Potencial nutracéutico de cultivos de arándano
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Potencial nutracéutico de cultivos de arándano
Universidad Autónoma de Querétaro Facultad de Química PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL CENTRO DE LA REPÚBLICA (PROPAC) “POTENCIAL NUTRACÉUTICO DE CULTIVOS DE ARÁNDANO (Vaccinum sp.) SELECCIONADOS EN MÉXICO” TESIS Que como parte de los requisitos para obtener el grado de Maestro en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Presenta Q. F. B. Martha Laura Cervantes Ceja Director de Tesis Dr. Octavio Paredes López Santiago de Querétaro, Qro., Octubre, 2009. RESUMEN Las frutillas son fuente importante de nutracéuticos, entre de los que se encuentran los compuestos fenólicos (flavonoides, antocianinas, ácidos fenólicos y estilbenos). Asimismo existen reportes que corroboran la actividad biológica de los fenólicos, entre las que se pueden citar: antioxidante, antiinflamatoria y anticancerígena. Dentro de las frutillas sobresale el arándano (Vaccinium spp.) por su elevada concentración de antioxidantes, es capaz de crecer en diferentes regiones, como México específicamente en el estado de Michoacán, particularmente USA el principal productor. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial nutracéutico de cultivares de arándano cultivados en Michoacán, como un primer paso para la selección de materiales con mensajes nutracéuticos sobresalientes y de importancia comercial. Nosotros determinamos la composición fisicoquímica (métodos AOAC), identificación de compuestos fenólicos por espectrofotometria, HPLC y GC/MS, y la capacidad antioxidante (DPPH y ABTS+), y la actividad antioxidante por medio de ensayo con cultivo celular. Nuestros resultados demuestran que Sharpblue tuvo la más alta concentración de sólidos solubles (14%). Biloxi fue el cultivar más ácido (pH 2.85), la más alta concentración de fenólicos en extracto acuoso (14.22 mg EAG/g fd) y metanólico (25.19 mg EAG/g fd), flavonoides (4.78 mg EQ/g fd) y antocianinas totales (12.24 mg EC3G/g fd). Biloxi además mostró la mayor capacidad antioxidante por DPPH (17.3 y 27. TEAC µmol/mg fd, extracto acuoso y metanólico, respectivamente) y ABTS (16.5 y 26.1 TEAC µmol/mg fd,extracto acuoso y metanólico). En los extractos hidrolizados la antocianina predominante fue cianidina, el flavonoide principal quercetina. Biloxi fue el material con mayor contenido de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante en los extractos acuoso y metanólico. En los extractos ASE (accelerated solvente extraction), la principal antocianina fue cianidina-3O-rutinosido, el flavonoide más abundante fue quercetina, el ácido fenólico predominante ácido ferulico y el principal estilbeno fue desosirapontigenina. Los extractos ASE fueron evaluados para la actividad antioxidante mediante la determinación de la inhibición de la generación de radicales libres en las células HL-60. Sharpblue, Biloxi y Misty exhibieron efecto antioxidante con valores de IC50 de 0.66, 1.1 y 1.8 mg/mg, respectivamente. en otras palabras Sharpblue fue el mejor. La potencial actividad antioxidante de los arándanos evaluados sugiere ser tan bueno o incluso mejor, que otras muestras de otros países. Palabras clave: Potencial antioxidante, Antocianinas, Flavonoides, Estilbenos, Ácidos fenólicos, Arándano. i SUMMARY Berries are an important source of nutraceuticals, such as phenolic compounds (flavonoids, anthocyanins, phenolic acids, and stilbenes). Some studies have reported the biological activity of phenolics as antioxidant, anti-inflammatory, and anticarcinogenic agents. Among berries, blueberry (Vaccinium spp.) is recognized for its high concentrations of antioxidants. This fruit is grown in different regions of Mexico, mainly in the state of Michoacán; particularly the main producer worldwide is the USA. The objective of this study was to evaluate the nutraceutical potential of blueberry crops (Sharpblue, Misty and Biloxi) grown in Michoacán, as a first step in the selection of materials with outstanding nutraceutical messages and commercial importance. We assessed the physicochemical composition by AOAC, the identification of phenolic compounds by spectrophotometry, HPLC and GC/MS, and the antioxidant capacity by DPPH and ABTS, and the antioxidant activity by the cell-based assay. Our results demonstrate that Sharpblue had the highest content of soluble solids (14%). Biloxi showed the lowest pH (2.85), the highest concentrations of phenolics in aqueous (14.22 mg GAE/g dry matter) and methanolic (25.19 mg GAE/g dm) extracts, as well as flavonoids (4.78 mg EAG/g dm) and anthocyanins (12.24 mg EC3G/g dm). Biloxi also showed the highest antioxidant capacity by DPPH (17.3 and 27.0 TEAC µmol/mg dm, aqueous and methanolic extract, respectively) and ABTS (16.5 and 26.1 TEAC µmol/mg dm, aqueous and methanolic extract, respectively). In the hydrolyzed blueberry extracts, the main anthocyanin was cianidin, and the main flavonoid was quercetin. Biloxi was the material with the major phenolics content and antioxidant capacity by the aqueous and methanolic procedures. In the ASE (accelerated solvent extraction) extracts, the main anthocyanin was cianidin-3O-rutinoside, the most abundant flavonoid was quercetin, the predominant phenolic acid was ferulic acid, and the main stilbene was desoxyrhapontigenin. The ASE extracts were evaluated for antioxidant activity by determining the inhibition of ROS generation in the HL-60 cells. Sharpblue, Biloxi and Misty exhibited antioxidant effect with IC50 values of 0.66, 1.1 and 1.8 mg/ml, respectively. In other words, Sharpblue was the best. The potential antioxidant activity of evaluated blueberries suggests to be as good or even better, as other samples from other countries. Key words: Antioxidant potential, Anthocyanins, Flavonoids, Stilbenes, Phenolic acids, Cultivar, Blueberry. ii DEDICATORIAS A Dios por permitirme experimentar nuevos caminos y por poner en ellos personas magnificas para recorrerlos……pero sobre todo por concederme la oportunidad de realizar este sueño y un paso más en mi existir Dedico este trabajo a los seres que me han dado la vida quienes con su amor, esfuerzo y sacrificio, me han dado un inmenso impulso para realizar cada uno de mis sueños y las ganas de seguir siempre adelante, con inmenso amor y admiración: Martha Ceja Juárez Y Jesús Cervantes Álvarez A mis hermanitos que han sido mis compañeros en mí existir, gracias por llenar mi vida de alegría, con todo respeto, admiración e inmenso cariño: Dan, Pau y Meliss iii AGRADECIMIENTOS Inmenso agradecimiento al Dr. Octavio Paredes López por su apoyo, consejos, asesoría y por compartirme su conocimiento, pero sobre todo por su amistad. Dra. Ma. Elena Valverde González Gracias Male por ser revisora de mi trabajo, pero sobre todo por el tiempo dedicado para el mejoramiento del mismo Dra. Agnes M. Rimando Por brindarme su apoyo excepcional para el presente trabajo, y por acogerme en su laboratorio sin duda fue una inolvidable y magnifica experiencia!! (Thank you so much!!) Dra. Rosalía Reynoso Camacho Por compartir sus conocimientos y sus valiosas observaciones para mejorar el presente trabajo de investigación Dra. Ana Tztzqui Chávez Bárcenas Por sus consejos tan acertados para mejorar y enriquecer el trabajo Dra. Ma. Guadalupe F. Loarca Piña Le agradezco sus atinadas recomendaciones para el presente trabajo Dr. José López Medina Por todo su apoyo, por compartirme su conocimiento y por la donación del material con el que se realizó el presente trabajo Dr. Gerardo Martínez Soto Por todas las atenciones y las facilidades otorgadas en el Laboratorio de Análisis Proximal de Alimentos del Instituto de Ciencias Agrícolas iv A Fabi por su amistad y por su grata compañía! A Talia por su disposición y ayuda para el desarrollo del presente trabajo Gloria Hervey y Katherine Martin, por el apoyo brindado para el desarrollo y aprendizaje de algunas técnicas empleadas, en Oxford! A Yola por apoyo generoso en toda ocasión, además de su trato amable A Margarita por su apoyo y su amistad. A Carmelita y Laurita, por todas sus atenciones y disposición A todos aquellos que en su momento me brindaron su apoyo para realizar este sueño realidad! v Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato y la Universidad Autónoma de Querétaro, bajo la asesoría y dirección del Dr. Octavio Paredes López. La Dra. Agnes M. Rimando del laboratory of Natural Products Utilization Research del U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), Campus Universidad de Mississippi, colaboró en esta investigación. vi INDICE GENERAL Pág. RESUMEN i SUMMARY ii DEDICATORIAS iii AGRADECIMIENTOS iv INDICE GENERAL vii INDICE DE CUADROS xii INDICE DE FIGURAS xiii I INTRODUCCIÓN 1 ll REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2 2.1 Frutillas 2 2.1.1 Entorno mundial de las frutillas 3 2.1.2 Producción de arándano a nivel mundial 4 2.1.3 Arándano 5 2.2 Nutracéuticos 7 2.2.1 Clasificación de compuestos nutracéuticos 9 2.2.2. Efectos de los nutracéuticos 11 2.3 Compuestos fenólicos 14 2. 3.1 Clasificación de los compuestos fenólicos 14 2.3.1.1 Ácidos fenólicos 16 vii 2.3.1.2 Estilbenos 17 2.3.1.3 Antocianinas 19 2.3.1.4 Diferuloilmetanos 21 2. 3.1.5 Flavonoides 22 2.3.1.6 Taninos condensados 23 2.3.2 Actividad biológica de los compuestos fenólicos 24 2.3.3 Compuestos nutracéuticos presentes en el arándano 27 2.4. Ensayos para evaluar la actividad biológica 2.4.1 Generalidades 28 28 2.4.2 Ensayos de capacidad antioxidante por métodos químicos 29 2.4.2.1 Método DPPH 30 2.4.2.2 Método ABTS 31 2.4.3 Actividad antioxidante por ensayo biológico 32 lll JUSTIFICACIÓN 34 IV OBJETIVOS 35 1. OBJETIVO GENERAL 35 2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 35 V MATERIALES Y MÉTODOS 36 5.1 Materiales 37 5.2 Métodos 37 viii 5.2.1. Caracterización fisicoquímica 37 5.2.1.1 Determinación de la composición química 37 5.2.1.2 Sólidos solubles 37 5.2.1.3 Acidez titulable 37 5.2.1.4 pH 38 5.2.1.5 Determinación de color de las frutas 38 5.2.2. Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos 39 5.2.2.1 Compuestos fenólicos 39 5.2.2.1.1 Extractos crudos para compuestos fenólicos totales 39 5.2.2.1.2 Determinación de fenoles totales 39 5.2.2.1.3 Determinación de flavonoides totales 40 5.2.2.1.4 Determinación de antocianinas totales 40 5.2.2.1.5 Extracción, hidrólisis de antocianinas e identificación por HPLC 40 5.2.2.1. 6 Caracterización de Flavonoides por HPLC 41 5.3 Determinación de la capacidad antioxidante 42 5. 3.1 Método DPPH 42 5.3.2 Método ABTS+ 43 5.4 Obtención de extracto ASE para determinación de fenólicos 44 5.5 Fraccionamiento 44 5.6 Actividad antioxidante en cultivo celular 45 5.7 Identificación y caracterización de compuestos fenólicos 46 ix en los extractos ASE y fracciones 5.7.1 Caracterización de antocianinas por HPLC 46 5.7.2 Caracterización de ácidos fenólicos y flavonoides por HPLC 46 5.7.3 Extracción y cuantificación de estilbenos por GS/MS 47 5.8 Análisis estadístico 48 VI RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49 6.1 Caracterización fisicoquímica de los arándanos 49 6.1.1 Características fisicoquímicas y proximales 49 6.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos 53 6.2.1 Fenoles totales 53 6.2.2 Flavonoides totales 56 6.2.3 Antocianinas totales 57 6.3 Actividad antioxidante por DPPH y ABTS+ 58 6.4 Correlaciones 61 6.4.1 Correlación fenoles totales y capacidad antioxidante 61 6.4.2 Correlación ABTS+ y DPPH 63 6.5 Caracterización de antocianinas por HPLC 65 6.6 Caracterización de flavonoides por HPLC 67 6.7 Fraccionamiento 69 x 6.8 Caracterización de compuestos fenólicos en los extractos ASE de arándano 69 6.8.1 Caracterización de antocianinas por HPLC 69 6.8.2 Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos por HPLC 72 6.8.3 Caracterización de estilbenos por CG/MS 75 6.9 Evaluación de potencial antioxidante por medio cultivo celular 77 6.9.1 Actividad antioxidante de los fenólicos en arándano 79 VII CONCLUSIONES 82 VlII PERSPECTIVAS 84 IX REFERENCIAS 85 X APÉNDICE 112 xi INDICE DE CUADROS Pág. 1. Nutracéuticos presentes en frutillas 2 2. Producción mundial de frutillas 3 3. Producción mundial de arándano 4 4. Clasificación de compuestos nutracéuticos según funciones fisiológicas 9 5. Clasificación de compuestos nutracéuticos según fuente alimenticia 11 6. Contenido de fenoles en arándano 28 7. Composición fisicoquímica de los arándanos 49 8. Contenido de compuestos fenólicos totales en extracto acuoso y metanólico de arándano 54 9. Contenido de flavonoides totales en arándano 56 10. Contenido de antocianinas totales en arándano 57 11. Actividad antioxidante por DPPH Y ABTS de cultivares de arándano 59 12. Caracterización del contenido de antocianinas en los cultivares de arándano 66 13. Caracterización del contenido de flavonoides en arándanos 68 14. Caracterización de antocianinas en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco) 71 15. Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco) 74 16. Caracterización de estilbenos en extracto ASE de arándanos y en fracciones (mg/g de peso seco) 76 17. Actividad antioxidante de extractos ASE de cultivares de arándano y fracciones 78 xii INDICE DE FIGURAS Pág. 1. Clasificación de fitoquímicos en base su estructura química 10 2. Clasificación de compuestos fenólicos 15 3. Estructura de ácidos fenólicos 17 4. Estructura de los estilbenos 19 5. Estructuras interconvertibles de las antocianinas 21 6. Estructura de los flavonoides 23 7. Estructura básica de los taninos condensados 24 8. Reducción del DPPH por un antioxidante 30 9. Formación del radical estable de ABTS con persulfato de potasio 31 10. Reacción fluorescente en ensayo DCFH 33 11. Esquema general de trabajo 36 12. Escala Hunter 38 13. Contenido de compuestos fenólicos totales en cultivares de arándano 55 14. Correlación entre fenoles totales con capacidad antioxidante (DPPH y ABTS+) en extracto acuoso y metanólico de arándano 62 + 15. Correlación entre ABTS y DPPH 64 16. Cromatograma obtenido por HPLC de las antocianinas analizadas en arándano del cultivar Biloxi detectadas a 520 nm. 67 17. Cromatograma obtenido por HPLC de flavonoides analizados en arándano del cultivar Biloxi detectados a 260nm 68 xiii I INTRODUCCIÓN México se caracteriza por una inmensa riqueza biótica, asimismo ocupa uno de los primeros lugares en biodiversidad a nivel mundial. De manera trascendente en el estado de Michoacán existe una gran variedad de ecosistemas y biodiversidad, principalmente por la presencia de cadenas montañosas, por los contrastes altimétricos del relieve y la gama de climas, que incluyen desde los más cálidos del país hasta los semifríos en las zonas altas de Mil cumbres y de la Meseta Tarasca. Por otro lado, el régimen de humedad predominante es el semihúmedo, aunque también existen zonas muy húmedas, así como algunas secas. Debido a las características mencionadas anteriormente, Michoacán es uno de los principales estados productores de frutillas o berries de la República. Entre los principales géneros de frutillas cultivados se encuentran Rubus, Fragaria, Ribes y Vaccinium. Las frutillas constituyen una parte importante de la dieta en los países desarrollados, principalmente por que son una fuente importante de nutracéuticos, entre los cuales se encuentran los compuestos fenólicos como ácidos fenólicos, antocianinas, flavonoides y estilbenos, compuestos con actividad antioxidante, anticarcinogénica, antimutagenica, antineurodegenerativa y antiinflamatoria, propiedades biológicas benéficas para la salud. Dentro del género Vaccinium se encuentra el arándano o blueberry en inglés, destaca por sus características antiinflamatorias, antioxidantes, nutritivas y medicinales. Esta fruta es muy apreciada por los países del hemisferio norte, principalmente USA y algunos países de Europa. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial nutracéutico de cultivares de arándano seleccionados de la meseta tarasca de Michoacán, México, para utilizarlos en futuros programas de comercialización y mejoramiento. 1 II REVISIÓN DE LA LITERATURA 2.1 Frutillas Las frutillas son consideradas como frutas finas en los países europeos y del hemisferio norte, por lo que tienen gran valor económico. Dentro de este grupo se encuentran la frambuesa, zarzamora, arándano, fresa, mora y grosella. Dentro de los géneros: Rubus, Fragaria, Ribes y Vaccinium. Las frutillas como frambuesa (Rubus sp), zarzamora (Rubus occidentales) y fresa (Fragaria anaassa) se consumen la dieta de los países desarrollados. Estos frutos han atraído la atención debido al potencial benéfico que tiene a la salud humana. Contienen gran cantidad de compuestos nutracéuticos con propiedades biológicas, como actividad antioxidante, anticarcinogénica, antineurodegenerativa y antiinflamatoria (Seeram y col., 2006b). El contenido de compuestos nutracéuticos en frutillas se encuentra en el Cuadro 1. Cuadro 1. Nutracéuticos presentes en frutillas Nutracéutico Fitoquímicos Arándano Frambuesa Zarzamora Fresa Antocianinas, Antocianinas, Antocianinas, Antocianinas, ácido elágico, ácido ácido elágico, ácido luteina, elágico, luteína y elágico, proantocianidinas, luteína y zeaxantina luteína y resveratrol y zeaxantina zeaxantina zeaxantina 78 41 308 17 14 32 30 85 9 26 36 35 K mg/100g 112 186 233 220 Fibra g/100g 3.5 8 7.6 3 Vitamina A mg/100g Vitamina C mg/100g Folatos µg/100g (Smith y col., 2004) 2 La actividad biológica que se atribuye a las frutillas se debe al alto contenido de diversos fitoquímicos como flavonoides (antocianinas y flavonas), taninos, ácidos fenólicos y lignatos (Seeram, 2006a). Las frutillas se consumen como fruta fresca, en bebidas, yogurts, gelatinas y mermeladas. Además sus extractos se utilizan en forma de suplemento por el beneficio potencial para la salud humana. Sin embargo, resulta difícil encontrarlos presentes en la dieta de países subdesarrollados ya que estos frutos tienen alto costo para el consumidor (Seeram y col., 2006b). 2.1.1 Entorno mundial de producción de las frutillas A nivel mundial existe una producción de aproximadamente 1 millón de frutillas, dentro de las cuales se encuentran arándano, zarzamora, frambuesa, fresa, entre otras. Los principales países productores son Irán, Rusia, Vietnam, USA, Polonia. En el Cuadro 2 se muestra la producción mundial de frutillas. Cuadro 2. Producción mundial de frutillas PAÍS PRODUCCIÓN Írán 211, 800 ton Rusia 184 000 Ton Vietnam 106, 000 Ton USA 98, 974 Ton Polonia 52, 539 Ton (FAO/STAT, 2008) México ocupa el décimo primer lugar con una producción de frutillas de 7,191 ton anuales. Los estados productores son Michoacán, Jalisco, Guanajuato, estado de México e Hidalgo. Las principales frutillas que se cultivan son zarzamora, 3 fresa, frambuesa y actualmente en los estados de Michoacán y Jalisco se están realizando pruebas en el cultivo de arándano. En el estado de Michoacán se genera el 96 % de la producción de frutillas del país, se cultivan aproximadamente 5 mil hectáreas; la mayor parte de las cuales, se encuentra en los municipios de Los Reyes, Tocumbo, Peribán, Ziracuaretiro, Uruapan, Ario de Rosales, Zitácuaro y Tacámbaro. En el estado de Jalisco empiezan a producirse frutillas en los municipios de Sayula, Mazamitla y Jocotepec; compañías de California se cultivan frambuesa, fresa, zarzamora y empiezan a abrir el cultivo del arándano (SAGARPA, 2007). Las exportaciones de frutillas frescas y congeladas mexicanas se realizan desde Octubre a Enero, en estos meses se alcanza precios elevados en el mercado debido a la escasa oferta de los otros países (SAGARPA, 2008). 2.1.2 Producción de arándano a nivel mundial Los principales países productores de arándano son USA y Canadá, que generan aproximadamente el 80.3% de arándano cultivado (Vaccinium corymbosum), ya que si se considerará el arándano silvestre (V. angostifollum) el porcentaje asciende aproximadamente a 85%, asimsmo si se valorará arádano procesado se alcanzaría un porcentaje de aproximadamente 89%. Otros de los principales países productores de arándano son Europa, Argentina, Chile, Oceanía. En el Cuadro 3 se ilustra la producción de arándano a nivel mundial (USDA, 2007). Cuadro 3. Producción mundial de arádano PAÍS USA/ Canadá Fresco (Ton) 178,000 Porcentaje 80.3 Europa 22,500 10.18 Argentina Chile Oceanía Total 9,000 6,500 5,050 221,050 4.07 2.94 1.4 100 (USDA, 2007) 4 En el estado de Michoacán, el cultivo de arándano es reciente, se considera que de la producción total de frutillas el rádano representa el 2%. Las evaluaciones experimentales del cultivo empezarón hace aproximadamente cinco años, por lo tanto las plantaciones tienen entre ds y cuatro años. Se cultivan aproximadamente 20 Ha; Este cultivo presenta rendimientos altos de hasta 5,000 kg/Ha, el cual es superior al rendimiento de USA y Canadá, para cultivos jóvenes como estos se reportan rendimientos de 1,500 - 2,000 kg/Ha. Se contempla que para el sexto año de producción se alcanzara un rendimiento de 20,000 kg/Ha, mismo que es superior al de los países del hemisferio Norte que solo alcanzan un promedio de 10,000 kg/Ha. El cultivo de arándano presenta gran rentabilidad y su mayor cotización la alcanza en los meses de Octubre – Abril, que es cuando los principales países productores no lo tienen, lo cual es una ventaja competitiva muy valiosa (SAGARPA, 2008). 2.1.3 Arándano El arándano, mejor conocido en el mercado como blueberry por su nombre en inglés, pertenece al género Vaccinium sección Cyanococcus en la tribu Vaccinieae de la subfamilia Vaccinioideae y la familia Ericaceae (Stevens, 1969). Es considerado un fruto falso ya que deriva del ovario inferior, a diferencia de los frutos verdaderos que derivan del ovario superior. El fruto es una baya casi esférica y dependiendo de la especie o cultivar puede variar de 0.7 a 1.5 cm de diámetro. Cuando el fruto está inmaduro es de color verde, después rojizo púrpura y finalmente de color azul claro y hasta negro al llegar a la madurez. La epidermis del fruto está cubierta por secreciones cerosas que le dan una terminación muy atractiva (Stevens, 1969). Dentro del género Vaccinium las especies más conocidas se agrupan según sus características de crecimiento y requerimientos agroclimáticos: • Arbusto alto o highsbush (arbustivo del norte; V. corymbosum y arbustivo del sur; hidribos interespecificos). • Arbusto bajo o lowbush (V. angostifolum) • Ojo de conejo o rabbiteye (V. ashei) 5 Existen distintas especies de arándanos nativas de América del Norte. La mayor extensión cubierta por este frutal corresponde al arándano bajo, que crece también silvestre en las regiones frías de Norteamérica. Es una planta arbustiva que mide entre 10 cm a 4 m de alto. Las especies menores son conocidas como "lowbush blueberries" y las especies mayores como "highbush blueberries". Los grupos predominantes dentro de las especies menores de arándano “lowbush blueberries” son V. angustifolium, V. myrtilloides. Los tallos miden menos de 0.5 m de altura (Luby y col., 1991). El mejoramiento de las especies menores de arándano inició con la selección de clones silvestres en distintas épocas del año por el departamento de agricultura de USA (The United Status Departament of Agricultura, USDA). También se realizaron selecciones por medio de características fenotípicas, como son: largo del fruto, sabor, color, productividad, resistencia a enfermedades, fácil propagación, entre otras. Todos los programas de mejoramiento de las especies menores de arándano comenzaron con V. angustifolium en 1975 hasta 1988 (Aalders y col., 1975; Hall y col., 1988). Los primeros cultivares ‘Augusta’, ‘Blomidon’, ‘Fundy’ presentaron dificultades de aceptación en la industria debido a los elevados gastos de la propagación (Hall, 1988). Las especies menores de arándano contiene cantidades sobresalientes de compuestos como fitoesteroles, ácidos fenólicos, flavan-3-ol, antocianinas, y oligomeros de proantocianidinas los que protegen de los estados de iniciación, promoción y progresión de la carcenogenesis (Kraft y col., 2005). Las especies mayores de arándano “highbush blueberies” llegan a medir hasta 2 m de altura. El cultivar más común es V. corymbosum. Este es un cultivar importante con producción comercial en aproximadamente 17 estados en USA (Hanson y Hancock, 1990). La domesticación y mejoramiento tradicional de las especies mayores de arándano comenzaron en el periodo de 1888-1937 por Frederick Vermon Coville continuaron con (Ballington, 1984). El arándano alto 6 (highbush blueberries) cultivado comercialmente presenta un tiempo de floración hasta la maduración del fruto de 90 días y tolera pH ácidos (Hanson y Hancock, 1990). Dentro del grupo arándano arbustivo del sur “southern highbush blueberry” predomina V. corymbosum, que tiene parentesco con V. angustifolum y en algunos casos con V. ashei y V. tenellum (Lyrene, 1990). El mejoramiento del arándano arbustivo del sur comenzó en la Universidad de Florida por R.H. Sharpe en 1948, los primeros cultivares mejorados fueron “Sharpblue”, “Flordablue” y “Avonblue”, desarrollados por Sharpe y Sherman en 1976-1977 (Lyrene, 1990). Los cultivares de arándano ojo de conejo “Rabbiteye blueberry” generalmente miden de 2 a 4 m de altura. La especie que predomina dentro de este grupo es Vaccinium ashei, muy común en regiones como Carolina del Sur, Florida del Norte y el centro de Kansas (Luby y col., 1991). El mejoramiento genético del arándano ojo de conejo “Rabitteye” comenzó en 1948 en la Universidad de Florida por Sharpe (Sharpe y Darow, 1959). Tolera pH alto, resiste sequía, presenta mayor producción que el arándano arbustivo alto del sur, así como mayor resistencia poscosecha y el periodo de desarrollo del fruto llega a ser de 90 a 120 días (Lyrene, 1990). 2.2 Nutracéuticos Históricamente los alimentos son evaluados por su valor nutricional, lo cual está esta asociado con los componentes esenciales para mantener la vida de un organismo. Estos componentes se clasifican como macro y micro-nutrientes y representan el 99% y el 1% de la dieta total, respectivamente. Boucher en 1999 define “Alimentos que proveen beneficio para la salud más allá de la nutrición básica” como nutracéuticos. 7 Delgado-Vargas y Paredes López, (2000) definen a un alimento nutracéutico como “Cualquier sustancia que puede ser considerada un alimento o parte de un alimento y provee beneficios médicos o a la salud, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades”. Los alimentos considerados como nutracéuticos o funcionales han sido presentados como sustancias GRAS (Generalmente Reconocidos como Alimentos Seguros, por sus siglas en inglés), se han identificados un gran número de alimentos y cultivos con potencial nutracéuticos como son: cereales, especias, condimentos, verduras, frutas entre otros (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1999; Wildman, 2006; Szajdek y Borowska, 2008; Maiani y col., 2009). La existencia de compuestos nutracéuticos podría considerarse como parámetro de calidad para frutos (Beel Kwilder y col., 2005). Existen numerosos reportes del efecto benéfico de una dieta rica en alimentos de origen vegetal sobre la salud, ya sea como antiviral, antitumoral, anticarcinogénico, reduciendo riesgos de enfermedades crónico degenerativas o mejorando la respuesta del sistema inmune (Cui y Chisti, 2003; Kaneno y col., 2004). Los alimentos de origen vegetal contienen diferentes combinaciones de fitoquímicos (Boucher, 1999; Raskin y col., 2002; Hannum, 2004). Los fitoquímicos que más se han estudiado son los compuestos fenólicos, que son producto del metabolismo secundario de las plantas, y forman parte esencial del crecimiento y sobrevivencia de las mismas (Hannum, 2004). Actualmente existe gran interés en identificar y caracterizar el perfil de antioxidantes de frutas y vegetales, por lo que es una necesidad llevar a cabo estudios del perfil de nutracéutico de frutas y vegetales, con el fin de considerarlo en programas de fitomejoramiento, así como en la selección de estrategias de cosecha y post-cosecha (Asami y col., 2003; Mass y col., 1991; Wang y col., 2002). 8 2.2.1 Clasificación de compuestos nutracéuticos Una de las formas de clasificación de los nutracéuticos está basada en el mecanismo de acción, es decir en las propiedades fisiológicas demostradas, como son; antioxidantes, antiinflamatorias, anticancerígenas, entre otras. La clasificación se muestra en el Cuadro 4 (Wildman, 2001). También pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza química, colocando en categorías a los compuestos según los grupos funcionales que presentan, a partir de esta clasificación se obtienen subclasificaciones (Wildman, 2006). En esta última forma de clasificación se encuentran los carotenoides, compuestos fenólicos, alcaloides, compuestos que contienen nitrógeno, compuestos organosulfurados (Figura 1). Los grupos más ampliamente estudiados son los compuestos fenólicos y los carotenoides (Liu, 2004). Otra forma de clasificación de los compuestos nutracéuticos se basa en la fuente alimenticia (Cuadro 5), esta clasificación es importante cuando se tiene interés en un compuesto nutracéutico en particular o en compuestos relacionados (Wildman, 2001). Cuadro 4. Clasificación de compuestos nutracéuticos según funciones biológicas Función Compuestos Fisiológica Antioxidante Flavonoides, Antocianinas, vitamina C Antimutagénica Estilbenos, ácidos fenólicos. Anticarcerígena Antocianinas, ácidos fenólicos Antiinflamatoria Resveratrol, antocianinas (Parr and Bolwell, 2000) 9 carotenoides, En la Figura 1 se muestra la clasificación de fitoquímicos con base a su estructura química. Fitoquí micos Carotenoides a- Caroteno ß- Caroteno ß- Criptoxan ti na Luteína Zeaxantina Astaxanti na Li copeno Comp. Fenól icos Ácidos Fenól icos Fl avonoides Flavonoles Ac hidroxi ci námico Ac Hi droxibenzoi co P-cum ari co Cafei co Ferul ico Sinápi co Gálico Protocatecuico Vani lico Si ringi co E sti lbenos Fl avonas Cumari nas Flavonoles (Catequinas) Quercetina Canferol Mairi cetina Gal angina Fiseti na Com puestos organosul forados Com puestos que conti enen nitrógeno Alcaloi des Tani nos Fl avononas Antoci aninas Ciani dina P elargonidi na Delfini dina P eonidina M al vidina Catequi na Epicatequi na Epigal ocatequina Gal ato Api geni na Cri si na Luteoli na Isotiocianatos Indol es Compuestos al ifáti cos sulfurados I sofl avonoi des Geni steina Dai dcei na Glici teina Formononetina Eri edi etiol Hespiri ti na Nari ngeni na Figura 1. Clasificación de fitoquímicos en base a su estructura química (Liu, 2004) 10 Mientras que en el Cuadro 5 se presenta la clasificación de los compuestos nutracéuticos según su fuente alimenticia. Cuadro 5. Clasificación de compuestos nutracéuticos según fuente alimenticia Componente Fuente alimenticia β- Caroteno Frutas color amarillo intenso Lactobacilos Previene el daño oxidativo Reduce riesgos de cancer de Tomate Licopeno Función demostrada prostata Leches Efectos benéficos sistema fermentadas intestinal e inmune Reduce riesgo de Ácidos grasos Atún, pescado enfermedades cardiovasculares Terpenos, triterpenos Fitoesteroles Compuestos “allium” Cítricos Anticancerígenos Soya, semillas Cebolla, ajo Inhibe absorción de colesterol diertario Anticancerígeno, antioxidante (Parr and Bolwell, 2000) 2.2.2 Efectos de los nutracéuticos La prevención de enfermedades sobre todo las crónico degenerativas mediante el consumo de frutas puede atribuirse, en parte al contenido de compuestos fenólicos. Las plantas interactúan con su medio ambiente biótico sintetizando compuestos fenólicos como metabolitos secundarios. Los compuestos fenólicos tienen diferentes funciones, tales como: dar color a las hojas 11 y frutos, atraer o repeler insectos y proteger a las plantas de herbívoros. Numerosos estudios han sugerido que el contenido de fitoquímicos de frutas y vegetales y la correspondiente actividad antioxidante contribuyen a un efecto protector oontra enfermedades crónico degenerativas (Parr y Bolwell, 2000). Existen diferencias en los constituyentes bioactivos de las frutillas, los cuales se encuentran en diferentes concentraciones o pueden estar presentes o nodependiende del genéro (Burns y col, 2008). En extractos de frutillas (Amelanchier alnifolia, Viburnum trilobum, Prunus virginiana y Shepherdia argentea) nativas de Norte América se ha reportado que los compuestos no polares, tales como terpenos, han mostrado una fuerte inhibición de aldosa reductasa, enzima involucrada en diabetes (Burns y col., 2008). Existen reportes sobre una asociación del consumo de vegetales con la disminución de cáncer (Duthie, 2007). El proceso de desarrollo de cáncer es dinámico e involucra muchos factores con una progresión gradual que conduce a una propagación incontrolada y crecimiento de células cancerígenas a través del cuerpo llamada metástasis. Los tres pasos críticos en este proceso para diversos tipos de formación de cáncer en humanos son iniciación, promoción y progresión (Pan y col., 2008). A nivel mundial, aproximadamente 10 millones de personas anualmente son diagnosticadas con cáncer (Bingham y Riboli, 2004) y el cáncer demanda la vida de alrededor de 7 millones de personas cada año. Los tipos de cáncer más comunes a nivel mundial (excluyendo el cáncer de piel) son pulmón (12.3% de todos los tipos de cáncer), mamá (10.4%) y cáncer colorectal (9.4%). Las evidencias de estas variaciones se deben principalmente a factores del medio ambiente y a estilos de vida, más que a factores genéticos (Bingham y Riboli, 2004). Estudios epidemiológicos han demostrado que del 32-35% de esta enfermedad se puede atribur a la nutrición y que los factores dietarios pueden ayudar a modificar estos procesos (Pan y col., 2008). Se ha demostrado que la efectividad de un número de componentes bioactivos dietarios tienen la habilidad de prevenir el cáncer y otras enfermedades crónicas, asimismo se ha encontrado 12 que varios compuestos bioactivos poseen propiedades antimutagénicas y anticarcinogénicas (Kellof y col., 2000). Estos estudios soportan la aceptabilidad de los compuestos bioactivos alimenticios como agentes quimopreventivos. Un agente quimopreventivo es una sustancia sintética o naturale que bloquea, retarda ó inhibe el proceso de carcinogénesis (Pan y col., 2008). Por otro lado, en fracciones de extractos de arándanos silvestres (Vaccinium angustifolium Ait.) recolectados en USA y algunas regiones de Europa se han encontrado inhibidores de topoisomerasa (Alwerdt y col., 2008). Tales inhibidores constituyen una clase de agentes quimopreventivos por que inhiben la vía de carcinogénesis, por su acción antiproliferativa evitan la diferenciación celular. El cáncer es un proceso altamente complejo, iniciando con una célula cancerosa vía ADN dañado, acumulación de mutaciones, promoción de la proliferación celular, expansión tumoral y finalmente llevando a un fenotipo maligno con subsecuentes invasiones y metástasis en otros sitios del cuerpo. Diversos sistemas en in vitro e in vivo han sido utilizados para determinar el efecto antimutagénico y anticarcinogénico de las frutillas y sus principales componentes nutracéuticos (Duthie, 2007). Las frutillas inhiben la iniciación de la tumoración por influencia en el metabolismo del carcinógeno; promueven la apoptosis, reducen la inflamación e inhiben la angiogénesis (Duthie, 2007). La mutagénesis en algunos casos es un evento esencial y temprano en el proceso carcinogénico. La acumulación de mutaciones en la regulación de genes, por ejemplo, división celular, apoptósis y reparación de ADN, resulta en la creación de una célula capaz de crecer de forma no controlada e invasiva. Los fitoquímicos presentes en frutillas pueden bloquear la mutagénesis por carcinógenos químicos a mutagénesis endógena. La topoisomerasa II provee una estrategia muy útil para seleccionar agentes quimopreventivos que pueden ser efectivos en los estados de promoción y progresión de cancer. (Cho y col., 2000, Shureiqi y col., 2000). 13 2.3 Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos o polifenoles son originados a partir de una de las principales clases de metabolitos secundarios en plantas, la fenilalanina. Las plantas y alimentos contienen una enorme variedad de derivados fenólicos, incluyendo fenoles simples, fenilpropanoides, derivados del ácido benzoico, flavonoides, estilbenos, taninos, lignanos y ligninas, suberinas y cutinas. Miles de diferentes compuestos fenólicos se han identificado en la dieta humana, como por ejemplo: el ácido clorogénico (café, zanahorias), ácido ferúlico (cereales, vegetales monocotiledones), flavonas y flavonoles (cebolla, vegetales verdes, té y manzanas), catequinas y otros (Stahl, y col., 2002). Los compuestos fenólicos actúan como antipatógenos, contribuyen con la pigmentación de las plantas y son atrayentes de polinizadores. El contenido de compuestos fenólicos en frutillas como el arándano varía dependiendo del cultivar, condiciones de crecimiento, grado de maduración y manejo después de la cosecha. En las células de las plantas, los fenoles se encuentran en compartimentos por lo que necesitan ser liberados por algún mecanismo antes de que puedan ser absorbidos. Por otro lado, los fenoles de bajo peso molecular son solubles en agua, los de alto peso molecular pueden ser insolubles en agua, también tienen la característica de reaccionar de manera irreversible con ellos mismo y con las proteínas. Los polifenoles procedentes de tejidos crudos pueden someterse a oxidación directa o por enzimas como la polifenol oxidasa (Stahl y col., 2002). 2.3.1 Clasificación de los compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son los antioxidantes más abundantes en la dieta humana. Son metabolitos secundarios de plantas con aproximadamente 8,000 variantes en su estructura presentan anillo(s) aromático (s) con uno o más grupos OH. La clasificación de compuestos fenólicos en base a su estructura y composición química se muestra en la Figura 2. Los fenólicos están subdivididos 14 en grupos por el número de anillos aromáticos y por los elementos estructurales que ligan esos anillos (Han y col., 2007): 1.- Ácidos fenólicos: Se distinguen dos clases dependiendo de la estructura: derivados de ácido benzoico (ácido gálico) y derivados de ácido cinámico (ácido cafeico, ferúlico y cumárico). 2.- Los flavonoides: Incluyen las flavonas, flavones, isoflavonas, flavanonas, antocianinas y flavoles. Están subdivididos en función a su estructura química 3.- Estilbenos: Se caracterizan por tener en su estructura como núcleo 1,2difeniletileno con sustituyentes hidroxilo y anillos aromáticos, el más representativo del grupo es el trans-resveratrol. 4.- Taninos: Polifenoles solubles en agua, se dividen en dos grupos hidrosolubles y condensados. Presentan por lo general dos grupos galotaninos y elagitaninos. 5.- Diferuloilmetanos: Son un pequeño grupo de compuestos fenólicos estructuralmente tienen dos anillos aromaticos sustituidos por grupos OH, algunos contienen cadenas alifáticas, la cucumarina es ejemplo de este grupo. (Han y col, 2007). Figura 2. Clasificación de compuestos fenólicos (Han y col., 2007) 15 Los compuestos fenólicos son ampliamente consumidos en la dieta humana. Las principales fuentes de fenólicos incluyen algunas frutas, vegetales y bebidas como jugos y vino tinto. En cuanto a la ingesta total de fenólicos en la dieta, los ácidos fenólicos forman aproximadamente una tercera parte y los flavonoides son los dos tercios restantes. Los flavonoides más abundantes en la dieta son flavanoles (catequina), antocianidinas y sus productos de oxidación. Las principales fuentes de polifenoles son jugo de fruta, vino, té, café, chocolate y cerveza y en menos medida vegetales, leguminosas deshidratadas y cereales (Han y col., 2007). Se ha estimado que en personas que consumen al menos raciones al día de frutas y vegetales consumen diariamente 1g de compuestos fenólicos. La Academia Nacional de Ciencias de USA recomienda consumir al menos cinco raciones de frutas o vegetales al día para un buen funcionamiento del organismo y para prevención de enfermedades crónico degenerativas (Bermudez y Tucker, 2003). 2.3.1.1 Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos están ampliamente distribuidos en las plantas y su biodisponibilidad en la dieta es un factor importante para los posibles beneficios a la salud de humanos y animales (Amarowics y col., 2009; Sailendra, 2006). Entre los ácidos hidroxicinámicos el más representativo es el ácido cafeíco se encuentra generalmente como ácido clorogénico (Clifford, 1999). Forma hasta un 70% del total de ácidos hidroxicinámicos en frutas (Macheix y col., 1990). El ácido elágico es un compuesto bioactivo con potentes efectos protectores en ciertos tipos de cáncer (Mass y col., 1991; Stoner y col., 2007). Además, se ha mostrado que los elagitaninos de frambuesas contribuyen significativamente en la actividad antioxidante y propiedades de vasodilatación (Mullen y col., 2002). En estudios realizados en ratas se ha mostrado que el ácido caféico y el 16 ácido clorogénico son absorbidos en el intestino delgado (Sailendra y col., 2006). En la Figura 3 se muestra la estructura de los ácidos fenólicos. Figura 3. Estructura de ácidos fenólicos (Lafay, 2008) Algunas investigaciones sobre el ácido elágico revelan que puede formar complejos con el ácido gálico y con los taninos forma elagitaninos los cuales no son absorbidos por humanos, pero una vez hidrolizados a ácido elágico son absorbibles, este fenómeno se presenta en algunas frutillas. (Lafay, 2008). Los ácidos hidroxibenzoicos presentan generalmente un esqueleto C6-C1 que deriva directamente del ácido benzoico, los más comunes son: ácido phidroxibenzoico, ácido salicílico, ácido gálico, ácido elágico. Entre los ácidos hidroxicinámicos los más representativos son el ácido cumárico, ácido cafeíco, ácido ferúlico y ácido sinápico que pueden formar conjugados que dan lugar a ácido tartárico, ácido quínico (Lafay, 2008). 2.3.1.2 Estilbenos Los estilbenos presentan en su estructurar un núcleo de 1,2-difeniletileno con grupos aromáticos sustituidos por hidroxilos, existen como monómeros, dímeros, trímeros y polímeros llamados viniferitas (Cassidy y col., 2000; Han y 17 col., 2007; Kundu y Surh., 2008). Los estilbenos y sus análogos han sido encontrados en arádano, uvas, fresas, arándano rojo, cacahuates y vinos de uva (Wang y col., 2002; Rimando y col., 2004; Rimando y Barney, 2005; Lyons y col., 2003). Los estilbenos reportados en el arándano son: resveratrol, piceatannol, pterostibeno, cuya estructura se muestra en la Figura 4 (Rimando y col., 2004). Los estilbenos presentan actividad biológica importante como es antioxidante, antienvejecimiento, alguicida, antiinflamatoria, protegen el sistema cardiovascular, presentan efectos quimiopreventivos y quimioterapauticos; dichos efectos han sido demostrado en sistemas in vitro e in vivo (Bhat, 2001; Potter y col., 2002; Rimando y col., 2004; Rimando y Barney, 2005; Aggarwal and Shishodia, 2006; Mizuno y col., 2008; Joseph y col., 2008; Shakibaei y col., 2009). El resveratrol se ha sido relacionado a una baja incidencia en enfermedades del corazón en poblaciones que consumen vino de manera frecuente (Hegsted, 1998, Renaud, 1992). El resveratrol también posee actividad preventiva contra cáncer, esto se ha demostrado en los tres estados de carcenogénesis: iniciación del tumor, promoción y progresión. (Shakibaei y col., 2009). El resveratrol es un fuerte antioxidante que inhibe la producción de especies reactivas de oxígeno. Se ha demostrado que el pterostilbeno tiene actividad similar a la del resveratrol sobre líneas celulares cancerígenas. (Rimando, 2002). El pterostilbeno aislado de Dracaena loureiri tiene efecto antagonista sobre ciclooxigenasa I y II las cuales son enzimas claves en el proceso de inflamación. Adicionalmente, el pterostilbeno reduce niveles de glucosa en plasma y tiene actividad similar al del hipoglucemiente metformina, el mecanismo de acción aún no ha sido elucidado enteramente, sólo se conoce que no existe estimulación de células B del páncreas por lo que no aumenta la producción de insulina (Rimando y col., 2004). 18 Figura 4. Estructura de los estilbenos (Rimando y col., 2004) El piceatannol o astringinina es un análogo del resveratrol, se ha comprobado que inhibe células preoneoplásicas (células que pueden formar tumores) en cultivos celulares de mama de ratón, es un potente antioxidante, así como un antiarrítmico. (Hung, 2001). El piceatannol aislado de Rheum undulatum presenta efectos antialérgicos en modelos experimentales de alergia tipo II, la cual involucra anticuerpos mediados por hipersensibilidad citotóxica. (Matsuda y col., 2000). Existen numerosos reportes de que los estilbenos presentan actividades biológicas in vivo, así como en in vitro (Rimando y col., 2002; Shakibaei y col., 2009). 2.3.1.3 Antocianinas Antocianina es una palabra que proviene del griego (anthos = flores y ciano = azul). Forman un grupo de aproximadamente 500 compuestos que presentan color rojo, púrpura y azul de muchas frutas y vegetales, son solubles en agua, pertenecen al grupo de flavonoides. Generalmente en las frutillas son responsables de los colores rojo, violeta y azul. Las frutas rojas, vegetales y vino 19 tinto son las fuentes más ricas en antocianinas para humanos (Delgado-Vargas y col., 2000; McGhie y col., 2007). Se estima un consumo de antocianinas de 200 mg por día en países del hemisferio Norte y europa. Las frutillas que contienen concentraciones elevadas de antocianinas, pueden proporcionar 100-300 mg en una porción de 100g de fruto fresco (Kahkonen y col., 2003). Químicamente, las antocianinas son derivados glucosilados, polihidroxilos, polimetoxilos del 2-fenilbenzopireno y contienen dos anillos benzoilos (A y B) separados por una anillo heterocíclico (C). Las variaciones estructurales de las antocianinas se deben a las diferencias en el número de grupos hidroxilo en la molécula, el grado de metilación , la naturaleza y número de moléculas de azúcares a la molécula de aldehído (aglicona) y la posición de ésta, así como a la naturaleza y número de ácidos aromáticos y alifáticos unidos a los azúcares. Las antocianinas mas comunes son cianidina, delfidina, pelargonidina, petunidina y malvidina (Hosseinian y Beta, 2007). Las antocianinas son compuestos reactivos, se degradan rápidamente o reaccionan con otros constituyentes en mezclas y forman compuestos coloreados u obscuros. La pérdida de pigmentación de las antocianinas puede ocurrir en presencia de oxígeno, algunas enzimas o por exposición a altas temperaturas. Por otro lado el pH tiene un marcado efecto sobre la estabilidad de las antocianinas y sobre el color de medios que contienen esos pigmentos (Jackman y col., 1987). En soluciones acuosas las antocianinas existen como un número de diferentes formas moleculares que están un equilibrio dinámico. Originalmente las antocianinas existieron en soluciones acuosas como tres formas moleculares interconvertibles, pero después incrementó a cuatro formas interconvertibles, y recientemente se reportan ocho estructuras moleculares, las cuales son producto de la isomerización las últimas cuatro estructuras (Asenstorfer y col., 2003). En la Figura 5 se muestran las cuatro principales antocianinas. 20 formas interconvertibles de las Figura 5. Estructuras interconvertibles de las antocianinas (Clifford, 2000) En la preparación y manufactura de alimentos se debe considerar la vida de anaquel de los productos las antocianinas están expuestas a diferente pH, temperatura, humedad del medio ambiente, por lo que es probable que puedan variar en la estructura, por medio de isomerización o rompimiento de enlaces pueden llegar a formar otro tipo de compuestos. Asimismo en el paso a través del tracto gastrointestinal; las antocianinas están expuestas a pH ácido, lo cual puede afectar su absorción y disponibilidad (McGhie y col., 2007). En cuanto a los beneficios potenciales a la salud, se sabe de la reducción de riesgos de enfermedades del corazón, mejora la vista y sus efectos anticarcinogénicos, antimutagénicos y antiinflamatorios (Pascual, 2008). Muchos de los beneficios a la salud han sido atribuidos a las propiedades antioxidantes de antocianinas (Elisia y col., 2007). 2.3.1.4 Diferuloilmetanos Los compuestos diferuloilmetanos son un reducido grupo de compuestos fenólicos con dos anillos aromáticos sustituidos con grupos hidroxilos y ligados por 21 una cadena alifática con grupos carbonil (Schaffer y col., 2007). El componente más sobresaliente de este grupo es la cucurmina que presenta efectos preventivos en enfermedades como diabetes, obesidad y cáncer. También, se han identificado múltiples actividades en el proceso de señalización celular, como modulación de la quinasa AMP que se utiliza ampliamente en la terapia de obesidad (Han y col., 2007; Schaffer y col., 2007). Existe un estudio llevado a cabo por Du y col. (2006) en el cual demostrarón el efecto inhibitorio del crecimiento de células de cancer de colon humano (HT-29), por medio de la inhibición de la expresión de la Ciclooxigenasa- 2 (COX-2). 2.3.1.5 Flavonoides Los flavonoides son conocidos como potentes antioxidantes y presentan diferentes estructuras químicas, su habilidad para atrapar radicales libres de hidróxidos o peróxidos ha sido demostrado repetidamente in vitro. Los flavonoides presentan un esqueleto de carbonos C6-C3-C6, las estructuras son sumamente variadas y se han identificado aproximadamente 5000 flavonoides en plantas (Harborne, 2000) (Figura 6). Estos presentan efecto antioxidante debido a que quelan metales, inhibiendo la producción de radicales libres. (Hannum, 2004: Aron y Kennedy, 2009). Los flavonoides son los compuestos fenólicos más abundantes en la dieta humana y están principalmente divididos en (Pietta, 2000, Marchand, 2002): a) antocianinas, glucosilados derivados de antocianidinas, dan color a flores y frutos. b) antoxantinas, un grupo de compuestos coloreados divido en diferentes categorías: flavonas, flavanas, flavonoles, isoflavonas y sus glucosidos. Los flavonoles están representados por miricetina, fisetia, quercetina y kaempferol (Han y col., 2007). Entre los posibles efectos que brindan al organismo están la modulacipon de enzimas de detoxificación que tienen cierta relación con la proliferación celular, además de actividad antioxidante. 22 Figura 6. Estructura de los flavonoides (Aronn y Kennedy, 2008) 2.3.1.6 Taninos condensados Los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular intermedio (más de 30,000 Da). Son moléculas que pueden formar complejos insolubles con carbohidratos y proteínas. Se han clasificado en dos grupos: hidrolizables y no hidrolizables o condensados. Los hidrolizables constan de unidades de ácido gálico que por condensación dimérica forman ácido hexahidroxidifénico (gasoil) y que se esterifíca como poliol. Contienen generalemente 18 unidades de glucosa que pueden condensarse a otra molécula gasoil y así formar polímeros de alto peso molecular y son hidrolizables por acción química o enzimática (Figura 7). Los no hidrolizables, llamados también proantocianidinas, son polímeros de alto peso molecular y estructuralmente más complejos, formados por unidades de catequina (flavan-3-ol) con una molécula leucoantocianidina (flavan-3,4-diol) como precursor, 23 condensados entre el C4 del heterociclo (Parr y Bolwell, 2000; Santos and Scalbert, 2000). Son los responsables de la astringencia en los alimentos debido a la precipitación de las enzimas en la saliva. Alimentos como los siguentes contienen taninos; tés, vinos, granos, frutas (manzanas, plátanos, uvas, ciruelas, peras, duraznos, sorgo, mijo, cebada, chícharos y fresas, arándanos). En los alimentos se encuentran predominantemente los taninos condensados, mientras que los hidrolizables sólo en cantidades traza. También se les han atribuido efectos antimutagénicos, anticarcerogénicos y antimicrobianos (Parr y Bowell, 2000). Figura 7. Estructura básica de los taninos condensados (Parr y Bolwell, 2000) 2.3.2 Actividad biológica de los compuestos fenólicos En los últimos años las enfermedades crónico degenerativas, tales como: diabetes I y II, enfermedades cardiovasculares, cáncer, arterosclerosis. El estrés oxidativo se considera importante en estas alteraciones fisiológicas. La estructura química básica de los polifenoles los hace excelentes antioxidantes, hacen frente a los radicales libres producidos por el estrés oxidativo por medio de reacciones del tipo óxido-reducción (Olsson, 1998). Para neutralizar y combatir las especies reactivas de oxígeno (ROS) existen estrategias antioxidantes, ya sea por el incremento de enzimas 24 antioxidantes endógenas o mejorando las defensas no enzimáticas por medio de mecanismos farmacológicos o dietarios. Existen numerosos reportes de que los polifenoles dietarios poseen una potente capacidad antioxidante por mecanismos endógenos o exógenos, los primeros son producidos por el organismo como mecanismo de defensa intrínseco y los segundos son ingeridos en la dieta (Scarlbert y col., 2005; Han y col., 2007; Maiani y col., 2009). Se ha demostrado el efecto neuroprotector de los fenoles, especialmente en el contexto antioxidante. El resveratrol tuvo un impacto en las deficiencias cognitivas activando la fosforilación de la proteína cinasa; además, in vitro se ha demostrado que puede disminuir la expresión de adhesión de células vasculares (Bastianetto y col, 2007). Los polifenoles dietarios pueden tener efecto modulador en ciertos procesos bioquímicos involucrados en la carcinogénesis. Por ejemplo, las antocianinas poseen efecto antiinflamatorio que también es una propiedad quimiopreventiva (Shih y col., 2005); el resveratrol inhibe enzimas involucradas con la proliferación celular y la replicación del ADN (Sun y col., 1998). Existen estudios que indican que el genotipo, especie, variedad, condiciones de cultivo, de almacenamiento, entre otras, determinan el contenido de compuestos bioactivos en los frutos, además estos factores pueden tener influencia en la capacidad antioxidante de los frutos (Wang y Stretch., 2001; Benvenuti y col., 2004). Se ha demostrado que el resveratrol de frutillas tiene efectos antiinflamatorios porque es un buen inhibidor de lipooxigenasas, estas enzimas son responsables de la síntesis de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos que intervienen en el proceso inflamatorio (Bhat y col., 2001). De manera importante se ha obseervado que flavonoides y antocianinas tienen efectos antiinflamatorios (Hale y col., 2008: Lotito y Frey, 2006). 25 También hay reportes sobre la actividad anticarcenogénica de los polifenoles dietarios. Se suponen dos mecanismos, uno de supresión y otro de bloqueo, ésto depende del punto de acción. Algunos fenoles llevan a cabo ambos mecanismos. (Sheu y col., 1998). Los constituyentes nutracéuticos presentes en arándano son reconocidos por que son efectivos en las etapas de promoción y progresión en el desarrollo de tumores. Por ejemplo, el resveratrol presenta la habilidad de prevenir la activación de carcinógenos y estimula la destoxificación e inhibe daño oxidativo al DNA, lo cual reduce la respuesta inflamatoria y bloquea el proceso de metástasis para la progresión de tumoraciones (Bhat y col., 2001; Kundu y col., 2008; SantosCervantes y col., 2007; Stevenson, 2007; Surh, 2003). Liu y col. (2005) reportaron que las antocianinas de frambuesa negra pueden reducir el desarrollo de tumores inhibiendo la angiogénesis, una etapa crítica en el proceso de desarrollo de cáncer. Por su parte Seeram y col. (2006b) reportaron la evaluación de los efectos antiapoptóticos y antiproliferativos de frutillas como arándano, zarzamora, arándano rojo, fresa, frambuesa roja, encontraron que al incrementar la concentración de los extractos de los frutos se incrementa la inhibición de la proliferación celular. Lacueva y col. (2005) reportaron que las antocianinas presentes en arándano tienen importantes efectos en la progresión de enfermedades crónico neurodegenerativas. Joseph y col. (2003) llevaron a cabo la evaluación de un suplemento de arándano que mostró potentes efectos benéficos en la enfermedad de Alzheimer. Las antocianinas y sus agliconas presentan efectos benéficos en diabetes ya que pueden interferir en la absorción de glucosa (inhibir el transporte activo) logrando la protección de las células pancreáticas. Por otro lado, cianidina, delfinidina y pelargonidina estimulan la producción de insulina en roedores (Pascual and Sanchez, 2008). Las frutillas presentan también afectos antimicrobianos debido a los 26 fenólicos presentes en las misma, por ejemplo el arándano rojo es reconocido por la prevención de enfermedades urinarias ya que impide que ciertas bacterias se adhieran; asi mismo, el arándano presente efectos benéficos en desordenes gastrointestinales (Howell y col., 2005; Nohynek y col., 2006). 2.3.3 Compuestos nutracéuticos presentes en el arándano El arándano es reconocido por sus propiedades benéficas sobre la salud, existen numerosos estudios convincentes de este potencial (Seeram, 2006 b; Seeram, 2008; Seeram, 2008a). Contiene compuestos fenólicos, como antocianinas, flavonoides, proantocianidinas, ácidos fenólicos y estilbenos (Neto, 2007). Existen publicaciones sobre la actividad antimutagénica y anticarcínogénica de arándano los cuales se corroboraron utilizando ensayos biológicos (Neto, 2007a). Los efectos biológicos de los compuestos fenólicos han sido reportados in vitro e in vivo (Manach, 2004; Manach, 2005). Las antocianinas están presentes en concentraciones elevadas en el arándano, cabe resaltar que no solamente poseen capacidad antioxidante, sino también tienen ciertos efectos fisiológicos sobre supresión de cáncer (Wang y Stretch, 2002; Stone-Zafra y col., 2007). Las antocianinas predominantes en arándano son: cianidina, delfinidina y malvidina (Szajdek y Boroswska, 2008; Koponen y col., 2007). El flavonoide sobresaliente es miricetina (Hakkinen y col., 1999). Otros de los compuestos importantes dentro del grupo de los polifenoles son los estilbenos, a los cuales se les han atribuido efectos antimutagénicos, antioxidantes, antiinflamatorios, entre otros. Los estilbenos reportados en el arándano son: resveratrol, piceatanol, pterostilbeno (Rimando y col., 2004; Rimando y Barney, 2005 ). Los extractos acuosos ricos en fenólicos de los cultivares arándano ‘Centurion’ y ‘Maru’ presentron potencial antioxidante en in vivo (Molan y col., 2008). Los miembros del género Vaccinium son fuentes ricas de antocianinas, 27 flavonoides, proantocianidinas o taninos condensados. (Kalt y col., 2000). Las frutillas del género Vaccinium son ampliamente reconocidas por su capacidad antioxidante. (Laplaud, 1997). En el Cuadro 6 se muestra en contenido de compuestos fenólicos y su capacidad antioxidante reportado para V. ashei y V. corymbisum. Cuadro 6. Contenido de fenoles en arándano Cultivar/ especie mg/100g Fenoles totales Capacidad antioxidante mg/100 g TEAC µMol/g 556.14 113.55 261 5.33 - 27.60 399.28 84.12 585 8.24 - 14.83 Ácidos fenólicos Antocianinas mg/100g Arándano ojo de conejo(V. ashei) Arándano alto (V. corymbosum) (Los valores mostrados son en fruto fresco. Seeram, 2006a; Seeram, 2006b; Seeram, 2008, Sellapan y col., 2002). 2.4 Ensayos para evaluar actividad biológica 2.4.1 Generalidades La oxidación de productos del metabolismo también causa daño al ADN, proteínas, carbohidratos y lípidos, contribuyendo al envejecimiento y al desarrollo de enfermedades relacionadas con este proceso, como son enfermedades cardiovasculares, debilitamiento del sistema inmune, disfunciones cerebrales y el cáncer. Existen reportes de la relación entre el consumo de frutas y vegetales y una baja incidencia de cáncer, fenómeno asociado a la presencia de antioxidantes en los alimentos mencionados, los cuales pueden proteger del daño que provocan los radicales libres al ADN, principal fuente de mutaciones y por consecuencia pueden causar cáncer (Collins y Horváthova, 2001). Un antioxidante es una 28 sustancia orgánica o enzima capaz de contrarrestar los efectos de la oxidación en tejidos animales (Huang y Prior, 2005). Por otro lado, un antimutágeno es un compuesto que actúa como agente protectore en el proceso de carcinogénesis en humanos, actúa contra la promoción o progresión de las etapas de este proceso, o tal vez destruyendo o bloqueando el daño al ADN por los mutágenos presentes fuera de la célula, evitando así mutaciones a nivel celular (Horn y Ferráo, 2003). Asimismo, un antiinflamatorio es un compuesto que tiene efecto inhibitorio de los componentes involucrados en el proceso de inflamación, inhiben la actividad de la enzima ciclo-oxigenasa (COX), resultando en la disminución de la formación de prostaglandinas y tromboxanos. Las prostaglandinas estan involucradas en la producción del dolor, inflamacipon y fiebra (Bhat y col., 2001). Además, la definición de un anticancerígeno es una sustancia que inhibe las etapas de iniciación, promoción y progresión de la carcenogénesis o desarrollo de un tumor (Stevenson, 2007; Surh, 2003). 2.4.2 Ensayos de capacidad antioxidante La mayoría de los ensayos para determinar la capacidad antioxidante cosisten en la oxidación de un sistema lipídico, se calienta y en el cuál se monitorea el consumo de oxígeno, la pérdida de sustrato o formación de producto. Los ensayos en los que se miden los sustratos a los productos pueder dar resultados que variables dependiendo de la especificidad (Fukumoto y Mazza, 2000). Entre los métodos que implican atrapar radicales libres supeóxido, peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso, radicales hidroxilo, radicales peróxilo están los que utilizan compuestos “azo” para generar radicales libres peróxilo como los métodos TRAP (por sus siglas ne inglés, Total Radical- Traping Antioxidant Parameter) y ORAC (por sus siglas en inglés, Oxygen- Radical Absorbance Capacity). Otros métodos utilizan radicales libres como ABTS o 2,2- 29 azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfanato) y DPPH o 2,2-difenil-1-picrilhidrazil que pueden ser expresados como TEAC (por sus siglas en inglés Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Sanchéz y col., 2003). 2.4.2.1 Método DPPH El radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) es uno de los pocos radicales orgánicos estables, posee un color violeta y se encuentra disponible de manera comercial. El ensayo se basa en la reducción del DPPH por los antioxidantes mediante la pérdida del color del radical, monitoreando el cambio en la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro (Prior y col. 2005). Los resultados pueden expresarse como TEAC comparando cantidades estándar del antioxidante sintético Trolox. (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2- ácido carboxílico, an análogo de la vitamina E). El TEAC se expresa en la concentración milimolar de una solución de Trolox que tiene una capacidad antioxidante equivalente a una solución 1 mM de la sustancia que se está evaluando (Antilovich y col., 2002) La reacción del antioxidante y el DPPH se muestra en la Figura 8. Figura 8. Reducción del DPPH por el antioxidante (Moon y Shibamoto, 2009) 30 2.4.2.2 Método ABTS El radical 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfonico) (ABTS+) es un antioxidante que posee un color verde-azul; se requiere previa generación para poder llevar a cabo la reacción química. Este radical se reduce por los antioxidantes presentes en el medio, presentándose pérdida del color del ABTS, monitoreando el cambio en la absorbancia a 734 nm en un espectrofotómetro (Prior y col. 2005). Los resultados pueden expresarse como aquivalentes TEAC comparando cantidades estándar del antioxidante sintético Trolox (6-hidroxi2,5,7,8- tetrametilcromano-2- ácido carboxílico, análogo de la vitamina E) (Scalbert y col., 2005). El método ABTS es aplicable tanto para fase acuosa como para fase lipídica, es decir por este método se puede calcular la capacidad antioxidante de sustratos de carácter hidrofílicoy lipofilíco. Es un radical que se produce por oxidación del ABTS por persulfato de potasio, para formar el radical estable (Figura 9). La capacidad antioxidante de productos naturales como carotenoides, fenólicos, y algunos antioxidantes del plasma son determinados por la reacción de decoloración del ABTS (Moon y Shibamoto, 2009). Figura 9. Formación del radical estable de ABTS con persulfato de potasio (Moon y Shibamoto, 2009) 31 2.4.3 Actividad antioxidante por ensayo biológico La investigación acerca de los antioxidantes ha ido en aumento, desde la decada de los 90´s y se han desarrollado una gran variedad de métodos para medir la capacidad antioxidante de los alimentos, compuestos y suplementos (Liu y Finley, 2005). De acuerdo con Wolfe y col. (2008) los protocolos de capacidad antioxidante in vitro no reflejan las condiciones de la célula y no consideran la biodisponibilidad, el consumo y el metabolismo de los compuestos antioxidantes. Asimismo los métodos químicos para determinar la capacidad antioxidante no incluyen compuestos apropiados para llevar a cabo la reacción, los organismos biológicos son sumamente complejos y los compuestos antioxidantes podrían operar por un mecanismos de acción diferentes, no se conoce totalmente la acción de las enzimas digestivas y otra enzimas sobre los antioxidantes, así como las posibles interacciones entre las enzimas y otros componentes con los compuestos antioxidantes presentes en los alimentos. Debido a estas limitaciones Wolfe y col. (2008) desarrollaron un método para determinar la actividad antioxidante celular (CAA por sus siglas en inglés Cellular Antioxidant Activity), este método puede revelar más información que los métodos químicos in vitro por que toma en cuenta algunos aspectos de la célula (metabolismo, difusión, distribución). Los ensayos in vivo con animales y humanos son los mejores, pero estos modelos son muy caros y para llevarse a cabo requieren largos periodos de tiempo, por lo tanto no son convenientes para el tamizaje inicial de antioxidante en alimentos (Liu and Finley, 2005). El ensayo de actividad antioxidante celular mide la habilidad de los antioxidantes para diclorofluoresceina prevenir (DCF). El la formación DCFH-DA del compuesto fluorescente (2´,7´-diclorofluorescina diacetato) compuesto no fluorescente penetra la membrana celular, en el citosol las esterasas citoplasmaticas, lo convierten en DCFH (compuestos no fluorescente y más polar), este compuesto es oxidado por los radicales libres (ROS) que son producidos cuando la célula se expone a un agente inductor como por ejemplo 2,2-azinobis(2-amidinopropano)-dihidrocloro (ABAP) (genera radicales libres), los radicales libres generados provocan que el DCFH transfiera un proton y se forme 32 DCF; de esta manera hay producción de DCF (fluorescente) a partir de DCFH (no fluorescente) (línea celular HepG2 o HL-60) (Figura 10). La disminución en la fluorescencia comparado con un control es indicativo de la actividad de los compuestos antioxidantes en la célula (Agnihotri y col., 2009; Takamatsu y col., 2003; Wolfe y Liu, 2007; Wolfe y col., 2008). Figura 10. Reacción fluorescente en ensayo DCFH (Moon y Shibamoto, 2009) Es importante remarcar que la estructura de los antioxidantes tiene influencia en el potencial antioxidante que presentan, asimismo en los alimentos existe una compleja mezcla de compuestos que presentan efectos de interacción entre ellos y pueden aumentar el efecto antioxidante o inhibirlo (Huang y col., 2005; Liu y Finley, 2005). El ensayo de actividad antioxidante celular es usado para determinar la actividad antioxidante de compuestos puros (fenólicos y carotenoides), frutos y vegetales ( y Liu, 2005). Los resultados obtenidos a partir de este ensayo pueden ser usados para predecir los resultados in vivo además de que es un excelente método de tamizaje comparado con los tradicionales métodos químicos (Agnihotri y col., 2009; Wolfe y col., 2008). 33 III JUSTIFICACIÓN El cultivo de arándano en México es reciente, por ello es necesario conocer el potencial nutracéutico de los materiales, así se tendrá la posibilidad de cultivar aquellos que compitan exitósamente con los que se desarrollan en otros países. De esta manera, la identificación de cultivares con mensajes nutracéuticos sobresalientes ayudaría a incrementar su valor agregado. 34 IV OBJETIVOS 1. OBJETIVO GENERAL. Determinar el potencial alimentario y nutracéutico de cultivares de arándano seleccionados en la zona de la Meseta Tarasca en Michoacán, México. 2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 1. Evaluar la composición química y las características fisicoquímicas de arándanos cultivados en México. 2. Extraer y caracterizar los compuestos fenólicos presentes en los materiales. 3. Estimar la capacidad antioxidante in vitro. 4. Obtener fracciones del material sobresaliente en compuestos fenólicos y capacidad antioxidante. 5. Evaluar la capacidad antioxidante por medio de cultivo celular en los arándanos y en las fracciones obtenidas. 6. Identificar y caracterizar los compuestos activos en los materiales usados en el ensayo anterior. 35 V MATERIALES Y MÉTODOS Esquema general de trabajo Colecta de los materiales materiales Tres cultivares de de ar Tres cultivares arándano Caracterizació n Caracterizació fisicoquíímica fisicoqu mica Caracterizació n Caracterizació nutracééutica nutrac utica Fenoles Fenoles totales totales Flavonoides Antocianinas Antocianinas Estilbenos Ácidos cidos fen fenóólicos Evaluación Evaluació n del del potencial nutracééutico nutrac utico Capacidad Antioxidante in vitro vitro ABTS DPPH Capacidad Capacidad antio antioxidante xidante Ensayo DCFH--DA DCFH Cultivo Cultivo celular Fraccionamiento del cultivar Biloxi Figura 11. Esquema general de trabajo 36 5.1 Materiales. Se colectaron los materiales de tres cultivares de arándanos comerciales (Biloxy, Misty y Sharpblue) cultivados en el municipio de Los Reyes, Michoacán. Se colectó aproximadamente 1 kg de cada cultivar. Los arándanos se limpiaron, congelaron con nitrogeno líquido y se almacenaron a -70°C hasta su posterior liofilización. Posteriormente, se procedió a pulverizarlos, después se almacenaron -70°C protegidos de la luz. 5.2 Métodos. 5.2.1. Caracterización fisicoquímica de los arándanos. 5.2.1.1 Determinación de composición química A los arándanos se les determino el contenido de proteínas (12.1.07), lípidos (31.4.02), cenizas (32.1.05), humedad (4.1.06), carbohidratos (16.267), y fibra dietaria (985.29) dietaria por la metodología oficial descrita por la AOAC 2000, cada uno de los parámetros fisicoquímicos se determinaron por triplicado. 5.2.1.2 Sólidos solubles La determinación de sólidos solubles de los arándanos se realizó por medio de un refractómetro (Atago Model PR-1. Tokio). 5.2.1.3 Acidez titulable La acidez titulable de los arándanos se determinó según el método oficial (939.05) de la AOAC 2000. La acidez titulable se reporta en miliequivalentes de ácido cítrico por gramo de muestra. La determinación se realizó por triplicado. 37 5.2.1.4 pH El pH de los arándanos se determinó a partir de una suspensión de 10 g de arándanos molturados y 100 ml de agua destilada a 25 °C, recientemente hervida (Método 02-52, AOAC 1998). La suspensión se agitó en un vortex 15 s cada 5 min a una velocidad alta hasta completar un tiempo de 20 min. Como siguiente paso se determinó el pH a la suspensión en agitación. La determinación se realizó por triplicado. 5.2.1.5 Determinación de color de los arándanos El color de los arándanos se determinó utilizando un Colorímetro Mod. DP-400 (Kónica Minolta Sensing, Inc. NJ, USA). Se obtuvieron los parámetros de color L, a y b, en la escala Hunter lab (Figura 12). El valor L representa la luminosidad del color en un rango de 0 (negro) a 100 (blanco); a representa la escala de rojo (positivo) al verde (negativo) y b la escala del amarillo (positivo) al azul (negativo). El color se expresa en función de la luminosidad (L) y el croma (C) [ a2 + b2)1/2]. Las Lecturas se realizaron por triplicado. Figura 12. Escala Hunter (HunterLab. Inc., 2008) 38 5.2.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos. 5.2.2.1 Compuestos fenólicos 5.2.2.1.1 Extractos crudos para determinación de compuestos fenólicos totales. Los extractos crudos se realizaron por triplicado de la siguiente manera, 1 g de arándano liofilizado se incorporó en tubos de polipropileno de 50 ml, se les adicionó 20 ml de metanol ó agua y se dejaron en agitación a 200 rpm durante 24 hr. Posteriormente se centrifugaron a 13000 rpm por 10 min; el residuo sólido se resuspendió nuevamente en 20 ml de metanol ó agua, se mantuvo en agitación por 24 hr y posteriormente se centrifugó. Los dos extractos se combinaron y protegieron de la luz, posteriormente se concentraron en rotavapor. Enseguida se resuspendió el extracto en 2 ml de metanol o agua. Se almacenó a -20° C hasta su utilización (Aparicio-Fernández y col., 2006). 5.2.2.1.2 Determinación de fenoles totales Los fenoles totales se determinaron por triplicado para extractos metanólicos y acuosos, según el método de Folin-Ciocalteu, descrito por Singleton y Rossi (1965). Se realizó a partir de 50 μl del extracto crudo y se adicionaron 200 μl de agua y 250 μl del reactivo de Folin Ciocalteu (50% v/v) mezclando vigorosamente. Al transcurrir 3 min se adicionaron 500 μl de Na2CO3 (7.5% w/v) y se mezclaron vigorosamente, enseguida se llevaron las muestras a incubación durante 15 min a 45°C. La absorbancia se registró a 760 nm usando un espectrofotómetro Beckman DU 640. Los cálculos se realizaron a partir de una curva estándar de calibración de ácido gálico y los resultados se expresaron en miligramosequivalentes de ácido gálico por g de extracto seco. 39 5.2.2.1.3 Determinación de flavonoides totales. La cuantificación de flavonoides totales se desarrolló por medio de la técnica empleada por Lock (2006). Se pesó 1 g de cada muestra liofilizada en tubos de polipropileno de 50 ml, y se les adicionaron 2 ml de etanol 80 %, se sonicaron 30 min a 60°C; posteriormente se centrifugaron durante 10 min a 13000 rpm. Una vez centrifugadas las muestras, se les retiró el sobrenadante y fue transferido a otro tubo. Posteriormente se tomaron 100 µl del extracto, se les adicionaron 200 µl de acetato de potasio (1M), 200µl de nitrato de aluminio al 10 % y 500 µl de etanol al 80 %; se dejó reposar durante 40 min y se registró su absorbancia a 415 nm en la región UV visible. La cuantificación de flavonoides totales se realizó por triplicado. Los cálculos se realizaron a partir de una curva estándar de calibración de qurcetina y los resultados se expresaron en mg equivalentes de quercetina por g de extracto seco. 5.2.2.1.4 Determinación de antocianinas totales Las antocianinas totales se determinaron por triplicado según el método descrito por Abdel-Aal y Hucl (1999). Se obtuvo un extracto metanólico a partir de 1 g de arándano liofilizado, posteriormente se le adicionaron 5 ml de etanol-HCl 1 N (85:15 v/v) y se mezclaron vigorosamente (200 rpm). El pH de la solución se ajustó a 1 con HCl 4 N. La mezcla se agitó por 12 horas a temperatura ambiente, protegida de la luz, después se centrifugó por 15 min a 13 000 rpm. El sobrenadante se colocó en un matraz volumétrico de 10 ml y se aforó con etanol acidificado. La absorbancia se registró a 535 nm. Para calcular las antocianinas totales se utilizó el coeficiente de extinción molar (25,965 cm-1 M-1), el peso molecular de la cianidina-3-glucósido (C3G) (449.2) y los resultados se expresan como mg de cianidina 3-glucósido por gr de arándano liofilizado. 5.2.2.1.5 Extracción, hidrólisis de antocianinas e identificación por HPLC La extracción de antocianinas se realizó por triplicado utilizando el método descrito por Romani y col. (2004). Los extractos se obtuvieron a partir de la adición 40 de 15 ml de metanol al 70% ajustando a un pH 2 con ácido fórmico y agitando a 80 rpm durante 3 hr. Este proceso se realizó tres veces y todos los extractos se combinaron y evaporaron a sequedad en rotavapor, el residuo finalmente se resuspendió en 2 ml de H2O/CH3CN/MeOH/HCOOH (45:22.5:22.5:10 v/v/v/v). La hidrólisis se llevó a cabo por el método propuesto por Takeoka y col. (1997), a 1 ml del extracto se le adicionó 1 ml de HCl 2 N en un baño de agua hirviendo por 60 min y enseguida se enfrió en baño de hielo. Las antocianinas se extrajeron dos veces con 2 ml de acetato de etilo, se concentraron a sequedad en rotavapor y se resuspendieron en 1 ml de ácido fórmico al 10%. Por último, el extracto se centrifugó a 13 000 rpm por 10 min para su inmediato análisis. Para el análisis en HPLC se utilizó una columna EPS C-18 (7x 57 mm), Rocket (Deerfield, IL. USA). El solvente A fue agua al 5% con ácido fórmico y el solvente B acetonitrilo al 5% con ácido fórmico. El gradiente lineal que se utilizó en la elusión de antocianinas fue: 5% B en 5 min 10% B en 10 min 18% B en 20 min, finalmente la columna se lavó con 95% B por 30 min y se equilibró con 100% de A por 3 min. El volumen de inyección fue de 20 µl con un flujo de 1 ml/min. El tiempo total de cada corrida fue de 40 min, la longitud de onda utilizada para detectar antocianinas fue de 520 nm. 5.2.2.1.6 Caracterización de flavonoides por HPLC Los flavonoides fueron analizados por triplicado a partir de extractos metanólicos hidrolizados, por el método reportado por Graham (1991). 1 ml de extracto fue evaporado en rotavapor a 40 °C. El residuo se diluyó con 3 ml de HCl 2 N y se llevó a 95 °C por 2 hr, se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los compuestos orgánicos fueron extraídos a partir de la solución acidificada con 4 ml de acetato de etilo, se separó la fase orgánica del resto de la mezcla. El acetato de etilo fue removido utilizando rotavapor a 40 °C. El residuo se resuspendió en 1 ml de metanol al 80% y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min, enseguida se utilizó para el análisis por HPLC. 41 Para los análisis de HPLC se utilizó un Detector PDA, Módulo de separación 2690 (Waters Co. Milford, MA, USA), y una columna de separación Platinium EPS C-18 (7 x 57mm) Rocket (Deerfield, IL. USA). El solvente A fue agua pH 2.8 ajustada con ácido acético y el solvente B acetonitrilo. El volumen de inyección fue de 30 µl con un flujo de 2.5 ml/min. Para la elución de flavonoides el gradiente lineal utilizado fue: 10% B en 2.5 min, 12% B en 6 min, 23% B en 18 min y 35% B en 24 min, al final la columna fue lavada con 95% B durante 3 min y equilibrada con 100% de A durante 3 min, el tiempo total de corrida fue 30 min. Las longitudes de onda que se utilizaron para la detección de flavonoides son 260 nm y 342 nm. 5.3 Determinación de la capacidad Antioxidante 5.3.1 Método DPPH La capacidad antioxidante se realizó a los extractos metanólicos y acuosos. Se utilizó el método original de Brand-Williams y col. (1995) modificado por Fukumuto y Mazza (2000) en micro placa. A una placa de 96 pozos se añadieron 22 µl de extracto [expresada como 100 μM equivalentes de (+) Trolox], ó BHT (1000 μM) y 200 µl de solución de DPPH a 150 μM, preparada en metanol al 80%. El extracto y los estándares se prepararon por triplicado, usando un rango de concentración de 0-500 µl. Se utilizó ácido gálico y BHT como controles positivos y DPPH en metanol al 80% como control negativo, utilizando metanol al 80% como blanco. Se registraron las lecturas de la placa cada 10 min de 0 a 90 min a 520 nm en un espectrofotómetro (Benchmark PLUS, BIORAD S.A de C.V.). La placa se mantuvo cubierta para protegerla de la luz y a temperatura ambiente entre las diversas lecturas. 42 5.3.2 Método ABTS+ Este método lo desarrolló Re y col. (1999). En un vial se mezclaron 5 ml de ABTS (7 mM) y 88 μL de la solución de persulfato de potasio (140 mM), se cubrió el vial con papel aluminio; la nueva solución (A) se almacenó en un lugar oscuro durante 12 horas a temperatura ambiente para la formación del radical. Una vez transcurridas 12 hr se mezclaron 1000 μL de la solución A, que contiene el ABTS•+ y 4.5 ml de etanol. Esta nueva solución B presentó una absorbancia entre 0.7 y 1, se verificó este valor en el espectrofotómetro UV-VIS a una longitud de onda de 734 nm. En una placa de 96 pozos se añadieron 20 µl de extracto y 230 µl de solución de ABTS preparada en etanol. El extracto y los estándares se prepararon en triplicado, usando un rango de concentración de 0-500 µl. Se registraron las lecturas de la placa a los 6 min 734 nm en un espectrofotómetro (Benchmark PLUS, BIORAD S.A de C.V.). La placa se mantuvo cubierta, para protegerla de la luz y a temperatura ambiente entre las diversas lecturas. Cálculo de capacidad antioxidante expresada como equivalentes de Trolox (TEAC) Según Van den Berg (1999) los resultados también se pueden expresar comparando con un estándar de antioxidante sintético Trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina E). Para esto, se hicieron diferentes concentraciones de Trolox para hacer una curva estándar, se aplicó el mismo tratamiento para las muestras y los controles. Los resultados se expresaron como equivalentes de capacidad antioxidante de Trolox (TEAC). 43 TEAC muestra = A muestra/( m* [ muestra ]) Donde: TEAC es la capacidad antioxidante de la muestra expresada en equivalentes de Trolox, A muestra es la absorbancia de la muestra a los 30 min, m es la pendiente de la curva de calibración de Trolox y [muestra] es la concentración de la muestra en µM 5.4 Obtención de extracto ASE para determinación de fenólicos La obtención del extracto se realizó según la metodología descrita por Rimando y col. (2004) y Rimando y Barney (2005). Se utilizó un aparato ASE (siglas en inglés Accelerated Solvent Extraction) esta técnica involucra la extracción por medio de solventes líquidos, bajo ciertas condiciones de temperatura y presión. (ASE apparatous Dioed Corporation, Sunnyvale, CA). Se realizó un extracto a partir de 10 g de arándano liofilizado con aproximadamente 2 g de arena purificada, la cual se utilizó para empacar el cartucho de extracción (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Las condiciones de extracción fueron las siguientes: temperatura 40 °C, presión 1000 psi, iempo 5 min. Disolvente de extracción metanol: acetona: agua: ácido acético (40:40:20:0.1), con cuatro ciclos. Los solventes orgánicos se eliminaron utilizando rotavapor a 40 °C. El residuo obtenido se secó en un concentrador aplicando vacío (ThermoFisher SCIENTIFIC. Thermo Savant). El extracto obtenido se guardó a 4 °C hasta su utilización. 5.5 Fraccionamiento Una vez realizadas las determinaciones de compuestos fenólicos totales, flavonoides totales, antocianinas totales y la capacidad antioxidante por los 44 métodos químicos ABTS+ y DPPH se seleccionó el material con mayor contenido en compuestos fenólicos y mayor capacidad antioxidante y se fraccionó, utilizando un sistema rápido de cromatografía en columna (biotage Flash). Se utilizaron como solventes fase A metanol al 1% y como fase B metanol al 100%. El gradiente usado fue 0% B hasta 100% B. Inicialmemte la columna se lavó con metanol y se obtuvieron 40 subfracciones de 21 ml cada una, posteriormente se examinaron por medio de una cromatografía en capa fina, después se combinaron las subfracciones comunes, en base a los resultados obtenidos en la cromatografia en capa fina.Enseguida Se concentraron en rotavapor, posteriormente se secaron en un concentrador aplicando vacío. (ThermoFisher SCIENTIFIC. Thermo Savant). 5.6 Actividad antioxidante en cultivo celular Se utilizó la metodología de Rosenkranz y col. (1992). El ensayo de capacidad antioxidante con cultivo celular se realizó por triplicado. Se utilizaron los extractos ASE de los cultivares de arádano y las fracciones de Biloxi. El ensayo de actividad antioxidante que se llevó a cabo utilizando el compuesto fluorecescente diacetato diclorofluoresceina (DCFH-DA) y un cultivo celular HL-60, el cual se cultivó en un medio RPMI 1640 con suero bovino fetal y 60 mg/ml del antibiótico amikacina a 37°C en un ambiente de humedad de 95% y 5% de CO2. Para el ensayo se tomaron 125 ul de la suspensión celular (1 x 10 6 células/ml) y se adicionaron a una microplaca de 96 pozos. Después del tratamiento con diferentes concentraciones de las muestras por 30 min, las células se trataron con el estimulante PMA (forbol acetato miristato 100 ng/ml) por 30 min. DCFH-DA se adicionó por 15 min. Los niveles de DCF producido se monitorearon a una longitud de onda de 485nm (excitación) y 530nm (emisión) en un espectrofotometro PolarStar. La habilidad de los materiales para inhibir los oxidantes exógenos se midió por la oxidación del compuesto DCFH-DA (no fluorescente) a DCF (fluorescente) en las células HL-60. Se utilizó como control positivo con PMA 45 (Forbol 12-miristato de 13-acetato). La disminución en el nivel de fluorescencia se relaciono con el grado de actividad del compuesto que estaba a prueba. Se calculó el valor de concentración media inhibitoria (CI50), el cual se obtuvo a partir de una curva dosis-respuesta por medio del porcentaje de producción de DCF contra la concentración del Trolox como control positivo. 5.7 Identificación y caracterización de compuestos fenólicos en los extractos ASE y fracciones 5.7.1 Caracterización de antocianinas por HPLC La determinación de antocianinas y antocianidinas se llevó a cabo a partir del extracto ASE, se utilizó 1 mg de extracto y se disolvió en 100 µl de agua: metanol 80:20 (v:v) con 0.1% HCl y fue analizado por HPLC. Se utilizó un HPLC Agilent Technologies 1200 Series y una columna Agilent Zorbax SB-C18 5 µm, 4.6 x 250 mm. La fase A fue agua con pH 1.68 acidificada con ácido fórmico y la fase B agua: acetonitrilo: ácido fórmico 50:45:5 (v: v: v). El volumen de inyección fue de 20 µl y el flujo de 0.9 ml/min. El gradiente utilizado para la identificación de antocianinas y antocianidinas fue: 20% B en 0 min, 25% B en 10 min, 33% B en 20 min, 100% B en 45 min, 0% B en 46 min. Las longitudes de onda utilizadas fueron; 520 y 530 nm. 5.7.2 Caracterización de ácidos fenólicos y flavonoides por HPLC La determinación de ácidos fenólicos y flavonoides se llevó a cabo a partir del extracto ASE, se utilizó 1 mg de extracto y se disolvió en 100 µl metanol y fue analizado por HPLC. Se utilizó un HPLC Agilent Technologies 1200 Series y una columna Inertsil ODS-2 5 µm, 4.6 x 250 mm. La fase A fue agua al 1% con ácido fórmico y la fase B metanol al 1% con ácido fórmico. El volumen de inyección fue 46 de 20 µl y el flujo de 1 ml/min. El gradiente utilizado para la identificación de antocianinas y antocianidinas fue: 5% B en 3 min, 70% B en 45 min, 100% B en 48 min, 0% B en 53 min. Las longitudes de onda utilizadas fueron; 254, 280, 320 y 370 nm. 5.7.3 Extracción y cuantificación de estilbenos por CG-MS Los estilbenos se extrajeron y cuantificaron a partir del extracto ASE descrito previamente. La extracción se realizó con 1 ml de acetato de etilo (tres veces), enseguida se evaporó a sequedad bajo una corriente de nitrógeno, el residuo se recuperó con acetato de etilo y se paso a un vial ámbar para GC/MS, después se secó en un concentrador aplicando vacío (ThermoFisher SCIENTIFIC. Thermo Savant), el residuo obtenido posteriormente se derivatizó y analizó mediante GC/MS. El análisis de estilbenos se realizó mediante la metodología publicada por Soleas (1995), modificada por Rimando y col. (2004). Se partió de 1 mg de extracto ASE, se diluyó en un 100 µl de bis8-trimetilsilil)trifluoroacetamida: dimetil formamida 1:1 (v:v) en un vial para cromatografía de gases de 2ml, el vial se calentó a 75 °C durante 40 min posteriormente se enfrió a temperatura ambiente, la muestra se analizó en cromatógrafo de gases acoplado a masas (JEOL GCMate II System. EE.UU., Inc. Peabodu,MA) Se manejaron las siguientes condiciones de operación: la temperatura inicial de 150 °C, aumentando 25 °C/ min hasta alcanzar 260 °C, a partir de ahí se manejo un incremento de 1 °C/min, cuando la temperatura alcanzó 270 °C se aumentaron 60 °C/min hasta lograr una temperatura de 320 °C, la cual se mantuvo durante un tiempo de 2 min. Se utilizó una columna de 30m x 0.25 mm, 0.25 µm, ZB-50 (Phenomenex, Torrance, CA). Se usó un gas de ultrapureza de helio (nexAir, Batesville, MS) a una velocidad de flujo de 1ml /7min. El análisis de resveratrol, pteroestilbeno, desoxirapontigenina, trimetoxiestilbeno y pinoestilbeno se llevó a cabo utilizando tiempos de retención de 18.22, 16.17, 15.72, 8.32, 17.32, respectivamente. El resveratrol se monitoreó usando m/z 444, la desoxirapontigenina y pinoestilbeno usando m/z 386, el pteroestilbeno y el trimetoxiestilbeno usando m/z 328. 47 5.8 Análisis estadístico Los experimentos de fenoles, flavonoides y antocianinas totales y la capacidad antioxidante por DPPH Y ABTS se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes. Se realizaron análisis de correlaciones entre fenoles totales, DPPH y ABTS. Las caracterizaciones de fenólicos por HPLC Y CG/MS se realizaron por duplicado. La actividad antioxidante se llevó a cabo por duplicado. Se analizaron diferencias para todas las determinaciones mediante el método de Tukey 48 VI RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Caracterización fisicoquímica de los arándanos 6.1.1 Características fisicoquímicas y proximales Entre las características importantes que pueden determinar la calidad interna de los arándanos se encuentran aquellas que involucran la composición del fruto, como son la concentración de sólidos solubles (°Brix), la acidez titulable (ácido cítrico), pH, color; además de otras características fisicoquímicas. En el Cuadro 7 se representa la caracterización fisicoquímica de los tres cultivares de arándano (Vaccinium sp) evaluados. Cuadro 7. Composición fisicoquímica de los arándanos Parámetro fisicoquímico Biloxi Misty Sharpblue L* 11.93a 19.09b 9.68a a* 0.82a 1.44b 1.36b b* -5.10a -5.27a -2.51b 2.85a 3.1a 2.99a 2.88±0.14 a 1.31±0.01 b 1.45±0.032 b 12.2a 13.5a 14.0a Humedad 85.5±0.5a 92±1.5b 87±1.5a Cenizas 0.34±0.01a 0.2±0.01a 0.21±0.01a Proteína 0.29±0.01a 0.22±0.02a 0.21±0.17a Fibra 2.70±0.2a 1.7±0.2 b 2.30±0.2a Lípidos .64±0.02a 0.7±0.2a 0.5±0.2a 12.17±2.02a 10.8±1.8b 15.3±2a Color pH Acidez titulable ° Brix Composición Proximal Carbohidratos Los resultados mostrados son en 100 g de arándano deshidratado. Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por fila indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). 49 Las características fisicoquímicas están estrechamente relacionadas con el grado de madurez de los frutos y con el grado de aceptación de los mismos, debido a esto son importantes. La determinación de color se llevó a cabo en aproximadamente 20 g arándano utilizando un Colorímetro Minolta DP-400. Los valores fueron expresados por medio de las parámetros de la escala de Hunter L*, a* y b*. Es importante mencionar que el color es un factor determinante en la aceptabilidad de los arándanos, ya que estas frutillas se relacionan con un intenso color azul, indicativo del grado de madurez. Los valores de luminosidad (L*) de los tres cultivares van desde 9.68 a 19.09 y son indicativos de una baja luminosidad, Misty fue la que mostró un mayor valor para dicho parámetro, seguida de Biloxi y Sharpblue, los valores de a* y b* muestran el color azul que caracteriza a los arándanos, la más azul fue Misty sucesivamente Biloxi y Sharpblue, los valores para los parámetros de la escala de Hunter son similares a los que reportan Giovanetti y Buratti (2009) para arándanos de Italia, tanto cultivado como silvestre y coincide con los valores reportados por Silva y col. (2005) para arándanos cultivados en Mississippi y Michigan, USA. Los valores de pH registrados para los arándanos son ácidos, esto se debe a que en los frutos más del 90% del volumen celular lo ocupa la vacuola, la cual usualmente es muy ácida, presenta pH inferior a 5 (Nanos y Kader, 1993); los resultados encontrados en los frutos maduros de arándano fueron de pH´s entre 2.85 y 3.11. El valor de pH más elevado fue registrado para Misty y los menores para Sharpblue y Biloxi, y son similares a la acidez reportada para V. corymbosum con un valor de 3.1 (Rodriguez y col., 2007; Ochmian y col., 2009). Debido al pH que presentan los arádanos se pueden clasificar dentro del grupo de frutos ácidos, que tambien concuerda con sus exigencias de un suelo ácido con un pH entre 4.5 y 5.5 (Darnell, 2000; Rodríguez y col., 2007). La acidez titulable (% ácido cítrico) de los cultivares de arándano analizados fluctuó entre 2.88% para Biloxi y 1.315% para Misty. Por lo tanto, se 50 puede apreciar que existe efecto significativo del cultivar en la concentración de ácidos orgánicos. La explicación de esta variación no es muy clara; los ácidos orgánicos presentan funciones muy variadas, la concentración de los mismos se puede ver afectada por la resppiración aeróbica y anaeróciba un ejemplo de las condiciones anaeróbicas es el ciclo de ácidos tricarboxílicos, que en muchos frutos conforma el segundo depósito de energía más importante, seguido de los carbohidratos. Por otro lado, los ácidos orgánicos son base e intermediarios de los productos para la síntesis en el metabolismo primario y secundario del fruto (Osterloh y col., 1996). Kays en el 2004 confirma que los precursores inmediatos de los ácidos orgánicos no son solamente otros ácidos orgánicos sino también los carbohidratos y pueden tener un papel importante en el aumento de la concentración. Los principales ácidos orgánicos del arándano son el cítrico y el málico, los cuales varían en concentración en función de la variedad (Green, 1979; Whiting, 1958).La relación inversa entre acidez y pH se esperaba ya que el pH esta directamente influenciado por la concentración de ácidos orgánicos presentes en las frutillas (Hoshino y Bridle, 1980). La concentración de sólidos solubles representa la concentración de sacarosa u otros carbohidratos presentes en los frutos, este parámetro se relaciona con la dulzura y madurez óptima de los frutos. Los valores encontrados muestran una variación de 12.2 a 14.0 °Brix, correspondiendo el primer valor al cultivar Biloxi y el segundo a Sharpblue. Estos valores son más elevados a los que reportan para arándanos cultivados en USA Kalt y McDonald (1996) encontraron una concentración de 10 °Brix, esta diferencia se puede deber a varios factores, algunos relacionados a procesos bioquímicos. Ellis y Gray (1986) encontraron en plantas sometidas a bajas temperaturas (-6 °C) una activación de diversas enzimas, como la ribulosa 1-5 bifosfatocarboxilasa, que participa en la síntesis de diversos carbohidratos en las plantas, por lo que incrementa la concentración de sólidos solubles. Es importante mencionar que la activación enzimática de alguna vía metabólica puede depender, tanto de factores endógenos de la planta (genotipo, es decir genes que codifiquen 51 para la síntesis de ciertas enzimas involucradas en el proceso), como de factores exógenos: condiciones de cultivo, medio ambiente, condiciones climáticas, localización geográfica, enfermedades, estrés, maduración, condiciones de cosecha y almacenamiento, entre otros factores (Moyer y col., 2002; Sellapan y col., 2002; Wang y col., 2009), que pueden afectar la orientación de la plantación, arquitectura de la planta, inclinación de las hojas, densidad de cloroplastos, estomas (fenotipo) como señalan Azcón-Bieto y Talpon, 1993. La composición proximal proporciona un panorama general del valor nutricional de los alimentos (Kirk, 1993), en el Cuadro 6 se muestran los valores encontrados.Para las muestras evaluadas la humedad presentó valores que fluctuaron entre 85.5% y 92%, para Biloxi y Misty, respectivamente. El contenido de cenizas fue de 0.2% y 0.34%, el primer valor para Misty y el segundo para Biloxi. El contenido de proteína fluctúo entre 0.21% y 0.29%, el valor más elevado fue para Sharpblue. Los valores del contenido fibra fueron 1.7% y 2.70% (Misty y Biloxi, respectivamente). El contenido de lípidos fluctuó entre 0.5% y 0.7% el primer valor lo mostró Sharpblue y el segundo para Misty. Los valores de carbohidratos variaron entre 10.8% y 15.3% (Misty y Sharpblue, respectivamente). La caracterización fisicoquímica no mostró diferencias significativas entre cada variedad. Los valores obtenidos para los parámetros evaluados en la composición proximal son similares a los que reportan Skupién, (2006) y Starast y col. (2007) para cultivares de arándano (Vaccinium corymbosum L.) de Europa, además la composición proximal y fisicoquímica de los arándanos cultivados en Michoacán fue similar a la reportada en la base de datos de el Departamento de Agricultura de USA (USDA, United States Department of Agriculture, 2004). 52 6.2 Determinación de compuestos nutracéuticos en arándanos 6.2.1 Fenoles totales El contenido de compuestos fenólicos totales de los frutos deshidratados de arándano procedentes de Los Reyes, Michoacán (Cuadro 8) para los extractos acuosos fluctuó entre 10.56 y 14.22 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g, el contenido más alto de compuestos fenólicos fue para el cultivar Biloxi y el más bajo para Misty, la media de los fenoles en el extracto acuoso fue de 12.56 mg EGA/g. El contenido de compuestos fenólicos en los extractos metanólicos fue de 19.57 y 25.19 mg EGA/g en Misty y Biloxi, respectivamente y la media fue de 21.59 mg EGA/g. Los arándanos analizados muestraron concentraciones sobresalientes de compuestos fenólicos, Wolfe y col. (2008), quienes encontraron una concentración de 4.29 mg EAG/g en fruto deshidratado, de arándano cultivado en Damariscotta, Maine, USA. La concentración de fenoles totales en los extractos acuosos y metanólicos fue variable, cabe destacar que Biloxi mostró diferencias significativas respecto a Misty y Sharpblue, se observo que el cultivar, es un factor que influye de manera significativa en la concentración de los fenoles en los frutos de arándano. Esto coincide con lo que reportaron Wang y Lin (2000), al evaluar el contenido de fenoles totales en fresa, frambuesa y zarzamora, tanto en el fruto como en las hojas de la planta de diferentes cultivares.Por otro lado, Moyer y col. (2002), también reportaron que la concentración de fenólicos significativamente de acuerdo al cultivar de arándano (Vaccinium spp). 53 varía Cuadro 8. Contenido de compuestos fenólicos totales en extracto acuoso y metanólico de arándano COMPUESTOS FENOLICOS TOTALES mg EAG/g Cultivar Acuoso Metanólico Biloxi 14.22 ± 1.10 aA 25.19 ± 0.79 aB Misty 10.56 ± 0.34 bA 19.57 ± 0.90 bB Sharpblue 12.90 ± 0.75 aA 20.01 ± 0.65 bB 12.56± 0.73 21.59 ± 0.78 Media mg GAE/ g fd: miligramos equivalentes de ácido gálico/g de fruto deshidratado. Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado; Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). Letras diferentes por renglón indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey) por extracto. Respecto al tipo de extracto, la concentración más alta de fenoles totales se obtuvo en los extractos metanólicos (Figura 13). Cabe mencionar que estadísticamente se encontraron diferencias significativas. Se puede deducir que los arándanos contienen mayor proporción de compuestos de carácter hidrófobo que hidrófilo, esta característica se ve afectada por la estructura química y los diferentes grupos funcionales a los cuales están enlazados los compuestos fenólicos (azucares, otros ácidos orgánicos, entres otros); también el grado de polimerización se relaciona con la hidrofobicidad (Parr y Bolwell,2000; Wang y Weller, 2006). 54 Figura 13. Contenido de compuestos fenólicos totales en cultivares de arándano El contenido de fenoles totales es expresado en mg GAE/g fd. Cada barra representa la media del ensayo y la línea vertical de representa la Desviación Estándar. Letras diferentes en las barras son estadísticamente diferentes ( p ≤ 0.05 por la prueba de Tukey) Además se ha reportado que el arándano tiene los más altos valores en antioxidantes fenólicos, comparado con otras frutillas consumidas principalmente en USA. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que en efecto el arándano cultivado en Michoacán, México puede ser un excelente alimento, que puede brindar efectos benéficos a la salud; especialmente por el alto contenido de compuestos fenólicos que presenta (Szajdek y Borowska, 2008: Wolfe and Liu, 2008; Amarowicz y col.,2009). 55 6.2.2 Flavonoides totales El contenido de flavonoides totales por método espectrofotométrico fluctuó entre 2.35 y 4.78 mg equivalentes de quercetina/g en fruto deshidratado, el valor más alto se encontro en el cultivar Biloxi, mientras que Misty presentó el valor más bajo, ambos cultivares presentaron resultados similares de fenoles totales. El valor medio de los cultivares analizados fue 3.42 mg EQ/g (Cuadro 9). Los valores obtenidos son comparables con los que reporta la USDA en su base de datos (2003), 2.70 mg EQ/g, es importante mencionar que tanto Biloxi y Sharpblue mostraron concentraciones más altas. Cuadro 9. Contenido de flavonoides totales en arándano FLAVONOIDES TOTALES mg EQ/g Cultivar Biloxy 4.78 ± 0.69 a Misty 2.35 ± 0.66 b Sharpblue 3.15 ± 0.62 b Media 3.42 ± 0.65 mg GAE/ g fd: miligramos equivalentes quercetina/g de fruto deshidratado. Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado; Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). Estadísticamente Biloxi mostró diferencias significativas respecto a Misty, pero no con Sharpblue (Figura 2). Se puede considerar que el cultivar es un factor que afecta la concentración de flavonoides, como también se observó para los fenoles totales. De modo similar, McGhie y col. (2005) determinaron que la concentración de flavonoides en manzana (Malus spp.) esta altamente afectada por el tipo de cultivar. Por otro lado Liu y col. (2002), reportaron que la variabilidad en el contenido de fenoles totales y flavonoides de frambuesa cultivada en Genova, NY se debe al tipo de cultivar y a los flavonoides. 56 6.2.3 Antocianinas totales El contenido de antocianinas totales por método espectrofotométrico fue de 6.24 y 12.24 mg equivalentes de cianidina-3-glucósido (C3G)/g, el contenido más alto lo presentó cultivar Biloxi que también presentó el valor más alto de fenoles y flavonoides totales. Mientras que Misty presentó el más bajo. El valor de la media fue 8.77 mg EC3G/g fd (Cuadro 10). Estadísticamente Biloxi mostró diferencias significativas respecto a Misty y Sharpblue. La concentración de antocianinas totales de los arándanos cultivados en Michoacán, son más altos que los que reporta Moyer y col. (2002) para miembros del género Vaccinium cultivados en Oregón, USA 4.3 mg EC3G/g. Hosseinian y Beta (2007) reportaron una concentración más baja para arándano silvestre nativo de Manitoba, Canadá 5.58 mg EC3G/g. Sin embargo, Nicoué y col. (2007), reportaron concentraciones más altas para cultivares de arándano procedentes de Quebec, Canadá (21.1- 28.9 mg EC3G/g). Estas diferencias en antocianinas pueden explicarse en función de la intensidad lumínica presente en cada una de las regiones, la cual afecta la síntesis de compuestos en las plantas (Timberlake y Henry, 1986). Cuadro 10. Contenido de antocianinas totales en arándano ANTOCIANINAS TOTALES mg EC3G/g Cultivar Biloxy 12.24± 1.83 a Misty 6.24 ± 0.84 b Sharpblue 7.85 ± 0.43 b Media 8.77 ± 1.03 mg EC3G/ g fd: miligramos equivalentes de cianidina-3-glucósido/g en fruto deshidratado. Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado; Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). 57 6.3 Actividad antioxidante por DPPH y ABTS+ Los valores de capacidad antioxidante, reportados como equivalentes de Trolox (TEAC)/mg, para los ensayos con DPPH y ABST+ (Cuadro 11) fueron muy similares para ambos ensayos; lo que sugiere que ambos métodos pueden ser útiles para determinar la capacidad antioxidante en arándanos aún cuando tienen mecanismo similares de acción, pero utilizan diferente radical. En el ensayo de DPPH, los valores obtenidos para los extractos acuosos fluctuaron entre 11.6 μmol ET/mg en Misty y 17.3 μmol ET/mg en Biloxi. El valor medio fue de 14.4 μmol ET/mg. Mientras para DPPH en los extractos metanólicos los valores oscilaron entre 20.3 y 27.0 μmol ET/mg, el valor más alto se encontro en el mismo cultivar Biloxi, mientras que Misty presentó el más bajo. La media fue de 23.6 μmol ET/mg. Los resultados obtenidos fueron más altos a los que reportaron Seeram y col. (2008), en jugo de arándano obtenido a partir del fruto completo (13.3 y 17.1 μmol ET/mg). Asimismo, Netzel y col. (2006) reportaron contenidos más bajos a los encontrados, 10.35 μmol ET/mg, en el cultivar Biloxi producido en Australia. Por otro lado, Ogawa y col. (2008) reportaron resultados comparables ó ligeramente más altos con los obtenidos (28 μmol ET/mg), en arándano liofilizado. Con el ensayo de DPPH se obtubieron los valores más altos en Biloxi (para ambos tipos de extractos), pero estas diferencias no son estadísticamente significativas respecto Misty y Sharpblue. Con el extracto metanólico se obtuvieron los valores más altos para los tres cultivares, dichas diferencias son significativas estadísticamente. En el ensayo de ABTS+ los valores para los extractos acuosos oscilaron entre 11.2 μmol ET/mg, en Sharpblue y 16.5 μmol ET/mg en Biloxi. El valor medio fue 13.6 μmol ET/mg en los extractos metanólicos, los valores obtenidos fluctuaron entre 18.5 μmol ET/mg en Misty y 26.1 μmol ET/mg en Biloxi. La media fue de 22.3 μmol ET/mg. Los resultados obtenidos son más altos a los que reportaron Ogawa y col. (2006) (14 μmol ET/mg). Asimismo, los valores 58 encontrados son más altos que los encontrados por Sellapan y col. (2002), en el híbrido de la especie V. corymbosum L. cultivado en Georgia, USA, (20.60 μmol ET/mg) y para el cultivar Sharpblue (14.83 μmol ET/mg). Con el ensayo de ABTS+ los valores más altos (para ambos tipos de extractos) se observaron en Biloxi. Estas diferencias son estadísticamente significativas en Misty y Sharpblue, lo cual sugiere que el cultivar tuvo influencia en la capacidad antioxidante de ambos tipos de extract. Con el extracto metanólico de los tres cultivares se obtuvo la mayor capacidad antioxidante; las diferencias observadas en para ambos métodos con respecto al tipo de extracto son indicativas de que el poder de extracción de cada solvente es variable, y que los fenólicos antioxidantes presentan diferente solubilidad; de la misma manera, los compuestos antioxidantes presentan diferente grado de reacción con los radicales libres usados en ambos ensayos. Por ejemplo, el radical DPPH presenta mayor solubilidad en solventes orgánicos, especialmente etanol; esto es una limitante cuando se interpreta el papel de los antioxidantes hidrófilos (Wojdlo y col. 2007). Cuadro 11. Actividad antioxidante por ABTS+ y DPPH de cultivares de arándano ABTS+ DPPH TEAC µmol/mg fd Cultivar TEAC µmol/mg fd Acuoso Metanólico Acuoso Metanólico Biloxi 17.3± 0.89 aA 27.0 ± 1.1 aB 16.5 ± 1.1 aA 26.1 ± 1.5 bB Misty 11.6 ± 2.2 bA 20.3 ± 3.5 bB 13.3 ± 1.1 bA 18.5 ± 5.6 aB Sharpblue 14.3 ± 3.2 bA 23.6 ± 2.5 bB 11.2 ± 1.5 bA 22.3 ± 3.1 aB Media 14.4 ± 2.09 23.6 ± 2.3 13.6 ± 1.2 22.3 ± 3.4 TEAC; Actividad antioxidante expresada en equivalentes de Trolox µmol/mg de fruto deshidratado. Los resultados mostrados son en 1 mg de arándano deshidratado. Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey) por frutilla. Letras diferentes por renglón indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey) por extracto. 59 De manera importante, la actividad antioxidante de los flavonoides depende de la estructura y sustitución de grupos hidroxilo en el anillo B, existen reportes que indican que los flavonoides y antocianinas con mayor número de grupos OH en el anillo B presentan una actividad antioxidante más fuerte. Las antocianinas presentan el siguiente orden de poder antioxidante según el número de OH del anillo B; delfinidina (3´,4´,5´-OH) > cianidina (3´,4´OH) > pelargonidina (3´, 4´- OH). Por esta razón, las agliconas de flavonoides y antocianinas son importantes en la capacidad antioxidante en los arándanos, además del contenido total de fenólicos, flavonoides y antocianinas (Noda y col. 2002; Ogawa y col. 2008). Es importante mencionar que el DPPH presenta mayor selectividad por los grupos OH que el ABTS+ (Nanjo y col. 1999), por lo tanto DPPH no reacciona con flavonoides que no contengan grupos OH en el anillo B, así como con los ácidos fenólicos que sólo contengan un grupo OH (Roginsky y Lissi, 2005; Von Gadov y col. 1997; Yokozawa y col., 1998). El ensayo DPPH mostró valores más altos respecto a ABTS+, se puede decir que los extractos de los arándanos pueden contener antioxidantes fenólicos con grupos OH en el anillo B. Esto coincide con lo que reporta Duthie y Crozier (2000) que estudiaron la actividad antirradical de flavonoides en relación a su estructura y concluyeron que en gran medida la posibilidad de reacciones antirradicales depende de los sustituyentes hidroxilo que contenga específicamente el anillo B. 60 6.4 Correlaciones 6.4.1 Correlación fenoles totales y capacidad antioxidante En las Figuras 14 A, B, C, D se ilustran las correlación entre fenoles totales de extracto acuoso y metanólico con DPPH y ABTS+. Sin embargo, se esperaba una correlación positiva y significativa, lo cual no ocurrió. Se observa una correlación lineal y débilmente significativa para fenoles totales en extracto acuoso y DPPH, donde el coeficiente de correlación fue r = 0.25. Se aprecia que la dispersión de los valores obtenidos es muy notoria, lo cual se refleja en el coeficiente de correlación. Se observa una correlación lineal negativa y significativa para fenoles totales en extracto metanólico vs. DPPH, el coeficiente de correlación fue r = 0.79, lo cual indica que las muestras que tuvieron una menor concentración de fenoles totales mostraron un mayor potencial antioxidante. Es importante recordar que en los extractos crudos existe una mezcla de antioxidantes y existen efectos de interacción (sinergismo y antagonismo) entre los compuestos de la planta (Harborne, 1980; Halvorsen, 2002), este hecho puede estar vinculado a los resultados obtenidos. Para fenoles totales extracto acuoso vs. ABTS+ el coeficiente de correlación fue r = 0.85, como se esperaba es la correlación fue significativa. Esta correlación lineal, positiva y significativa fue observada por Sellapan y col. (2002), para arándano cultivado en Georgia, reportaron una r = 0.98. Para fenoles totales de extracto metanólico vs. ABTS+ se encontró una correlación significativa y positiva, el coeficiente de correlación fue similar a la correlación que se observó entre fenoles totales extracto acuoso vs. ABTS+, r = 0.85. Esta correlación es comparable a la se reportaron en otras plantas y frutos. Dudonné y col. (2009) evaluaron algunas plantas de interés industrial usando diferentes ensayos como DPPH, ABTS+, FRAP, ORAC y encontraron una correlación positiva y significativa entre fenoles y capacidad antioxidante (DPPH, ABTS+, FRAP), los coeficientes de correlación fueron r = 0.93, 0.96 y respectivamente. 61 0.90, DPPH- Fenoles totales extracto acuoso Y = 8.87695 x + 0.38272 r = 0.25 B DPPH - Fenoles totales extracto metanólico Y = 39.6901 x - 0.98836 r = - 0.79 C ABTS+ - Fenoles totales extracto acuoso Y = - 1.3454 x + 1.2547 r = 0.85 D ABTS+ - Fenoles totales extracto metanólico Y = 6.72039 x + 0.7994 r = 0.85 Figura 14. Correlación entre fenoles totales con capacidad antioxidante (DPPH y ABTS+) en extracto acuoso y metanólico de arándano 62 Por su parte Prior y col. (1998) reportaron un coeficiente de correlación significativo para diferentes cultivares del genero Vaccinium usando el ensayo de ORAC, r = 0.85. De los resultados obtenidos, se puede decir que la correlación entre fenoles totales y capacidad antioxidante es significativa, a excepción de fenoles totales en extracto acuoso vs. DPPH. La significancia de esta correlación concuerda con Cao y Prior (1997) que observaron que los fitoquímicos responsables de la capacidad antioxidante en frutillas son, principalmente flavonoides, antocianinas y ácidos fenólicos. Diversos estudios sugieren una relación directa entre el contenido de fenólicos y la capacidad antioxidante, Kähkönen y col. (1999) estudiaron un grupo de plantas con potencial nutracéutico (frutillas, vegetales, semillas), encontraron que las frutillas contenían una mayor concentración de compuestos fenólicos y poseían a su vez la mayor capacidad antioxidante del grupo de plantas analizadas, además los flavonoides y ácidos fenólicos como elágico y ferúlico estaban en mayor proporción. Sin embargo, Heinonen y col. (1998) no encontraron correlación entre fenólicos y capacidad antioxidante en vinos y licores de frutas, lo cual puede indicar que los valores obtenidos en cada uno de los métodos se pueden diferir según la reacción química de cada método y los constituyentes de los alimentos analizados. 6.4.2 Correlación ABTS+ y DPPH La correlación entre ABTS+ vs. DPPH se ilustra en la Figura 15. El coeficiente de correlación fue débil r = 0.53 este valor indica una correlación media. Los resultados muestran se puede considerar que ambos métodos pueden estimar la capacidad antioxidante de los arándanos. Dudonné y col. (2009) obtuvieron un coeficiente de correlación de 0.9 al comparar ABTS+ contra DPPH en varias plantas con potencial nutracéutico de interés industrial. 63 ABTS+ - DPPH Y = 6.6792 x + 0.78457 r = 0.53 Figura 15. Correlación entre ABTS+ Y DPPH Es importante considerar ciertos aspectos agronómicos a los que debieron ser sometidas las plantas que analizamos; como por ejemplo el sistema de riego empleado, estrés ambiental, temperatura y nutrientes del suelo, clima, disponibilidad de riego, luz solar; factores que puuden influir en la capacidad antioxidante de los arándanos cultivados en Michoacán (Parr y Bowell, 2000). Por ejemplo, se ha comprobado que si la planta se expone en mayor grado a la luz solar, se incrementa la síntesis de antocianinas (Pascual y Sanchez, 2008). 64 6.5 Caracterización de antocianinas por HPLC El contenido de antocianinas totales por HPLC en los arándanos fue de 7.17 a 16.32 mg/g , los valores son para Misty y Biloxi, respectivamente. El valor medio fue 10.83 mg/g. Al comparar los resultados de antocianinas totales (espectofotométrico) con el contenido por HPLC se observaron concentraciones más altas para el método espectrofotométrico, el factor de correlación fue significativo(r = 0.90). Los resultados obtenidos son superiores a los que reporta Hosseinian y Beta (2007) para arándano cultivado en Canadá. Por otro lado, Nocoué y col. (2007) reportan valores entre 21.1 y 28.9 mg/g de peso seco para V. angostifolium y V. mystilloides. Para arándano cultivado en Europa reportaron contenidos más altos entre, 21.4 y 49.8 mg/ g de peso seco (Gao y Mazza, 1999). Se detectaron las seis antocianinas principales (cianidina, pelargonidina, petunidina, delfinidina, peonidina, malvidina) por HPLC (Figura 18). Las principales antocianinas fueron cianidina, malvidina y peonodina. Cabe destacar, en el presente trabajo se identificó pelargonidina, trabajos previos no reportan concentraciones de esta antocianina en frutos del género Vaccinium (Nicoué y col., 2007). Se puede decir que los arándanos cultivados en Michoacán presentan características bióticas y abióticas que tuvieron cierta influencia en la síntesis de esta antocianina, asimismo en las concentraciones más altas o bajas de las otras cinco antocianinas evaluadas en el estudio. Siriwoharn y col. (2004) encontraron gran variabilidad en el contenido de antocianinas en zarzamora (Rubus L); además está influenciado por cultivar. 65 Cuadro 12. Caracterización del contenido de antocianinas en los cultivares de arándano. Cultivar Cianidina Delfinidina Petunidina Peonidina Pelargonidina Malvidina (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) Biloxi 7.77± 0.48 a 3.54 ± Misty 0.48 b 4.31 ± Sharpblue 0.17 Media b 5.20 ± 0.37 Total (mg/g) 1.90± .0.32 a 0.34 ± 0.17 a 2.64 ± 0.23 a 0.19 ± 0.02 a 3.48 ± 0.42 a 16.32 0.88 ± 0.22 b 0.49 ± 0.14 a 0.85 ± 0.06 b 0.08 ± 0.02 a 1.33 ± 0.25 b 7.17 b 0.87 ± 0.09 b 0.89± 0.08 b 1.26 ± 0.06 b 0.1± 0.01 b 9.00 b 0.57 ± 0.13 1.58 ± 0.11 1.21 ± 0.21 a 1.57 ±0.11 0.12± 0.016 2.12 ± 0.26 a 10.83 Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado; Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). El cultivar Biloxi mostró las concentraciones más altas para las antocianinas analizadas, seguida de Sharpblue y Misty. Estadísticamente las diferencias encontradas entre cada variedad para el contenido de cada una de las seis principales antocianinas son significativas (Cuadro 12). Los valores para la concentración de cianidina fluctuaron entre 3.54 y 7.77 mg/g, malvidina mostró concentraciones entre 1.33 y 3.48 mg/g, Peonidina 0.85 y 2.64 mg/g, petunidina 0.34 y 0.89 mg/g, pelargonidina 0.08 y 0.19 mg/g, (Misty y Biloxi, respectivamente); delfinidina 0.87 y 1.90 mg/g, el valor más bajo para Sharpblue y el más alto para Biloxi Los valores encontrados fueron comparables con los que reportan Ogawa y col. (2008) para Vaccinium spp cianidina 0.44 mg/g y peonidina 4.08 mg/g. 66 Figura 16. Cromatograma obtenido por HPLC de las antocianinas analizadas en arándano del cultivar Biloxi detectadas a 520nm. (1) Cianidina; (2) Pelargonidina; (3) Petunidina; (4) Delfinidina; (5) Peonidina; (6) Malvidina. 6.6 Caracterización de flavonoides por HPLC El contenido de flavonoides totales por HPLC fue de 4.4 a 8.98 mg/ g, el más alto para Biloxi y el más bajo para Misty (Cuadro 13). La media fue de 6.19 mg/g. Los resultados obtenidos son más altos a los encontrados por el método espectrofotométrico, estadísticamente se encontraron diferencias significativas entre ambos métodos. Los flavonoides analizados por HPLC fueron quercetina, kaempferol y miricetina (Figura 19). El flavonoide sobresaliente en los cultivares de arándano fue quercetina, lo valores fluctuaron entre 2.7 y 4.38 mg/g, los valores son más altos a los que reportan Sellapan y col. (2002), 9.85- 14.60 mg/100g de fruto. El kaempeferol mostró concentraciones entre 0.6 y 2.7 mg/g, estos valores son más altos con lo que reporta Hakkinen y col., (1999; 1999a), 3.72 - 3.17 mg/100g de fruto congelado. La miricetina no fue encontrada en el cultivar Sharpblue, esto coincide con lo que reporta Määttä- Riihinen y col. (2004) y Sellapan y col. (2002). Los valores mostrados para miricetina fluctuaron entre 1.1 y 1.9 mg/g, los cuales son similares a los que reporta Kader y col. (1996). 67 Cuadro 13. Caracterización del contenido de flavonoides en arándanos Cultivar Quercetina Kaempferol Miricetina (mg/g) 2.7 ± .0.32a (mg/g) Biloxi 4.38 ± 1.8a (mg/g) Total 1.9 ± 0.5a 8.98a Misty 2.7 ± 0.7b 0.6 ± 0.2b 1.1 ± 0.14a 4.4 b Sharpblue 3.9 ± 0.5a 1.3 ± 0.1b ND 5.2b Media 2.99 ± 1.0 1.5 ± 0.62 1.0 ± 0.21 6.19 (mg/g) Los resultados mostrados son en 1 g de arándano deshidratado ND: no detectado Los valores representan las medias de tres réplicas ± DS Desviación Estándar. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). Figura 17. Cromatograma obtenido por HPLC de los flavonoides analizados en arándano del cultivar Biloxi detectados a 260nm. (1) Quercetina; (2) Kaempferol; (3) Miricetina 68 6.7 Fraccionamiento Se seleccionó el cultivar de arándano con el contenido más alto de compuestos fenólicos y con mayor capacidad antioxidante y se obtuvieron fracciones. El material que mostró dichas características fue Biloxi, esto se corroboro por medio de análisis estadístico, que indico que efectivamente había diferencia significativa respecto a Misty y Sharpblue. El fraccionamiento se realizó por medio de una cromatografía en columna (Biotage Flash), se obtuvieron 40 subfracciones. Por medio de una cromatografía en capa fina se eligieron las comunes (presentaron similitud en el patrón cromatográfico)y se combinaron, se obtuvieron cinco fracciones; la fracción 1 (F1) (1-8), fracción 2 (F2) (9-17), fracción 3 (F3) (18-27), fracción 4 (F4) (28-40), fracción 5 (F5) (metanol con el que se lavo la columna). Las fracciones obtenidas fueron caracterizadas por HPLC y GC/MS y también utilizadas para realizar el ensayo de actividad antioxidante utilizando un cultivo celular. 6.8 Caracterización de compuestos fenólicos en los extractos ASE de arándano 6.8.1 Caracterización de antocianinas por HPLC Las antocianinas en los extractos ASE de arándano y en las fracciones utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante se muestran en el Cuadro 14. La antocianina predominante fue cianidina-3-O-rutinosido, se encontraron concentraciones entre 37.48 y 56.75 mg/g de peso seco, el valor más bajo para Misty y el más alto para Sharpblue, para las fracciones la concentración fluctúo entre 21.1 y 21.64 mg/g, el valor más bajo fue para la F1 y el más alto para F2 y F3. La segunda antocianina predominante fue malvidina-3-O-glucósido, las concentraciones fueron de 28.19 y 49.09 mg/g, el primer valor para Misty y el 69 segundo para Sharpblue, en las fracciones fue detectada en F1 5.88mg/g y F2 5.95 mg/g. Peonidina-3-O-galactósido fue la siguiente antocianina predominante las concentraciones fluctuaron entre 31.99 y 36.44, para Misty y Sharpblue, respectivamente. Los resultados obtenidos son similares a los que reporta Hosseinian y Beta (2007) para arándano silvestre de Canadá, a excepción de la Cianidina-3-O-rutinosido, que no fue detectada. Martinelli y col. (1992) reportaron que las antocianinas de los miembros del género Vaccinium presentan en su estructura mayoritariamente glucosa, galactosa. En el contenido total de antocianinas fue más alto en el extracto ASE, en comparación con el método espectrofotométrico y el extracto hidrolizado en el que se determinaron las seis antocianinas principales. Los valores del contenido total de antocianinas en el extracto ASE fluctuaron entre 149.0 y 228.3 mg/g para Misty y Sharpblue, respectivamente. Sin embargo, en el método del extracto hidrolizado se lograron identificar las seis antocianinas principales en los arándanos y en el método del extracto ASE no fue posible identificarlas. De manera importante, se logró identificar la pelargonidina, estudios previos reportan que no han encontrado dicha antocianina en arándano (Martenilli y col., 1992; Hosseinian y Beta, 2007; Nicoué y col., 2007). También en el extracto hidrolizado se detectaron delfinidina, malvidina, pelargonidina, petunidina en el extracto ASE no fue posible identificarlas. Cabe mencionar que las diferencias entre ambos métodos son estadísticamente significativas. En cuanto al cultivar se encontraron diferencias significativas. En el extracto ASE, Sharpblue mostró el mayor contenido de antocianinas, en el extracto hidrolizado el contenido más alto lo mostró Biloxi; esto se puede deber a las condiciones de extracción de ambos métodos y las condiciones usadas en el HPLC. 70 Cuadro 14. Caracterización de antocianinas en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco) Antocianina Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 F3 F4 F5 ND ND ND ND ND ND ND ND ND Delfinidina Del-3- glu 29.64a 16.26b 37.55a 8.7c 7.12c 3.54d ND Cianidina 9.83b 15.39a 9.18b 9.43b ND ND 12.27a 16.26 a Cia-3-glu 20.66 a Cia-3-rut 44.06a 37.48b Cia-3-gal ND Peonidina Peo-3-gal 32.87 Peo-3-glu ND Mal-3-glu 5.87 b 16.90 a ND a 31.99 a ND 33.42a 28.19a 15.23 a 17.86 a 1.7 c 16.0 4.88 a 56.75c 22.1d ND ND 36.44 a 27.05 b ND ND 26.35 b 26.66 ND d ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 21.64d 21.64d ND b 6.25 b ND ND ND ND ND ND 49.09b 5.88c 5.95c ND ND ND Malvidina ND ND ND ND 16.84a ND ND ND Petunidina ND ND ND ND ND ND ND ND Pelargonidin ND ND ND ND ND ND ND ND 228.3c 90.7d Total 186.8a 149.0b 92.24d 31.44e 26.66e ND ND; No detectado Los valores representan la media de dos replicas. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). Del-3-glu; Delfinidina-3-O-glucósido, , Cia-3-gal; Cianidina-3-O-galactósido, Cia-3-glu; Cianidina-3O-glucósido, Cia-3-rut; cianidina-3-O-rutinosido, Peo-3-gal: Peonidina-3-O-galactósido, Peo-3-glu; Peonidina-3-O-glucósido, Mal-3-glu; malvidina-3-O-glucósido. 71 6.8.2 Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos por HPLC Los flavonoides y ácidos fenólicos en los extractos ASE de arándano y en las fracciones utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante se muestran en el Cuadro 15. El flavonoide sobresaliente en los extractos ASE fue quercetina, 75.12 mg/g fd, el segundo fue miricetina (16.37 a 57.68 mg/g) el valor más alto fue para Sharpblue ye el más bajo para Biloxi. No fue posible comparar los resultados obtenidos ya que los reportes que existen son de fruto fresco, en el presente estudio se analizó arándano liofilizado en polvo. Sellapan y col., (2002) analizaron arándanos frescos y obtuvieron 6.72-6.98 mg/100 g de fruto miricetina., 2.52-3.17 mg/100g de kaempferol 9.70-14.60 mg/100 de quercetina. Cabe mencionar que no fue posible detectar catequina y epicatequina, ya que al parecer se traslaparon al momento de ser analizadas en el HPLC. Se probaron diversas condiciones en el cromatógrafo, pero como tienen un espectro de UV muy similar, no fue posible distinguir ambos compuestos. Catequina y epicatequina son enantiómeros y pueden sufrir reacciones de isomerización durante la extracción, las cuales se favorecen en pH ácidos, el arándano se caracteriza por ser un fruto ácido, también puede haber rompimiento de enlaces y degradación de moléculas (Lea, 1979). En cambio en las fracciones de Biloxi, si fue posible detectar catequina en F2 (9.77 mg/g) y epicatequina (2.04-4.09 mg/g F1 y F2, respectivamente) debido a que en el fraccionamiento se rompieron enlances de dímeros, trímeros o polímeros de catequinas y fueron disponibles para su identificación en el cromatógrafo. Por otro lado en F1 se detectó kaempferol, en el extracto ASE de Biloxi no fue detectado. También se detectó miricetina en F1, F2, F3 en concentraciones de 4.35-4.44 mg/g y quercetina se detectó en F1 (6.8 mg/g ps) y F2 (6.7 mg/g). El ácido fenólico más sobresaliente en los extractos ASE fue el ácido ferúlico en concentraciones de 74.99 y 79.0 mg/g el valor más bajo fue para Biloxi y el más alto para Misty. El segundo ácido fenólico sobresaliente fue el ácido cafeico, 69.23 y 71.06 mg/g ps en Biloxy y Sharpblue, respectivamente. No fue 72 posible comparar los resultados obtenidos ya que los reportes de ácidos fenólicos en arándano son de fruto fresco y se analizo arándano liofilizado en polvo. Ayaz y col. (2005) reportaron el contenido de ácidos fenólicos en arándano fresco cultivado en Turquía, los principales ácidos fenólicos reportados son: cinámico, gálico, protocatecuico, siringico y cafeico, los valores que reportan son menores a los encontrados en el presente trabajo. Por su parte Mattila y col. (2006) reportaron los ácidios ferúlico y cafeico como los mayoritarios en el arándano, lo cual coincide con nuestros resultados. Sellapan y col. (2002) analizaron un grupo de híbridos de la especie V. Corymbosum incluyeron Sharpblue y reportaron el ácido cafeico como el mayoritario en dicho cultivar, que también coincide con los resultados obtenidos. Por otro lado, Mattila y Kumpulainen (2002) analizaron el contenido de ácidos fenólicos en algunos vegetales y frutos como en fresa y frambuesa roja reportaron a los ácidos p-hidroxi benzoico y p-coumárico como ácidos mayoritarios. En las fracciones el ácido fenólico predominante fue el gálico, el cual no se detectó en el extracto de Biloxi, mostro concentraciones de 6.5 mg/g ps en F1 y 6.9 mg/g ps en F2, la identificación del ácido gálico y otros compuestos fué por el proceso de purificación en la cromatografía, de esta manera hubo rompimiento de enlaces entre los compuestos que formaban complejos y de los ácidos fenólicos que formaban conjugados, los compuestos fueron disponibles para la detección en el cromatógrafo. En las fracciones también se identificaron los ácidos cafeico, ferúlico y elágico. Las diferencias encontradas fueron estadísticamente diferentes. 73 Cuadro 15. Caracterización de flavonoides y ácidos fenólicos en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (mg/g de peso seco) Compuesto Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 Kaempferol ND ND ND 2.97 ND Miricetina Quercetina Catequina Epicatequina Ácido cafeico 16.37 a 75.12 a ND ND 71.05 71.06 4.36 b b 4.4 9.77 a 2.04 a 1.70 6.7 c c ND ND a ND c 6.8 ND ND a 57.68 b ND ND ND 69.23 57.49 b F3 b 4.09 a 1.69 b 4.35 c ND ND F4 F5 ND ND ND ND ND ND ND ND 3.55 a ND ND 1.68 b ND ND ND ND Ácido sinápico ND ND ND ND ND ND Ácido ferúlico 74.99a 79.0a ND 2.19b 2.19b 2.20b ND ND Ácido elágico a b b b ND ND 16.37 13.45 a 13.09 a 3.75 3.72 3.66 Ácidop-coumárico ND ND ND ND ND ND ND ND Ácido vanílico ND ND ND ND ND ND ND ND Ácido siríngico ND ND ND ND ND ND ND ND ND a a ND ND ND Ácido gálico ND ND 6.5 6.9 ND: No detectado Los valores representan la media de dos replicas. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). 74 6.8.3 Caracterización de estilbenos por CG/MS Los estilbenos detectados en los extractos ASE de arándano y en las fracciones utilizadas para el ensayo de actividad antioxidante basado en cultivo celular se muestran en el Cuadro 16. En los cultivares de arándano el estilbeno predominante fue desorapontigenina con valores entre 18.86 y 39.03 µg/g de peso seco, el valor más alto para Biloxi y el más bajo para Misty, no existen trabajos previos donde reporten la desoxirapontigenina en frutos del género Vaccinium. Asimismo, el cis- trimetoxiestilbeno fue detectado en Sharpblue (2.101 µg/g) igualmente no existen estudios previos que indiquen la presencia de este estilbeno en arándano. Pteroestilbeno se encontró en concentraciones de 5.58 y 6.26 µg/g para Sharpblue y Misty, respectivamente. El pteroestilbeno no fue detectado por Rimando y col. (2004) en arándano cultivado en Carolina del Norte, USA. Sin embargo, Adrian y col. (2000) reportaron en uva niveles de pteroestilbeno de 0.24.7 µg/g y Pezet y Pont, (1998) reportaron concentraciones de pteroestilbeno las variedades de uva Gamay y Pinot Noir de 14–74 ng/g y 120 y 530 ng/g de fruto fresco. Se encontraron concentraciones de resveratrol entre 0.15 a 0.39 µg/g de peso seco, el valor más bajo para Sharpblue y el más alto para Biloxi. resultados de resveratrol mostraron Los valores dentro del rango que reportaron Rimando y col. (2004) (327-853 ng/g de fruto seco) para arándano cultivado en Corvallis, Oregon, USA; también, son similares a las que reportaron Rimando y Barney (2005) para frutos del género Vaccinium de Idaho, Washington y Wyoming, USA (0.26 y 4.67 µg/g de frutillas liofilizada). El pteroestilbeno se detectó en concentraciones más altas de las que reportaron en dicho estudio, dichos autores reportaron 0.25 y 0.61 µg/g de frutillas liofilizada. En F1, F2, F3 se detectaron pinoestilbeno, pteroestilbeno, desoxyrapontigenina y resveratrol. El más sobresaliente fue pteroestilbeno, 0.843.374 µg/g, para F2 y F1, respectivamente. Valores entre 1.301 y 1.505 µg/g (F1 y F2, respectivamente se observaron de resveratrol). Pinoestilbeno no se detecto en 75 Biloxi, pero si en las fracciones en concentraciones de 0.674 y 0.884 µg/g (F3 y F1, respectivamente). Finalmente la desoxirapontigenina fluctuó entre 0.122 y 0.218 µg/g, el más bajo para F3 y el más alto para F1. Los resultados obtenidos no son comparables ya que no existen trabajos previos donde describan un fraccionamiento en extracto de arándano para identificación de estilbenos. Cuadro 16. Caracterización de estilbenos en extractos ASE de arándanos y en las fracciones (µg/g de peso seco) Compuesto Biloxi Misty Sharpblue F1 F2 F3 F4 F5 t-Trimetoxiestilbeno ND ND ND ND ND ND ND ND c-Trimetoxiestilbeno ND ND 2.101a ND ND ND ND ND Trimetoxiestilbeno Pinoestilbeno Pteroestilbeno Desoxirapontigenina Resveratrol ND ND ND 6.06 39.03 0.39 ND ND a a a 6.26 4.23 a ND a 18.86 0.19 a a b 5.58 0.884 a ND 0.15 b 3.374 b 0.218 b 1.301 c ND 0.683 ND a 0.845 0.157 c b 1.504 c 0.674 ND ND a ND ND c ND ND b ND ND c ND ND 0.854 0.122 1.361 ND: No Detectado Los valores representan la media de dos replicas. Letras diferentes por columna indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). 76 6.9 Evaluación de potencial antioxidante por medio cultivo celular El potencial de la actividad antioxidante evaluado por medio de un cultivo celular se reporta como concentración inhibitoria 50 (CI50) (µg/ml), que representa la media de la máxima concentración inhibitoria de la sustancia que se está analizando (Cuadro 17). Los extractos de los arándanos y las fracciones utilizadas en el ensayo basado en células fueron obtenidos en un aparato de extracción automática (ASE, siglas en ingles Accelerated Solvent Extraction). En este aparato se presento una extracción más alta y eficiente de compuestos nutracéuticos en comparación con la extracción manual (Papagiannnopoulos y col., 2001). La actividad antioxidante de los extractos (obtenidos en el aparato ASE) y las fracciones fue evaluada utilizando el cultivo celular HL-60 (células de la línea promielocítica humana) y el compuesto fluorescente DCFH-DA (diacetato 2´,7´dicloro- fluoresceína). Este método se basa en examinar directamente la habilidad del material que se está probando para penetrar las células e inhibir la oxidación provocada por los radicales libres de DCFH a DCF. DCFH-DA es un compuesto no fluorescente que se difunde dentro de las células. Las esterasas citoplasmáticas hidrolizan DCFH-DA a DCFH que es oxidado a DCF (2´,7´diclorofluoresceína) y fluórese. La actividad antioxidante de las muestras es determinada midiendo el nivel de DCF producido comparado con controles. Los valores de CI50 que mostraron los extractos ASE de arándano fueron de 0.66 a 1.8 µg/ml (a una concentración de 10 mg/ml) el valor más bajo fue para Sharpblue y el más alto para Misty. Comparando estos resultados con los de la capacidad antioxidante por DPPH Y ABTS+, Misty mostró la menor capacidad antioxidante en los ensayos químicos y también la menor actividad antioxidante en el compuesto fluorescente. Biloxi mostró una fuerte actividad antioxidante ya que el valor de CI50 fue 1.1 µg/ml, Sharpblue mostró una potente actividad antioxidante para el ensayo DCFH, estadísticamente mostró diferencias significativas. 77 Cuadro 17. Actividad antioxidante de extractos ASE de cultivares de arándano y fracciones Muestra 1 Actividad antioxidante [CI50 µg/ml] Biloxi 1.1 1 a Misty 1.8 1 a Sharpblue 0.66 1 b F1 NA F2 2.5 2 c F3 0.3 3 d F4 0.3 3 d F5 6.2 2 e Trolox 0.28 3 d (5mg/ml), 2 (10mg/ml), 3 (2 mg/ml), NA, No Activo. Los valores representan las medias de dos réplicas Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05 por la prueba de Tukey). Los valores encontrados para la CI50 son más bajos a los que reportan Lalancette y col. (2009) para jugo de arándano (116 µg/ml); para el ensayo utilizaron la línea celular L-929 de fibrosarcoma. Por otro lado, Wolfe y Liu (2007) evaluaron la capacidad antioxidante de arándano, arándano rojo, manzana, uva roja y manzana verde y obtuvieron valores de la concentración efectiva cincuenta (CE50) (también evalúa la media del efecto máximo de un compuesto) para arándano entre 3.44 y 10.81 mg/ml. Wolfe y col. (2008) reportaron la actividad 78 antioxidante de los frutos más comúnmente consumidos en USA, para arándano silvestre, reportaron CE50 (2.53 – 6.77 mg/ml), arándano cultivado, 5.95- 27.0 mg/ml. En ambos estudios utilizaron las células de hepatocarcinoma humano HepG2. Los valores de CI50 para las cinco fracciones de Biloxi fluctuaron entre 0.3 y 6.2 µg/ml. La fracción 1 no mostró actividad antioxidante en el ensayo. Las fracciones 3 y 4 mostraron valores de CI50 0.3 µg/ml, comparables con el antioxidante Trolox CI50 0.28 µg/ml, utilizado como control en el mismo ensayo. La fracción 2 mostró una CI50 2.5 µg/ml (10mg/ml), indicativa de una considerable actividad antioxidante. La fracción 5 mostró el más alto valor de CI50 6.2 µg/ml (10 mg/ml). Las diferencias encontradas para las fracciones fueron significativas. No existen trabajos previos que describan un fraccionamiento de arándano y una evaluación de la actividad antioxidante para una posible comparación. 6.9.1 Actividad antioxidante de los fenólicos en arándano Los valores de la actividad antioxidante celular para los extractos ASE de arándano fueron de CI50 entre 0.66 y 1.8 μg/ml, el valor más bajo para Sharpblue y el más alto para Misty, ambos extractos se analizaron a una concentración de 10 mg/ml. Estadísticamente las diferencias encontradas para los tres cultivares son significativas. Es evidente que Sharpblue mostró mayor actividad antioxidante respecto a Biloxi y Misty. Esto se debe a las diferencias en solubilidad, peso molecular y polaridad, que presentó cada cultivar de arándano, reflejándose en la biodisponibilidad y absorción de la mezcla de compuestos en las células. Estudios previos reportan que los flavonoides presentan alta actividad antioxidante, lo cual se refleja en los resultados obtenidos. Los flavonoides son absorbidos e incorporados en células Caco-2, HepG2, HL-60 miricetina, quercetina y kaempferol son absorbidos (Takamatsu y col., 2003; Yokomizo y Moriwaki, 2006). Biloxi presentó mayor concentración de fenólicos como flavonoides y 79 estilbenos en comparación con Sharpblue; sin embargo Biloxi presentó menor actividad antioxidante respecto a Sharpblue. Una posible explicación es que la actividad antioxidante está determinada por la estructura que presentan los compuestos (Yazaki y col., 2008). Wolfe y Liu, (2007) reportaron que algunos flavonoides como catequina y epicatequina, ácido ferulico y resveratrol tienen baja actividad antioxidante en el modelo de estudio con células HepG2. Los resultados obtenidos en este trabajo coinciden de cierta manera, ya que Biloxi mostró mayor concentración de ácido ferulico, quercetina, resveratrol y los análogos del resveratrol desorapontigenina y pteroestilbeno; sin embargo, la actividad antioxidante fue menor. Por otro lado, pudo haber existido una serie de reacciones en la mezcla de fenólicos antioxidantes dando, lugar a compuestos que no fueron absorbidos por las células utilizadas en el ensayo. Otro factor que pudo haber influido es la actividad prooxidante que presentan algunos fenólicos como los flavonoides, antocianinas, ácidos fenólicos y estilbenos que pueden llegar a producir compuestos que dañan los componentes celulares como ADN, existen estudios en mamiferos y bacterias que indican efectos de mutagenicidad y genotoxicidad de los flavonides, dichos efectos son dependientes de la concentración (Trueba, 2003). Lalancette y col. (2009) analizaron la actividad antioxidante en células HL60 de algunos frutos, vegetales y compuestos puros; incluyeron kiwi, fresas, melocotón, arándano, brocoli y zanahorias, así como α-tocoferol, ácido cafeico, ácido gálico y quercetina. Encontraron efecto prooxidante en el brócoli y la zanahoria, asimismo encontraron alto contendió de fenólicos en ambos vegetales. Aplicaron un tratamiento térmico en ambos vegetales y volvieron a realizar en ensayo, sorprendentemente después de dicho tratamiento aumento la actividad antioxidante. Esto lo corroboraron en otras dos líneas celulares humanas WS-1, A549 y DLD-1. Una posible explicación a dicho fenómeno es que al aplicar temperatura alta puede producir isomerización, rompimiento de enlaces o formación de nuevos flavonoides u otros compuestos fenólicos diferentes a los que originalmente existieron y que tengan mayor permeabilidad y actividad celular (Rodríguez y col., 2008). 80 Las fracciones de Biloxi presentaron en el siguiente orden decreciente actividad antioxidante F3, F4 > F2 > F5. Sorprendentemente, F1 no mostró actividad antioxidante en el ensayo, a pesar de que fue la fracción que mostró el más alto contendido de fenólicos como antocianinas, flavonoides, ácidos fenólicos y estilbenos, esto se puede deber a los efectos prooxidantes de la mezcla de fenólicos presentes o simplemente los fenólicos no lograron penetrar las células HL-60. En F3 y F4 se observó el mismo valor de CI50 0.3 μg/ml a una concentración de 2 mg/ml, comparando este valor con el que presentó el Trolox 0.28 μg/ml que fue el control positivo. En el ensayo F3 y F4 se observó una fuerte actividad antioxidante; sin embargo la composición de fenólicos en ambas fue totalmente diferente, por ejemplo el contenido de antocianinas, flavonoides, ácidos fenólicos y estilbenos en F3 fue más alto; en F4 solo se detecto cianidina-3-Ogalactósido (26.66 μg/ml de peso seco), esta fracción presentó el valor más alto de esta antocianina, por lo tanto se puede decir que a la cianidina-3-O-galactósido se atribuyó la fuerte actividad antioxidante. F2 mostró un alto contenido de fenólicos en comparación con F3 y F4; sin embargo la actividad antioxidante fue menor, esto se puede deber a los factores ya mencionado previamente, efectos prooxidantes, posibles reacción en la mezcla de compuestos o a que los fenólicos no se difundieron dentro de la célula. Como era de esperarse en F5 no se observó actividad antioxidante ni se detectó ningún fenólico y fue el metanol con el cual se lavó la columna usada en la obtención de fracciones. 81 VII CONCLUSIONES Con el cultivar Biloxi se obtuvo una capacidad antioxidante más elevada y la mayor concentración de fenólicos que con Misty y Sharpblue, lo que puede ser indicativo de que están relacionadas la capacidad antioxidante y la concentración de fenólicos. La capacidad antioxidante de frutos de arándano determinada por DPPH o por ABTS mostró resultados equivalentes, por lo que pueden utilizarse indistintamente bajo las condiciones ensayadas en el presente trabajo. Estando esta capacidad fuertemente correlacionada con la concentración de compuestos fenólicos; esto se observó en ambos tipos de extractos (agua y metanol), lo que indica que estos compuestos son los principales responsables del poder antioxidante. En todos los cultivares se detectó pelargonidina, este es el primer trabajo en el que se describe a este compuesto dentro del perfil de antocianinas de los miembros del género Vaccinium. Sharpblue mostró mayor actividad antioxidante en el cultivo de células HL-60, seguida de Biloxi y Misty; dicha actividad pudo haber estado influenciada por la presencia de antocianinas como cianidina-3-O-glucosido y estilbenos como resveratrol. Sorprendentemente en la fracción 1 no se encontró actividad antioxidante, a pesar del alto contenido de compuestos fenólicos, lo cual sugiere un posible efecto prooxidante de los fenolicos o simplemente no lograron difundirse dentro del citosol celular. 82 Las fracciones 3 y 4 presentaron mayor actividad antioxidante. La fracción 3 alta concentración de antocianinas, flavonoides y estilbenos, específicamente resveratrol; esto permitió identificar cierta relación con el potencial antioxidante. En la fracción 4 sólo se detectó cianidina-3-O-galactósido, lo cual indica que es la responsable del potencial antioxidante de dicha fracción. Los arándanos son cultivados en Michoacán, México durante todo el año, además mostraron un mayor potencial antioxidante comparado con los arándanos cultivados en otros países. El elevado potencial antioxidante de los arándanos cultivados en Michoacán, México, los convierte en frutos altamente nutracéuticos, debido principalmente a las sobresalientes concentraciones de compuestos fenólicos antioxidantes. 83 VIII PERSPECTIVAS Establecer estrategias de mejoramiento para incrementar los niveles de fenólicos en el arándano. Realizar bioensayos de actividad anticancerígena, antimutagénica y antiinflamatoria en cultivos celulares para establecer las dosis a las cuales se obtiene el efecto; así se tendría la posibilidad de utilizar dichos extractos como suplementos nutracéuticos. Realizar ensayos de biodisponibilidad de fenólicos antioxidantes por medio de sistemas in vivo con el fin de establecer posibles dosificaciones. Usar esta investigación como base para tratar de seleccionar materiales con mayor potencial nutracéutico. Lo anterior generaría un mayor valor agregado a los arándanos producidos en México; simultáneamente la comercialización de este tipo de arándanos tendría mayores oportunidades. 84 IX REFERENCIAS Aalders, l. E., and Hall, I. V. 1975. A study of variation in fruit yield and related characters in two diallels of the lowbush blueberry, Vaccinium angustifolium Ait. Can. J. Genet. Cytol. 17:401-404. Abdel-Aal, E. S. M., and Hucl, P. 1999. A rapid method for quantifying anthocyanins in blue aleurone and purple pericarp wheats. Cereal Chem.. 76:350-354. Adom, K. K., and Liu R. H. 2005. Rapid peroxyl radical scavenging capacity (PSC) assay for assessing both hydrophilic and lipophilic antioxidants. J. Agric. Food Chem. 53: 6572-6580. 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