (libres de talco)
 Papel aluminio
 Gradillas de unicel para tubos tipo eppendorf
 Estaciones para trabajo en frío para tubos tipo eppendorf
 Placas de polipropileno con 96 pozos claros especiales para PCR en tiempo real con capacidad
de 5 -125 µL
 Tiras con 8 tubos especiales para PCR en tiempo real con capacidad de 0.2 mL
 Tiras con 8 tapas ópticas ultra claras especiales para PCR en tiempo real.
 Marcadores indelebles de punto fino
 Contenedores y bolsas para desecho de material biológico-infeccioso.
 Pinzas
a. Cepa de referencia utilizada como control positivo.
b. Estuche para extracción de ARN viral, (QIAamp® Viral ARN Mini Kit) Marca QIAGEN,
catálogo 52906.
c. Enzima para amplificación: SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum, Marca Invitrogen,
catálogo 11372-088 o Marca Bio-Rad, catálogo 170-8894.
d. Agua calidad PCR libre de ARNsa, Marca Roche, catálogo: 033 159 32 001.
e. Iniciador Sarampión MVN1139-F: 5’ TGG CAT CTG AAC TCG GTA TCA C 3’
f. Iniciador Sarampión MVN1213-R: 5’ TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA 3’
g. Sonda Sarampión MVNP1163-P: 5’ FAM – CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG
A -BHQ1 3’.
h. Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-F): 5’ AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3’.
i. Iniciador ARNsa P (HURNASE-P-R): 5’ GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 3’.
j. Sonda (BHQ1 HURNASE-P):5’FAM TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG BHQ1
3’.
k. Etanol al 75%.
l. Etanol grado biología molecular (96-100%)
m. Hipoclorito de sodio al 5%.
 Solución para eliminación de ADN, DNaZap, Marca Ambion, catálogo 98
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Nota: Las cepas de referencia fueron donadas por los Centros para el Control y Prevención de
Enfermedades (CDC).
Los fluoróforos pueden ser cambiados por otros, siempre y cuando se encuentren en el mismo canal
de adquisición. Esto dependerá de la disponibilidad en la síntesis de cada empresa.
Procedimiento
Preparación del área de trabajo
Cada una de las áreas de trabajo debe contar con material, equipo, reactivos y personal exclusivo.
Antes de empezar, el gabinete de bioseguridad o flujo laminar de cada una de las áreas de trabajo
(extracción de ARN, preparación de mezcla maestra de reacción y de ARN’s de muestras
problemas) deberá de limpiarse con hipoclorito de sodio al 5.0%, agua bidestilada y etanol al 75%,
siguiendo ese orden. Irradiar con luz ultravioleta durante 20 minutos antes y después de a trabajar.
Si se cuenta con soluciones inhibidora de ARN’s y ADN’s se recomienda realizar la limpieza con
estas soluciones antes y después de trabajar. El material necesario que se use debe estar listo en cada
área de trabajo.
Extracción de ácidos nucleicos
El estuche de extracción simplifica la extracción de ARN viral a partir de fluidos libres de células
mediante un procedimiento rápido de centrifugación en columna. No se requiere utilizar fenolcloroformo. El ARN se une específicamente a la membrana de silica-gel, por la cual pasan todos los
contaminantes. Los inhibidores de PCR como los cationes divalentes y proteínas, son
completamente removidos durante los pasos de lavado dejando el ARN puro y listo para ser
desprendido de la membrana con la solución de elución.
Preparación de reactivos
a. Agregar 310 µL de solución amortiguadora AVE al tubo que contiene 310 µg de acarreador de
ARN liofilizado, para obtener una solución de trabajo de 1.0µg/µL.
b. Disolver perfectamente, realizar alícuotas en volúmenes suficientes para trabajar 5-10 muestras y
almacenar a –20 °C.
c. Evitar ciclos de congelación-descongelación más de tres veces.
d. Preparar solución AVL, agregando acarreador de ARN en relación de: 0.56 mL de AVL + 5.6
µL de acarreador de ARN por cada muestra a procesar (máximo 24 muestras).
e. La solución de lavado AW1, debe ser preparada agregando 125 mL de etanol (96-100%) grado
biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol.
f. La solución de lavado AW2, debe ser preparada agregando 160 mL de etanol (96-100%) grado
biología molecular y marcar el frasco para indicar que se le agregó etanol.
Obtención de ARN
a. Elaborar la bitácora de trabajo correspondiente para la realización de la extracción.
b. Etiquetar los tubos tipo eppendorf de 1.7 mL necesarios dependiendo del número de muestras a
procesar.
c. Adicionar 560 µL de solución AVL/acarreador de ARN a cada uno de los tubos tipo eppendorf.
d. Agregar 140 µL de suero o plasma y agitar durante 15 segundos.
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e. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugar brevemente a 1500 rpm por 30
segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
f. Agregar 560 µL de etanol grado biología molecular, agitar durante 15 segundos y centrifugar
brevemente 1500 rpm por 30 segundos para mantener la tapa del tubo libre de reactivos.
g. Remover del empaque las columnas/tubo colector a utilizar y etiquetarlas.
h. Tomar 630 µL de la solución anterior (inciso f) y agregarlos cuidadosamente dentro de la
columna, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 °C.
i. Cambiar la columna a un tubo colector limpio y repetir el paso anterior.
j. Cambiar la columna nuevamente a un tubo colector limpio y agregar 500 µL de solución de
lavado AW1, centrifugar a 8000 rpm durante un minuto a 4 °C.
k. Cambiar la columna otra vez a un tubo colector limpio y agregar 500 µL de solución de lavado
AW2, centrifugar a 14,000 rpm durante 3 minutos a 4 °C.
l. Cambiar la columna a otro tubo tipo eppendorf de 1.7 mL limpio, estéril, libre de ARNsa y
ADNsa, etiquetado (con el número de muestra correspondiente) y agregar 60µL de solución de
elución (AVE) a cada una de las columnas. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto y
centrifugar a 8000 rpm por un minuto a 4 °C.
m. Descartar la columna y cerrar el tubo tipo eppendorf que contiene el ARN de interés.
n. Almacenar a -20 °C si se lleva a cabo la amplificación dentro de las primeras 48 horas y de no
ser así se almacena a -70 °C, hasta su análisis.
Notas:
 Todos los desechos de los tubos colectores se deben descartar en un recipiente exclusivo para su
posterior eliminación.
 Las soluciones de extracción AVL y AW1 contienen sales de guanidina, las cuales pueden
formar compuestos altamente reactivos cuando se combinan con cloro.
 En caso de incorporar un control interno, este deberá adicionarse junto con el acarreador a la
solución AVL. El control interno debe tener al menos 200 nucleótidos, moléculas más pequeñas
no promueven un buen rendimiento de ARN.
 En caso de que se requiera realizar la extracción de más de 30 muestras, se deberá usar el equipo
automatizado, siguiendo el Instructivo de extracción automatizada de ácidos nucleicos y el
Instructivo de Operación del Equipo MagNA Pure LC 2.0. En este caso se deberá utilizar la
bitácora de trabajo de extracción automatizada.
AMPLIFICACIÓN
Cálculo de reactivos y ubicación de muestras
a. Con base al número de muestras y controles (positivos y negativos) se realizan los cálculos
correspondientes para preparar la mezcla maestra de reacción, estos datos se deben anotar en la
bitácora de trabajo correspondiente. La persona encargada de realizar la mezcla maestra de
reacción, determinará el número requerido de tubos/pozos, de acuerdo al número de muestras
problema y controles.
b. Realizar los cálculos de cada uno de los reactivos, de acuerdo al número de muestras y controles.
Considerar un excedente para una muestra más.
c. Anotar la ubicación de las muestras y controles en la bitácora de trabajo así como todos los datos
solicitados en la misma. La ubicación de los controles debe estar lo más alejado posible de las
muestras problema.
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d. Abrir el programa del termociclador para crear un nuevo documento (placa) basándose en el
formato existente (“Plantilla Rubeola”); para ubicar en la misma posición las muestras y
controles en la placa del programa como en la bitácora de trabajo.
e. Guardar el documento elaborado con formato de fecha (dd/mm/aa) en la carpeta
correspondiente.
Preparación de mezcla maestra de reacción
a. Limpiar el área como se indicó anteriormente y sacar del congelador los reactivos a utilizar,
manteniéndolos en un contenedor con cama de hielo. Agregar a un tubo tipo eppendorf de 1.7
mL cada uno de los reactivos que conforman la mezcla maestra de reacción con base en la
bitácora de trabajo realizada.
b. Agregar 22.5 µL de la mezcla maestra de reacción a cada tubo/pozo a utilizar.
c. Agregar 2.5 µL de agua calidad biología molecular al tubo/pozo que contendrá el control
negativo de reactivos y taparlo.
d. Pasar al área de adición de ARN los tubos/pozos que contienen la mezcla maestra de reacción
evitando exponerlos al ambiente, para ello se deben trasladar en una caja limpia, cerrada y libre
de ARNas y ADNas.
Adición de los ARN de muestras problemas
a. Limpiar el área como se indicó anteriormente y sacar los ARN de las muestras problema del
congelador.
b. Trabajar siguiendo las buenas prácticas de laboratorio para Biología Molecular.
c. Agregar 2.5 µL del ARN de la muestra problema a cada tubo/pozo siguiendo la ubicación de la
bitácora de trabajo correspondiente, en primer lugar se agrega el ARN de la muestra problema,
al final los controles positivos y estándares (en caso de cuantificación). Al terminar de colocar
una hilera esta deberá de taparse usando tiras de tapas. Evitar el contacto directo de los guantes
al momento de tapar.
d. Ingresar los tubos/pozos al termociclador, seleccionar en el programa el protocolo de
amplificación (“Rubeola”) e iniciar la corrida.
Interpretación de las curvas de amplificación
a. Los valores de amplificación se expresan en valores de Ct (Cycle threshold, por sus siglas en
inglés), donde un Ct es el ciclo a partir del cual los valores de fluorescencia relativa rebasan el
punto de corte o umbral. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN o ADN
presente en la muestra.
b. A cada uno de los fluoróforos se le asignó un color para diferenciar el ARN viral del ARN del
RP, como se indica a continuación:
c. Fluoróforo FAM color verde para identificar al RP de las muestras clínicas.
d. Fluoróforo FAM color azul para identificar al ARN viral de las muestras clínicas.
e. Para que la muestra sea considerada positiva deberá presentar curvas sigmoides.
f. Muestras con valor de Ct menor o igual a 40 son positivas para Rubéola.
g. Muestras con valor de Ct mayor o igual a 40 son negativas.
h. Muestras con Ct menores a 35, pero con curvas NO sigmoides (artefactos), no deben reportarse
y deben repetirse por duplicado.
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i. Muestras con valor de Ct entre 36 y 38, deben repetirse por duplicado. Si se obtiene
nuevamente el mismo resultado se debe repetir el ensayo desde la extracción de ARN, en caso
de obtener el mismo resultado se reporta como positivo.
Notas:
 En caso de incorporar un control interno se deben seguir las instrucciones de uso del fabricante.
 Los controles positivos y negativos sirven para monitorear alguna falla en alguno de los reactivos
del ensayo y para validar el ensayo.
 El ensayo se debe repetir si alguno de los controles positivos no amplifica o si estuvieran fuera
del rango esperado o sí el control negativo amplificara.
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Figura. 10. Resultados de amplificación. Gráficas de amplificación presentadas en formato
logarítmico
Método de Retro-transcripción acoplada a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) para
la detección del Virus de Sarampión
El método de RT-PCR permite realizar el diagnóstico de sarampión, usando la transcriptasa reversa
se obtiene el Ácido Desoxirribonucleico complementario (cADN por sus siglas en inglés). En una
reacción de PCR convencional, el cADN es amplificado empleando la enzima Taq polimerasa. Los
productos de PCR se someten a un corrimiento electroforético para determinar el tamaño del
fragmento de ADN.
La reacción de RT-PCR para diagnóstico de sarampión utiliza un par de iniciadores: PARMV43 y
PARMV44 los cuales están dirigidos a una región conservada del gen de la nucleocápside (N),
dando u fragmento de 300 pb, este fragmento no puede usarse para secuenciar.
Una segunda reacción de RT-PCR es empleada para genotipificar el virus de sarampión, utilizando
los iniciadores PARMV59 y PARMV63 esta combinación de iniciadores da como resultado un
amplicon de 831 pb. Para obtener un fragmento más específico se realiza PCR nested (PCRn) en el
cual se utilizan un par de iniciadores internos PARMV60 y PARMV63N (se encuentran en la parte
final de la región carboxilo COOH del gen N) que dan un fragmento de 563 pb.
Muestra primaria
El ARN es extraído y purificado por el método de columna, mencionado en el instructivo para la
extracción por columna del ARN viral con el estuche QIAMP QIAGEN (LPMS-I-01/0) a partir
de aislamientos en las líneas celulares B95 (linfocitos B de mono titi) o Slam, muestra original como
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exudado faríngeo y orina. En el caso de brotes el número de muestras aumenta y si este es mayor a
cincuenta se hace la extracción automatizada con el equipo MagNAPure LC2.0 Roche.
El ARN total obtenido en el proceso de extracción es colectado en tubos estériles tipo eppendorf
calidad PCR de 1.7 mL libres de ADNas y ARNas, estos deberán ser conservados a -20 °C, para
evitar la degradación del material genético y conservar su pureza hasta el momento de su análisis.
Equipo
 Agitador tipo vortex
 Cabina de bioseguridad clase II tipo A
 Termociclador
 Micropipeta de 0.5 a 10 μL
 Refrigerador
 Congelador
 Ultracongelador
 Espectrofotómetro
Materiales
 Microtubos calidad PCR con tapa plana de 1.7 mL, 500 μL y 200 μL libres de ARNas y
ADNas
 Puntas con filtro, estériles para pipeta automática de varios volúmenes 0.1 a 10 μL, 10 a 100 μL,
20 a 200 μL
 Gradillas para tubos y microtubos
 Congelador portátil para tubos eppendorf LabCooler
 Contenedor para puntas de desecho
 Lentes de seguridad
 Guantes
Reactivos y Materiales Biológicos
 Solución ARNse AWAY (Invitrogen catálogo 10328-011)
 Agua libre de ARNas y ADNas
 Solución amortiguadora 10x para PCR con 1.5mM de MgCl2 (Roche catálogo 11 271 318 001)
 DNA Taq-Polimerasa de 5 U/µL (Roche catálogo 11 418 432 001)
 Inhibidor ARNsin de 40 U/µL de placenta (Roche catálogo 03 335 399 001)
 Agua grado PCR (Roche catálogo 03 315 932 001)
 Transcriptasa Reversa del virus de Mieloblastosis Aviar (RT-AMV) (Roche catálogo 10 109
118 001).
 Iniciador PARMV41 para diagnóstico
 Iniciador PARMV44 para diagnóstico
 Iniciador PARMV59 para secuenciación
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





Iniciador PARMV63N para secuenciación
RNA extraído del sobrenadante de células con el virus de sarampión
DNA obtenido de la RT-PCR para secuenciación
Control positivo: sobrenadante de cultivo de cepas de referencia aisladas en las líneas celulares
Vero Slam o B95a (linfocitos B de mono titi): Edmonston, Moraten, Swartz y Chicago.
dNTP’s 2.5mM marca Sigma.
Etanol al 70%
Procedimiento
 Realizar la extracción manual del ARN viral conforme al instructivo del estuche comercial para
la extracción por columna.
 En caso de tener un gran número de muestras, realizar la extracción automatizada en el robot
“MagNAPure” LC 2.0 Roche.
 Llevar a cabo la prueba de RT-PCR para el diagnóstico de sarampión.
 Para realizar esta metodología es indispensable contar con áreas separadas y suficientes
operadores para evitar contaminaciones entre el mismo material genético del virus de sarampión
y de los controles positivos o con ADN genómico
 Preparar la mezcla de reactivos de la siguiente forma:
 Trabajar en cabina de bioseguridad tipo II exclusiva para preparar la mezcla de reactivos.
 Limpiar la cabina empleando una solución descontaminante de DNAsa y RNAsa,
posteriormente con una solución de etanol al 70%.
 Poner el material que se usará para preparar la mezcla de reactivos e irradiarlo con luz
ultravioleta (UV) por 20 minutos.
 Ventilar la cabina durante 20 minutos antes de su uso.
 En el área Pre-PCR, se preparará la mezcla de reactivos para la RT-PCR. En un tubo
eppendorf de 1.7 mL preparar la mezcla de reacción (mantener el tubo en el congelante portátil
para tubos a -20 °C)
 Adicionar los reactivos a las siguientes concentraciones finales y en el siguiente orden: solución
amortiguadora 1X para PCR con MgCl2, 200 μM de cada DNTPs, 10 picomoles de los
iniciadores PARMV41 y PARMV44, 8 U de RT AMV, 5 U de ARNsin, 2 U de Taq
polimerasa y H2O calidad PCR.
 En el área de aislamiento de RNA, se preparará una serie de tubos eppendorf de 200 μL según
el número de muestras que se esté trabajando. A un tubo adicionar 5.0 μL de ARN del control
negativo y cerrar el tubo perfectamente, en otro tubo poner 5.0 μL del control de reactivos (H2O
con la que se preparó la mezcla de reactivos) y finalmente poner 5.0 μL de la muestra problema
en cada tubo y tapar perfectamente.
 En el área de PCR, se colocarán 5.0 μL de ARN de los controles positivos (Edmonston,
Moraten, Swartz y Chicago) en tubos eppendorf de 200 μL. Después incubar en el
termociclador según el programa indicado para hacer la PCR nested (anidada) bajo las
siguientes condiciones: 35 ciclos de amplificación, 94 °C, 30 segundos; 55 °C, 45 segundos y 72
°C, un minuto, un ciclo final de 72 °C durante 7minutos y una fase estacionaria de 4 °C por
tiempo indefinido para preservar el ADN amplificado.
 Retirar las muestras del termociclador, apagar el equipo y desconectarlo. Los productos de ADN
se almacenan a -20 °C.
 Realizar el corrimiento electroforético de los productos en geles de agarosa.
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Interpretación de resultados
Negativo: ausencia de amplificado.
Positivo: presencia del amplificado esperado. Los casos positivos se envían al Laboratorio de
Genoma de Patógenos (GNM) para su secuenciación.
Los resultados son interpretados por comparación de la presencia y tamaño del producto de PCR de
todas las muestras contra el control positivo (ADN obtenido de los aislamientos: Edmonston,
Moraten, Swartz y Chicago). El producto final de la reacción para diagnóstico es de 300 pb, en el
caso de secuenciación es de 831 pb y en la PCRnested es de 563 pb.
Método de Retro-transcripción acoplada a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) para
la detección del Virus de Rubéola.
El método de RT-PCR permite realizar el diagnóstico de rubéola. El ácido ribonucleico viral es
convertido a ADNc (Ácido Desoxirribonucleico complementario) usando la transcriptasa reversa
(RT). En una reacción de PCR convencional, el ADNc es amplificado empleando la enzima Taq
polimerasa. Los productos de PCR se someten a un corrimiento electroforético en geles de agarosa
y poliacrilamida-bisacrilamida para determinar el tamaño del fragmento de ADN.
En la síntesis de ADNc y en la reacción de PCR se utilizan un par de iniciadores R2 y R7 que se
encuentran en el marco de lectura abierto del genoma del virus de rubéola, del gen E1 que codifica
para una proteína estructural.
Esta combinación de iniciadores da como resultado un amplicón de 185 pb. Para tener un
diagnóstico más específico se realiza un PCR nested [PCRn (PCR anidado)] en donde se utilizan
un par de iniciadores internos llamados R8 y R11 para obtener un fragmento de 144 pb.
Muestra
El ARN es extraído y purificado por el método de columna mencionado en el instructivo para la
extracción por columna del ARN viral con el estuche QIAMP QIAGEN (a partir de las líneas
celulares Vero Slam y Vero). En el caso de contar con un mayor número de muestras, realizar la
extracción automatizada con el robot “MagNAPure” LC 2.0 Roche.
El ARN total obtenido en el proceso de extracción es colectado en tubos estériles tipo eppendorf
calidad PCR de 1.7 mL libres de ADNas y ARNas, deberá ser conservado a -20 °C, para evitar la
degradación del material genético y conservar su pureza hasta el momento de usarlo.
Equipo
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Agitador tipo vortex
Cabina de bioseguridad clase II tipo A
Termociclador
Micropipeta de 0.5 a 10 μL
Micropipeta 2 a 20 μL
Micropipeta 1 a 10 μL
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Refrigerador
Congelador
Ultracongelador
Espectrofotómetro
Materiales
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Microtubos calidad PCR con tapa plana de: 1.7 mL, 500 μL y 200 μL, libres de ARNas y
ADNas.
Puntas con filtro, estériles para pipeta automática de diferentes volúmenes: 0.1 a 10 μL, 10 a
100 μL, 20 a 200 μL.
Gradillas para tubos y microtubos
Congelador portátil para tubos eppendorf (LabCooler)
Contenedor para puntas de desecho
Lentes de seguridad
Batas desechables
Guantes desechables
 Solución ARNse AWAY (Invitrogen No. de catálogo 10328-011)
 Agua libre de ARNas y ADNas
 Solución amortiguadora 10x para PCR con 1.5 mM de MgCl2 (Roche catálogo 11 271 318001)
 Solución amortiguadora 10x para PCR sin 1.5 mM de MgCl2 (Roche catálogo 11 699 113001)
 Solución de Dithiothreitol (DTT) ((Roche catálogo 11 788 558 001)
 ADN Taq-Polimerasa de 5 U/µL (Roche no de catálogo 11 418 432 001)
 Inhibidor ARNsin de 40 U/µL de placenta (Roche catálogo 03 335 399 001)
 Agua grado PCR (Roche catálogo 03 315 932 001)
 Etanol grado biología molecular (96-100%)
 Solución de etanol al 70%
 Transcriptasa Reversa del virus de Mieloblastosis Aviar (RT-AMV) (Roche catálogo 10 109
118 001)
 Iniciador R2
 Iniciador R7
 Iniciador R8
 Iniciador R11
 ARN extraído del sobrenadante de células Vero Slam y Vero infectadas con el virus de rubéola
 ADN obtenido de la RT-PCR de rubéola
 Control positivo: sobrenadante de cultivo de la vacuna RA27/3 en tercer pase
Procedimiento
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Realizar la extracción del ARN viral conforme al instructivo del estuche para la extracción por
columna, si el número de muestras es mayor, hacer extracción automatizada en el robot
“MagNAPure” LC 2.0 Roche
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Llevar a cabo la prueba de RT-PCR para el diagnóstico de rubéola
Es indispensable contar con áreas separadas y suficientes operadores para evitar contaminaciones
con el material genético del virus de rubéola y de controles positivos o con ADN genómico
Preparar la mezcla de reactivos de la siguiente forma:
 Trabajar en cabina de bioseguridad tipo II exclusiva para preparar la mezcla de reactivos.
El gabinete deberá limpiarse empleando una solución descontaminadora de ADNsa y
ARNsa
 Retirar con una solución de etanol al 70%
 Poner el material que se usará para preparar la mezcla e irradiarlo con luz ultravioleta
(UV) por 20 minutos, después ventilar el área.
En el área de Pre-PCR, se preparará la mezcla de reactivos para la RT-PCR. A cada muestra se
le agregan 20 μL de la siguiente mezcla: solución amortiguadora 1X para PCR con MgCl2, 5
mM DTT, 250 μM de cada dNTP, 10 picomoles de los iniciadores R2 y R7, 25 U de RT
AMV, 10 U de ARNsin, 2 U de Taq polimerasa y H2O c. b. p. y 5.0 μL de muestra para un
volumen final de 25 μL de reacción.
Utilizar tubos eppendorf de 200 μL y adicionar 20 μL de mezcla de reactivos para la RT-PCR,
seleccionar un tubo para el control negativo y otro para el control de reactivos, adicionar
respectivamente a cada uno de ellos 5.0 μL de ARN obtenido de la línea celular Vero Slam sin
infectar y 5.0 μL del agua utilizada en la preparación de la mezcla de reactivos. Todos los tubos
deben taparse perfectamente y llevarse al área en donde se colocaran las muestras de ARN
infectadas con el virus de rubéola.
En el área para extracción o aislamiento de ARN el mismo operador A seleccionará un tubo
para el control positivo. Destapar los tubos uno por uno y adicionar 5.0 μL de ARN de la
muestra. Mezclar los tubos ligeramente en agitador tipo vortex, evitando la formación de
burbujas.
El operador B trabajará en el área de PCR y adicionará 5.0 μL de ARN del control positivo
(RA27/3) al tubo seleccionado en el paso anterior.
Colocar los tubos en el termociclador, el programa inicia con la retro-transcripción, seguido de
una fase de 5 minutos de desnaturalización (para eliminar los restos de enzima), después 35
ciclos cada uno con tres etapas: desnaturalización, alineación y extensión, seguido de un ciclo de
extensión para terminar partes incompletas y por último una etapa de enfriamiento (4 °C) para
preservar el ADN sintetizado.
Terminada la corrida se retiran las muestras del termociclador y se conservan a 4 °C. Apagar el
equipo y desconectarlo.
Realizar el corrimiento electroforético de los productos en geles de agarosa.
Realizar primero las diluciones 1:20 para la PCRnested e interpretar los resultados.
PCRnested o PCR anidada

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En el área de PCR se hará primero la limpieza necesaria e irradiación con luz ultravioleta (UV).
Después se harán diluciones 1:20 de los productos de la RT-PCR. Primero procederá a mezclar
en el agitador tipo vortex los tubos que contienen los productos de ADN.
Poner 38 μL de agua libre de ARNas y ADNas en tubos eppendorf de 500 μL. Seleccionar tres
tubos uno para el control negativo, el otro para el control de reactivos y uno para el control
positivo (trabajar al final). Abrir uno de los tubos y agregar 2.0 μL del producto de RT-PCR del
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control negativo, tapar. Abrir el siguiente tubo y agregar 2.0 μL del producto de RT-PCR del
control de reactivos y tapar. Abrir el siguiente tubo y agregar 2.0 μL del producto de RT-PCR
de la muestra infectada con virus de rubéola, tapar. Esto se repite según el número de muestras
que se vayan a procesar.
Se trasladarán los tubos al área de extracción es decir, el tubo que contiene agua y el producto de
la RT-PCR con el control positivo. Abrir los tubos y agregar 2.0μL del control positivo, tapar
ambos tubos.
Agitar todos los tubos en el agitador tipo vortex y etiquetar.
En el área de Pre-PCR se hará la preparación de la mezcla de reactivos para la PCRnested.
Realizar la asepsia necesaria en el área de trabajo e irradiar con luz UV.
La mezcla de reacción deberá contener: Solución amortiguadora (Buffer 1X) sin MgCl2, 1.0
mM de MgCl2, 300 μM de cada dNTP, 5 picomoles de iniciadores R8 y R11, 2 U de Taq
polimerasa y la cantidad de agua necesaria para completar un volumen de 45 μL. Agitar en
vortex para homogenizar la mezcla.
Utilizar tubos eppendorf de 200 μL y agregar 45 μL de mezcla de reactivos para la PCRnested,
tapar los tubos y trasladar al área de PCR.
En el área de PCR, se trabajará con la dilución del control de reactivos. Destapar el tubo que
llevará el control de reactivos y agregarle 0.5 μL de la dilución correspondiente, taparlo, agitar
suavemente en el agitador tipo vortex y observar que no se formen burbujas.
En el área de extracción o aislamiento de ARN, se trabajará con la dilución de las muestras
problema. Destapar el tubo que contiene la mezcla de reacción y agregar 5.0 μL de la dilución
correspondiente que tiene la dilución con la muestra problema, taparlo, después agitar sin que se
formen burbujas en el agitador tipo vortex.
Dilución del control positivo. Destapar el tubo que llevará el control positivo y agregar 5.0 μL
de la dilución correspondiente, taparlo, después agitar con suavidad en el agitador tipo vortex y
observar que no se formen burbujas.
Incubar en el termociclador y utilizar el protocolo que guarda el programa en el que se incubaran
las muestras para sintetizar la PCRnested: 20 ciclos de amplificación: 94 °C, 30 segundos; 56
°C, 45 segundos y 72 °C, un minuto, un ciclo final de 72 °C durante 7minutos y una fase
estacionaria de 4 °C por tiempo indefinido para preservar el ADN amplificado.
Retirar las muestras del termociclador, apagar el equipo y desconectarlo. Si el operador continúa
con la electroforesis puede mantener la muestra a temperatura ambiente mientras carga el gel, de
lo contrario, almacenar en refrigeración.
Realizar el corrimiento electroforético de los productos en geles de agarosa.
Interpretación de resultados
Negativo: ausencia de amplificado
Positivo: presencia del amplificado esperado
Los resultados son interpretados debido a la comparación de la presencia y tamaño del productos de
PCR de todas las muestras contra el control positivo que es la vacuna RA27/3. El producto final de
la reacción es de 143 pb.
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Genotipificación de Sarampión
El principio de la secuenciación automática se basa en el método de Sanger (1977) y permite
obtener la secuencia de productos de PCR de diferentes patógenos de importancia médica como el
sarampión.
La genotipificación de sarampión se basa en analizar una ventana de 634 nucleótidos
correspondientes al gen que codifica para la nucleoproteína, por lo que es necesario amplificar por
RT-PCR en tiempo real un producto de amplificación de 854 pares de bases y obtener su secuencia
para posteriormente compararla filogenéticamente con los secuencias de los diferentes genotipos de
sarampión reportados en todo el mundo.
Para conseguir este objetivo se utiliza el estuche “Measles Genotyping Kit” versión 2.0 para producir
los fragmentos de ADN y secuenciarlos siguiendo el método (Biología Molecular, InDRE).
Reactivos y Equipo
 Secuenciador Automático Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer.
 Termociclador GeneAmp con una velocidad de calentamiento de 1 °C/s, Marca Applied
Biosystems, Modelo PCR system 9700
 Estuche “Measles Genotyping Kit”
 Iniciador MeV214 5’ TGGAGCTATGCCATGGGAGT 3’
 Iniciador MeV216 5’ TAACAATGATGGAGGGTAGG 3’
 Enzima ExoSAP-IT (USB Corporation)
 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)
 Solución amortiguadora “Big Dye Terminator Buffer 5x (Applied Biosystems)”
 Polímero POP-7 y/o POP-6 (Applied Biosystems)
RT-PCR
 Extraer el material genético manualmente mediante columnas Qiagen ARN miniviral o
automáticamente con el estuche MagnaPure Total Nucleic Acids, dependiendo del número de
muestras.

Preparar la mezcla de reacción de RT-PCR utilizando el estuche SuperScript III de Invitrogen:
 Agua:
6.0 µL
 Solución amortiguadora 2X:
12.5 µL
 Primer MeV214:
0.5 µL
 Primer MeV216:
0.5 µL
 RT/Taq:
0.5 µL
 Muestra (RNA):
5.0 µLl

Colocar lo tubos en el termociclador con el siguiente programa:
 Transcripción Reversa: 50 °C/60 min
 Desnaturalización: 94 °C /2 min
 40 ciclos de:
 Desnaturalización 94 °C/30 s
 Alineación a 60 °C/30 s
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


Extensión a 68 °C/60 s
Extensión a 68 °C/2 min
Mantener a 4 °C.
Cuantificación y Purificación
 Determinar la calidad y la cantidad de ADN de cada producto para su purificación y para la
reacción de secuenciación
 Agregar por cada 5.0 µL de producto de PCR, 0.5 µL de la enzima ExoSAP-IT.
 Incubar a 37 °C por 15 min en el termociclador AB 9700
 Inactivar la enzima a 80 °C por 15 min y mantener los productos a 4 °C.
Reacción de Secuencia

Agregar por cada tubo de reacción los siguientes reactivos:
Reactivo
Terminator Ready Reaction Mix (BigDye 3.1v)
Iniciador (3.3 pmol/µL)
BigDye terminator Buffer 5x para 1.1v y 3.1v (solución amortiguadora)
Producto de PCR
H2O grado biología molecular

a.
b.
c.
d.
Cantidad
2.0 µL
1.0µL
3.0 µL
Volumen necesario
Ajustar a 20 µL
Colocar los tubos en el termociclador y llevar a cabo la reacción de secuenciación por 40 ciclos
con las siguientes condiciones:
Desnaturalización a 96 °C por 10 s
Alineación a 50 °C por 5 s
Extensión a 60 °C por 4 min
Mantener a 4 °C
Purificación de los productos de extensión
 Preparar y etiquetar las columnas DyeEx 2.0 Spin y los tubos de colección de hidratación.
 Colocar en el centro de cada columna (sin tocar la silica) cada una de las muestras según
corresponda. Centrifugar las columnas a 3500 rpm durante 3 min a temperatura ambiente.
 Agregar 16 µL de formamida a cada tubo de colección para suspender el producto y agitar
vigorosamente con el agitador tipo vortex.
 Colocar cada una de las muestras de la placa, desnaturalizar y montar la placa en el secuenciador
3130xl.
Electroforesis capilar
 En el equipo ABIprism 3130xl abrir el programa Data Collection Software y crear una corrida
para las muestras a ensayar.
 Abrir las puertas del Secuenciador 3130xl y checar visualmente las condiciones óptimas del
equipo.
 Ensamblar la placa en el soporte y asegurarla con el sujetador.
 Colocar la placa en la posición A o B del “autosampler” del secuenciador y ligar la palanca.
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
Iniciar la corrida dando un “click” en “play”.
Análisis de secuencia
 Abrir el software “Sequencing Analysis” que se encuentra en el escritorio, agregar los datos
obtenidos por el secuenciador e iniciar el análisis.
 Verificar el “electroferograma” y el “Raw Data” de cada producto secuenciado y salvar el análisis
de las secuencias.
 Editar los electroferogramas de cada producto empleando el Programa “Chromas” y
complementar ambas secuencias para obtener una secuencia completa.
 Obtener la secuencia completa en formato FASTA (formato de texto) de los electroferogramas
y salvarlos en formato de texto.
Interpretación
 Depositar la secuencia en código fasta o txt en el software MEANS (Measles Nucleotide
Surveillance) disponible libremente en red con previo registro (http://www.hpabioinformatics.org.uk/Measles/Public/Web_Front/register.php).
 Solicitar el análisis filogenético al equipo de acuerdo a los valores predeterminados en el mismo
y obtener el genotipo.
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Lineamientos EFE 2012 - Dirección General de Epidemiología

Transcripción

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