ezquerra_j

CENTRO DE INVESTIG\CIO NESBIOLOGICAS
DE L NO ROESfE, S,e.
Programa de Posgrado
TECNOLOGfA ENZIMÁTI CA EN ACUACUL TURA:
EVALUACiÓN in vitro DE LA DIGESTIBILIDAD
ENZIMÁTICA DE LA PROTEfNA DIETARIA POR
pH-STAT PARA LA OPTIMIZACiÓN DE DIETAS
DE Penaeus vannamei CULTIVADO
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l,c, "TJ\~r-"íO DE INFORMACION CiEtjflf .~ h
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Requisito para
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Doctor en Ciencias
Uso, Manejo y Aprovecha miento de los Recu rsos Natura les
(Orientación en Biotecnología)
pr
e
sen
ta
da
po
Josafat Marina Ezquerra Brauer
La Paz,
s.e.s.
Octubre de 1997
r
PREFACIO
Esta tesis está basada en los siguientes artículos y manuscritos, los cuales sertm
citados en el texto por sus numeros romanos .
ARTíCULOS
PI.
Fernando Luis Garcia-Carreño. Ange les Navarrete del Toi"O and Marina
Ezquerra. 1997. Digestive shrimp proteases lor evaluation 01 protein
digestibility in vilro. 1: Effect 01 protease inhibitors in protein ingredients. J.
Marine Biotechnology. 5:36-40.
PII.
J. Marina Ezquerra, Fernando Luis Ga rcia-Carreño, Roberto Civers, and
Norman F. Haard . pH-stat method to predict digegtibility in white shrimp
(Penaeus vanname/). Aquaculture. En prensa
PIII.
J. Marina Ezquerra , Fernando Luis Garcia-Carreño, .3nd Norman F. Haard.
Effects 01 leed diets on digestive proteases lrorr' the hepatopancreas 01
white shrimp (Penaeus vannamel). J. Food Biochemistry. Aceptado.
MA NUSCRITOS
MI.
J. Marina Ezquerra, Fernando Luis Garcia-Carreño. Guillermo Arteaga and
Norman F. Haard. Aminopeptidase aetivity lrom the hepatopanereas 01
white shrimp (Penaeus vanname/) fed with different diets. Para ser enviado
a J. Food Biochemistry.
Mil.
J. Marina Ezquerra, Fernando Luis Garcia-Carreño and OIImpla Camilo. In
vitro digestibility 01 protein sourees lor Paeifie white shrimp (Penaeus
vanname/). Para ser enviado a Aquaculture.
11
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) y la
Universidad de Sonora por su apoyo financiero para la realización de mis estudios
doctorales. Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste les agradezco por
haberme aceptado dentro de su Programa Doctoral. Al equipo del programa de
posgrado por su ayuda en la realización de mis estudios doctorales.
Deseo expresar mi sincera gratitud a los úrs. Fernando Luis Garcfa-Carreño,
Norman F. Haard, GUillermo Arteag a y Roberto Civera C. por su guia, apoyo y
estimulo durante mi programa doctoral y desarrollo de este trabajo. Un
agradecimiento especial a los Drs. Francisco Vargas Albores
y G loria Yepiz P. por
su atinada orientación en la preparación del presente manuscrito.
El trabajo de investigación no podria haber sido posible sin la valiosa ayuda de
muchas personas. Dr. Roy Bowers por su orientación y apoyo durante la realización
de mis estudios. B. Guillermo Portillo por proporcionar los animales utilizados
durante este estudio, apoyo
y por permitir la utilización de! la boratorio de Biolog ía
Marina para realizar los ensayos in vivo. A los Ings. Sonia Rocha. Ernesto
Goytortua, a la M.C. Rockarake Raksakalthai de la Universidad de California, en
Oavis,y Ma. Angeles Navarrete del Toro por toda la ayuda brindada. Agradezco la
ayud a pres tada por Horacio Sandoval y Carlos A. Pacheco durante la edición del
manuscrito de tésis. A Brian Herkenrath y Jack Presley de la Universidad de
California por e l análisis de amino ácidos. Un ag radecimiento especial a los Drs.
John Withaker y Oouglas Conklin de la Universidad de California en Oavis CA
por su valiosa orientación. No hay palabras para expresar mis mas sincera gratitud
y aprecio a la Dra. Elisa Serviere, M.C.Tere Gollas, M.C. Lucia Ocampo e Ing .
Mayra Vargas, su amistad y guía fueron cruciales para lograr el desarrollo completo
de mi trabajo de investigación.
Un agradecimiento especial y de la manera más cálida posible a la Sra. Victoria
Haard por su hospitalidad y cariño durante mi estancia en Davis, a Thelma
Castellanos, Adolfo García, Lourdes Morquecho, Angel Carrillo, Bertha Arredondo ,
Jorge Hernandez, Sandra de la Paz, Cecilia Picos. René Rebollar, JuWen Wu y,
Vasana Weerasinghe por su amistad, paciencia y apoyo durante mis estudios
doctorales. Mi aprecio se extiende a las Oras. OIelia Rouzaud y Herlinda Soto, y a
Martha Espinoza por su gu la, estímu lo y amistad.
Finalmente. no menos importante fue la ayuda brindada por los Ors. Josepn
Oubrosky por sugerir el titulo, Olimpia Carrillo por la revisión del manuscrito en
español y Ellis Glazier por la revisión del manuscrito en inglés.
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C6fUH«¡O,
A la memoria de Roy Bowers
v
RESUMEN
El camarón del Pacífico (Penaeus vanname/) es una de [as especies rlás importantes
de penaeidos para producción comercial. La glándula digestiva de los pene idos es conocida
por poseer alta actividad proteolítica, además d~1 proceso digestivo, las enzimas son una
importante herramienta en biotecnología, ;::¡rocesamiento de alimentos y otras industrias.
El método del pH-stat fue empleado para evaluar la digestibilidad de proteínas de
harinas de diferente::; orígenes, anchoveta, desperdicios del atún, pescado deshuesado
blanco , langostilla, soya y dos harinas de pescado sin cabeza. La caseína fue utilizada como
proteína de referencia. Las dietas eva luadas estaban constituidas por un 85% de una dieta
de referencia para camarón y un 15% de cualquiera de las siete harinas antes mencionadas
como proteína de substitución. El grado de hidrólisis (OH) de las siete harinas, correlacionó
mejor con la digestiblidad aparente de proteína in vivo (APO) cuando se usaron como
sistemas enzimaticos a los extractos provenien tes del he pato páncreas del camarón (SHE)
(1.2::; O.73~O.80), comparado con el sistema de cuatro enzimas comerciales (FES) r~ O.7~.
Empleando el SHE para evaluar las siete muestras de harinas tuvieron mejor correladon
con la APD cuando se analizaron por el método del pH·stat comparado con el método del
pH-drop (r ~ 0.55). La bond ad del método del pH-stat fue confirmClda por los resultados
obtenidos durante un ensayo de crecimento de 30 días, donde se probaron las siete dietas
ensayadas en los estudios de APD. El análisis de la siete harinas por pH-staí empleando
SHE como enzimas, presentaron una correlacion sig nificativa con el crecimiento de los
camarones (r= 0.50-0.67).
Se evaluó la actividad proteolítica en el SHE proveniente de los camarones blancos
(Penaeus vannamef) que fueron alimentados con una de las siete dietas analizadas durante
30 días. Basándose en la composicion quimica, de amino ácidos y en el color, la harina de
pescado sin cabeza (B), presentó baja calida d como alimento para camarón. El zimograma
empleando SDS-PAGE, del SHE proveniente de cada uno de los grupos de camarones
alimentados con las siete dietas, mostró un palrón muy similar de actividad cuando se usó
caseína como substrato. La mayor actividad total de proteinasas, medidas con azocaseína
(unidades/g SHE), fue para los extractos del grupo de camarones alimenta ::los con fa dieta
conteniendo desperdicios de atún como proteína de su bstitución (P<O.05). La actividad de
tripsina y quimolripsina fue más alta en el SHE de los animales alimentados con [a dieta
conteniendo como proteína de substituciór, la harina de pescado sin cabeza B (P<O.05)
La actividad de aminopeptidasa en el SHE fue evaluada, probando diferentes substratos
artificiales. La actividad de la leucin-aminopeptidasa se vió inhibida, cuando se analizaron
más de 0.2 IJg de proteína del SHE, lo que sugiere la presencia de inhibidores o de otros
compuestos interferentes en [os e.:tractos. Cuando se adicionó Zn *2 y Mg*2, la actividad de
la leu-aminopeplidasa disminuyó. Apllc.sndo el análisis del componente principal. el cual
arrojó distintos patrones, tanto por dieta, como por substrato, se obtuvo que la mayor
actividad fue cuando se empleó como substaro Met-p-nltro3nilida. Al comparar los SHE
provenientes de los grupos alimentados con la dieta conteniendo la harina de pescado sin
cabeza B, presentó la más 2.lta actividad con los siguientes susbstratos en el siguiente
orden· pro-<val-<Ieu-<Iys-<met-p-nitroanilida, mientras los DHE de [a dieta conteniendo
harina de soya, tuvieron la mas baja acliv8d con los sub stratos de gly- y met·p-nitroanilida.
Este estudio demostró que el método del pH-stat predijo mejor la calidaci de la proteína
de fuentes alternativas de proteína que el método del ph-drop. La substitución en le dieta
basE para camarón blanco, con e115% de las fuentes de proteínas evaluadas, influyó sobre
la actividad de proteinasas de los SHE.
VI
·CONT ENIDO '
Página
PRE FAC iO ......... ..
AGRADECiMIENTOS .... .............. ..... .......... .... ..... .... .. ....... ...... .
DEDiCATORIA.. ............ .. . ............ ...... ............... .. .
.. ................ .
11
IV
V
VII
INTRODUCCION
Camarones Pene idos ..... ...... ....... ............ . .......... ... ........ ...... ........ .......
Nutrición del Camarón ................. ...... ..... .. ..... ........ ........ ....... .. .... ... ....
Digestibilidad de Prote[na in vitro ... .. ..... .. ........... ..... .... ........ ....... .... ... .
Actividad Enzimática Digestiva en Camarón ................. .... .. ... ... .. ........... ...
Tecnología Enzilnática .. ........................... .. ....... ........................... ... .... .. .... .
DISCUS iÓN DE RESULTADOS
Digestibilidad in vitro de camarón blanco (Penaeus vannamel)
Fuentes de ProteÚlas ......................... .. ....... .......... ... .. ..... ...... ... ............... ... .
Evaluación de la digestibil idad de proteínas in vi/ro con el ensayo de
pH-stat y extractos del hepatopáncreas de camarón. ..............
Comparación de los métodos del pH-stat con el del pH-drop...... ..........
Enzimas con Activ idad Peptidasa y Proteinasa del Sistema Digestivo
del Camarón Blanco (Penaeus vannamel).. ................................. ............
Actividad tripsina y quimotripsina en extractos de hepatopáncreas de
......... .... ... .... ... ... ..... ....... . ......... .
camarón.. . . ... ... ........ ... ..... ......
Actividad aminopeptidasa en extractos de hepatopáncrcas de camarón...
CONCLUSIONES. .... ............
.. .......... . ...............
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFiA ..
ANEXO ..
"1
1
2
3
5
6
7
7
7
9
[1
11
[3
17
18
19
23
Las
enzuuas son
una
INTRODUCCiÓN
importante
Camarones peneidos
herram ienta en bi otecnología, en el
procesado de alimentos y otras industrias.
Existe una considerable demanda de
enzimas con propiedades adecuadas para
aplicaciones especificas. Los estudios de
digestibilidad en laboratorio, empleando
extractos enzimáticos, ofrecen una forma
barata, conveniente y rápida, para el
desarrollo y evaluación de componentes
potenciales de dietas. Las proteasas
presentes en animales marinos son
importantes, porque pueden ser util izados en
diversos procesos industriales tales como los
de fermentación, y por otro lado, pueden
tamb ien intervenir en la disminución de la
calidad de pescados y mariscos, crudos y
coc idos, ya sea d urante el almacenam iento
en frio o bien en el procesado en caliente
(Haard, 1992).
Los objetivos primordiales de este
trabajo fuero n: 1) evaluar la digestibilidad
de proteína en camarón blanco, Penaeus
vannamei. mediante e l ensayo in vitro de l
pH -stat usando como sistema enzimático
preparac lon
enz imática
del
una
hepatopáncreas del camarón; 2) comparar
los resultados de los ensayos in vi/ro con los
resultados In vivo, obtenidos de 10.
evaluación de la digestibilidad aparente de
proteína; 3) desarrollar una técnica
predict iva de laboratorio, para evaluar la
digestibilidad de prote ína en insumas para
camarón; 4) identificar la actividad oc
rripsllla, qUlmotripsina y am inopeptidasa en
extractos de l hepatopáncreas de l camarón
blanco; y 5) establece r el efecto de la
proteína dietada sobre la actividad tota l de
proteasas, de tripsina. quimotripsina y
aminopeptidasa, en e l hepatopánc reas del
camarón blanco del Pacifico en cultivo.
La industria de la maricultura del
camarón en América Latina, se ha
expandido en forma dramática, desde que se
hizo comercial en los últimos años de la
década de los 60s (Villa lon, 1991). Esla
tendencia se espera que continúe en el
futuro. La razón de esto se atribuye a la alta
demanda del camarón en el mercado
mundia l, lo impredecible de su captura en
los oceános y alto costo, y el reciente
desarrollo tecnológico en las áreas de
engorda, manejos en e l cultivo, control de
enfermedades e ingenieriles. En 1981 , la
producción total del camarón de granja se
est imó que representó el21 % del total de la
producción
mundial
de
camarón
(Rosenberry, 1995). Para 1995, la
producción del camarón cultivado fue de 2.6
millones de tone ladas métricas (MMT) o el
27% del total de la proDucción mundial
(Rosenberry, 1995).
El camarón blanco del Pacífico (Penaeus
vannamei Boolle), es la especie líder
cultivada en la parte oeste del hemisferio,
represefltando más del 90% de la
producción total. Puede ser obtenido e.n
estadías temp ranos y presenta llOa tasa
uniforme de crecimiento, a lcanzando un
tamaño máximo de 230 milímetros. :::;u
requerimiento proteínico es del 20-25%. La
sobrp.vivencia durante su captura es alta
entre el 50-60%. Durante su crecimiento, el
P. vannamei posee una reputación de animal
"resistente". Su mercado inciuyen los
Estados Unidos de América (70%) donde es
adquirido fresco, congelado, colas en
maquetas, y como producto con un valor
agregado, y en Europa (30%) donde se
adquiere congelado con cabeza. El Japón
represen ta un merCadO reciente para el
camarón blanco.
Introducción
p/atyceros.
Nutrición en camarón
Ellos concluyeron que la
digestiblidad del nitrógeno para ambas
especies fue, al menos tan alta como en
otros animales (insectos, peces, cerdos, o
pollos). Akiyama e, al. (,992) han
establecido que la digestibilidad de la
proteina de ingredientes puros, es superior a
los no pur ificados, y las fi¡entes de o rigen
animales (particu lannente de origen marino)
son mejor digeridas que las de origen
vegetal.
La investigac iones nutricionales en
especies de crustáceos es relativamente
nueva y escasa, comparada con la que se
tiene en peces o especies terrestres
(O'Abramo
y
Castell,
1997).
Históricamente, los camarones pen":idos
fueron
considerados
omnívoros
o
comedores de materia orgánica en
descomposición. Estudios recientes del
contenido estomacal del pene ido, indicaron
que los camarones son carnívoros en la
naturaleza,
consumiendo
crustáceos,
anfibios, y poliquetos pequeños (Wyban j
Sweeney, 1991). Los constituyentes de los
al imtntos naturales son una importante
fuente para cultivos extensivos, mientras
que los allrnentos artificiales son requeridos
para las prácticas de cultivo semi-intensivas
e intensivas. En un sistema de cultive
intensivo, el alimento representa el mayor
gasto, generalmente más del 50% del total
de los costos de operación Por lo que, el
desarrollo de insumos que sean eficientes y
económicos, es fundamental para el éxito de
cualquier cultivo de camarón
(Um y
Akiyama, 1995). El desarrollo de alimentos
de bajo costo, con alto valor nutritivo
depende amp liamente de la información que
se tenga oe los requerimientos nutricionales
y la disponibilidad dI'! los diversos
ingredientes alimenticios.
La evaluación de la digestib ilidad de un
alimento, es claramente uno de los métodos
óptimos para medir e l aprovecham lento de
un nutriente en una dieta. Un alimento
artificial puede estar bien balanceado y
poseer todos JoS 11utrientes esenciales, pero
aún así no producir un buen crecim iento,
debido a que lOS nutrientes no son
aprovechados. La digestib ilidad de un
alimento por un animal, depende no s610 de
la estructura j fisiología de l tracto digestivo
de éste y de la condiciones ambienta les, si
00 también de las características físicas
tanto del alimento como del nutriente (Lee
y Lawrence, 1997). La digestibilidad de un
alimento es también de interés para el
acuacultor: debido a la necesidad de
disminuir la contaminación por los desechos
alimenticios. El uso de los datos de
digestiblidad de un alimento, puede ser
importante, durante la formulación de una
dieta con un bajo índice dE:: contaminación,
favoreciendo así la certificación dE:: aicho
alimento, que se considere sin riesgo para el
medio ambiente (Lee y Lawrence, 1997).
Se ha establecido que la proteína es el
ingred ie"1te más caro de las die~as (Lim y
Akiyama, 1995) y el más un portante, ya que
una buena proteína d ietaría es digerida
eficiente mente y absorbida por el sistema
digestivo. La eficiencia de la digestión y
absorción de la proteína cruda, ha sido
medida por varios investigadores. La más
extensiva investigación ha sido realizada por
Forster y Gabott (l97 1) quienes evaluaron
16 fuentes de proteinas como ingredientes
dietarios para Pa/aemon serraiUS y Pada/us
Una de las recomendaciones y
tendencias en los estudios de digestiblidad
de un alimento en crustáceos, durante la
siguiente década, es la que los métodos de
evaluación
de
digestiblidad
deben
expandirse a medir la resistencia hidrolítica
de la materia orgán ica, establecer mérados
de corrdaciones entre digestibilidades in
2
Introducción
Diversos métodos in vi/ro basados en la
digestib ilidad de proteínas empleando
proleinasas han sido desarrollados. La
mayoría de los estudios efectuados en
digestibilidad in vI/ro se han correlacionado
con algunos índices de proteólisis con la
digestibilidad in vivo en ratas. Los diferentes
métodos in vi/ro se caracterizan por la
cantidad y e~ tipo de enzimas que se utilizan ,
la condiciones de hidrólis is, el método de
fraccionaci6n digest iva y por la for ma en
que son evaluados los productos de'! la
hidrólisis.
vitro y compos lclon química de los
nutrientes. Estos métodos deben ser primero
comparados con estudios in vivo para
evaluar su efectividad (Lee y Lawrence,
1997).
Digestibilidad in vi/ro de proteínas ../
La dietas
han
sido eva luadas
generalmente en base a ensayos de
crecim ient o y reciente mente eva luando la
digestibli dad aparente de la proteína
(Ak iyama el al., 1989), pero es ampliamenle
conocido que estos métodos son caros,
req uieren de tiempo y so n afectados por
factores ambientales (G rabner, 1985; Lan y
Pan, 1993). Los métodos clásicos para
detenn inar la cantidad y calidad de una
proteína, incluyen las detenni naciones por
el método Kje ldahl y la de la composición
de amino ácidos. Estos métodos involucran
reacciones más fuertes que aquellas que
ocurren durante un proceso nonn al de
digestión,
estas
reacciones
liberan
nutrientes. que baj o condiciones naturales
no son digeridos por el animal (Anderson el
al., 1993). Por lo que se ha prestado una
considerable atención a aq uellos métodos
que sean rápidos y que eval úen en form a
eficiente la diges tibl idad de la proteúla (para
referencia ver Dimes y Haard, 1994). Los
métodos in vio'o para eva lu ar la
digestiblidad de un" proteina son necesarios,
porqu"! estos generalmente son rápidos y
menos caros que los métodos in vivo,
además proporcionan más in formac ión
sobre el porcentaje de en laces peptídicos
hidro lizados de una proteína
en un
alimento, empleando sólo pequeñas
cantidades
de
la
materia
prima
Estos
métodos
no
(Grabner, I 985).
reemplazarán a los ensayos de digestibilidad
aparente de proteína, pero pueden ser
utilizados para evaluar la digestibilidad
potencial de un insumo en part icular (Lee y
Lawre nce, I ~97).
En un priflcipio los ensayos in vit,~o se
realizaron empleando una sola enzima
digestiva. Sin embargo, posteriormente se
demostró qllC el uso de s istemas
multienzimáticos, simulaban mejor las
co ndic iones de un proceso ¿;gestivo en un
anima l, además de poseer una mayor
correlación con digeslibilidades in vivo (Hsu
el al., 1977, S.nerlee el al., 1981). Hsu el
al. (1977), describieron un método in vi/ro
empelando tres enzimas para determinar la
d igr.stibilidad
proteica.
El
sistema
consistió
de
tripsi na,
enzimát ico
quimolripsina y una peptidasa intestinal. El
método se basó en la digestió n de un a
suspensión proteica a 37°C Y pH 8 usando
el s istema enzimático. La diges tibilidad in
vi/ro fue estimada mediante la evaiuación de
la reducción del pll en la suspensión
prote ica, después de 10 minutos de
digestión . Las enzimas proteo líticas actúan
sobre el en lace peptídico de la prote ína,
dejando libres 105 grupos ionizables,
a-am ino y a -carboxilos, los iones de
hid rógeno son liberados y por lo general el
pH de la suspensión acuosa de la proteína
disminuye.
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Introducción
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Penaeus schmitii fue llevado a cabo, donde
se concluyó que el método, fue una manera
segura para estimar la digestibil idad de
proteínas de organismos
cultivados
(Carrillo, 1994).
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Otros investigadores han reportado que
el método del pH-drop sobreestimó la
digestibilidad de fuentes de proteinas
pobremente digeridas y subestimó aquellas
muestras que fueron altamente digeridas
(Dimes y Haard, 1994). Pederson y Eggum
(1983) estab lecieron que la detenninación
por el método del pH-drop está influenciada
por la capac idad amort iguadora de las
proteínas en suspensión. Una alternativa al
método del pH-drop es el del pH-stat. El
método de l pH-stat ofrece algunas ventajas
sobre el pH-drop para monitorear la
digestibilidad de proteínas, tales como: 1) el
pH se mantiene constante durante el proceso
de la digestión, sin la necesidad de utilizar
altas concentraciones de la so lución
amortiguadora (Pederson y Sggum, 1923),
2) la tasa de l grado de hidrólisis, puede ser
estimada rápidamente durante el proceso de
la digestión mediante la evaluación de la
curva
de
titulación
obtenida
automát icamente (Dimes y Haard , 1994).
Dimes y Haard (1994) desarrollaron un
método in vitro, emp leando una fracción
enzimática del tracto digestivo del Salmo
gairdneri y estimaron la digestibilidad de
proteínas aplicando el ensayo del pH-stat.
Ellos concluyeron que el método es una
manera segura de estImar la digestibilidad
de fuentes alternativas ae proteínas para
insumos para salmón idos.
c..cc:' i
...
El mélOdo pH-drop propuesto por Hsu el
al. (1977) fue modificado por Satterlee el al.
(198 1), lncrementando el tiempo del ensayo
a 20 minutos, y adicionando cuatro enzimas
comerciales
(tripsina,
quimotripsina,
proteasa y peptidasa) en lugar de tres.
Estos autores encontraron una muy buen?.
correlación entre los resuhados in vitro y la
digestibilidad rea i en ratas. La mayoría de
los ensayos in vitro fueron probados para
animales de sangre caliente, por lo que se
consideraron que estos no eran adecuados
para evaluar calidad de protcina de animales
poiquilotennos. Se ha sugerido que las
proteasas digestivas provenientes de los
animalt:s que se están estudiando, arrojan
resultados má'\ cer:anos a la realidad, que
aquellas que comúrmente se utilizan (i.e. de
mamíferos y de mIcroorganismos) (Grabner,
1985; Lan y Pan, 1993 ; Dimes el al., 1994).
Varios método:; in vi/ro para predecir la
digestibilidad de proteínas para peces y
camarones han sido descrÍlos. Lan y Pan
(199:» estudiaron la digest ión de varias
proteínas aIiml.:nticiaf., empleando un
método de dos fases de evaluación del pH,
usando como sistema ellzimático, un
extracto del hepatopáncreas de P. monodon.
Ellos encontraron una alta correlación entre
la digestión de Ir proteína in vilro y el
contenido de lisina y arginina en la proteína
alime . . ticia . E l método del pH-drop
utilizando como enzimas un extracto de
En los métodos del pH-sta~, la tasa o la
cantidad de álca li consumida para mantener
el pH constante, es uti lizada para calcular el
número de e:llaces oeptídicos hidrolizados.
La proteina hidrolizada se calcula mediame
e l equivalentf: de hidró lis is h, a partir del
volumen de la solucion d tándar de álcali
4
Introducción
(NaOH 0.1 N) requerido para mantener en
8.0 el pH de la me zcl a de reacción·
La
suspensión
ensayada
es
constantemente agitada con un ag itador
magnético y se purga con n itrógeno para
pre ven ir la incorporac ión de CO 2
atmosférico en la mezcla de reacción.
h = -;;-;-::-o;;;-;-;-,=(M:: S %/100)
El método del pH-stat fue usado por
Dimes el al. (1994) para evaluar diferentes
insumas proteicos para salmónidos, usando
a la caseína como proteína de refe rencia. La
digeslibílidad in vitro correlacionó mejor
con la digestiblidad in vivo usando enzimas
del tracto digestivo de salmón idos (1'"0.93),
que el sistema de cuatro enzimas
comerciales (r=0.84), sin embargo el
método no fu e adecuado para prote ínas
parcialmente hidrolizadas, tales como los
ensilados de pescado.
donde B= mL de base utilizados; a
=1 0pH.pKI1+lOpH.pK., Nb = nonnalidad de l
tltulante. M es la masa en g de la mezcla de
reacr.ión; y S es la concentración de la
proteína en la mezcla de reacción.
El grado de hidró(isis (DH%) se calcula
a partir de h como sigue:
OH % =(hlh r.) x 100
donde h/(II es el número total de enlaces
peptídicos en la proteína. Este ténnino es
establecido en las proteínas, calculando el
promedio del peso molecular de los amino
ácidos resi du ales. Para la mayoría de los
a limentos utilizados Goma insumas, se
?sume como peso promedio para los amino
ácidos residuales un valor de 120. La bureta
de titulación, el medidor de temperatura, y
el medidor del pH pueden ser conectados a
una computadora, con una base de datos
aprop iada. El DH% de. la reacción se
calcula apartir del siguiente algoritmo:
volumen (mL)
pH
pK
Actividad de las enzimas digestivas en
camarón
La digestión de proteínas invo lucra la
acción conjunta de varias prote inasas y
peptidasas. En general , la peps ina en el
estómago y la tripsina, quimotripsina, y
carboxi- y aminopeptidasas en el intestino,
son responsables de [a hidrólisis de las
proteínas ingeridas (Whitaker. 1994). La
mayoría de las proteinasas identificadas en
los camarones pertenecen a la fa milia de las
serinas, tales como la trips ;na (Galgani el
al., 1984, Honjo el al., 1990), qulmotripsina
(Tsai el al., 1986, Tsai el al., 1991),
aminopcptidasa (Jiang el al. 199 1; Lan y
Pan 1991) y carboxipeptldasas (Sibson y
Barker, 1979). Existe más de una forma de
proteasas. La lTipsin a (Honjo el al., 1990) y
la quimotripsina C"fsai el al., 1)91 ; Van
Wonnhoudt el al., 1992) poseen isoformas.
En Penaells l'al1namei se han reportado dos
formas de quimorripsina (Van Worrnhoudt
el al., 1992). Estos autores reportaro n un
peso molecular en ambas formas de la
enzima de aproximadamentE.. 25 kDa. E~
peso mo lecu lar de los z!mógenos putativos
=m" de la burela/50.00
=7 + (mv del pH melrol10)
=8.275-0.0233 x T (oC) de reacción
DH % = (hlh r.) x 100
h
=""'¡M'"'"x"'" S"o""VoI""'ocOO"¡-
a =
5
Introd ucción
fue de 33364 Da y 279000 Da para las
formas activas.
estos procesos. El uso potencia l de las
enzimas de animales marinos en la industria
alimentaria se debe a sus propiedades ún icas
(Haard, 1992). Las enzimas catal izan
rea~~iones, q ue pueden tener un im pacto
pOS itIVO o negativo en los índices de cal idad
en los alimen tos, i.e., sabor, olor, colo r
.
.
'
co nSistenc Ia, nu tric ional o seguridad. La
enzi mas pueden estar presentes en forma
natura l, incid enta lmente o bien adic ionarse
en forma inten ciona l, contribuyendo de esta
forma a las reacc iones antes men cionadas
(H aard , 1~?5). La acción de las pro te inasas
sobre el teJido, puede contribuir a l deterio ro
de la ca li dad de l produ cto. Los cambios
bio9uimicos post-cosecha causados por
e n z l ~as
endógenas,
inclu yendo
las
protemasas, son la primera causa de la
perdida de calidad en camarones en hie lo
(Kawamura el al., 198J; Baranoski el al. ,
1984). Además de e ll o, las protei nasas
pueden ser directamente responsables de
~efectos .en la te~tura de mariscos, e.g.
estallamlento de vlsceras", "hundi m iento"
y "desmoronamiento" de pescados , y "cam~
dura" y "ablandamiento" en crustáceos con
el~o ~casionando una pobre calidad i n i~ia l y
perdIda del producto. La des trucción de la
integridad celu lar, normal mente ocurre
durante el procesamien to de los a limentos
liberando
las
enzimas
de
lo~
compartimien tos na tura les de la célula. Las
enzimas digestivas pueden liberarse hacia el
múscu lo y así dismi nuir la vi da de anaquel
del camarón (Nip el al., 1985). Se ha
reportado que la vida medi a del cam arón
cosechado no es superior a los 4 días (N ip el
al., 1985) y esto se atribuye a la a lta
actividad proteolítica (Jiang el al., 199 1;
lan el ul., 1994).
. La a.cci.ón c.ombinada de la tripsina y la
qUlmotnpsma liberan péptidos. La cantidad
de enzi~as presentes en el tejido, pueden
ser drásticamente influenciadas por fac tores
específicos,. tales como la edad bio lóg ica, la
dl e t ~, la s ~ Lnlda d de l agua, e l ejerc icio, y la
preSión hldrostática (Haard, 1990; Haard,
1?92) . E l tipo de prote ína presente en la
dieta puede influir sobre la acti vi dad de las
enzimas digestivas de l conrenido intestinal
regulando la síntesis, excreción ~
inactivación del sistema enzimatlco
digest ivo (Snook y Meyer, 1964) teniendo
cierta influencia sobre la hidróli~is de las
prote inas. El incremento en actividad de
ciertas enzimas digest ivas hidro líticas, se
presen tó en Penaeus japoniclis alimentado
con almejas vivas (Maugle el al., 1982). Uro
Incremento en la protema vegeta l en la dieta
de Penaeus vonnamei
propic ió un
decremento en la actividad total de
proteasas, así como en la r:ie trips ina (Lee el
al., 1984). Villarreal el al. (1990),
reportaron un Incremento r.r: la actividad de
protei nasas totaJes, evaluad as con substratos
sintéticos en camarón blanco (P. vannamei)
cuando la harina dE. pescado fue substitu ida
con hari na de langostilla (Pleuroncodes
planipes).
Tecn o logia enzimática
Las
enzimas
proteo líticas
son
ampliamcnle utilizadas como herrami enta
durante el procesamiento de alimentos. En
años recientes, las enzimas proteolíticas de
or igen marino han sido incluídas dentro de
6
DISCUSION DE RESULTADOS
La descripción detallada de los
resultados de cada capítulo, no se incluye er,
esta parte. Para mayor información ver [os
artículos que acompañan a este documento.
La actividad proteolítica de los extractos
crudos del hepatopáncreas de camarón
(SH E), fue aproximadamente un 40 %
menor a la presentada por un sistema de
cuatro enzimas comerciales (FES) ( 1.6
rnglmL tripsina, 3.1 mglmL quimotripsina,
1.3 mg/m L peplidasa y 7.95 mglm;"
proteasa bacteriana), sin embargo el grado
de hidrólisis (DH) de la case ína, sólo fue
10% menor,
al
ut ilizar el SHE
comparándolo con el obtenido por el FES.
Estos resultados manifiestan la potencial
utilización de los extractos de camarón
blanco, como fuente de enzimas en ensayos
in vitro (ver tab la 3, p. 3 en PII).
Digesti bilida d de Proteína ill vi/ro de
Fuentes Proteicas para Camarón Blanco
(Pellaeus valllwmel)
La meta de esta parte fue desarrollar una
técn ica de laboratorio para predeci,- la
digestibilidad de proteína en camarón.
Se desarrolló un ensayo empleando el
pH-stat y extractos enzimáticos del
hepatapáncreas de camarón (PI; PII). El
ensayo se utilizó para evaluar el porcentaje
de enlaces peptídicos hidrolizactos (grado de
hidrólisis, OH) y estimar la calidad de la
proteína en va rias harinas : anchoveta,
pescado sin cabeza, pescado blanco sin
hueso , desperdicios de atún, proteína de
soya y langostilla. Los resultados obteni dos
por el métodc de l pH-stat fueron
comparados con aqueltos arrOjados po r los
análisis químicos y de los ensayos in vivo de
la determinación de la digestibilidad
aparente de proteína (APO) (PII). Penaeus
vannamei juveniles, con un peso entre 3.5 a
4 g, obtenidos oe la granjas del ~ [8NOP~ ,
fueron utilizados I,! Il la determinación del
APO. Las dietas estudiadas fueron
e laboradas, substituyendo en una dieta
control, el 15 % de las harinas eva luadas
(vertab la 2, p. 3 en PII).
Evaluación de la digestibilidad de proteína
IIsalldo el ensayo del pH-stal y extractos
enzimáticos del camaró1I (PI y PII)
La
proteasas
digestivas
de i
hepatopáncreas de l camarón fueron usadas
para evaluar la digestibilidad de proteínas de
insumos para camarón blan co, Penaeus
vannomel, emp leando el método in vUro del
pH-stat. Además, correlacional estos
resultados con los obtenidos de ensayos in
vivo, provenientes del análisIs de la
digestibilidad aparente de proteína.
Las fuemes de proteínas utilizadas en el
experimento fue ron proporcionadas por
proveedores comerciales. Las enzimas
fuero n extraídas de hepatopáncreas de
camarones blancos de un peso de lOa 12 g
(ca 200 hepatopáncr(:as), dichos camarones
se obruvieron de la granja de l -:::IBNOr. (PI ;
PU). La preparacióll el1.zi mática j la
actividad de proteasas se llevó a cabo
siguiendo la metodología descrim por
Garcia-Carreña y Haard (1993).
3c detectaron d ifere ncias significativas
(P<O.05) en la composición químIca de las
fuen tes de proteínas eval uadas . Las
diferenc;as en la compos ición química
7
Discusión de Resultados
dentro de las harinas de pescado, pueden
deberse a la cantidad de Jípidos y humedad
presentes en dichas harinas, sin embargo
algunas de estas diferencias podrían deberse
también a la especie de pescado em pleada
como materia prima para elaborar las
harinas (Anderson el al., ¡ 993).
que los arroj ados por las harinas de pescado
y la de langostilla. No se detectaron
diferencias significativas (P>O .OS) entre las
hari.nas de desperd icios de atún, pescado sin
cabeza "A" y " 8 ". Estas harinas presentaron
valores de digestibilidad inferiores al 70%
(ver tabla 4, p.4 en PII~. Los valores
obtenidos de I\PD de las hari nas de pescado
y los de la proteína de soya, son similares a
aquellos rcportados por otros in vestigadores
(Akiyama el al., 1989; Anderson el nI.,
1993). Sin embargo los resultados Obtenidos
en la dieta conteniendo langostilJa, fueron
menores a los reportados por Goytortúa
(1993) . El bajo va lor de la A PO de los
despe rdicios de atú n y las harinas de
pescado sin cabeza "A" y "B" podrían
indica r su limitado valor nutritivo para el
camarón.
Los
resul tados
obtenidos
indicaron que la proteína de soya fue mejor
digerida que las de las harinas de pescado y
de langostilla. Sin embargo, Forster y
Gabbot (197 1), trabaj ando con Pa/aemon
serralus y Pandalus plalyceros, y Fennuci el
al., (1982), con Penaeus styliroslr¡s, han
reportado que la proteína de or igen animal
fue mejor digerida que las de origen vegetal.
Estas d iferencias en los valores de APO,
pueden ser atribuídas a las especies de
camarón estudiadas, a la calidad de los
1ngredientes empleados o bien (l. la
composición de la dieta (Ak iyama, 1991).
Los valores del OH de las siete harinas
analizadas por el método del pH-stat,
mostraron
diferencias
significativas
(P<O.05). El OH de la harinas empleando
enzimas del camarón, fue similar a los
obtenidos por la mezcl a de enzimas
comerciales, excepto para el caso de la
harina de langostilla y la de desperdicios de
atún. Al emplear como fuente de enzimas al
SH E, el OH de la harina de desperdicios de
atún fue de 23%, mientras con FES los
valores fue ron de 20% (ver tabla 4, p. 4 en
PII). En el caso de la harina de pescado
blanco s in hueso, cn ambos sistemas
enzimáticos (SHE y FES). se presentó el
mayor valor de OH, mientras que el menor
valor se present6 en la harina de los
desperdicios de atún ( ver tabla 4, p. 4 en
PII) El bajo valor del OH en la har ina de
los desperdicios de atún, puede ser atribuído
entre otras cosas, a la pobre calidad de la
materia prima usada o bien al tIpO de
proceso aplicado. La harina de pescado sin
cabeza "A". a pesar de presentar alto
contenido de espinas y huesos. y la harina
de pescado sin cabeza "8", a pesar de
poseer alto contenido de grasas, no
presentaron los valores más bajos de l DH.
Se ha rep0l1ado que la digestibi lidad de las
harinas de pescado es independiente del
conten ido de grasa, así como del de cenizas
(minerales), mientras el contenido d~ ami no
ácidos en la proteína se mantenga en
equi librio (Lan y Pan, 1993).
Se
detectaron
correlaciones
significativas entre el :::>H y la APD, con un
valor de ,.1=0.77, cuando se usaron como
fuente de enzimas las provenientes del
hepatopáncreas del camarón y una ,.1""0.71,
cuando fueron empleadas las cuatro enzimas
comerciales (PII ). El método de:! pH-stat
ofrece la ventaja de poder med ir la cinética
de la reacc ión, a partir del porcentaje de
enlaces
peptídicos
de
la
proteina
h idrolizados (D imes y Haard, 1994) . La
digestibil idad
in vilro de la proteína
obten ida ;}Qr el método del pH-stat fue
En los estudios In vivo de la
detenn inación de A PO, la harlna de proteína
de soya, presentó valores más altos de APD,
8
Discusión de Resultados
capaz Cie detecrar el efecto de un tratamiento
térmico
sobre
algunos
inhibidores
cluimáticos en algunas materias primas de
origen vegetal (PI). Los valores de la
digesiibilidad in vitro de la proteína de soya
y del pescado sin cabeza "8" fueron sobre
estimados, comparándolos con los obtenidos
en los t:nsayos in vivo. Tomando en cuenta
los coeficientes de la regresión lineal (r2) de
0.77 (P<0.05), el método del pl-I-stat
utilizando los extractos enzimáticos del
hepatopáncreas del camarón parece ser una
buena alternativa a los ensayos in vivo, para
eva luar dietas para camarón . Lan y Pan
(l993) reportaron va lores sim ilares a los
obtenidos ror el rH -stat de digestbilidad in
vi/ro de proteínas, para la proteína de soya
y de la harina de pescado blanco si n hueso.
Estos autores midieron el cambio de
absorbencia (A l80 ) de la pro teí:na hidrolizada
detectando una muy buena correlación
("=0.99) entre los ensayos de digcstiblidad
in vitro con el conten ido de lis ma y arg inina
de la:; fuentes de prote ínas evaluadas.
Desafortunadamente, en este trabajo no
reportaron resultados de ensayos in VI VO,
que corroboran el método.
grado de hidrólisis obtenido por ei pH -stat a
23, 25, Y 27°C, con el contenido de
arg ini na y lisina de las fuentes de proteínas
evaluadas para Penaeus vannamei.
La elaboración y preparación de las
dietas fue ron similares a las reportadas en
a[tícu10 JJ (ver p: 8 en PIl). Para [os ensayos
de crecimiento se trabajó con juveni les de
Penaeus vannamei de 1.5 a 2 g, obtenidos
de [a granja de l CIBNOR. Se evaluó, e l peso
promedio ganado por los camarones por
dieta, después de 30 días de estudio. El
contenido de amino ácidOS de cada un". de
las ha rinas fue determi nada en e l
Laboratorio de l-'roteínas, de la Un iversidad
de Ca!iforniu., en Davis, Estado Unid os de
Am ér ica. El ensayo del pH-drop se realizó
de acuerdo a la metodología desc ri ta por
Hsu el al. (¡ 977)_
E l contenioo de arginina de [as fu~ntes
de proteina obtenidas a parti r del aná lisis de
amino ácidos (ver tabla 3, en p. 4 en PIII) ,
estuvo entre 4.7 a 7 gil 00 g de proteína. E l
valor más baj o se presentó en la har in a de
de sperdicios de atún, y el contenido mas
alto de argini na se obtuvo en la harina de
pescado blanco sin hueso. El contenido de
arginina a l re lacionarse con e l crecimiento
de l camarón
arrojó correlaciones
signifi cativas co n un valo r de ,.1=0.76 (ver
tabla 4, pA del MlI)_ Hird (1986) estableció
que la arginina es un o de los amino ác idos
esencial es más determinates en el
creclm iento del camarón, cuya función es la
de actuar como fosfógeno en los crustáceos,
y una defic iencia de este ami no ácido en la
die ta, pu ede disminuir el creci mien to del
camarón (Li m y A!jyama, 1995). Al
comparar, e l contenido de arginina de las
harinas con el valor recomendado para
camarón, se obtu vieron calificac iones
q uím icas de más del 70%, mostra'ldo que
todas las die tas proporcio naro n la cantidad
adecuada de estE. amino ácido y ésto,
Evaluación de la calidad de proteína por el
método del pH-stat, pH-drop y collfenido
de umillo ácidos (Mil).
Los atributos más deseables de las dietas
para camarón son los de poseer alto
contenido de amino ácidos esenciales, alta
digestiblidad y ausencia de fac tores
¡¡ntinutricionales. El principal propósito de
esta parte del trabajo fue la de comparar !a
digestibl idad de la prote ín a de harinas en
camarón blanco (Penaeus vannamei),
derelll1inada por el método del pH-stat, con
aquellos valores presentados con pH ~drop,
además de detl.:rmi nar la re la c ión entre e l
9
Discusión de Resultados
aseguró el buen crecimiento presentado por
los camarones (voc tabla 2, p. 3 del Mil).
La relación entre el OH obtenida por el pHstat a 25 y 27 oC y crecimiento, aunque fue
significativa (P<O.OS) los valores fueron
bajos (r~O,67 y 62, respectivamente) (ver
tabla 6, p. 5 en MII). La mejor ecu ación
para predecir el valor biológico para los
animales eval uados, fue la obtenida a 25°C
(ver figura 2, p. 7 en MIl), arrojando valores
oe Faltos (42) y los más bajos del error
estandar de l valor de predicción (SE E)
(4%),
La suma de ami no ácidos bás icos de las
harinas, principalmente. [isi na y arginina,
obten idas a partir del análisis del am ino
ácidos (ver tabla 3, p. 4 en PIII) se relacionó
con la digest ibilidad in vitro por e l método
de l pH-stat, d~spués de una hid ró lisis de 60
minutos osando SHE. E l OH de las fuentes
de proteína no mostraró una re lación
significativa (P>O.OS) con la suma de [isilla
y arginina, tal como ñle reportado en e[
trabajo de Lan y Pan (1993), Estos
una
alta
investigadores
detectaron
correlación entre la digest ión in virro con el
contenido de [isma y arglnina en fuentes
prOleicas para Penaeus monodon. Las
prote ínas utilizadas en la formulación de [as
dietas, generalmente sufTe ur:. sobre
calentamiento durante la obtención de las
harinas, dando como resu ltado que la
so lubilidad de la proteína y su func ional idad
se reduzca (Opstvedt el al., 1984), La
determinación del contenido de amino
ácidos, se hace después de una hid ról isis
ácida, por lo que esta determinación no va a
reflejar una modificación inducida por el
tratamiento térmico, 10 que causa cambios
en [a digestiblidad in vivo (Lan y Pan,
1993),
Se encontró una buena correlación entre
la digest ibilidad in vivo con el método del
pH-stat. Los coeficientes de correlación, los
errores estándar, y otros datos estad ísticos
de la regresión del OH a 23, 25 Y 27 oC con
la digestibilidad aparente de proteína son
mostrados er el manuscrito 11 (ver tab la 7 en
p. 5 e n MIl). Los valores indica ron que el
pH-stat a 25°C dió ur. coefic iente de
correlación (r) de 0.76 con ti % de SEE,
Cuando se evaluaron las temperaturas de 23
y 27°C, se obtuvo que a 23°C el coefic iente
de correlación fue similar a 25°C, con un
va lor de ,..1=0.73, mientras que cuando se
fue más alto
trabajó a 27°C, el va lor de
(0,80), Al analizar los estadisticos, se
observó que a 27°C, el valor de F fue el más
alto (86), y e l error estandar del valor de
predicción (SEE) fue el más bajo (1%). Lo
que sugiere que la mejor ecuación de
predicción para la digestibilidad aparente de
prote íllé! fue cuando se determ ¡nó el DH a
27°C. Las curvas de regresión obten idas de
las ecuaciones de predicción el 23° Y 27°C se
muestran en el manuscrito fl (ver figuras 3a
y 3c, p.7 en Ivl lI ),
r
Se obtuvo una correlación sign ificativa
entre la APO y el crecim iento de l camarón,
pero con un valor bajo (r~0,50), lo cual
demostró que el incremento en peso no
depende sólo del consumo de n itrógeno.
Se ha reprotado que la temperatura tiene
inlluencia sobre el DH% de las fuentes
proteicas (Dimes y Haard, 1994). No se
detectaron diferencias estadísticamente
significativas (P>O.05) del OH entre las tres
temperaturas evaluadas 23,25 Y 27°C ( ver
tabla 5, p, 4 en M il ), atribuido a que el
rango de remperarnra evaluada es muy bajo.
Los valores obtenidos con el método del
pH-drop,
aunque
correlacionaro~
sign ificat ivamente (P<O.OS ), el valor de r
fue muy bajo (0.55) (ve r tabla 8, p, 6 en
MIr), La d igestbilidad de proteina obtenida
10
Discusión de Resultados
aplicación
de
los
extractos
hepat6pancr\..:as del camarón.
por el pl-l-drop, se estableció en base a la
siguiente ecuac ión :
del
% de Digestibilidad =355.32-37.74(X)
donde las constantes prov ienen del análsis
Actividad de la tripsil1u y quimotripsillo ell
el ltepalopállcreas del camarólI (PIII).
de regres ión realizado (Tabla 8, p. 6 en
Mil), X~ pH des pues de 10 min de
incubación. El método de l pH-drop tendi ó a
sobreestimar (MIl) las muestras que
presentaron digest ibilidades menores al 70%
(ver ta bla 4 en PI1), ta les como las harinas
de desperdicios de atún, las harinas de
pescado sin cabeza "A" y "B", Y sub-
Una indi cación del valor biológico de
una proteína puede ser su contenido de
lisma y de arginina, y la in terrelación entre
ambos. Esta interre lación es conocida como
Este
antagonismo
lisina-arg inina.
antagonismo ocurre cuando se presentan
valores excesivos de UIlO de estos amino
ácidos, lo que puede ocasionar una
disminución en el crecimiento de l camarón.
Se recomienda que la relación entre
lis ina:arginina, debe mantenerse entre 1: 1 a
1: 1.1 (Ak iyama el al. 1992). En este estudio
se observó una ligera diferencia en esta
relación li sina:arginina en la harina de
estimar (ver tabla 8 en Mil) aquell as con
alta digestibil idad, como la de las prote ína
de soya (ver tabla 4 en P Il), y aquellas con
alto contenido de cenizas como el caso de la
harina de langostilla (ve r tabla I en PlI ).
Una limitación del pH-drop es que el pH no
se mantiene constante durante el curso de la
reacción. La capac idad amortiguadora de los
péptidos, proteínas y otras substancias en el
alimento pueden in fluir sobre el pH (Dimes
anchoveta (1 :0.7), la de desperd icios de atún
(1 :0.7), y harina de pescado sin cabeza " A"
( 1:0.7), i.e. los contenidos de arg in in a
y Haard, 1994). El método de l pH-s tat en
este trabajo ofreció mas ventajas que el pHdrop y el conten ido de arginina, aunado a
que predijo mejor la calidad de las proteínas
para fuentes al ternativas de proteínas para
dietas de camarón blanco.
fuero n relativam en te menores, comparados
con el contenido de lisi na (PUl).
La actividad enzimática es utilizada
durante los procesos digestivos en los
crustáceos, para aprovechar los nutrientes de
íos alime ntos. La actividad proteo lítica en
Enzimas con actividad de peptidasa y
protcinasa del sistema digestivo del
camarón blanco (Penaeus Val1l111mei).
los extractos del hepatopáncreas (SHE) del
camarón blanco (Penaeus vannamei) que
fueron alimentados con cada una de las siete
dietas, durante 30 días, fue evaluada por
varios métodos (PHI).
El camarón es una de los más
importantes productos en el comercio
internac iona l, sin emoargo se ti ene poca
información sobre las proteasas y sus
efectos sobre la calidad de este cmstáceo.
Los resu ltados de esta sección trataran de
proveer bases para entender los estudios de
calidad de este importante insumo y la
Los zlmogram as de SDS-PAGE de los
SHE de los animales alimentados con las
diferentes dietas mostraron la presencia de
bandas con actividades proteo líticas
sim ilares. Independientemente de la dieta,
todos los organ isOlos desplegaron varias
zonas de act iv idad con caseína como
subsITato (ver figura l. p. 4 e n Plll). E l peso
i I
Discusión de Resultados
molecular de las zonas activas estuvo entre
[4 a 64 kDa (ver figura 2, línea B, p.S en
PIII). La reducción de la act ivi dad
proteolítica en presencia de inihibidores de
serin proteasas (PMSF) es una indicación de
la presencia de serin proteasas en los
extractos del camarón (ver figura 2, línea D,
p. 5 en PHI). Las zonas activas inihibidas
por PMSF, presentaron pesos moleculares
(24 a 30 kDa) similares a los extractos de
PacifastaclIs astacllS y Pleurocondes
planipes. (García-Carreño y Haard, 1993;
Garcla-CalTeño el al., 1993). Los extractos
del hepatopáncreas del ca marón fueron
sensibles a inhibidores de tripsina TLCK
(ver figu ra 2, línea E. p. 5 en PllI). Los
zimogramas
de
los extractos del
hep ato páncreas del camarón mostraron al
menos
cuatro
fracciones
con
compo rtami ento de actividad de proteasas
sensibles al inhibidor de tripsina TLCK.
Una proteinasa de 22 kDa, correspo ndi ente
al peso molecular de la tripsina porcina
(GarcÍa-Carreño, 1992) fue detectada corno
una zona menor en todos los extractos del
hepatopáncreas del camarÓn. Los extractos
del camarón fueron insensibles al inhibidor
de quimorripsina usado TPCK (ver figura 2,
linea F. p. 5 en PlIl). Resu[tados simi lares
fueron reportados por Gracia-Carreña el al.
(1994) trabajando con proteinasas del
Pacifastacus astacus y Pleurocondes
planipes.
por aquellas obtenidas por [as de las hacinas
de langosrilJa (81 unidades de actividadlg de
he pato páncreas). Esto puede atribuirse al
alto contenido de cenizas en estas harinas
(P II). Es co nocido que el contenido de
minerales induce la actividad digestiva de
proteasas (Lan y Pan, 1993). El uso de la
proteína de soya, no incrementó la actividad
total de proteasas (ver tabla 4, p. 6 en PIII),
tal como fue reportado por Lee el al. (1984).
Ellos evaluaron la influencia de l nive l de la
proteína vegeta l en el alimento. En este
trabajo, solo el l5 % de la proteína vegetal
fue utilizada corno protelna de substitución
en la dieta bas~
Los extractos de l hepatopáncreas del
camarón (P. lIannamef) hidrol izaron
substratos específicos para tripsina y
quimotripsina (ver tablas 4 y o, p. 6 en PllI).
Este tipo de proteinasas han sido descritas
en varias especies de decápodos, incluyendo
a espec ies de Penaeus sp., Para/iylhodes
camstchalica, Euphausia superba, y
Pacifacastacus astaclIs (Gibson y Barker,
1979; Zwilling el al., 1981; Osnes, 1985;
Kim, 1991; Garcia-Carreño y Haard, 1993;
y Garcia-Carreño el al., 1994).
La alta actividad específica de tripsina
(P<0.05) se obruvo en aquellos animales
alimentados con [a dieta subs tituida con la
harina de pescado sin cabeza "B" (ver tabla
5, p. 6 en PII I). Parece ser que la actividad
de trlpsina es independiente del contenido
de grasa y de cenizas, siempre)' cuando S~
mantengan en equilibrio el contenido de
amino ác idos en la fuente proteica (Lan y
Pan, 1993). La trips ina actúa sobre los
en laces peptídicos de los amino ácidos
básicos de la proteína. La suma de ¡isina y
argi nin a, obtenidas del perfil de amino
ácidos (ver tabla 3, p. 4 en Plll), arrojó los
valores más bajos en la proteína de soya
(9.7), la ha rina de pescado s in cabeza "EL
(10.2) Y ia harina de langostilla (10.4). La
La actividaú tota l de proteasas,
empleando azocaseína como substrato,
reportada como unidades de actividadl g de
hepatopáncreas no fue s ignificativamente
(P>O.OS) afectada por el tipo de dieta, solo
en el caso de aquella conteniendo
desperdicios de atún (ver tab la 4, p. 6 en
PllI). Los extractos de los animales
alimentados con la dieta conteniendo
desperdic ios de atún tuvo la mas alta
activ!dad proteolítca ( 102 unidades de
actividades/g de hepatopáncreas) seguida
t2
_ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ --"'Oiscusión de Resultados
actividad de tripsina no se vió afectada por
los valores de lis ina y argi nina presentes en
la muestra, pero sí por el conten ido de
lípidas presentes en las harinas y el proceso
de secado de las hari nas de pescado. La
harina de pescado si n cabeza "B" mostró el
mayor contenido de grasa (ver tabla 1, p. 2
en PII ), además de presentar un color muy
obscuro, lo cual podría ser un ind icio de un
sobrecalentamiento (Anderson el al. , 1993).
Se ha reportado que el sobrecalentamiento
puede ocasionar que la lis in a reaccione
tripsina y quimotripsina de aquellos
camarones alimentados con la dieta
conteniendo la harina de pescado sin cabeza
" B", p uede afectar la vida media del
camarón cosechado.
La actividad total de las proteasas en los
extractos del hepatopáncreas fue también
evaluada a travé s del grado de hidróli sis de
la caseina (OH). Los DHs de la caseina no
se vieron estadísticamente afectados
(P>0.05), por las dietas (P>0.05) (ver tabla
4, p. 6 en PIII). Resultados sim ilares fu eron
reportados por Dimes y Haard (1994),
cuando se eval ué el DH utilizando extractos
de la trucha arcoir is y salmór. eoho
ali mentados con diferentes fuentes de
proteínas. Anterionnente se demostró en el
presente trabajo que la digest ibil idad in vitro
usando como fuen te de enzimas extractos
del hepatopáncreas de l camarón y el método
de l pH-stat. puede predec ir la digestibilidad
de fuentes alternativas de proteínas para
camarón blanco. Los resulta dos de l DH de
la caseína, demostraron que la" evaluaciones
in vitro utilizando el pH-stat, no se ven
afectadas por el tipo de dieta con la cual se
alimente al camarón, tamb ién se observó
que el método de! pH-stat no es una técnica
útil para evaluar el efecto de la calidad de la
proteína sobre la actividad.
covalentemente con otros amino ácidos,
dis minuyendo así la calidad de la proteína
(Anderson el al. , 1993), ésto a su vez puede
incrementar la act ividad de tripsina en el
SHE (Rodrigucz el al., 1994) y reducir la
vida de anaquel del camarón (Ni p el al,
1985).
Se detectaron diferencias signi ficativas
(P<0.05) en la actividad de quimotripsina en
los extractos de camarón, a limentados con
cada una de las siete dietas evaluadas (ver
tabla 6, p.6 en PIll ). La mas alta actividad
de qui motripsina se detectó en aquellos
organ ismos alimentados con la dieta
conten iendo la harina de pescado sin cabeza
"B". El contenido tota l de tirosina y
fenila lanina (tabla 3 en PU l) se relacionó
con la actividad de quimotripsina, así como
la calidad general de las harinas. El valor
más bajo de tiros in a y feni lalanina se
obtuvo en la hari na de pescado sin cabeza
"B", la cua l a su vez, como ya se menc ionó,
presentaba la cantidad más alta de grasas y
un co lor muy obscuro. Estas observaciones
sugieren que esta harina poseía W1a proteina
de baja calidad, lo cual, corno es bien
sabido, puede estimula r la activ idad de
tripsina y quimotripsi na (Rodríguez el al.,
1994). Las proteasas alcal in as, tales como la
tripsina han sido impl icadas en el
detrimento de la textu ra de los alimentos de
origen marino, como los crustáceos (Salem
el al., 1970), por lo que la alta actividad de
Actividad
de amillopeptidasa en los
extractos del hepatopállcreas de camarón
(MI).
Tomando en cuenta que el sistema
digestivo de los crustáceos posee¡~ alta
cantidad de peptidasas, las cua les actúal~
sobre los enlaces peptídicos de jos ex tremos
de los péptidos (García-Carreño y Haard,
1993; Gareia-Carreño el al. , 1994), y que la
cal idad prote ínica de un alimento puede
afectar la actividad enzimática, el objetivo
de esta parte del trabajo de investigación fue
1)
Discusión de Resultados
la de identificar la actividad de
aminopeptidasas
en
extractos
de
hepatopáncreas del camarón blanco j uvenil
y establecer el efecto la fuente de proteína
sobre la actividad de aminopeptidasas en P.
no se detectó actividad de
aminopeptidasas (De Villez,
1965 ;
Brockerhoff el al., 1970). Sin embargo,
estos autores utilizaron un substrato
altamente
específico
para
leucinaminopeptidasa lo cual no puede excluir la ,
posibilidad de que el jugo gástrico de los
crustáceos
posea
otro
tipo
de
aminopeptidasas (De La Ruelle, 1992). Por
otro ladú, Kleine y Ponyi (1967)
encontraron actividad de aminopeptidasas,
principalmente en el hepatopáncreas de
Astacus aslaCllS y Cambarus affinis,
indicando que la digcstiór! de los
oligopéptidos
toma
lugar
en
el
hepatopánc reas, en lugar del estó mago, y
que estas enzimas juegan un papel
importante en la digesti ón intracelular. Jiang
eL al. (1991) Y Lao y Pan ( 1991) trabajando
con el hepatopáncreas de Penaeus monodon
reportaron
la presencia de
Leuaminopeptidasas.
aSlacus,
vannamei.
Los hepatopáncreas del camarón blanco,
fueron obtenidos después de un ensayo de
crecimiento de 30 días (MI). Los
hepatopáncreas del camarón fueron
procesados de acuerdo a lo descrito por
García-Carrcí\o
y
Haard
(1993).
La
act ividad de aminopeptidasa fue evaluada
espectrofotométicamentc
mediante la
cuantificación de la p -nitroanilina producida
por cada uno de los 10 substratos sintéticos
evaluados (Leu- p -NA, Gly- p -NA, Ala- p
-NA, Val- p -NA, Pro- p -NA, Phe- p -NA,
Met- p -NA, Glu- P -NA, Lys- P -NA, Y
Arg- p -NA). Soluciones sali nas de ZnSO,
fueron adicionadas al amortiguador de
fosfato de sodio a concentraciones fmales de
I mM y 2 mM, también se probó el MgCI,
. a 1 mM y lO mM. La reacción en cada caso
se inició al momento de adicionar los
extractos enzimáticos ensayados. Las
condiciones del amilisis fueron aquellas que
describió Pfeiderer (1970). La actividad
total de proteasas fue evaluada de acuerdo a
lo descrito por García-Carreño y Haard
(1993). La concentración de la proteína
solub le presente en la solución enzimática
se determ ¡nó espectro fotométricamente de
acuerdo al método de 8iuret (GornaH el al.,
1949) (MI).
Se ~valuó la ir.f1uepcia de vanas
concentraciones
de
extractos
de
hepatopáncreas (SHE) (O lo 0.01 mg of
SHEimL), empleando como substrato
sintético al amino ácido L-Leu-p - NA. La
relación entre la concentración del SHE y
act ividad de la aminopeptidasa S~ muestra
en el manuscrito [ (ver figura 1, p. 4 del
MI). Se utilizó la dilución de I ~gimL para
los
subsecuentes
ensayos
de
aminopeptidasa. Sin embargo. cuando
diferentes concentraciones del SHE (O a 0.1
mg/mL) fueron ensayadas usando como
substrato a la azocaseína no se observó
inhibición por las altas concentraciones del
SHE (ver figura 2, pA del MI). Esto podría
indicar que en el SHE están presentes
diferentes enzimas que pueden competu" con
el substrato para leucina-aminopeptidasa.
Se detectó la presencia de Leuaminopeptidasa
en
extractos
de
he pato páncreas de camarón blanco
(Penaells vannamei) (ver tabla S, p.6 en
MI). Se sabe que las proteinasas son
sin tetizadas
y
secretadas
en
el
hepalopáncreas de los cmstáceos, donde
ejercen su acción enzimática (Cecaldi,
J 997). En el jugo gástrico de PacifastacllS
La Leu-aminopcptidasa de olras fuentes
ha sido identificada como una metaloenzima
(Taylor, 1993) y se ha demostrado que la
14
Discusión de Resultados
substratos, en el siguiente orden: p ro~ <val~
<Ieu- <Iys-<met-p-nitroanilida (ver tabla 6,
p.S en MI). Donde la mayor actividad se
obtu vo al utilizar como subst rato sintético a
la met-p-NA.
actividad de las
metaloenzymas, en
ocasiones se ve estimulada por la adición de
cationes diva lentes, princ ipalmente sales de
zinc (Bacon, 1994; Hajjou y Le Gal, 1994).
Fueron evaluadas dos sales de cation es
divale",cs (ZnSO, y MgCI 2 ) a diferen tes
concentraciones. La act ividad, empleando
como subsn·ato all~Le u -p·NA , decreció con
ambas sales y este efecto aumentó cuando se
increm entó la concentrac ión de la sal (ver
tabla 6, p. 4 en MI). Hay qu e tomar en
cuenta que en este ensayo se trabaj ó con
extractos crudos de l SHE, por lo que estos
res ultados no in dican que la Leu·
aminopeptidasa del camarón no requiera de
cationes para actuar. Se requ ieren realizar
trabajos de purificació n de la enzima, para
poder establecer el efecto real de los
cationes de Mg-! o Zn +2
en la
aminopeptidasa del camarón blanco.
La gráfica del peso de las dos variab les
evaluadas (substrato y fuente de proteina),
de mostró grupos de variab les a lo largo del
eje hor izonta l, donde la harina de pescado
sin cabeza " B" presentó mayor valor en PC 1
(más cargado hada la izqu ierda) (ver figura
3, p.S en MI). Por lo que esta muestra posee
la más alta acti vidad con pro, val, leu, Iys, y
rnet-aminopeptidasa, La dieta conteniendo
la harina de pescado sin cabeza " B" también
tuvo un alto va lor en el componente
pr;ncipal dos (PC2) (ver tab la 7, p.S en MI),
donde el substrato gly-aminopeptidasa tiene
un peso pos itivo, lo que sug iere que glyaminopeptidasa tiene también un valor alto.
UfL
amplio grupo proveniente de las
muestras de la d ieta con ten iendo harina de
soya, se observó en la parte izquierda del
pe 1 (ver figura 3, p. S del M I). Esto sugiere
que los extractos provenientes de animales
alimentados con d ieta conteniendo soya,
poseen baja actividad con gly- y met-p -NA.
Se midió la actividad hidrolítica de la
enzima empleando 10 derivados de pnirroanilida (ver tabla 6, p. S en M I). Los
resultados fuero n analizados aplicando el
anál isis estadístico del componente princi pal
(PCA). Reci entemente, Toldrá el al. (1996)
apl icaron el
para estudia! p-l
compol1amiento de las enzimas proteo Ht icas
y li políticas en el músculo de puercos con
bajo .Y alto contenido de grasa, En este
trabajo [os resultados del anális is estadístico
mostraron que las dietas tuvieron un efecto
sobre la actividad enztmática. Ei análisis del
componente pr incipal de las dietas y de los
tres
substratos
evaluados
presen tó
componentes principales, con pesos de l
54%, 21.6%, Y I 1.97%. Para el primer
componente, el de mayor peso, las variables
más importantes fueron pro-, val·, leu-, Iys,
y met- aminopeptidasas (ve r tabla 7, p. 5 en
MI). Sonsiderando que estos substratos
presentaron el mayor peso estadístico en el
compone nte princ ipa l uno (PC I), las
muestras que presentan alto valor en el PCl,
presentaron al ta activ idad al usar como
pc." ,
Se asoció la ca lificación química de los
amino ácidos esenc iales (AAS) en las
harinas evaluadas (ver tab la 3, pA en MI)
con la activ idad de las nminopeptidasas, as í
com o con la calidad gene ral de los
prod uctos. El AA S de las dietas evaluadas,
presentó una corre lación significati va con la
actividad de am inopeptidasa, presentando
un va lor de r' de 0.70. Los SHE
provenientes de los animales alimentados
con la dieta conteni endo la harina de
pescado si n cabeza " B", mostraron el valor
más bajo de ft.AS, además de presentai la
mayor actividad de amin opeptidasa en la
mayo ria de los substratos evaluados. Tal
como se di sc utió anteri ormente, esta harina
además poseía alto contenido de grasa (Pll),
t5
Discusión de Resultados
y una coloración muy obscura, lo cual es un
indicador de sobrecalentamiento durante el
proceso de obtención de la harina. El
sobrecalentamiento puede causar reacciones
entre la lisina y los otros amino ác idos,
disminuye ndo la calidad nutricional de la
proteina (Anderson el al., 1993), y ésto
puede causar un incremento en la act ividad
enzimática (Rodriguez el al., 1994). Sin
embargo este deterioro no se reflejó durante
las evaluaciones bio lógicas, ya que los
camarones que se alimentaron con la dieta
conteniendo la harina de pescado sin cabe:l.a
"B", aunque presentaron una baja
digestibilidad (67%) no fue la más baja
(PIl), y el crecimiento presentado por estos
camarones después de 30 días fue superior
al 100% (M il). Esto lleva a suponer aue si
bien las dietas de baja calidad proteica
pueden aumentar la actividad de las
proteasas este efecto no se manifiesta en
dietas de muy mala calidad, como I¿I que
contenía desperdicios de atún, en la cual se
presentó una digestibilidad muy pobre
(63%) (ver tabla 4, p. 4 en PU) y el
crecimiento más bajo 09%) (tabla 2, p.3 en
Mll). De cualquier manera, el saber que
una dieta que presente ciertos índices
inferiores de cai idad, como el del
sobrecalentamiento, que influye sobre la
actividad de la o'ipsina, quimotr ipsina (PIJI),
y sobre la am inapept idasa (M I), y que e l
illcremento en la actividad de proteasas,
reduce la vida de anaquel de l camarón (N ip
el o/. 1985), es una información que puede
ser útil durante la elaboración de insumos a
suministrar a peneidos en cultivo.
16
CONCLUSIONES
El ensayo in vitro de digestibilidad de la
proteína empleando el método del pH-stat,
arrojó resultados que, en Sl' mayor parte,
correlacionaron con los obtenidos en los
ensayos in vivo de la determinación de la
digestibilidad aparente de proteína (APO) en
camarón blanco.
vannamei), ya qUf: se obtuvo un buen valor
de correlacióll (r' "0.76).
El pH-stat posee ".n alto potencial como
una técnicr. !"ápida y segura para estimar la
digestibilidad y el valo¡· biológico de fuentes
alternativas de proteí nas para dietas de
camarón blanco.
El grado de hidrólisis (OH) de las
proteínas alimenticias no se vió afectado por
las temperaturas de evaluación, lo que se
atribuyó a que el ran go ensayado fue m uy
estrecho. Los resultados del DH obtenidos
con el método del pH-stat a 27°C se
relacionaron mejor con la APD del camarón
blanco. Los valores del OH arrojados de los
ensayos in vilro por el método del pH-stat a
25°C, empleando los extractos enzimáticos
del
hepatopáncreas
del
camarón,
presentaron correlaciones con los ensayos
de crecimiento del P. vannamei, que indican
que el pH·stat podría ser una buena
herramienta
para
evaluar
la
Todos los extractos del hepatopáncreas
del cama rón, mostraron zonas de actividad
de proteasas muy similares, y cuandc se
aplicaron inhibidores específicos para
pro teasas (TLCK para tripsma y PMSF para
la
proteasas
alcalina),
se
detectó
inact ivación de zonas espec ificas.
Se
ident ificó
la
actividad
de
aminopeptidasa
en
extractos
de
hepatopáncreas del camarón bla nco. La
actividad de lcucina-aminopeptidasa se vió
inhibida por la presencia de Zn 2+ y Mg 2+ en
la soiución amortiguadora de la reacción. La
relaci ón entre actividad de aminopeptidasa
y concent raci ón de extracto enzimátir.o,
mosrró la presencia de otros comp uestos en
los extractos, los cuales pueden competir
por el mismo substrato, o bien puede indicar
la presencia de ciertos inhibidores de la
enzima en el extracto crudo.
calidad
biológica de fuentes alternativas
proteínas para camarón blanco.
de
El método del pll-drop evaluado para
estimar la digestib ilidad de proteína en
insumas para camarón blanco, aunque
correlacionó significativamente con Jos
ensayos in vivo, el valor de relación es bajo
(r':0.55).
El método so breestimó la
digest ibilidad de proteínas pobremente
digeridas y subestimó aquellas que fueron
altamente digeridas, o bien con alto
con teni do de cenizas. Por lo que la
digestibilidad de proteínas e,·, el camarón
blanco de l Pacifico puede ser mejor
estimada a través de la dcrefminación de l
grado de hidrólisis usando el método del
pH-stat a 27°C y extractos del SHE.
La actividad de la am ínopeptidasa en los
SHE varió dependiendo del substrato
s intético probado. Se detectó una alta
actividad en todos los extractos dd
hepatopáncreas del camarón, cuando se usó
la metiontna-pcomo subst rato z.
nitroanil iaa.
:}e concluye bajo las condiciones de este
estudio . que las actividades de trip~ina,
quim otripsina y aminopeptidasa. se ven
afectadas por la fuente de pro teína
empleadas durante la alimentación de P.
vannamei juveni l, s in alterar la composición
de las proteasas presentes en dichos
extractos.
Los resultados indicaron que el
contenido de arginina de las harinas puede
ser utilizado como índice de predicción del
crecim ie nto de camaró n blanco (Penaeus
17
RECOMENDACIONES
Se requiere de más estudios in vivo
para poder establecer una clara imágen de
la relación entre los ensayo in vivo con
los datos in vitro. Es necesario ~valuar
otras dietas, con un rango mas amplio de
ca l¡dad de proteína, as.~ como de
compos ición quúnica, además de ensayar
con otras especies de camarón y otras
tallas, para poder demostrar la utilidad
potencial del método del pH-stat usando
como sistema enzirnático extractos del
hepatopáncreas del camarón.
Otra de las investigaciones que se
proponen, derivadas de este estudio, es la
de establecer la relación entre la tri PSI na,
quimotripsina y
aminopeptidasa
purificadas y la oalidad de la fuente de
prote[na, para corroborar que una ma la
calidad de la dieta incrementa la
actividad enzimática.
La importancia de la presente
investigación en el campo de la enzimas
digestivas del hepatopáncreas del
camarón, estriba en que la explotación
potencial de [os extractos de camarones
marinos y la calidad de las dietas deberá
ser considerada, si se desea lograr el
máximo aprovechamiento de las enzimas,
con el consecuente mejoramiento de [os
camarones cultivados.
A pesar de que se ha reconoc ido que
las protcinasas se relacionan con la v ida
de anaquel del camarón cosechado, los
resultados de este estudio indican que se
requieren trabajos de investigación más
complejos, donde se pueda establecer la
interrelación de la actividad de las
enzimas digestivas, calidad de las fuentes
de proteínas y vida de anaquel de los
camarones cultivados, con la finalidad de
probar que el incremento en actividad
proteo[ítica afecta [a vida post*cosecha
del camarón.
[8
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