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COMITÉ DE EDUCACION CONTINUA Y CONTINUADA
COORDINADORA: DRA SILVINA KUPERMAN
PROGRAMA CONSULTA AL EXPERTO
COORDINADORA: DRA GRACIELA LEÓN DE GONZÁLEZ
AUTOMATIZACIÓN EN EL FRACCIONAMIENTO DE LA SANGRE
PROFESOR INVITADO: Bioq Sebastián Oknaian.
Coordinador de Calidad del Centro Regional de Hemoterapia
del Hospital Garrahan. Buenos Aires, Argentina.
[email protected]
AUTOMATIZACIÓN EN EL FRACCIONAMIENTO DE LA SANGRE
INTRODUCCION
En estos últimos años la automatización del fraccionamiento de los componentes se ha
extendido, principalmente en los países de Europa.i Estos sistemas pueden
implementarse en los procesos de producción de componentes de la sangre ya que en
estos se realizan varias acciones manuales repetitivas que pueden ser realizadas por
equipos automáticos. La automatización a su vez mejora la eficiencia y la
estandarización del proceso.
En los procedimientos manuales de fraccionamiento la sangre entera es centrifugada y
los componentes se separan por la diferencia de densidad de cada subcomponente.
Para la producción de concentrados plaquetarios derivados de sangre entera se
utilizan dos métodos: el método de Plasma Rico en Plaquetas y el método a partir de
buffy –coat. En el primero la sangre entera es sometida a una centrifugación liviana
quedando en el sobrenadante un plasma rico en plaquetas que luego de una segunda
centrifugación fuerte, se separan las plaquetas que quedan resuspendidas en 50 a 70
mL de plasma. En el método de buffy–coat, la sangre entera es centrifugada
inicialmente a una gran fuerza centrífuga total quedando los glóbulos rojos en la zona
inferior de la bolsa, en la zona intermedia el buffy–coat y en la parte superior el plasma
pobre en plaquetas. Separados estos componentes, varios buffy–coats pueden unirse
formando un pool que luego de una segunda centrifugación fuerte, se puede disponer
de un pool de plaquetas con cantidades similares a las obtenidas por colectas con
equipos de aféresis de donaciones únicas. Estos pasos son los que se automatizan en
los equipos de fraccionamiento, obteniéndose productos finales más consistentes. Los
equipos poseen detectores de flujo, válvulas y prensas automáticas.
En las primeras generaciones de equipos automatizados, los equipos de conexión
estéril fueron indispensables para la implementación de instrumentos como el
Compomat (Fresenius kabi AG, Bad Homburg, Germany), el Optipress (Fenwal Inc, Lake
Zurich, IL, USA) y el Macopress Smart (Macopharma, Mouvaux, France), utilizados para
la separación de los componentes a partir de sangre entera.ii-iii
En una segunda generación de equipos automatizados se hizo énfasis en la
automatización de la obtención de los concentrados plaquetarios a través del método
de buffy –coat resuspendidos en plasma o soluciones aditivas para plaquetas (PAS).iv
Entre estos equipos se encuentran el sistema OrbiSac y el sistema TACSI de Terumo
BCT. En el sistema OrbiSac los distintos buffy –coats son “pooleados” y mezclados con
plasma o PAS, son centrifugados y filtrados en línea, generando en una sola largada de
aproximadamente 12 minutos un pool de plaquetas de buffy-coat leucorreducido.v El
sistema TACSI tiene la capacidad de realizar los mismos pasos que el sistema OrbiSac
pero procesando simultáneamente seis pools de buffy –coats.vi
Entre los equipos automatizados de tercera generación con capacidad de automatizar
la gran mayoría de los pasos para la obtención de glóbulos rojos, plasma y
concentrados de plaquetas a partir de sangre entera, podemos incluir los sistemas
Atreus viiy Reveos de Terumo BCT. Recientemente se ha adaptado el sistema TACSI con
esas mismas funciones.viii
El sistema Atreus está validado para el procesamiento de sangre entera hasta 24 horas
luego de la colecta. Se disponen de tres programas diferentes: en el protocolo 2C, se
obtiene un plasma leucorreducido por centrifugación, un concentrado de glóbulos
rojos que puede ser leucorreducido manualmente y un residuo de leucocitos que
puede utilizarse para investigación; en el protocolo 2C+ se obtiene una unidad de
plasma, una de glóbulos rojos y una unidad de Buffy –coat. La unidad de Buffy –coat
puede ser procesada por los equipos OrbiSac o TACSI para preparar pooles de
plaquetas leucorreducidas; en el protocolo 3C, se obtiene una unidad de plasma, una
de glóbulos rojos, una unidad de concentrado de plaquetas lista para transfundir y un
residuo de leucocitos.
1. SISTEMA DE FRACCIONAMIENTO AUTOMATICO: REVEOS
El sistema de fraccionamiento Reveos incluye: El equipo Reveos propiamente dicho, la
aplicación de un software Reveos System Manager y las bolsas Reveos para colectar
sangre entera. El equipo Reveos tiene la capacidad de procesar simultáneamente
cuatro unidades de sangre enteraix. El equipo incluye el balanceo y la centrifugación de
las unidades, la separación de los componentes y el sellado de las tubuladuras. Posee
dos protocolos: con el protocolo 2C, a partir de una bolsa de sangre entera se obtiene
una unidad de plasma, una de glóbulos rojos y una unidad de buffy –coat que no se
utiliza para preparar plaquetas para la transfusión; con el protocolo 3C, a partir de una
bolsa de sangre entera se obtiene una unidad de plasma, una de glóbulos rojos, una
unidad de buffy –coat y una unidad interina de plaquetas.
Al colocar las unidades en el equipo Reveos, el rotor empieza a girar separándose en la
primera cubeta la sangre en sus componentes, luego a través de una cámara hidráulica
se extraen el plasma, las plaquetas y los leucocitos residuales. Los glóbulos rojos
quedan en la bolsa principal. Este último paso se repite en las otras tres cubetas. Al
finalizar las extracciones las válvulas del equipo sellan las tubuladuras de los productos
obtenidos. El procesamiento se realiza en aproximadamente 12 minutos. La
información de cada procedimiento se transfiere al software Reveos System Manager.
Con el software el usuario puede configurar el equipo, definir usuarios, exportar datos
y generar informes.
Las bolsas Reveos para colectar sangre entera poseen: una aguja para la punción con
un sistema de derivación de los primeros mililitros; una bolsa principal donde se
almacena provisoriamente la sangre entera; una bolsa con 100mL de solución aditiva
para glóbulos rojos (SAGM) que está unida, con una tubuladura con un filtro de
leucorreducción, a la bolsa principal; una bolsa para el plasma, una bolsa para la
unidad interina de plaquetas y otra pequeña bolsa para almacenar el buffy –coat,
todas estas bolsas unidas a la bolsa principal.
Los concentrados de glóbulos rojos se leucorreducen mezclándolos primero con el
SAGM y luego filtrándolos con el filtro en línea. Las unidades interinas de plaquetas
son un componente temporal intermedio. Estas se utilizan para preparar pools de
plaquetas que se leucorreducen en línea con un set de filtración. Además el pool
puede resuspenderse en plasma o en solución aditiva para plaquetas (PAS). Las
plaquetas que conforman un pool deben poseer el mismo grupo sanguíneo. El sistema
Reveos informa un índice de rendimiento de plaquetas (IPU) que se correlaciona con la
cantidad de plaquetas en cada unidad interina de plaquetas. Con este dato puede
hacerse más efectiva la combinación de las unidades interinas de plaquetas para
garantizar la cantidad mínima de plaquetas en el pool.
El fraccionamiento con el protocolo 3C puede desarrollarse en la modalidad 3C Fresh o
3C Overnight. En la modalidad Fresh la sangre entera es procesada dentro de las 8
horas; en la modalidad Overnight, la sangre entera es conservada a temperatura
ambiente hasta 18 horas y luego se producen todos los componentes mencionados.
2. VALIDACION DEL SISTEMA REVEOS
En el año 2013 en el Centro Regional de Hemoterapia del Hospital Garrahan validamos
el uso in situ del sistema Reveos para el fraccionamiento de la sangre entera (SE) para
producir concentrados de glóbulos rojos (CGR), plasma y pools de plaquetas. Se
comparó las modalidades 3C Fresh y 3C Overnight.
Se procesaron 898 unidades de sangre entera colectadas en las bolsas Reveos: 339
fueron procesadas con protocolo 3C Fresh y 559 fueron procesadas con protocolo 3C
Overnight. Cada unidad de SE fue pesada antes de ser procesada. El volumen de los
CGR leucorreducidos fue calculado dividiendo el peso de los mismos por 1,065. Se
comparó el volumen de los plasmas reportados por el equipo, contra el volumen
calculado dividiendo el peso de los mismos por 1,030. En la siguiente tabla se
muestran los valores obtenidos en el procesamiento de estas unidades:
Total
3C Fresh
3C Overnight
p*
540.2 (20.7)
541.3 (14.8)
539.8 (22.7)
0.28
282.7 (23.7)
285.7 (23.0)
280.8 (23.9)
0.003
245.5 (22.7)
241.7 (23.6)
247.9 (21.8)
<0.0001
252.6 (23.1)
249.5 (22.7)
254.5 (23.2)
0.002
Diferencia de volumen (mL)
7.4 (8.6)
7.6 (8.8)
7.3 (8.5)
0.67
Volumen plaquetario
reportado por Reveos (mL)
30.3 (4.6)
30.5 (4.8)
30.2 (4.6)
0.42
67 (23)
66 (26)
68 (21)
0.22
32.3 (3.7)
31.7 (3.8)
0.04
5.6 (1.3)
5.7 (1.2)
0.22
Peso SE (g)
Media (DS)
Volumen CGR (mL)
Media (DS)
Volumen plasma reportado
por Reveos (mL)
Volumen de plasma manual
(mL)
Indice IPU
Volumen plaquetario
31.9 (3.8)
manual (mL)
Volumen Leucocitos
5.7 (1.2)
Residuales reportado por
Reveos (mL)
*Prueba de t 3C Fresh vs 3C Overnight.
62 (7.3%) unidades interinas de plaquetas de un total de 848 tuvieron un valor de
índice IPU menor a 30.
Se prepararon 141 pools de plaquetas. Peso promedio: 290.2 g (DS 26.1). Se
prepararon 40 pools con protocolo 3C Fresh. Peso promedio: 288.8 g (DS 36.5). Se
prepararon 101 pools con protocolo 3C Overnight. Peso promedio: 290.8 g (DS 20.6).
Eventos: En 30 oportunidades el equipo notificó un error de proceso.
Se evaluaron todas las bolsas Reveos antes de ser usadas, sin observar eventos
relacionados a la inspección visual.
Se realizó el control de calidad en los CGR al día 42 determinando el hematocrito (Hto),
hemoglobina (Hb), hemólisis, Peso, K+, leucocitos residuales (LR) y cultivo.
En los pools de plaquetas se controló, al día 1 o 2, el recuento de plaquetas (RP), pH,
leucocitos residuales (LR), swirling y cultivo.
En los plasmas congelados se controló el peso, concentración de Factor VIII (FVIII),
Factor V (FV), von Willebrand (vW) y fibrinógeno (Fg). Para comparar los resultados de
las dos modalidades se utilizó la prueba t con un p<0.05.
En la siguiente tabla se muestran los valores obtenidos en el control de calidad de 67
CGR:
Todos los CGR
n=67
CGR (3C Fresh)
n=17
CGR (3C Overnight)
n=50
p*
Peso (g) Media (DS)
298.3 (25.6)
305.1 (22.1)
296.1 (26.5)
0.21
Volumen (mL) Media (DS)
280.1 (24.0)
286.5 (20.7)
278.0 (24.9)
0.21
Hto (%) Media (DS)
62.6 (3.7)
63.7 (4.0)
62.2 (3.5)
0.16
Hb total (g) Media (DS)
53.9 (6.9)
55.5 (6.0)
53.3 (7.1)
0.26
148.1 (106.6)
147.5 (107.0)
148.3 (107.6)
0.97
0.28 (0.17)
0.27 (0.19)
0.28 (0.17)
0.81
49.0 (5.7)
50.5 (5.3)
48.5 (5.8)
0.21
Hb libre mg/dL
Media (DS)
Porcentaje de hemólisis
Media (DS)
+
K Media (DS)
*Prueba de t 3C Fresh vs 3C Overnight.
Todos los GR presentaron una Hb total mayor a 40 g por bolsa. Tres CGR (4.5%)
presentaron un valor de Hb total menor a 45 g por bolsa.
Tres de 67 CGR (4.5%) presentaron un valor de porcentaje de hemólisis mayor a 0.8%.
De estos CGR, 2 fueron procesados Overnight (0.83% y 0.95% de hemólisis) y uno Fresh
(0.89% de hemólisis).
Diecisiete de 67 CGR (25.4%) presentaron un valor de sobrenadante de K+ mayor al
límite de referencia de 51.8 mEq/L basado en el trabajo de Moroff G et alx. De estos
CGR, 12 fueron procesados Overnight y 5 Fresh.
Se cultivaron los 67 CGR, todos fueron negativos.
Se evaluaron los leucocitos residuales de 14 CGR: Todos presentaron un valor inferior
al límite de aceptación (5 x 106 leucocitos/bolsa). Promedio: 0.21 x 106
leucocitos/bolsa (DS 0.17 x 106).
Se realizó el control de calidad de 40 pools de plaquetas. Recuento promedio: 26.7 x
1010 Plaq/Pool (DS 7.6 x 1010). Se prepararon 25 pools de 4 unidades interinas con un
recuento promedio: 29.4 x 1010 (DS 6.28 x 1010). Cuatro pools tuvieron un recuento
menor al límite de aceptación de 22.0 x 1010 Plaq/Pool propuesto para esta validación.
Los valores de estos pools eran: 15.8, 19.5, 19.7 y 21.1 x 1010 Plaq/Pool, las cuatro
unidades provenían de procesamiento Fresh. Por otro lado se prepararon 15 pools de
3 unidades interinas con un recuento promedio: 22.3 x 1010 Plaq/Pool (DS 7.5 x 1010).
Cuatro pools tuvieron un recuento menor al límite de aceptación de 16.5 x 1010
Plaq/Pool propuesto para esta validación. Los valores de estos pools eran: 12.0, 12.6,
13.0 y 14.1 x 1010 Plaq/Pool, las cuatro unidades provenían de procesamiento Fresh.
De los 40 pools, 29 fueron procesados por el procesamiento 3C Fresh y 11 por
Procesamiento 3C Overnight.
En la siguiente tabla se muestran los recuentos de plaquetas de los pools según la
cantidad de unidades integrantes y la modalidad de procesamiento:
Procesamiento
Pools de 3 unidades
Pools de 4 unidades
3C Fresh
10
n=12 Media 21.3 x 10
10
(DS 8.3 x 10 )
10
n=17 Media 28.1 x 10
10
(DS 6.8 x 10 )
3C Overnight
10
n=3 Media 26.0 x 10
10
(DS 3.8 x 10 )
10
n=8 Media 32.3 x 10
10
(DS 4.1 x 10 )
Se evaluó el pH de 38 pools de plaquetas. pH promedio: 7.15 (DS 0.09).
No hubo pools con valores inferiores al límite de aceptación de 6.8. El promedio del pH
de los pools procesados en la modalidad Fresh (n=27) fue de 7.13 (DS 0.10). Entre los
pools de la modalidad Overnight (n= 11) el promedio fue 7.19 (DS 0.04). Prueba de t 3C
Fresh vs 3C Overnight: p = 0.08.
Se evaluaron los leucocitos residuales de 38 pools de plaquetas. LR promedio: 0.07 x
106 leucocitos/bolsa (DS 0.12 x 106). No hubo pools con valores superiores al límite de
aceptación de 5 x 106 leucocitos/bolsa. El promedio de los LR de los pools procesados
en la modalidad Fresh (n=27) fue de 0.04 x 106 leucocitos/bolsa (DS 0.06 x 106). Entre
los pools de la modalidad Overnight (n= 11) el promedio fue 0.13 x 106
leucocitos/bolsa (DS 0.20 x 106). Prueba de t 3C Fresh vs 3C Overnight: p = 0.05.
Se cultivaron los 38 pools, todos fueron negativos.
Se evaluó la Inspección visual de 40 pools de plaquetas: El swirling en todos los pools
fue de 4+.
En la siguiente tabla se muestran los valores obtenidos en el Control de Calidad de 66
plasmas:
Todos los
plasmas
n=66
Peso (g) Media (DS)
257.8 (24.6)
Factor VIII (%) Media (DS)
117.4 (41.7)
von Willebrand (%) Media (DS)
118.7 (84.8)
Factor V (%) Media (DS)
111.8 (25.7)
Fibrinógeno (mg/dL) Media (DS)
319.4 (60.5)
*Prueba de t 3C Fresh vs 3C Overnight.
Plasmas
(3C Fresh)
n=30
260.9 (26.5)
126.1 (48.5)
108.9 (45.9)
113.6 (26.8)
318.6 (59.1)
Plasmas
(Overnight)
n=36
255.3 (23.0)
110.1 (34.2)
126.9 (107.0)
110.4 (25.0)
320.0 (62.5)
p*
0.36
0.12
0.39
0.62
0.92
Todos los plasmas, excepto uno, presentaron un peso superior al promedio histórico
establecido como valor de referencia en esta validación (193g). Valor del peso del
plasma 188g.
Se observaron 4 plasmas con valores de Factor VIII menores a 0.70 UI/mL (%). Tres
plasmas fueron procesados Fresh y uno Overnight.
Se observaron 12 plasmas con valores de von Willebrand menores a 0.70 UI/mL (%).
Seis plasmas fueron procesados Fresh y seis Overnight.
Se observaron 3 plasmas con valores de Factor V menores a 0.70 UI/mL (%). Dos
plasmas fueron procesados Fresh y uno Overnight.
Todos los plasmas presentaron un valor de Fibrinógeno superior al establecido como
criterio de aceptación en esta validación (150 mg/dL).
3. CONCLUSIONES
La automatización en el fraccionamiento de la sangre mejora la estandarización de los
componentes de la sangre producidos. La producción automatizada utilizando el
sistema Reveos fue eficiente y efectiva. Los componentes de la sangre obtenidos
poseen características aceptables comparándolas con los promedios históricos de
nuestra institución y cumplen con las especificaciones de las normas técnicas vigentes
y los estándares de calidad. El manejo del equipo no fue complejo.
Cuando comparamos las dos modalidades de procesamiento no encontramos
diferencias significativas. Es de destacar, el beneficio del procesamiento Overnight
para tener la posibilidad de procesar la sangre entera hasta 18 horas luego de su
colecta para producir pools de plaquetas; especialmente cuando las colectas se
realizan en sitios alejados o en el caso de colectas de gran duración.
Asimismo, la aplicación de un software de soporte permite una estricta trazabilidad del
proceso de producción de los componentes de la sangre. Si este software se conecta
con el sistema informático del laboratorio de fraccionamiento la transmisión de los
resultados minimiza los errores de transcripción.
Cabe destacar la importancia de validar in situ todo nuevo sistema de procesamiento
automático de componentes de la sangre, para evaluar, no solo su desempeño
propiamente dicho en el ambiente en el que se instala, sino también el desempeño del
proveedor.
Declaración de conflicto de interés: No tengo conflicto de interés.
4. REFERENCIAS
i
Janetzko K, Kluter H, Waeg GV, et al.: Fully automated processing of buffy-coat-derived pooled platelet
concentrates. Transfusion 2004; 44:1052-1058.
ii
Pasqualetti D, Ghirardini A, Cristina Arista M, et al.: Blood component fractionation: manual versus
automatic procedures. Transfus Apher Sci 2004; 30:23-28.
iii
Aulmann M, Ullrich R, Iber B, Neppert J. Procedure for production of leukocyte depleted erythrocyte
and thrombocyte concentrates (PRP method) using top and bottom bags, Optipress automated
separators and a computer controlled Cryofuge 6000. Beitr Infusionsther. 1992; 30:122-6.
iv
Ashford P, Gulliksson H, Georgsen J, et al.: Standard terminology for platelet additive solutions. Vox
Sang 2010; 98:577-578.
v
Cid J: Automation in blood component preparation methods; Blood Component Preparation: From
Benchtop to Bedside. Bethesa, MD, AABB Press, 2011:271-286.
vi
Jurado MJ, Arquero C, Garcia I, et al.: Validation of the new terumo advanced component centrifuge
with separator integrated of platelets concentrates from BC. Vox Sang 2007; 93 (Suppl. 1):101-102.
vii
Thomas S, Beard M, Garwood M, et al.: Platelet concentrates produced from whole blood using Atreus
processing system. Vox Sang 2009;97:93-101.
viii
Najdovski T: Whole blood separation into blood components with novel TACSI WB system: first
evaluation in routine production. Vox Sang 2013; 105(Suppl.1):129-130.
ix
Langerberg JW, Salado-Jimena JA, Löf H, et al.: Evaluation of quality of blood components obtained
after automated separation of whole blood by a new multiunit processor. Transfusion 2013; 53:17981807.
x
Moroff G, AuBuchon JP, Pickard C, et al.: Evaluation of the properties of components prepared and
stored after holding of whole blood units for 8 and 24 hours at ambient temperature. Transfusion 2011;
51 1S:7S.