Sin título-1 - Real Academia Gallega de Ciencias

Transcripción

ISSN - 1135 - 5417
Revista
REAL
ACADEMIA GALEGA DE CIENCIAS
VOLUMEN XXVII
SANTIAGO DE COMPOSTELA
2008
REVISTA
REAL
ACADEMIA GALEGA DE CIENCIAS
VOLUMEN XXVII
2008
Real Academia Galega de Ciencias
http://www.ragc.cesga.es
[email protected]
ISSN - 1135 - 5417
© REAL ACADEMIA GALEGA DE CIENCIAS
IMPRIME:GRAFICOLOR MINERVA, S.L.
POLÍGONO INDUSTRIAL DEL TAMBRE - GÜTENBERG, 5 - SANTIAGO, 2009
DEPÓSITO LEGAL: C - 277 / 84
Subvencionada por: Fundación Pedro Barrié de la Maza
Consellería de Innovación e Industria da Xunta de Galicia
ÍNDICE
Pág.
DETERMINACIÓN DE METALES EN ALGAS MARINAS DESTINADAS
A LA ALIMENTACIÓN HUMANA PRODUCIDAS Y PROCESADAS
EN GALICIA: DESARROLLO DE METODOLOGÍA ANALÍTICA
AUTOMÁTICA, por M. Carmen Yebra Biurrun..........................................
5
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA SELENOMETIONINA SOBRE LA
REPARACIÓN DEL DAÑO EN EL ADN, por Vanessa Valdiglesias, Blanca
Laffon, Eduardo Pásaro y Josefina Méndez..................................................
41
COMPOSICIÓN EN MACRONUTRIENTES, AMINOÁCIDOS Y
MINERALES DE ALGUNOS INVERTEBRADOS MARINOS NO
UTILIZADOS HABITUALMENTE COMO ALIMENTO, por C. Taboada,
R. Millán, I. Miguez, E. Fernández-Pulpeiro...........................................
95
DESARROLLO DE BANCOS DE GERMOPLASMA DE CASTAÑO
Y ALCORNOQUE MEDIANTE CRIOCONSERVACIÓN DE ÁPICES
CAULINARES Y EMBRIONES SOMÁTICOS, por Nieves Vidal, Ana M.
Vieitez, M. Rosario Fernández y Beatriz Cuenca.....................................
107
ESTUDO ANTROPOLÓXICO DOS RESTOS ÓSEOS RECUPERADOS
DA NECRÓPOLE DA COVA DO SANTO, PARDOLLÁN, RUBIÁ,
OURENSE. UNHA NECRÓPOLE DA IDADE DO BRONCE EN
GALICIA, por Olalla López-Costas.........................................................
131
ESTIMACIÓN DE LA EVAPOTRANSPIRACIÓN DIARIA A PARTIR DE
PRONÓSTICOS METEOROLÓGICOS EN GALICIA, por J. A. RodríguezSuárez, S. Feijóo, B. Soto.............................................................................
145
DIFUSIONES DÉMICAS Y COMPONENTES DE LA ESTRUCTURA
GENÉTICA DEL NW AFRICANO. PERSPECTIVAS MULTIVARIANTES
DE STRS AUTOSÓMICOS, por B. Caeiro, A. Ferreiro, D. Beiroa, J. A.
Rodríguez-Pérez, F. Picchi-Figueira, M. M. Regueiro.......................................
163
LA CORRIENTE DE MALVINAS: ¿UNA VÍA DE DISPERSIÓN PARA
CNIDARIOS BENTÓNICOS DE AGUAS FRÍAS?, por M. O. Zamponi.........
183
VIDA DA REAL ACADEMIA GALEGA DE CIENCIAS . ........................
205
MEMORIA DAS ACTIVIDADES ..............................................................
206
CURSOS DE CONFERENCIAS..................................................................
218
PREMIOS DE INVESTIGACIÓN................................................................
222
COMPOSICIÓN DA REAL ACADEMIA ...................................................
224
PUBLICACIÓNS DA REAL ACADEMIA .................................................
228
INSTRUCCIÓNS PARA OS AUTORES......................................................
231
Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII. Págs. 5-40 (2008)
DETERMINACIÓN DE METALES EN ALGAS MARINAS
DESTINADAS A LA ALIMENTACIÓN HUMANA
PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA: DESARROLLO
DE METODOLOGÍA ANALÍTICA AUTOMÁTICA
M. CARMEN YEBRA BIURRUN1
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología.
Facultad de Química. Universidad de Santiago de Compostela.
15782-Santiago de Compostela
[email protected]
RESUMEN
Se ha propuesto un método nuevo, simple, rápido y automático basado en
la extracción ácida asistida con energía de ultrasonidos para la determinación
de metales en algas. Los metales se determinaron en línea por espectrometría
de absorción atómica con llama utilizando un sistema de análisis por
inyección en flujo. Se estudió la influencia de varias variables en la eficacia
del proceso de extracción utilizando diseños experimentales. Además, las
metodologías propuestas fueron evaluadas calculando el límite de detección,
límite de cuantificación y precisión. La validación se efectuó analizando un
material de referencia certificado (NIES-9, ”Sargasso”, National Institute
for Environmental Studies, Japan) y mediante estudios de recuperación.
Finalmente, la metodología propuesta se ha utilizado para la determinación
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentación
humana producidas y procesadas en Galicia.
Palabras clave: metales, extracción ácida continua, ultrasonidos, análisis
por inyección en flujo, algas.
1
Premio de Investigación Real Academia Galega de Ciencias-Fundación Caixa Galicia,
convocatoria 2007.
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Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII
ABSTRACT
A new, simple, fast and automated method based on continuous
ultrasound-assisted acid extraction has been developed for the determination
of metals (Zn, Cu, Fe, Mn, Ca and Mg). The target metals have been on-line
monitoring by flame atomic absorption spectrometry by using a flow injection
analysis manifold. The influence of several extraction parameters on the
efficiency of metal leaching has been evaluated by using experimental designs.
Limits of detection and quantification and precision of the over all procedure
have been assessed. Method validation was performed analysing a seaweed
reference material (NIES-9, “Sargasso”, National Institute for Environmental
Studies, Japan) and by recovery studies. Finally, the developed continuous
extraction methodology has been applied to the determination of Zn, Cu, Fe,
Mn, Ca and Mg in edible seaweeds produced and processed in Galicia.
Key words: metals, continuous acid extraction, ultrasounds, flow injection
analysis, edible seaweeds.
INTRODUCCIÓN
Las algas se definen como plantas talofitas, unicelulares o pluricelulares
que viven de preferencia en el agua, tanto dulce como marina, y que, en
general, están provistas de clorofila acompañada a veces de otros pigmentos
de colores variados que la enmascaran. El talo de las pluricelulares tiene
forma de filamento, de cinta o de lámina y puede ser ramificado. Aunque hay
muchas algas de agua dulce, la mayoría vive en el mar. Dentro de éstas, se
encuentran las algas unicelulares, microalgas o fitoplancton, las cuales son
microscópicas y representan el primer eslabón de la cadena alimenticia de
los animales acuáticos. Además, existen algas pluricelulares o macroalgas,
visibles al ojo humano y que normalmente se conocen como algas marinas
(Pérez-Cirera López-Niño, 2005). Entre las algas marinas macroscópicas se
pueden diferenciar cuatro grupos principales: Cyanophyta o algas azules,
Chlorophyta o algas verdes, Rhodophyta o algas rojas y Phaeophyceae o algas
pardas. Estos grupos se caracterizan no sólo por los pigmentos que poseen,
sino también por la complejidad de su talo y sus mecanismos reproductivos
(Otero Schmitt et al., 2002). Sin embargo, tienen la característica común
de vivir sin raiz, y extraen su alimento y los nutrientes esenciales para su
crecimiento del agua del mar que les rodea. Desde hace mucho tiempo, el
7
hombre ha usado las algas con distintos fines para el medio ambiente y el ser
humano. Estas aplicaciones son:
- agropecuarias. Mejoran la producción vegetal utilizadas como abono y
fertilizante, como corrector del pH de la tierra, e incluso como alimento para
el ganado.
- alimenticias. Las algas se han incorporado desde hace muchos siglos en
la dieta alimenticia, sobre todo en las culturas orientales y especialmente en
Japón, Corea y China, y en la “poliacuicultura ecológica”, las algas sirven de
complemento dietético para peces o moluscos de granjas de cultivo.
- cosméticas. Los extractos de algas se emplean en productos para el
tratamiento de uñas rotas, acné, arrugas, seborrea, e incluso para la caída del
cabello, el rejuvenecimiento de la piel, la obesidad o la celulitis. Asimismo,
su capacidad fotoprotectora se está utilizando para el desarrollo de cremas
solares.
- farmacológicas. Las algas son muy utilizadas en la medicina tradicional
oriental.
- industriales. Para la optención de ficocoloides: agarófitos (E-406),
alginatos (E-401 al E-405), y fundamentalmente carrageninas (E-407). El
agar se emplea en la elaboración de medio de cultivo en laboratorio por
tener un gran poder gelificante. El agar también se añade como aditivo
gelificante y espesante (E-406) en gran cantidad de alimentos. Asimismo se
emplea en la industria fotográfica y en la industria biotecnológica (agarosa
para separaciones cromatográficas y electroforéticas). Las carrageninas son
polisacáridos sulfatados muy apreciados por diversos tipos de industrias por
sus numerosas aplicaciones, normalmente alimentarias.
- medioambientales y energéticas. Como restauradoras de zonas
contaminadas, depuradoras de efluentes o como bioindicadores para conocer
el estado de un determinado medio (Chaudhuri et al., 2007; Morrison et al.,
2007; Kamala-Kannan et al., 2008). Asimismo, su uso como combustible,
para generar biogás (metano), hidrógeno o biodiesel es otra línea fructífera de
investigación (Castelló Orvay, 1993).
El consumo directo de algas en la alimentación humana está muy
extendido en los países orientales (China, Corea, Japón). Sin embargo, en las
8
últimas décadas, la demanda de algas para la alimentación humana esta en
alza en países occidentales (González et al., 1998; Fernández Saa, 2002). Las
algas más apreciadas para la cocina son:
- wakame (Undaria pinnatifida): pertenece a las algas pardas y es
apreciada en la cultura oriental y muy abundante en las costas de Galicia.
Rica en calcio, yodo, proteínas y fibra.
- Espagueti de Mar (Himanthalia elongata): es una alga parda, muy
sabrosa y frecuente en litorales profundos y aguas agitadas. Rica en fibra y
en hierro.
- Kombu (Laminaria ochroleuca, Laminaria hyperborea, Laminaria
saccharina): alga de gran tamaño, color pardo y consistencia carnosa. Su
principal característica es que es rica en ácido glutámico que potencia el
sabor de los demás alimentos y es rica en minerales, especialmente calcio
y magnesio. La Laminaria saccharina tiene un sabor ligeramente dulce y es
llamada por ello Kombu de azúcar.
- Dulse (Palmaria palmata): es un alga de color rojo rica en vitamina C,
proteínas y potasio.
- Nori (Porphyra umbilicalis): es un alga de pequeño tamaño y muchos
pliegues. En Galicia se encuentra silvestre en la bajamar. Tiene un sabor
intenso y destaca en proteínas, vitamina A y vitamina B12.
- Osmundea (Osmundea pinnatifida): es un alga muy pequeña, pero con
un intenso olor a mar. Muy difícil de coger ya que se encuentra bajo las rocas
en las que se crían los percebes.
- Codium (Codium tomentosum).
- Lechuga de mar (Ulva rigida): es un alga verde que recuerda mucho en
su apariencia a la lechuga.
- Agar-agar Atlántica, Gelatina de algas (Gelidium sesquipedale). Es
la fibra soluble extraída del alga Gelidium sesquipedale. Se suele emplear
como espesante y gelificante (E-406) y también muy usada en investigación
(microbiología).
- Musgo de Irlanda (Chondrus crispus): Se utiliza en su gran mayoría
para la producción industrial de carrageninas, pero también puede utilizarse
en cocina como espesante (E-407).
9
- Verdello (Enteromorpha Intestinalis): Es una alga verde del orden de
las Ulvales.
El análisis composicional de las algas desvela que concentran del agua
del mar una amplia variedad de nutrientes esenciales: contenido elevado
en minerales esenciales (Ca, Na, K, Mg, Mn, P, Cl, Fe, Cu, Zn, I, etc.)
(Robledo y Freile Pelegrin, 1997; Rao et al., 2007). Algunas especies son
ricas en proteínas. Presentan mayor cantidad en aminoácidos esenciales
que las verduras. Contienen antioxidantes y son extremadamente ricas en
polifenoles, carotenoides, vitaminas E y C, clorofila, ácidos grasos esenciales,
enzimas y fosfolípidos, que neutralizan los radicales libres y ayudan a retrasar
el envejecimiento. Además, contienen vitamina A, vitamina B1, vitamina
B2, vitamina B9, vitamina B12 y vitamina K. Presentan un bajo contenido
calórico en relación con otros alimentos, y como poseen ácidos grasos
poliinsaturados de cadena larga (Omega-3 y Omega-6) ayudan a disminuir y
a regular el exceso de colesterol. Los glúcidos que contienen se encuentran casi
exclusivamente en forma no asimilable (fibra). Por tanto, aportan poco valor
energético. Contienen ácido algínico que es un desintoxicante abundante en
las algas pardas laminarias (kombu) que ayuda a prevenir la contaminación
de elementos radiactivos en el cuerpo.
El agua de mar contiene, de forma natural, pequeñas concentraciones
de metales que no sólo no resultan perjudiciales para el ecosistema sino
que son necesarios para el desarrollo de los organismos vivos. El problema
surge cuando se produce un aumento de concentración y se convierten en
sustancias tóxicas para los organismos marinos o se acumulan en la cadena
trófica de forma que pueden convertirse en tóxicos para el hombre. Las
macroalgas bioconcentran los iones metálicos libres mediante dos procesos
físico-químicos. El primer proceso es rápido y reversible e involucra la
adsorción del ión metálico sobre la superficie externa de la pared celular. Este
proceso puede ser iónico o por formación de complejos con los ligandos de la
pared celular. Los polímeros que componen la pared celular son ricos en grupos
carboxílicos, fosforílicos, hidroxilos y aromáticos que pueden ligar cationes o
producir complejos orgánicos que pueden influir la absorción de metales. El
segundo mecanismo de incorporación de metales es más lento, esta regulado
por el metabolismo celular y los metales se almacenan en el citoplasma en
vacuolas ricas en polifenoles (Granan et al., 1992). Como producto de esta
acumulación las algas pueden alcanzar contenidos de elementos traza varios
10
ordenes de magnitud más elevados respecto a las aguas. Además, hay que
tener en cuenta que las distintas especies de algas tienen diferentes afinidades
por los metales, por lo que su contenido metálico depende de la clase de
alga. La concentración de metales puede variar en las diferentes partes del
alga, siendo normalmente mayor en las partes más viejas, ya que han estado
más tiempo expuestas al medio. Muchas especies muestran variaciones en la
concentración de metales dependiendo de sus periodos de inmersión. Para
especies que vivan en el mismo hábitat, el contenido metálico depende de la
edad del alga. Otros factores que influyen en la concentración metálica de
las algas son el área geográfica, temperatura del agua, pH, etc. (Villares et
al., 2002; Yamada et al., 2007).
En los procedimientos analíticos en los que se tiene que eliminar la materia
orgánica y/o disolver la muestra, la etapa de pretratamiento de la muestra
constituye normalmente el talón de Aquiles del proceso analítico debido,
sobre todo, al tiempo que consume su realización. Por eso, la automatización
de las operaciones previas del proceso analítico es en la actualidad uno de los
objetivos principales de la Química Analítica. De esta manera, la preparación
de la muestra es una etapa muy importante en la estrategia del análisis. Por lo
que en todo procedimiento analítico es deseable que tenga lugar una mínima
manipulación de la muestra, utilizando un pretratamiento lo más sencillo
posible, lo cual además, evita problemas de pérdida y contaminación de
analito(s). La selección del tipo de pretratamiento de la muestra depende de
la técnica analitica que se va a utilizar para la determinación de los metales.
Como la espectroscopía de absorción atómica con llama es usualmente la
técnica de determinación elegida, ésta requiere normalmente que las muestras
sólidas estén disueltas para que la muestra pueda ser introducida en la fuente de
atomización. Los métodos clásicos utilizados para la preparación de muestras
vegetales implican la digestión por vía seca (calcinación) o la digestión por
vía húmeda de las muestras (Knapp et al., 1975; Somenath, 2003; Munilla
et al., 1995). Los métodos clásicos haciendo uso de una digestión por vía
húmeda en recipientes abiertos son procedimientos laboriosos y tediosos,
y además, están sujetos a posibles errores por pérdida de analito(s) y/o
contaminación de la muestra. Otro inconveniente de este procedimiento es el
manejo de ácidos concentrados y la generación en el proceso de gases tóxicos
(óxidos de nitrógeno). De la misma manera, los procesos que implican una
calcinación de la muestra también presentan inconvenientes, ya que además
de la pérdida de analitos volátiles y la posibilidad de contaminación de la
11
muestra, se pueden producir reacciones en las paredes del crisol. Tampoco
se deben olvidar las dificultades que se pueden producir al disolver el
residuo obtenido en la combustión (Meeravali y Sunil, 2000). Debido a estos
problemas, se han propuesto otros procedimientos para la preparación de
muestras vegetales (Curdova et al., 1998; Zezzi Arruda, 2006). Así, se han
utilizado procedimientos de digestión en vía húmeda realizados en recipientes
cerrados y bajo la acción de la energía de microondas. Sin embargo, aunque
estos procesos son una buena alternativa para llevar a cabo la preparación
de la muestra, ya que reducen el tiempo de pretratamiento en comparación
con las metodologías clásicas, siguen presentando el inconveniente del uso de
ácidos concentrados. Además, como la muestra se disuelve completamente,
aumenta la probabilidad de que existan interferencias de matriz. Debido a estos
inconvenientes se han propuesto otras estrategias para realizar la preparación
de muestras de origen vegetal. Éstas se basan en la calcinación mediante láser,
en extracción con líquidos a presión y en procesos de extracción ácida bajo la
acción de la energía de ultrasonidos. Sin embargo, las dos primeras propuestas
presentan los siguientes inconvenientes: elevado costo del equipo y dificultad
para realizar los procesos de manera automática y miniaturizada (Ahlgren
et al., 1988; Saeed et al., 1999; Morales-Muñoz, et al, 2007; Moreda-Piñeiro
et al., 2007). Como la extracción ácida de metales asistida por la energía de
ultrasonidos no presenta estos inconvenientes, es hoy día una de las alternativas
más válidas para realizar el pretratamiento de las muestras sólidas, incluídas
las de origen vegetal como las algas marinas (Luque Garcia y Luque de Castro,
2002; Luque de Castro y Priego Capote, 2007).
La energía de ultrasonidos facilita y acelera procesos como la disolución
y la extracción. Las muestras sometidas a energía de ultrasonidos se dispersan
de tal forma que originan una fina suspensión que se ataca fácilmente por
los reactivos (ácidos o bases diluídos). Los procesos de extracción en un
baño de ultrasonidos proporcionan una mayor eficacia en la disolución de
numerosos analitos de muestras complejas y reducen la duración del proceso
en comparación con los métodos clásicos de extracción. Esta metodología
proporciona recuperaciones entre el 94-100%, con una buena reproducibilidad
para la mayoría de los metales. Los metales son extraídos generalmente con
ácidos diluidos, lo que hace que no se disuelva la matriz de la muestra, evitándose
de esta forma las interferencias que puede producir en la determinación de el
(los) analito(s) (Priego Capote y Luque de Castro, 2004; Luque de Castro y
Priego Capote, 2007).
12
En lo que se refiere a la determinación de metales en muestras de vegetales
y plantas, se han propuesto varias metodologías basadas en la extracción ácida
asistida por energía de ultrasonidos. Así, se han determinado Ba, Ca, Cd, Cu,
Mg, Ni, Pb, Sr y Zn en diversos tejidos vegetales y plantas (Lavilla et al., 1998;
Filgueiras et al., 2002; Nascentes et al., 2001; Borkowska-Burnecka et al., 2003)
y As, Ba, Ca, Na, Mg, Cd, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Ni, Pb, V y Zn en algas
(Dominguez-Gonzalez et al., 2005; Ladra-Ramos et al., 2005).
La extracción continua de metales en muestras sólidas usando energía
de ultrasonidos llevada a cabo en un dispositivo automático basado en
el análisis por inyección en flujo (FIA) ha resultado ser una metodología
rápida, sencilla y cuantitativa para el pre-tratamiento de muestras sólidas
(Ruiz-Jiménez et al., 2003; Moreno-Cid et al., 2004; Yebra et al., 2005). Otras
ventajas que presenta esta metodología en comparación con la alternativa no
automática comentada en el apartado anterior son las siguientes: reducción
de la contaminación de la muestra y de las pérdidas de analito debido a una
mínima manipulación de la muestra, bajo consumo de reactivos y de muestra
(el sistema es miniaturizado), disminución considerable del tiempo de
tratamiento de la muestra, se evitan las etapas de centrifugación y filtración
para la separación de la fase líquida del residuo sólido (matriz de la muestra)
e incremento de la calidad de la metodolgía analítica.
Este procedimiento combina los beneficios de la extracción asistida con
energía de ultrasonidos con los obtenidos por los sistemas FIA (Valcárcel y
Luque de Castro, 1987). Estos métodos automáticos todavía no se han propuesto
para la extracción ácida asistida por energía de ultrasonidos de metales y su
posterior determinación en muestras de algas, siendo por primera vez objeto
de estudio y aplicación en este trabajo de investigación.
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
El mar es muchas veces el destino final de los contaminantes generados
por los seres humanos. Los metales pesados son uno de estos contaminantes.
El problema surge cuando se produce un aumento de concentración y se
convierten en sustancias tóxicas para los organismos marinos o acumularse en
la cadena trófica de forma que pueden convertirse en tóxicos para el hombre.
Los productos marinos, entre los que se encuentran las algas, forman parte hoy
día de la dieta humana. Por lo que sería interesante conocer su composición en
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lo que se refiere a metales para establecer su valor nutricional y para determinar
su seguridad alimentaria. Las algas se utilizan como bioindicadores de la
contaminación ambiental, con lo cual también es importante conocer su
contenido metálico para establecer el grado de contaminación por metales
del medio ambiente marino de donde proceden. Hasta la fecha no se han
propuesto métodos analíticos automáticos para la determinación de metales
en muestras de algas.
Todo ello justifica la necesidad de proponer metodologías analíticas
automáticas para utilizar de manera rutinaria en laboratorios de control de
calidad de alimentos y en laboratorios de control de calidad del medio marino.
Estos métodos permitirán realizar de manera rápida y fiable un control riguroso
del contenido metálico en organismos marinos como son las algas.
PARTE EXPERIMENTAL
En este trabajo de investigación se ha realizado la determinación de
metales en algas marinas destinadas a la alimentación humana producidas
y procesadas en Galicia. Para llevar a cabo este estudio se han optimizado
dispositivos basados en el análisis por inyección en flujo (FIA) que permiten
realizar en línea la extracción ácida asistida por energía de ultrasonidos de los
metales de las muestras de algas y la determinación continua de los mismos
por FAAS.
Reactivos, aparatos e instrumentación analítica
Ácido nítrico (Merck): 65%, d=1,39 g/mL, Pm= 63,01 g/mol, ácido
clorhídrico (Merck): 30%, d=1,15 g/mL, Pm=36,46 g/mol, agua ultrapura
de 18,2 MΩ cm de resistividad específica, obtenida por el sistema Milli-Q
(Millipore Corp.), disolución patrón de cinc (Merck): 1000 mg/L (Zn (NO3)2 en
HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de cobre (Merck): 1000 mg/L (Cu(NO3)2
en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de hierro (Merck): 1000 mg/L
(Fe(NO3)3 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de manganeso (Merck): 1000
mg/L (Mn(NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de calcio (Merck):
1000 mg/L (Ca (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolución patrón de magnesio
(Merck): 1000 mg/L (Mg (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L). Cloruro de lantano (III)
heptahidratado (LaCl3·7 H2O) (Merck). Agua ultrapura de 18,2 MΩ cm de
resistividad específica, obtenida por el sistema Milli-Q (Millipore Corp.).
14
Bombas peristálticas GILSON MINIPULS 3, con ocho canales y
selector de velocidad. Minicolumna de vidrio borosilicatado químicamente
inerte (Omnifit) de 3 mm de diámetro interno y 100 mm de longitud con
dos terminales fijos y 0,70 mL de volumen de lecho. En esta minicolumna se
introduce la muestra, colocando, en cada uno de sus extremos, un papel de
filtro (Whatman 541) para evitar cualquier obturación de sistema por pérdida
de muestra durante el proceso (Figura 1).
Figura 1. Minicolumna conteniendo la muestra.
Ultrasonidos Selecta de 550 watios de potencia con selector de temperatura
y tiempo programable. Frecuencia de ultrasonidos 40 kHz. Válvulas de
selección y de inyección de tipo hexagonal (Rheodyne). Espectrofotómetro
de Absorción Atómica Perkin Elmer, modelo 5000, con llama aire-acetileno y
sistema nebulizador de bola de impacto y mechero de 10 cm.
Todo el material de vidrio y plástico fue lavado y almacenado en ácido
nítrico al 10% (V/V) al menos durante 48 h. Antes de ser utilizado se enjuagó
tres veces con agua ultrapura (Milli-Q).
Preparación de las muestras de algas
Para poder llevar a cabo los análisis de las muestras, éstas han sido
trituradas y homogeneizadas. Una vez homogeneizadas, se secaron en una
estufa a 80 ± 5 ºC hasta tener las muestras a peso constante. Después se
tamizaron para conseguir fracciones de partículas menores de 30 µm y
partículas entre 30-200 µm.
Procedimiento para la determinación de cinc, cobre, hierro y
manganeso
El esquema de trabajo del método optimizado para la determinación
de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas utilizando el dispositivo FIA
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propuesto (Figura 2) es el siguiente: En una primera etapa se realiza la
extracción de Zn, Cu, Fe y Mn. Para ello se inserta con cuidado y se pesa
Figura 2. Dispositivo FIA usado para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras
de algas mostrando los valores óptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, baño
de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristálticas; D, desecho; DE, disolución extractante; DP,
disolución patrón; FAAS, espectrofotómetro de absorción atómica con llama; M, columna
conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla; VI, válvula de inyección; VS1, VS2 y VS3,
válvulas de selección.
directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada y
homogeneizada (10, 80, 10 y 25 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente).
Posteriormente, se colocan dos papeles de filtro en los extremos de la columna
para evitar pérdidas de muestra a través del sistema. Una vez preparada la
minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo, se llena el sistema
de disolución extractante por medio de la VS1 (1 mL de ácido nítrico 0,1M;
3 M; 3M y 0,5 M para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente), manteniendo la
temperatura del baño a 20 ºC (temperatura ambiente). Después, se somete
a la minicolumna a la acción de la energía de ultrasonidos durante 0,5 min
para el Zn y el Mn, y 1 min para el Cu y el Fe, a la vez que circula a su
través la disolución extractante. El sentido del movimiento de la disolución
extractante que circula a través de la columna a 6 mL/min se cambia cada
10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior
de la columna. Una vez realizada la extracción de los metales de la muestra,
se gira la válvula de selección (VS2) pasando el extracto ácido a la segunda
parte del sistema, mientras que la disolución blanco va al desecho. En esta
parte, el extracto ácido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras
ser homogeneizado, se inyectan 250 µL de extracto ácido en una corriente
portadora (agua ultrapura) a través de una válvula de inyección (VI). Esta
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disolución portadora que circula a un caudal de 3,5 mL/min, transporta el
bolo de muestra hasta el nebulizador de un espectrofotómetro de absorción
atómica con llama (FAAS), donde se detectan los metales de forma continua.
Para realizar las rectas de calibrado se introducen secuencialmente en el
sistema FIA disoluciones patrón de distintas concentraciones de cada metal
(preparadas en ácido nítrico 0,1 M para el Zn, 3 M para el Cu y el Fe, y 0,5
M para el Mn). El volumen inyectado de cada disolución patrón a través de la
válvula de inyección (VI) en la disolución portadora es de 250 mL (igual que
el de la muestra). La disolución blanco es ácido nítrico 0,1 M para el Zn, 3 M
para el Cu y el Fe, y 0,5 M para el Mn.
Procedimiento para la determinación de calcio y magnesio
El esquema de trabajo del método optimizado para la determinación
de Ca y Mg en algas marinas utilizando un dispositivo FIA (Figura 3) es el
siguiente: Primero se
Figura 3. Dispositivo FIA usado para la determinación de Ca y Mg en muestras de
algas mostrando los valores óptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, baño
de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristálticas; D,desecho; DE, disolución extractante; DIL,
canal de dilución (disolución de lantano); DP, disolución patrón; FAAS, espectrofotómetro
de absorción atómica con llama; M, columna conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla;
VI, válvula de inyección; VS1, VS2 y VS3, válvulas de selección.
realiza la extracción de Ca y Mg. Para ello se inserta con cuidado y se pesa
directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada
y homogeneizada (30 mg para la determinación de Ca y 5 mg para la
determinación de Mg). Después, se colocan dos papeles de filtro en los
extremos de la columna para evitar pérdidas de muestra a través del sistema.
17
Una vez preparada la minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo,
se llena el sistema de disolución extractante por medio de la VS1 (5 mL de
ácido nítrico 3 M para Ca y 0,5 M para Mg), manteniendo la temperatura del
baño a 20 ºC (temperatura ambiente). Después, se somete a la minicolumna a
la acción de la energía de ultrasonidos durante 0,5 min, a la vez que circula a
su través la disolución extractante. El sentido del movimiento de la disolución
extractante que circula a través de la columna a 6 mL/min se cambia cada
10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior
de la columna. Una vez realizada la extracción de los metales de la muestra,
se gira la válvula de selección (VS2) pasando el extracto ácido a la segunda
parte del sistema, mientras que la disolución blanco va al desecho. En esta
parte, el extracto ácido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras
ser homogeneizado, se inyectan 250 µL de extracto ácido en una corriente
portadora (agua ultrapura) a través de una válvula de inyección (VI). Esta
disolución portadora que circula a un caudal de 0,2 mL/min converge con un
canal de dilución (lantano 2%) que circula a 5,8 mL/min. El canal resultante
que contiene el extracto ácido diluido llega directamente hasta el nebulizador
de un espectrofotómetro de absorción atómica con llama (FAAS), donde se
detectan los metales de forma continua. Para realizar las rectas de calibrado se
introducen secuencialmente en el sistema FIA 2 disoluciones patrón de distintas
concentraciones de cada metal (preparadas en ácido nítrico 3 M para Ca y 0,5
M para Mg) a través de la válvula de inyección (VI). El volumen inyectado de
cada disolución patrón en la disolución portadora es de 250 mL (igual que el
de la muestra). Las distintas disoluciones patrón sufren la misma dilución en
Tabla 1. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Variables y nivelesconsiderados para el
diseño factorial de screening.
línea que las muestras. La disolución blanco es ácido nítrico 3 M para el Ca,
y 0,5 M para el Mg.
18
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de cinc, cobre, hierro y manganeso
Para realizar la optimización de los parámetros que afectan a la extracción
de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas, se ha utilizado un diseño factorial
debido a que el número de variables implicadas es elevado (6 variables). Así,
es necesario aplicar un diseño factorial de screening, para reducir de modo
significativo el número de experimentos a realizar en la optimización. Uno de
los diseños de screening más utilizados es el diseño de Plackett-Burman. Éste
permite fraccionar un diseño factorial completo proporcionando números de
combinaciones de factores que son un múltiplo de cuatro. Por ejemplo, si se
aplicara un diseño factorial completo a 2 niveles para 6 variables implicaría
la realización de 64 experimentos. Sin embargo, aplicando el diseño de
Plackett-Burman con un punto central, el número de experimentos a realizar
es de trece. Así, las variables a optimizar para el dispositivo FIA 1 son las
siguientes: concentración de HNO3 (disolución extractante), concentración de
HCl (disolución extractante), tiempo de extracción,
Tabla 2. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Concentración certificada y cantidad
de muestra analizada del material de referencia “Sargasso”, NIES-9, National Institute for
Environmental Studies, Japan.
temperatura de extracción, caudal de extracción y volumen de disolución
extractante. Para poder realizar este diseño factorial es necesario considerar
para cada variable dos niveles (valor máximo y mínimo). Estos valores
fueron seleccionados en función de experimentos realizados en estudios
previos (Tabla 1).
El diseño factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^6*3/16 que
implica realizar 13 experimentos (Statgraphics Plus v.5.1). En este diseño se ha
19
considerado un punto central en el que las variables toman un valor medio entre
el límite superior e inferior. Una vez obtenida la matriz del diseño, se realizaron
los experimentos fijados por la misma. Para realizar estos experimentos se
utilizó un material de referencia certificado (NIES-9,”Sargasso”, National
Institute for Environmental Studies, Japan). La concentración certificada para
Zn, Cu, Fe y Mn, y la cantidad de material de referencia utilizada (fijada
en función de la concentración) para optimizar el proceso se muestran
en la Tabla 2.
La variable respuesta considerada ha sido el % eficacia en la extracción
(% EF), calculado según la siguiente ecuación:
La matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores que toma cada
variable en cada experimento y el % eficacia en la extracción
Tabla 3. Matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada
variable en cada experimento para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. A, [HNO3]; B,
[HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F,
Volumen de disolución extractante.
20
obtenido para el Zn, Cu, Fe y Mn, se recogen en la Tabla 3. Los experimentos
se han realizado por duplicado, por lo que el % eficacia en la extracción
indicada es la media de estos dos experimentos.
Una vez realizados los experimentos, se procede al análisis de los datos.
Para conocer que variables son significativas se recurre a las Cartas Pareto
estandarizadas (Figura 4).
Figura 4. Cartas Pareto estandarizadas para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. A,
[HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de
extracción; F, Volumen de disolución extractante.
A partir de la observación de las cartas Pareto (Figura 4) se pueden
establecer las siguientes conclusiones en función de cada variable:
Concentración de ácido nítrico (A): En todos los casos la concentración
de HNO3 es una variable estadísticamente significativa con efecto estimado
positivo. Esto se debe a su efecto oxidante, el cual facilita el proceso de
extracción.
21
Concentración de ácido clorhídrico (B): No es una variable
estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo
para la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn.
Tiempo de extracción (C): No es una variable estadísticamente
significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción
de Zn, Cu, Fe y Mn, ya que cuanto más tiempo permanezca la muestra bajo
la acción de la energía de ultrasonidos mayor contacto se produce entre la
muestra y la disolución extractante, y por tanto se logra una mayor eficacia
en la extracción. Sin embargo, tiempos de sonicación elevados suponen
elevados tiempos de análisis y por lo tanto una reducción de la frecuencia de
muestreo.
Temperatura de extracción (D): No es una variable estadísticamente
significativa, y presenta efectos estimados muy pequeños en todos los casos.
Esto indica que esta variable prácticamente no influye en el proceso de
extracción.
Caudal de extracción (E): Para ninguno de los cuatro metales es una
variable estadísticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado
positivo.
Volumen de disolución extractante (F): En ninguno de los casos es una
variable estadísticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado
positivo, aunque éste no es muy elevado.
Como el diseño de Plackett-Burman proporciona las tendencias de cada
una de las variables hacia el óptimo, y no el valor optimo en sí mismo, se
realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseño, de acuerdo
con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los valores óptimos
de cada una de las variables que afectan a la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn.
Comenzando por aquellas variables no significativas se comprueba que un
volumen de disolución extractante de 1 mL y una temperatura de extracción
de 20ºC pueden ser los valores óptimos para estas variables, ya que con ellos
se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (experimentos 1 y 3 de la
matriz de Plackett-Burman, Tabla 3).
En el estudio de las variables tiempo de extracción y caudal de extracción
(Figura 5) se observa que, a pesar de que el tiempo de extracción tiene un
efecto estimado bastante positivo, son suficientes 0,5, 1, 1 y 0,5 min a un
22
caudal de 6 mL/min para extraer cuantitativamente el Zn, Cu, Fe y Mn en este
tipo de muestras. Así, éstos valores serán elegidos como óptimos para estas
variables, ya que con ellos se alcanza la frecuencia de muestreo más elevada
Figura 5. Optimización del tiempo de extracción para Zn, Cu, Fe y Mn para caudales
de extracción de 3,5 y 6 mL/min. [HNO3]=3 M; [HCl]=3 M; Temperatura de extracción= 20
ºC; Volumen de disolución extractante= 1 mL.
Con respecto a las concentraciones de los ácidos, se estudió la posibilidad
de eliminar el ácido clorhídrico, ya que su concentración resultó ser una
variable no estadísticamente significativa en el diseño de screening. Así, los
estudios realizados deteminaron que si se elimina de la disolución extractante
este ácido (utilizando únicamente HNO3 3M como disolución extractante)
se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (95,3-100,5%), lo cual
también se puede corroborar con los experimentos 1 y 4 de la matriz de
Plackett-Burman, Tabla 3). Una vez comprobado que se podía eliminar el ácido
clorhídrico de la disolución extractante, se estudió la posibilidad de disminuir
la concentración de HNO3 al máximo. Como se observa en la Figura 6, fue
posible disminuir la concentración de este ácido hasta un valor de 0,1 M para
la extracción del Zn y 0,5 M para la extracción del Mn, mientras que para la
extracción de Cu y Fe la mínima concentración de ácido nítrico necesaria
para extraer cuantitativamente estos metales debía ser de 3M.
23
Figura 6. Optimización de la concentración de ácido nítrico utilizado como disolución
extractante para Zn, Cu, Fe y Mn. [HCl]=0 M; Tiempo de extracción= 0,5 min para Zn, y Mn
y 1 min para Cu y Fe; Temperatura de extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min;
Volumen de disolución extractante= 1 mL.
Al realizar la optimización de las distintas variables que afectan al proceso
de extracción ácida se han utilizado las cantidades de muestra indicadas en
la Tabla 2. No obstante, también se ha investigado la posibilidad de analizar
cantidades de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad
de la metodología analítica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido
en cuenta la sensibilidad de cada uno de los metales en el espectrofotómetro
de absorción atómica con llama y la concentración normalmente existente en
las muestras de algas. Así, los resultados obtenidos en este estudio para Zn,
Cu, Fe y Mn demostraron que con las condiciones óptimas es posible utilizar
cantidades de muestra hasta 60, 100, 25 y 90 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente. Cantidades mayores no se probaron porque esto requeriría
incorporar un canal de dilución en el dispositivo para no sobrepasar el límite
de linealidad del detector.
Los estudios anteriores se realizaron con el material de referencia
certificado NIES-9, el cual presenta un diámetro de partícula de 80 mesh
(177 µm). Por tanto, con el objetivo de estudiar si esta variable influye en
el proceso de extracción de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas se
analizaron diferentes porciones de la misma muestra con diferentes tamaños
de partícula. Los diámetros de partícula estudiados fueron dos: 1) partículas
de muestra con diámetros menores de 30 µm y 2) partículas de muestra con
diámetros entre 30-200 µm. Para realizar el estudio de la influencia del tamaño
de partícula, se tomó una muestra real de alga, de la que se seleccionaron
24
los dos tamaños de partícula anteriormente citados. En consecuencia, para
poder comparar los resultados obtenidos por el método propuesto para cada
tamaño de partícula fue necesario establecer la concentración de los metales
en cada fracción de muestra. Para ello, se realizó la determinación de los
metales utilizando como pretratamiento de la muestra una digestión ácida,
ya que ésta es una metodología contrastada y convencional para este tipo
de muestras (Chan et al., 2006). De este modo, fue posible correlacionar los
valores obtenidos con cada metodología (la propuesta y la convencional) para
cada tamaño de partícula estudiado. En la Tabla 4 se muestran los resultados
obtenidos, demostrándose que en el intervalo estudiado el tamaño de partícula
no influye en la determinación de estos metales con la metodología propuesta,
ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos (mayores de 95%).
Esto simplifica el análisis, ya que no hay que realizar un tamizado exhaustivo
para seleccionar un tamaño de partícula concreto y muy pequeño de la
muestra antes de insertarla en el dispositivo automático de determinación de
los metales.
Determinación de calcio y magnesio
Para realizar la optimización de los parámetros que afectan a la
extracción de Ca y Mg de las muestras de algas, también se ha utilizado
un diseño factorial. Al igual que en el estudio de la optimización de las
Tabla 4. Determinación de Zn, Cu, Fe y Mn. Experimentos realizados en porciones de
muestra con diferente tamaño de partícula.
*DA: Digestión ácida de la muestra
**MP: Método propuesto
25
variables implicadas en la extracción de Zn, Cu, Fe y Mn, se ha elegido
como diseño de screening el diseño de Plackett-Burman. En este caso, las
variables a optimizar para el dispositivo FIA (Figura 3) son las siguientes:
concentración de HNO3 (disolución extractante), concentración de HCl
(disolución extractante), tiempo de extracción, temperatura de extracción,
caudal de extracción, volumen de disolución extractante y concentración
de la disolución de lantano. Como se puede observar, se ha incluido como
variable la concentración de lantano, a pesar de no ser una variable implicada
directamente en el proceso de extracción. Esto se explica porque para poder
realizar la determinación tanto del calcio como del magnesio, es necesario
eliminar las posibles interferencias químicas que sufren estos dos metales
en la celda de atomización. Además, el extracto ácido debe diluirse, ya que
las concentraciones de estos dos metales presentes en las muestras objeto de
estudio son muy elevadas. De hecho, según el límite de linealidad de estos
metales, 5 y 0,5 µg/mL, para Ca y Mg, respectivamente, y teniendo en cuenta
las concentraciones a las que se pueden encontrar estos metales en las algas
marinas, se escogieron respectivamente, como caudal de portador y caudal de
dilución 0,2 y 5,8 mL/min, lo que supone realizar en línea una dilución 1:30. Para
realizar el diseño de screening es necesario considerar para cada variable un
valor máximo y uno mínimo. Estos valores fueron seleccionados en función
de experimentos realizados en estudios previos (Tabla 5).
Tabla 5. Determinación de Ca y Mg. Variables y niveles considerados para el diseño
factorial de screening.
26
El diseño factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^7*3/32 que implica
realizar 13 experimentos (considerando un punto central) (Statgraphics Plus
v.5.1). Para realizar los experimentos establecidos por la matriz del diseño
se utilizó el material de referencia certificado (NIES-9,”Sargasso”, National
Institute for Environmental Studies, Japan). La concentración certificada es
de 1,34 ± 0,05 y 0,65 ± 0,03 %, para Ca y Mg, respectivamente. La cantidad de
material de referencia utilizada para optimizar el proceso (fijada en función de
la concentración) fue de 30 y 5 mg, para Ca y Mg, respectivamente. La variable
respuesta considerada ha sido el % EF. La matriz del diseño de Plackett-Burman
con los valores que toma cada variable en cada experimento y el % EF obtenido
para el Ca y el Mg, se muestran en la Tabla 6. Los experimentos se han realizado
Tabla 6. Matriz del diseño de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada
variable en cada experimento para la determinación de Ca y Mg. A, [HNO3]; B, [HCl]; C,
Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción; F, Volumen
de disolución extractante; G, concentración de la disolución de lantano.
por duplicado, por lo que el % EF indicada es la media de estos dos
experimentos.
Una vez realizados los experimentos, se analizaron los datos mediante las
Cartas Pareto estandarizadas (Figura 7).
27
Figura 7. Cartas Pareto estandarizadas para la determinación de Ca y Mg. A, [HNO3];
B, [HCl]; C, Tiempo de extracción; D, Temperatura de extracción; E, Caudal de extracción;
F, Volumen de disolución extractante; G, Concentración de la disolución de lantano.
A partir del estudio de las cartas Pareto (Figura 7) se pueden establecer
las siguientes conclusiones en función de cada variable:
Concentración de ácido nítrico (A): Para Ca y Mg la concentración de
HNO3 es una variable estadísticamente significativa con efecto estimado
positivo.
Concentración de ácido clorhídrico (B): No es una variable estadísticamente
significativa, aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción
de Ca y Mg.
Tiempo de extracción (C): No es una variable estadísticamente significativa.
Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extracción de Ca y Mg.
Temperatura de extracción (D): No es una variable estadísticamente
significativa, y presenta efectos estimados muy pequeños para la extracción
de Ca y Mg. Esto indica que esta variable prácticamente no influye en el
proceso de extracción.
Caudal de extracción (E): No es una variable estadísticamente significativa
para la extracción de estos dos metales. Aunque presenta un efecto estimado
positivo.
Volumen de disolución extractante (F): En ninguno de los casos es una
variable estadísticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado
positivo, aunque éste no es muy elevado.
28
Concentración de la disolución de lantano (G): Para Ca y Mg la
concentración de la disolución de lantano es una variable estadísticamente
significativa con efecto estimado positivo. Esto demuestra que es necesaria
esta disolución para eliminar las interferencias producidas por la formación
de compuestos estables a la temperatura de llama.
Se realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseño,
de acuerdo con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los
valores óptimos de cada una de las variables que afectan a la extracción de
Ca y Mg. Se comenzó por aquellas variables no significativas y se comprobó
que un volumen de disolución extractante de 5 mL y una temperatura de
extracción de 20ºC pueden ser los valores óptimos para estas variables, ya que
con ellos se obtienen eficacias en la extracción cuantitativas (experimento 1
de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Si se tiene en cuenta que el caudal
de extracción presenta un efecto estimado positivo y que en los experimentos
5 y 11 de la matriz de Plackett-Burman (Tabla 6) se consiguen eficacias en
la extracción cuantitativas, un caudal de extracción de 6 mL/min podía ser
considerado como óptimo para la extracción de Ca y Mg.
Al estudiar el tiempo de extracción (Figura 8) se puede ver que aunque
esta variable presenta un efecto estimado bastante importante y positivo, son
suficientes 0,5 min para extraer cuantitativamente el Ca y el Mg en este tipo
de muestras.
Figura 8. Optimización del tiempo de extracción para Ca y Mg. [HNO3]=3 M; [HCl]=3
M; Temperatura de extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min; Volumen de
disolución extractante= 1 mL; Concentración de la disolución de lantano= 2%.
29
Además, se estudió la posibilidad de eliminar el ácido clorhídrico de la
disolución extractante, ya que su concentración resultó ser una variable no
estadísticamente significativa en el diseño de screening. Así, los estudios
realizados deteminaron que si se elimina se obtienen eficacias en la
extracción cuantitativas (98,7-101,7%), lo cual también se puede corroborar
con los experimentos 1 y 11 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Una
vez comprobado que se podía eliminar el ácido clorhídrico de la disolución
extractante, se estudió la posibilidad de disminuir la concentración de ácido
nítrico al máximo. Como se observa en la Figura 9, fue posible disminuir la
concentración de este ácido hasta un valor de 0,5 M para la extracción del
Mg, mientras que para la extracción de Ca la mínima concentración de ácido
nítrico necesaria para extraer cuantitativamente este metal debía ser de 3M.
Figura 9. Optimización de la concentración de ácido nítrico utilizado como disolución
extractante para Ca y Mg. [HCl]=0 M; Tiempo de extracción= 0,5 min; Temperatura de
extracción= 20 ºC; Caudal de extracción= 6 mL/min; Volumen de disolución extractante= 5 mL;
Concentración de la disolución de lantano= 2%.
Por último, se estudió la variable concentración de la disolución de
lantano. Así, se comprobó que para ambos metales, la concentración de la
disolución de lantano, necesaria para eliminar las interferencias, no podía ser
menor del 2%.
Al realizar la optimización de las distintas variables que afectan al proceso
de extracción ácida se han utilizado las cantidades de muestra antes indicadas.
30
En este caso, también se ha investigado la posibilidad de analizar cantidades
de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad de la
metodología analítica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido en
cuenta la sensibilidad de ambos metales en el espectrofotómetro de absorción
atómica con llama y la concentración normalmente existente en las muestras
de algas. Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que con las
condiciones óptimas establecidas es posible utilizar cantidades de muestra
hasta 50 y 10 mg, para Ca y Mg, respectivamente. Cantidades mayores no se
probaron porque esto requeriría aumentar el caudal del canal de dilución del
dispositivo FIA para no sobrepasar el límite de linealidad del detector.
Se analizaron diferentes porciones de la misma muestra de alga con
diferentes tamaños de partícula (menor de 30 y entre 30 - 200 µm) con el
objetivo de estudiar si la variable tamaño de partícula influía en el proceso de
extracción de Ca y Mg de las muestras de algas. En la Tabla 7 se muestran los
resultados obtenidos, demostrándose que en el intervalo estudiado el tamaño
de partícula no influye en la determinación de estos metales con la metodología
propuesta, ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos.
Tabla 7. Determinación de Ca y Mg. Experimentos realizados en porciones de muestra
con diferente tamaño de partícula.
*DA: Digestión ácida de la muestra
**MP: Método propuesto
Características analíticas de los métodos propuestos para la determinación
de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas
Con el objetivo de estudiar las posibles interferencias que puede provocar
la matriz de la muestra, es decir la influencia de los demás componentes de
31
las algas, se comparó para cada uno de los casos la pendiente de la recta de
calibrado con la obtenida para la recta de adición. Los resultados obtenidos
aparecen en la Figura 10. Como se puede observar en esta Figura, en todos
los casos la recta de calibrado y la recta de adición son paralelas. Dicho
paralelismo se corroboró mediante la aplicación de un test estadístico t para
un nivel de significación del 95%. Por todo ello, se puede decir que no existe
efecto matriz para la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en las muestras de
algas por el método propuesto. Lo que se traduce en que se puede utilizar
únicamente la recta de calibrado correspondiente para relacionar la señal de
la muestra con la concentración existente de cada metal.
Figura 10. Rectas de calibrado y adición para Zn, Cu, Fe y Mn.
Se calculó el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ)
y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para
la determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas por el método
propuesto. Los resultados obtenidos para cada uno de estos parámetros se
muestran en la Tabla 8.
La comprobación de la exactitud de la metodología analítica propuesta se
realizó de tres maneras: realizando el test de pares de valores (comparación con
32
un método convencional de pretratamiento de la muestra realizando la digestión
de la misma con ácidos concentrados), estudio de la recuperación analítica y
mediante la utilización de un material de referencia. Los valores obtenidos en
el test de pares de valores sobre diferentes muestras resultaron comparables
estadísticamente al 95% de probabilidad, es decir, no hay diferencias entre los
resultados obtenidos por los dos métodos. El estudio de la recuperación del
método se realizó analizando una muestra real de alga. En el análisis de esta
muestra se utilizaron disoluciones extractantes (HNO3 0,1M para Zn, HNO3 3 M
para Cu y Fe, y HNO3 0,5 M para Mn) a las que se le habían adicionado distintas
concentraciones de cada metal (0,1; 1,0; 1,0 y 0,5, µg/mL, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente). Los resultados obtenidos fueron 98,7, 96,8, 101,3 y 99,3%,
para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Se analizó un material de referencia
(NIES-9,”Sargasso”, National Institute for Environmental Studies, Japan), de
Tabla 8. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinación de Zn, Cu, Fe y Zn en algas
para distintas cantidades de muestra.
composición elemental típica de un alga marina parda. El contenido certificado,
para los metales en este material de referencia es: 15,6 ± 1,2; 4,9 ± 0,2; 187
33
± 6 y 21,2 ± 1,0 µg/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Los resultados
obtenidos para el análisis de estos metales por el método propuesto fueron
los siguientes (media ± desviación estándar, n=3): 15,0 ± 0,2; 5,1 ± 0,1; 183,7
± 1,1 y 20,9 ± 0,2 µg/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Con todos
estos datos se puede decir que el procedimiento utilizado para realizar la
determinación de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas mediante la metodología
automática propuesta es exacto.
La precisión se estudió en base al cálculo de la repetibilidad de la
metodología propuesta. Para ello, se aplicó el método propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos expresados como
coeficiente de variación fueron los siguientes: 1,3; 2,0; 0,6 y 1,0%, para Zn,
Cu, Fe y Mn, respectivamente.
Se calculó la frecuencia de muestreo del método propuesto considerando
la duración de la etapa de extracción y la duración de la etapa de medida (20
s). De esta manera, las frecuencias de muestreo para los distintos metales
fueron las siguientes: 60, 36, 36 y 60 muestras/h, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente.
Características analíticas de los métodos propuestos para la determinación
de Ca y Mg en muestras de algas
Como se puede observar en la Figura 11, la recta de calibrado y la recta
de adición son paralelas. Este paralelismo se comprobó mediante la aplicación
de un test estadístico t para un nivel de significación del 95%. Por todo ello,
es posible concluir que no existe efecto matriz para la determinación de Ca y
Mg en las muestras de algas por el método propuesto.
Figura 11. Rectas de calibrado y adición para Ca y Mg.
34
Se calculó el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ)
y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para
la determinación de Ca y Mg en muestras de algas por el método propuesto.
Los resultados obtenidos para cada uno de estos parámetros se muestran en
la Tabla 9.
La comprobación de la exactitud de la metodología analítica propuesta se
realizó mediante el estudio de la recuperación analítica y analizando un material
de referencia certificado. El estudio de la recuperación del método se realizó
analizando una muestra real de alga. En el análisis de esta muestra se utilizaron
disoluciones extractantes (HNO3 3 M para Ca y HNO3 0,5 M para Mg) a las que
se le habían adicionado distintas concentraciones de cada metal (20 y 1 µg/mL,
para Ca y Mg, respectivamente). Los resultados obtenidos para la recuperación
analítica fueron 98,7 y 101,0%, para Ca y Mg, respectivamente). Lo que significa
Tabla 9. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinación de Ca y Mg en algas para
distintas cantidades de muestra.
que se obtiene una recuperación cuantitativa en ambos casos. Además, se
analizó un material de referencia (NIES-9,”Sargasso”, National Institute
for Environmental Studies, Japan). El contenido certificado, para Ca y
Mg en este material de referencia es 1,34 ± 0,05 y 0,65 ± 0,03%, para Ca
y Mg, respectivamente. Los resultados obtenidos para la determinación
de estos metales en el material de referencia por la metodología propuesta
35
(media ± desviación estándar, n=3) fueron 1,33 ± 0,02 y 0,66 ± 0,01%, para Ca
y Mg, respectivamente.
La precisión se estudió en base al cálculo de la repetibilidad de la
metodología propuesta. Para ello, se aplicó el método propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos para el estudio de la
precisión expresados como coeficiente de variación estaban en el intervalo
0,9-1,4%, demostrándose la precisión de la metodología analítica propuesta.
Se calculó la frecuencia de muestreo del método propuesto considerando
la duración de la etapa de extracción (0,5 min) y la duración de la etapa de
medida (25 s). Así, la frecuencia de muestreo para Ca y Mg resultó ser de 55
muestras/h.
APLICACIÓN
DE
LAS
METODOLOGÍAS
ANALÍTICAS
DESARROLLADAS. DETERMINACIÓN DE Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y
Mg EN ALGAS MARINAS DESTINADAS A LA ALIMENTACIÓN
HUMANA PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA
Los métodos propuestos fueron aplicados para la determinación de de Zn,
Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentación humana
producidas y procesadas en Galicia. Las muestras analizadas se adquirieron
en supermercados y tiendas de alimentación. Estas algas son las siguientes:
Algas rojas: Agar-agar Atlántica (Gelidium sesquipedale), Dulse
(Palmaria palmata), Musgo de Irlanda (Chondrus crispus) y Nori (Porphyra
umbilicalis).
Algas pardas: Wakame (Undaria pinnatifida), Espagueti de Mar
(Himanthalia elongata), Kombu (Laminaria ochroleuca) y Kombu de azúcar
(Laminaria saccharina).
Algas verdes: Lechuga de mar (Ulva rigida).
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.
CONCLUSIONES
Las ventajas que presenta la metodología automática propuesta frente a los
métodos analíticos utilizados hasta el momento para realizar la determinación
de metales en muestras de algas son las siguientes:
36
Tabla 10. Resultados obtenidos para las muestras de algas analizadas: concentraciones
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg. Media ± desviación estándar (n= 3 determinaciones).
* Concentraciones expresadas en % (g metal /g muestra) x 100
- Se utiliza una cantidad de muestra menor: 5-160 mg frente a 0,2-0,5 g.
- El modo dinámico del los sistemas y la reducción del tamaño de muestra
hacen que se pueda reducir el tiempo necesario para realizar cuantitativamente
la extracción de los metales: 0,5-2 min frente a 30-35 min.
- La extracción tiene lugar con ácidos diluidos (0,1-3 M HNO3) y a
temperatura ambiente.
- Debido a la miniaturización, se reduce el volumen de reactivos, lo cual
además, en el caso del volumen de la disolución extractante, incrementa la
sensibilidad del sistema.
- Se evita la contaminación de la muestra y las pérdidas de analito debido
a una mínima manipulación de la muestra.
- Se evitan las etapas de centrifugación y filtración para la separación
de la fase líquida del residuo sólido (matriz de la muestra). Este punto con el
punto nº 2 hacen que se produzca una disminución considerable del tiempo de
tratamiento de la muestra.
- Se produce un incremento en la calidad de la metodolgía analítica
inherente a la metodología FIA utilizada.
37
Los metales esenciales, también denominados biometales, son los que
están presentes en los organismos vivientes y ejercen una función biológica
insustituible. Un déficit en el organismo de un metal esencial conduce a serias
alteraciones biológicas. Actualmente la Organización Mundial de la Salud
considera entre otros metales esenciales para la salud humana a Zn, Cu, Fe,
Mn, Ca y Mg. En las algas estudiadas se encuentra un contenido importante
de metales, lo que representa un alto valor nutritivo para este alimento. Según
los datos obtenidos, las algas más ricas en Zn son Nori y Espagueti de mar,
el alga más rica en cobre es la Dulse, las algas más ricas en hierro son Dulse
y Lechuga de mar, las algas más ricas en manganeso son Dulse y Lechuga
de mar, las algas más ricas en calcio son Espagueti de Mar y Wakame, y
el alga más rica en magnesio es la Lechuga de mar. Estas concentraciones
suponen una concentración de metales esenciales mayor que la que presentan
los vegetales “terrestres” (Mataix Verdú, 1998).
38
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA SELENOMETIONINA
SOBRE LA REPARACIÓN DEL DAÑO EN EL ADN
VANESSA VALDIGLESIAS1,2*,1 BLANCA LAFFON 2, EDUARDO
PÁSARO 2 Y JOSEFINA MÉNDEZ 1
1
Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidade da Coruña.
Facultad de Ciencias, Campus A Zapateira s/n, 15071 A Coruña, España.
2
Unidad de Toxicología. Departamento de Psicobiología. Universidade da Coruña.
Edificio de Servicios Centrales de Investigación, Campus Elviña s/n, 15071 A Coruña, España.
E-mail: [email protected]
RESUMEN
En este estudio se han evaluado los efectos de la selenometionina (SeMet),
un derivado orgánico de selenio, sobre la inducción, reparación y persistencia
del daño en el ADN inducido por la bleomicina (BLM) sobre leucocitos
humanos. Se empleó el ensayo del cometa para determinar las roturas de
cadena en el ADN, y el tratamiento con la enzima de reparación hOGG1 para
el estudio específico del daño oxidativo. La SeMet fue añadida a los leucocitos
durante el cultivo (A), la exposición a BLM (B) y/o durante el periodo de
reparación (C). El ensayo del cometa se realizó al término de cada una de las
fases. Los resultados obtenidos describen un posible papel antigenotóxico de
la SeMet sobre el daño en el ADN inducido por la BLM, y también sobre la
reparación y la persistencia de este daño, cuando se aplica antes o junto con
la BLM.
Palabras clave: selenometionina, bleomicina, ensayo del cometa, daño
oxidativo, antigenotoxicidad.
*Premio Academia Galega de Ciencias-Fundación CaixaGalicia a Jóvenes Investigadores,
convocatoria año 2007.
42
SUMMARY
The effects of the organic selenium compound selenomethionine (SeMet)
on the induction, repair and persistence of DNA damage was evaluated in
human leukocytes challenged with bleomycin (BLM). Comet assay was used
to determine DNA strand breaks, and incubation with the repair enzyme
hOGG1 for the specific recognition of oxidative damage. SeMet was added to
the leukocytes during the culture (A), the exposure to BLM (B) and/or during
the repair period (C). Our results showed antigenotoxic effect of SeMet on
BLM-induced DNA damage and also on repair and persistence of this damage
when applied before and simultaneously with BLM.
Key words: selenomethionine, bleomycin, comet assay, oxidative damage,
antigenotoxicity.
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Selenio
1.1.1. Descripción
El selenio (Se) es un elemento traza presente en todos los organismos
y esencial para el funcionamiento normal de muchos procesos celulares.
Desempeña una gran variedad de funciones en los sistemas biológicos,
algunas de las cuales residen en su capacidad de actuar como antioxidante
y elemento de prevención de enfermedades (Letavoyavá et al., 2006). No
obstante, dependiendo de su forma química, el Se también puede actuar
como agente tóxico pro-oxidante que puede inducir daño en el ADN y
muerte celular (Spallholz, 1994). Dada esta dualidad que presenta el Se, el
conocimiento exacto de las funciones que desempeña en el organismo y de
su modo de acción a distintos niveles es considerado de gran interés para la
salud humana.
El Se fue descubierto en 1817 por el químico sueco Jakob Berzelius y su
toxicidad se determinó casi desde ese momento. Sin embargo, no se describió
su papel nutricional hasta los años 50 del siglo XX, definido como esencial y
aplicado en pasto de ganado y otros organismos. Comienza entonces un gran
auge de estudios toxicológicos con Se en microorganismos, plantas, animales
y en mucha menor medida en humanos, para esclarecer las causas de la
toxicidad, determinar umbrales de ingesta y evaluar sus efectos beneficiosos
para el organismo.
43
Casi 20 años después comienzan los estudios del posible papel preventivo
del Se frente al cáncer. En 1973 J.T. Rotruck y colaboradores publicaron la
primera demostración del papel funcional del Se estableciendo las bases
bioquímicas y la relación del Se con la enzima glutation-peroxidasa implicada
en la defensa antioxidante celular y relacionada, en consecuencia, con la
aparición y desarrollo de procesos cancerígenos (Aboul-Fadl, 2005).
Desde entonces, se han multiplicado considerablemente los estudios
con Se, haciéndose especialmente importantes los llevados a cabo in vivo en
mamíferos. La mayoría de estos trabajos apoyan el hecho de que los posibles
efectos beneficiosos o anticancerígenos del Se dependen de su forma química
y de su concentración (Ip, 1998). Los primeros estudios con Se empleaban
formas inorgánicas como el selenito, el selenato o sus respectivas sales sódicas
(Lawson y Birt, 1983; Khalil, 1989; Yu et al., 1991). Aunque varios de estos
trabajos señalaban que un suplemento en la dieta con sales de Se resultaba en
una menor incidencia de cáncer u otras patologías (Yu et al., 1991 y 1997; Feng et
al., 1999), en otros se concluyó que las sales no sólo no disminuían la incidencia,
sino que ejercían efectos adversos sobre el organismo, principalmente debidos
a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) resultantes de su
metabolismo (Khalil, 1989; Biswas et al., 1999; Wycherly et al., 2004).
Bioquímicamente, el Se es un análogo del azufre por lo que presenta muchas
similitudes en sus propiedades físico-químicas (valencias, tamaños atómicos,
bandas energéticas, potenciales de ionización, afinidades electrónicas…)
aunque difiere en otras pocas (se metaboliza a estados más reducidos,
presenta mayor acidez al interaccionar con el hidrógeno) lo que confiere a los
compuestos de Se una mayor eficacia como agentes antitumorales frente a sus
análogos sulfurados (Briviba et al., 1996; Aboul-Fadl, 2005).
Se han identificado entre 30 y 50 selenoproteínas importantes (25 de
ellas en humanos), se han caracterizado completamente 20 por análisis de
sus secuencias y se ha asignado función enzimática al menos a 10 de ellas
(Hesketh y Villete, 2002). Todas contienen Se en su estructura y realizan
funciones celulares importantes, la mayoría relacionadas con la defensa
celular y la maquinaria de reparación. De entre las selenoproteínas más
importantes y estudiadas destacan la familia de las glutation-transferasas y la
de las tiorredoxin-reductasas (Thomson, 2004).
Tanto en la naturaleza como en la dieta, y en consecuencia en el
organismo, el Se se puede presentar en distintas formas. El Se orgánico está
44
presente en los alimentos principalmente en forma de selenocisteína (SeCys),
selenometionina (SeMet) y metilselenocisteína (MeSeCys), mientras que
las formas inorgánicas, como el selenito o el selenato, son mucho menos
frecuentes y están en concentraciones mucho más bajas. De las formas
orgánicas, la SeMet es la forma predominante en la mayoría de las dietas
ricas en Se (Letavayová et al., 2006).
1.1.2. Toxicidad
Exposición elevada
A niveles elevados, el Se puede resultar tóxico para el organismo,
conociéndose esta toxicidad desde hace varios siglos (Tinggi, 2003). En
humanos, la toxicidad producida por Se se presenta principalmente en
individuos expuestos a dosis elevadas o prolongadas en el tiempo.
Los síntomas de la intoxicación por Se, o selenosis, incluyen erupciones,
fragilidad de uñas y pelo, paroniquia, decoloración en las uñas, aliento con
olor a ajo (debido a la espiración de dimetilseleniuro), formación de vesículas
e infecciones secundarias. En exposiciones más severas, el envenenamiento
se agudiza llegando a producir caída de pelo, uñas y dientes, lesiones en la
piel, alteraciones del sistema nervioso, fatiga, irritabilidad, flacidez muscular,
temblores, etc. (Ammar y Couri, 1981; Aboul-Fadl, 2005).
Dos razones fundamentales explican la toxicidad del Se. Por un lado la
capacidad de producir ROS durante su metabolismo (Spallholz, 1994 y 1997),
y por otro la reducción a otros compuestos mutagénicos que se forman a partir
de los compuestos originales de Se (Whiting et al., 1980).
La toxicidad del Se depende no obstante de diversos factores. La forma
química y la cantidad suministrada parecen ser los más importantes pero
también influyen otros como la edad, el estado fisiológico, interacciones
con otros nutrientes o componentes de la dieta, la ruta de administración,
etc. (Aboul-Fadl, 2005). En general se piensa que la toxicidad del Se se
manifestará de forma aguda o crónica cuando el daño oxidativo que provoca
como consecuencia de su metabolismo supere las defensas antioxidantes que
posee la célula (Nogueira et al., 2004).
Se estimó que la cantidad más baja de Se suministrado a la cual se
producen efectos adversos para el organismo (LOAEL, Lowest Adverse Effect
Level) es de 1540±653μg/día (Yang et al., 1989), y la cantidad de Se a la que
45
no se espera ningún efecto adverso (NOAEL, No Adverse Effect Level) es de
819±126μg/día (Whanger et al., 1996).
Deficiencia
Además de la toxicidad que presenta el Se per se, se ha relacionado la
deficiencia de este elemento en el organismo con la incidencia de varios tipos
de cáncer, aparición y progresión de diversas patologías, mayor virulencia
de determinadas infecciones y alteraciones de los sistemas nervioso,
inmunológico y cardiovascular (revisado en Thomson, 2004; Patrick, 2004).
Dos enfermedades, ya descritas, y relacionadas con la deficiencia de Se en
la dieta son la enfermedad de Keshan caracterizada por una anomalía del
músculo cardíaco, y la enfermedad de Kashin-Beck, que ocasiona alteraciones
articulares y óseas (Beck et al., 2003; Thomson, 2004).
Varios estudios describen una relación inversa entre la cantidad de Se en el
organismo y la incidencia de cáncer (Alaejos et al., 2000; Surai, 2006). Se vio
que individuos con bajos niveles de Se en plasma presentaban una incidencia
significativamente mayor de leucemia y de cáncer de intestino, recto, próstata,
pulmón, ovario y mama. También se describió una asociación inversa aunque
no significativa entre Se ingerido y cáncer de páncreas, piel y vejiga (revisado
en Schrauzer et al., 1977).
La deficiencia de Se viene acompañada de un descenso en la respuesta
inmune, por lo que está ligada a la aparición, virulencia y progresión de
algunas infecciones virales como el SIDA (Beck et al., 2003). Este elemento
también parece ejercer un efecto protector en pacientes con hepatitis vírica
(B o C) contra la progresión hacia el cáncer de hígado (revisado en Rayman,
2000). El sistema nervioso puede verse también alterado por niveles deficientes
de Se. Se ha descrito que una baja concentración de Se puede afectar a los
neurotransmisores, pudiendo relacionarse con el desarrollo de la enfermedad
de Alzheimer y con una aceleración de procesos seniles. Además una
aportación de Se en la dieta reduce los ataques epilépticos en niños (revisado
en Rayman, 2000).
En mujeres, bajos niveles de Se incrementan el riesgo de aborto y
en hombres se ha relacionado con deficiencias en la movilidad de los
espermatozoides y variaciones en la fertilidad (Letavayová et al., 2006). El
Se tiene importancia además en la función tiroidea, ya que está relacionado
con la correcta actividad de ciertas hormonas tiroideas (Patrick, 2004).
46
1.1.3. Estudios de suplementación con selenio
En 1984, Shamberger publica una recopilación de los principales estudios
realizados hasta la fecha con Se destacando la ambigüedad de los resultados.
Resume sus efectos genotóxicos, mutagénicos y antimutagénicos en diferentes
organismos y ya entonces, concluye que el Se es un agente mutagénico,
principalmente a niveles elevados, aunque a niveles nutricionales puede actuar
como anticarcinogénico en cáncer de mama, colon, riñón y cáncer de piel. En
las últimas décadas, el estudio de la administración de Se en la dieta como
posible método de prevención del cáncer o disminución del desarrollo de esta
enfermedad se ha hecho más frecuente. Varios son los trabajos desarrollados
in vitro, también los realizados con animales y algo menos con humanos
(revisados en Whanger, 2004; Rayman, 2005). En ellos los resultados han
sido diversos atendiendo a la forma y a la cantidad de Se empleadas.
Efectos beneficiosos
Partiendo de los efectos nocivos que provocan los bajos niveles de Se en el
individuo y buscando el resultado contrario comenzó a estudiarse la posibilidad
de que un suplemento de Se en el organismo tuviese efectos beneficiosos para
el mismo. Se han publicado numerosos trabajos en las últimas décadas donde
ciertamente se demuestra un efecto protector o beneficioso de este compuesto
(revisado en Schrauzer, 2000a y Patrick, 2004). Algunos estudios indican que
el Se confiere estabilidad genómica a células prostáticas cancerígenas (Dong
et al., 2003; Karunasinghe et al., 2004; Morris et al., 2006). Además, en
los ensayos clínicos realizados con suplementación con Se, se encontró que
reduce la incidencia y la mortalidad del cáncer en general (Clark et al., 1996),
del cáncer de próstata (Duffield-Lillico et al., 2002), del cáncer de hígado (Yu
et al., 1997), del cáncer de estómago (Blot et al., 1993) y del cáncer de pulmón
(Reid et al., 2002). En general, las evidencias epidemiológicas en humanos
indican una relación significativamente inversa entre los niveles de Se y el
riesgo de cáncer (Ganther, 1999).
Los posibles efectos anticancerígenos del Se pueden estar estrechamente
relacionados con su papel en la reducción del estrés oxidativo por las
selenoproteínas, con su capacidad de incrementar la respuesta inmune o, más
probablemente, con su capacidad para producir metabolitos antitumorales
(como el metilselenol o sus precursores) que pueden perturbar el metabolismo
de las células tumorales, inhibir la angiogénesis e inducir la apoptosis de las
47
células cancerígenas (Rayman, 2000 y 2005; Whanger, 2004; Aboul-Fadl,
2005). Además de su relación con los procesos cancerígenos, también se observó
que el suministro de Se puede reducir la progresión de la infección por VIH en
pacientes portadores (Hurwitz et al., 2007), estimular la reparación del daño
en el ADN inducida por distintos carcinógenos (Lawson y Birt, 1983; Kibriya
et al., 2007, Luchese et al., 2007), preservar a las células de los efectos de una
exposición a radiación UV (Rafferty, 1998 y 2003) y proteger al organismo de
la toxicidad de otros compuestos como el plomo (Aykin-Burns y Ercal, 2006),
el mercurio (Lemire et al., 2006) o el cadmio (Frisk et al., 2002).
Además, al igual que varios estudios sugerían que la deficiencia en Se está
acompañada por una pérdida de inmunocompetencia, también se encontró
que una suplementación con Se estimula el sistema inmunológico: linfocitos
de voluntarios suplementados con Se en la dieta (en forma de selenito sódico)
mostraron un aumento en la respuesta a la estimulación antigénica y una
mayor capacidad de convertirse en linfocitos citotóxicos y de destruir células
tumorales (Kiremidjian-Schumacher et al., 1994). En general, se cree que las
células del sistema inmune pueden tener una necesidad funcional importante
de Se (Rayman, 2000; Arthur et al., 2003).
Efectos adversos
A pesar de todos los estudios in vitro e in vivo realizados en distintos
organismos que defienden los efectos beneficiosos de los compuestos de Se,
otros trabajos pusieron de manifiesto los posibles efectos adversos que se
pueden llegar a producir tras la administración. Se encontró que producían
aberraciones cromosómicas y alteraciones en la estructura cromosómica
en linfocitos humanos (Khalil, 1989; Biswas et al., 2000) y en células de
ratones cuya dieta había sido previamente suplementada con Se (Biswas et al.,
1999), aumentó la incidencia del cáncer de piel no melanómico en personas
suplementadas con Se en dieta (Duffield-Lillico et al., 2003) y produjo estrés
oxidativo en células y organismos tratados con este compuesto (Wycherly et
al., 2004) llegando en algunos casos a alterar funciones celulares importantes
(Brown et al., 2000). Todos los trabajos realizados concluyeron que tanto
la toxicidad como el efecto quimiopreventivo del Se vienen determinados
por diversos factores, principalmente la forma química y la concentración
empleadas en cada caso.
48
1.2. Selenometionina
1.2.1. Introducción histórica
La selenometionina (SeMet) es un aminoácido análogo a la metionina
(Met) que contiene Se sustituyendo al átomo original de azufre (Figura 1).
La forma isomérica L es la fuente natural común en los alimentos ricos en
Se. Este compuesto no puede ser sintetizado por animales superiores, que
lo obtienen a través de la dieta, principalmente de las plantas que sí pueden
incorporarlo a sus proteínas sustituyendo a la metionina de forma inespecífica
(Schrauzer, 2000b).
Figura 1. Estructura química de metionina (a) y selenometionina (b).
En los años 50-60 del siglo XX se identificó la SeMet como una proteína
presente en determinadas plantas y se demostró también que era producida
por Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Escherichia coli, bacterias
del rumen y algas marinas que crecían en medio que contiene Se (Schrauzer,
2000b). Pero no se supo mucho de la SeMet hasta los años 70 cuando se
permitió su uso en alimentación animal. A mediados de esta década salen al
mercado las primeras levaduras ricas en Se. Pronto se vio que la SeMet era
bien absorbida y retenida por el organismo (Griffiths et al., 1976), por lo que
su empleo desde entonces en dietas que necesitan aportación de Se ha ido en
aumento. En 1983, levaduras ricas en SeMet fueron escogidas como fuente de
Se en algunos tratamientos preventivos contra el cáncer (Schrauzer, 2001).
En Junio de 2000, fue aprobado el uso de levaduras con Se en alimentación
animal por la FDA (Food and Drug Administration), a partir de este momento
comienza una sustitución paulatina de las sales de Se por levaduras como
complemento en la dieta hasta la actualidad, en que prácticamente todo
el Se suplementado se administra en forma de levaduras enriquecidas
(Schrauzer, 2001). La SeMet es la forma predominante de Se en dietas ricas
en este compuesto (Letavayová et al., 2006) y ha sido encontrado como el
principal componente de levaduras enriquecidas usadas como suplemento de
Se en la dieta (Ayouni et al., 2007).
49
Actualmente, y basándose en estudios en humanos, se han establecido
unos límites en la dieta, máximo de 400μg/día y mínimo de 40μg/día,
dentro de los cuales no se presentan efectos adversos. Una ingesta superior
a los 3200-5000μg/día suele implicar la aparición de selenosis y por debajo
de los 11μg/día se producen problemas graves de salud por carencia de Se
(enfermedad de Keshan). Es por esto que en quimioprevención se utiliza el Se
en dosis limitadas (Letavoyavá et al., 2006).
1.2.2. Metabolismo
La SeMet se absorbe con facilidad y, o es inmediatamente metabolizada,
o bien es incorporada en la estructura de las proteínas siendo almacenada
principalmente en el páncreas (Suzuki et al., 2006a). Las células no
distinguen entre Met y SeMet durante la síntesis de proteínas, así que este
selenoaminoácido natural se incorpora inespecíficamente en el cuerpo de las
proteínas (la albúmina, por ejemplo) en lugar de la Met, tanto si ésta es factor
limitante como si no (Letavayová et al., 2006). El reemplazamiento de Met
por SeMet no produce, como norma general, alteraciones estructurales en
la proteína que lo porta, pero puede influir en la actividad de la enzima si
la SeMet sustituye a la Met en una posición próxima al sitio activo. Como
el grupo Se-CH3 de la SeMet es más hidrofóbico que el grupo S-CH3 de la
Met, el acceso del sustrato puede verse afectado, alterando los parámetros
cinéticos de la proteína (Schrauzer, 2000b).
Figura 2. Metabolismo de la SeMet.
50
En la Figura 2 se muestran las posibles rutas metabólicas de la SeMet. Una
de ellas la constituye la conversión de SeMet por la vía de trans-selenación
en SeCys (similar a la trans-sulfuración del metabolismo de la Met); la SeCys
es seguidamente convertida a H2Se siguiendo la ruta metabólica habitual de
este compuesto (Esaki et al., 1981). Por otra parte, la SeMet puede generar
un importante metabolito secundario: el metilselenol (Suzuki et al., 2006b).
Esta ruta está catalizada por la metionina-α,γ-liasa, también conocida como
metioninasa (Meuillet, et al., 2004). El metilselenol podrá luego dar lugar a
H2Se por acción de una demetilasa o excretarse en la orina tras una serie de
reacciones (Suzuki et al., 2006c).
1.2.3. Estudios con selenometionina
Puesto que la historia de la SeMet es reciente, los estudios sobre su
caracterización y aplicación se centran en las últimas décadas, intensificándose
recientemente debido a las aparentes propiedades beneficiosas que parece tener
y a la posibilidad de ser empleado en la prevención de patologías e infecciones
severas. Los resultados obtenidos en los diferentes trabajos realizados son
bastante heterogéneos incluso en muchos casos contradictorios, por lo que se
requieren más estudios que profundicen en sus efectos.
Efectos beneficiosos
Distintos trabajos in vitro defienden los beneficios de la SeMet y las
ventajas de su empleo frente a otras fuentes de Se. Varios estudios descartan
su citotoxicidad (Stewart et al., 1999; Seo et al., 2002a; El-Sayed et al., 2007),
describen su efecto protector frente a metales tóxicos (Frisk et al., 2002), a
peroxinitrito (Roussyn et al., 1996), y a radiación UV (Rafferty et al., 1998;
Rafferty et al., 2003; Seo et al., 2002a) y destacan su capacidad de inducir una
respuesta reparadora en las células tratadas (Russell et al., 1980). Numerosos
estudios in vitro defienden también los posibles efectos quimiopreventivos
de la SeMet relacionados con su capacidad para incrementar la actividad de
las selenoenzimas, principalmente la glutation-peroxidasa (Kajander et al.,
1990; Rafferty et al., 2003), retardar o inhibir la síntesis de ADN (Morris et
al., 2006) y el crecimiento celular (Kajander et al., 1990; Dong et al., 2003),
participar en la activación de la proteína supresora de tumores p53 (Seo
et al., 2002b; Smith et al., 2004) o regular la homeostasis celular del zinc
(Blessing et al., 2004).
51
En diversos trabajos con animales se observó que un suplemento de
SeMet en la dieta no produce efectos negativos ni en las ratas alimentadas
ni en su descendencia (Taylor et al., 2005), y que la SeMet puede reducir la
carcinogénesis de colon inducida por aminas aromáticas (Feng et al., 1999).
En humanos, el mayor estudio in vivo fue sin duda el realizado por Clark y
colaboradores. Se trata de un estudio a doble ciego donde a una población
de más de 1300 individuos se les suplementó con Se/placebo en la dieta
durante 10 años. Los resultados muestran un descenso de la incidencia de
cáncer en general y puntualmente de pulmón, próstata, colon y recto, y
no detecta diferencias significativas entre los tratamientos para cáncer de
cabeza y cuello, vejiga, esófago y mama (Clark et al., 1996; Reid et al., 2002,
Duffield-Lillico et al., 2003).
Actualmente se está desarrollando otro gran estudio in vivo en donde,
desde el año 2001, a más de 32000 personas se les está administrando SeMet
y vitamina E en la dieta. Se trata de otro estudio a doble ciego siguiendo el
protocolo ya descrito por Clark et al. (1996) y cuyos primeros resultados se
obtendrán en el año 2013 (Klein et al., 2001).
Efectos adversos
Los primeros trabajos con SeMet obtuvieron resultados bastante negativos.
Los estudios de Ammar y Couri (1981) con ratones concluyeron que una
administración de SeMet intravenosa produce diversos efectos neurotóxicos
en los animales tales como alteraciones cardiorrespiratorias, parálisis de las
patas traseras y, en algunos casos, la muerte del individuo. Si la administración
se producía como suplemento en la dieta, también se vio que la SeMet se
acumulaba llegando a niveles tóxicos cuando la dieta era previamente rica
en Met (Waschulewski y Sunde, 1988). Por otro lado, en un estudio in vitro
se observó un incremento significativo de aberraciones cromosómicas en
linfocitos humanos tratados con SeMet (Khalil, 1989).
En general, parece que los efectos adversos y la toxicidad de la SeMet
dependen de diversos factores como la cantidad suministrada, siendo mayores
en cantidades elevadas y mínimas (Kajander et al., 1990; Brown et al., 2000;
Waters et al., 2005), el tipo de administración siendo preferible la via oral
(Ammar y Couri, 1981), la interacción con otros suplementos comunes como la
vitamina C o el sulfato de cobre, ya que se vio que la administración conjunta
52
resulta en un incremento significativo de aductos de ADN (Shen et al., 2001),
o los niveles basales de Se en el individuo receptor del suplemento.
En humanos, a partir de los resultados del trabajo de Clark (Clark et al.,
1996) se llegó también a la conclusión de que el Se no sólo no disminuye la
incidencia de cáncer de piel sino que aumenta, aunque no significativamente,
el riesgo de carcinomas celulares escamosos y de cánceres no melanómicos
de piel en general (Duffield-Lillico et al., 2003).
1.3. Evaluación de la capacidad de reparación del ADN: el ensayo de
competencia de reparación
1.3.1. Reparación del ADN
Los mecanismos de reparación del ADN celular constituyen un sistema
de defensa diseñado para proteger la integridad del genoma. Deficiencias en
este sistema contribuyen, entre otros, al desarrollo del cáncer. Es por esto que
la epidemiología de la capacidad de reparación del ADN y sus efectos sobre
la susceptibilidad al cáncer en humanos constituyen una muy importante área
de investigación actual (Berwick y Vineis, 2000).
Cuando un agente citotóxico llega a la célula produce una serie de daños
que, de no repararse, pueden llevar a esa célula a experimentar distintas
alteraciones estructurales o metabólicas, desencadenando finalmente procesos
de apoptosis y muerte celular. Los distintos daños que puede sufrir el ADN
incluyen apareamientos incorrectos, modificaciones covalentes de las bases
nitrogenadas del ADN, roturas de cadena doble o sencilla, entrecruzamientos,
etc. La célula posee sin embargo una serie de mecanismos de defensa
frente a estos agentes que pueden, en muchos casos, evitar o disminuir el
daño que inducirían en ella (Wood, 1996). Una primera línea defensiva la
constituyen los sistemas de antioxidación y detoxificación celular, encargados
de evitar que el agente ejerza su toxicidad bien por eliminación del tóxico
bien mediante su transformación a compuestos bioquímicamente inertes
(Luque y Herráez, 2002).
Si esta línea defensiva falla, entra en juego la maquinaria de reparación
celular que abarca distintas vías y que está constituida por un gran número de
complejos proteicos y enzimas asociadas. La reparación del ADN dañado incluye
tres posibilidades: la reversión directa del daño basada fundamentalmente en
la acción de distintas enzimas (fotoliasas, alquiltransferasas…); la reparación
53
por escisión, que incluye tres vías: la reparación por escisión de bases (Base
Excision Repair, BER), la reparación por escisión de nucleótidos (Nucleotide
Excision Repair, NER) y la reparación de emparejamientos erróneos (Mismatch
Repair, MMR); y finalmente la reparación de roturas de doble cadena que
también implica dos vías distintas: la recombinación homóloga (Homologous
Recombination, HR) y la unión final no homóloga (Non-Homologous End
Joining, NHEJ) (Luque y Herráez, 2002).
Si esta maquinaria no consigue reparar el daño causado por un agente
dado, se desarrollará una anomalía en el ADN que puede desembocar
finalmente en un proceso cancerígeno o en una patología dada (Buermeyer,
et al., 1999; De Boer y Hoeijmakers, 2000). La importancia de estudiar la
capacidad de reparar lesiones en el ADN radica por tanto en la observación
de que mecanismos deficientes de reparación del genoma se han relacionado
con la presencia de una gran variedad de patologías y procesos neoplásicos, y
de que alteraciones en estos mecanismos pueden influir en la susceptibilidad
de los individuos expuestos a un determinado mutágeno (Au, 1993; Au et al.,
1996a; Berwick y Vineis, 2000). No obstante, las técnicas y metodologías
para evaluar la capacidad de reparación del ADN están todavía en desarrollo,
por lo que su aplicación resulta de rigurosa actualidad. Se conocen diversos
métodos para evaluar la capacidad de reparación de las células, que se
agrupan en 4 categorías principales, además de las combinaciones entre ellas
(Berwick y Vineis, 2000): tests basados en daño inducido en el ADN con
agentes químicos o físicos (más conocidos como “ensayos de sensibilidad a
mutágenos”), medidas indirectas de reparación del ADN (como la síntesis de
ADN no programada y la medida de actividades enzimáticas), tests basados
en medidas cinéticas de reparación (entre ellos el host cell reactivation assay)
y medidas de variación genética asociada con las diferencias en la reparación
del ADN (polimorfismos en genes de reparación).
1.3.2. El ensayo de competencia de reparación del ADN
El ensayo de competencia de reparación del ADN (DNA repair
competence assay) es un ensayo citogenético, basado en el challenge
assay desarrollado por Au y colaboradores (1991), que permite evaluar la
capacidad celular de reparar el daño inducido en el ADN por diversos
agentes (Cebulska-Wasilewska, 2003). Partiendo de la observación de que
la exposición a agentes mutagénicos puede producir importantes alteraciones
54
en el ADN aumentando así el riesgo a padecer determinadas enfermedades
como el cáncer, se plantea como posible causa de esto no sólo los efectos
genotóxicos directos inducidos por la exposición, sino también el hecho de
que ésta puede originar anomalías en la maquinaria de reparación celular
(Au et al., 2001). Estas alteraciones podrían en consecuencia reducir la
capacidad de las células de reparar el ADN dañado, lo que disminuiría la
defensa del individuo frente a exposiciones posteriores y favorecería la
aparición y el desarrollo de los procesos patológicos. El fundamento de este
ensayo consiste en que las células expuestas a un determinado agente pueden
tener deteriorada su maquinaria de reparación del ADN, disminuyendo así la
capacidad de reparación del daño inducido. Cuando esas células son tratadas
posteriormente con un mutágeno “in vitro” (irradiadas con rayos X, por
ejemplo) presentarán incrementos significativos en el daño generado en el
ADN respecto a células no expuestas, y esto puede ser evaluado mediante
la aplicación de diversos tests de genotoxicidad (aberraciones cromosómicas,
micronúcleos, ensayo del cometa, etc.) (Au, 1993).
Según la hipótesis de partida y el fundamento de la técnica se define por
tanto el ensayo de competencia de reparación del ADN como un ensayo de
capacidad de reparación, donde las células son forzadas, mediante distintos
métodos de inducción, a reparar las lesiones producidas en el ADN (Au, 2003).
Lo realmente novedoso de esta técnica, y la ventaja frente a otras técnicas
similares, es la posibilidad de cuantificar esa reparación por la evaluación
del daño a diferentes tiempos (Schmezer et al., 2001). El desarrollo de la
técnica es sencillo. Muestras celulares (generalmente leucocitos periféricos)
de poblaciones expuestas a un tóxico (en estudios in vivo) o células cultivadas
en presencia de un determinado agente mutagénico (en estudios in vitro), son
inducidas a desarrollar lesiones en su ADN mediante algún agente inductor
(lo que se denomina challenge: “reto”). Posteriormente, empleando diversos
tests de genotoxicidad se evalúa el daño a diferentes tiempos. Lo más habitual
es medir a tiempo 0 (inmediatamente después del tratamiento con el agente
inductor) y después de un tiempo de reparación (distinto según cada caso),
aunque algunos autores establecen también medidas del daño a tiempos
intermedios para seguir el proceso de reparación de forma progresiva. El
descenso en el daño genotóxico evaluado producido durante la incubación
se toma como medida de la capacidad de reparación del ADN (Au, 1993;
Au et al., 1995b; Rajaee-Behbahani et al., 2001). Puesto que la incapacidad
para reparar el ADN dañado es una de las principales causas del cáncer, se
ha propuesto el uso del ensayo de competencia de reparación como un buen
55
biomarcador del riesgo a desarrollar esta patología (Au, 1993), basándose en
la asociación establecida por numerosos estudios previos entre la mayoría de
los cánceres y un elevado índice de anomalías cromosómicas.
Bleomicina como agente inductor
La bleomicina es un antibiótico antineoplásico que se usa en diferentes
terapias (solo o en combinación con otros) para tratar diferentes enfermedades
incluidos carcinomas, tumores testiculares, sarcoma Kaposi y linfomas
no-Hodgkin (Wozniak et al., 2004).
Figura 3. Estructura química de la bleomicina (análogos).
Bioquímicamente, la bleomicina es un glucopéptido que contiene varios
aminoácidos y azúcares y un extremo amino terminal que varía entre los
diferentes análogos de la bleomicina (Figura 3). Se han encontrado pocas
diferencias en cuanto a la actividad o mecanismos de acción entre esos análogos
(Povirk y Austin, 1991). La bleomicina se comporta como radiomimético e
induce un amplio espectro de lesiones mutagénicas en células de mamíferos,
incluyendo daño en bases del ADN, sitios apurínicos y apirimidínicos,
alteraciones en el ARN (Milic y Kopjar, 2004), y la generación de sitios
álcali-lábiles (Wozniak et al., 2004) que resultan en roturas de cadena sencilla
y doble (Wei et al., 2005). Además, al igual que otros agentes químicos, entre
ellos el peróxido de hidrógeno, la bleomicina genera daño oxidativo en el
ADN a través de la producción de radicales de oxígeno. En células eucariotas,
la genotoxicidad de estos compuestos ha sido investigada concluyéndose que
ambos producen aberraciones cromosómicas, mutaciones en genes y roturas
de cadena de ADN (Anderson et al., 1994).
56
La bleomicina está clasificada como un agente clastogénico directo,
puesto que no necesita activación metabólica para ejercer su actividad, y
actúa de forma independiente de la fase S de replicación del material genético
en el ciclo celular (Povirk y Austin, 1991). Es por ello frecuente el uso de
este compuesto como agente inductor de daño en estudios de medida de la
capacidad de reparación celular (Gajecka et al., 2005; Wei et al., 2005).
El ensayo del cometa como test de genotoxicidad
El ensayo de electroforesis en microgel de células aisladas (“single cell gel
electrophoresis assay”), también llamado ensayo del cometa, es una técnica
sencilla, rápida y sensible para el análisis y cuantificación del daño en el
ADN en células individuales (Singh et al., 1988). Esta técnica mide roturas de
cadena en el ADN y permite, de este modo, detectar los efectos genotóxicos
de diferentes agentes físicos o químicos. El ensayo parte de la lisis de células
que se encuentran embebidas en un gel de agarosa preparado sobre un
portaobjetos con una solución que contiene detergente, para permeabilizar las
células, y alta concentración de sales, para eliminar las proteínas nucleares y
permitir el desenrollamiento de la hélice de ADN. De esta manera, se eliminan
las membranas, el citoplasma y el nucleoplasma y se obtienen nucleoides.
Posteriormente se realiza una incubación en medio neutro o alcalino para
permitir el desenrollamiento y relajación de la estructura superenrollada del
ADN. A continuación el ADN se somete a electroforesis y se tiñe con un
marcador fluorescente. Durante la electroforesis, los fragmentos rotos de
ADN y las zonas relajadas de la cromatina migran hacia el ánodo, fuera del
núcleo, formándose así una estructura que recuerda a un cometa (Figura 4).
La longitud e intensidad de la cola del cometa son proporcionales al
número de roturas en el ADN inducidas por el agente en estudio.
Figura 4. Células sometidas al ensayo del cometa: (a) célula no dañada, (b) célula con
daño moderado y (c) célula muy dañada.
57
El tipo de daño evaluado depende de las condiciones utilizadas. Si las
condiciones son neutras se evalúan las roturas de doble cadena, y si las
condiciones son alcalinas, se pueden detectar además las roturas de cadena
sencilla, los sitios álcali-lábiles y procesos incompletos de reparación por
escisión, ya que las condiciones alcalinas producen la rotura de los puentes
de hidrógeno que mantienen unida la estructura de la doble hélice de ADN.
Además, este ensayo permite analizar tipos específicos de daño en el ADN
mediante la utilización de enzimas de reparación que reconocen y cortan
bases nitrogenadas con ciertas modificaciones determinadas (Collins et al.,
1993 y 1996).
La enzima hOGG1 para detectar daño oxidativo
La enzima hOGG1 (8-hidroxiguanina ADN-glicosilasa humana) es
una glicosilasa que participa en la maquinaria de reparación celular en la
vía de reparación por escisión de bases. Cuando un radical hidroxilo entra
en contacto con el ADN puede atacar sitios de elevada densidad electrónica
llegando a modificar sus bases. De entre todas las bases la guanina es la más
propensa a la oxidación, durante la cual se añade un grupo hidroxilo a la
posición 8 produciendo como resultado la 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina
(8-OHdG) (Angerer et al., 2007). La enzima hOGG1 reconoce esta base
modificada y corta específicamente el ADN en los puntos donde se encuentra
(Smith et al., 2006), iniciando así su reparación.
Para detectar daño oxidativo mediante el ensayo del cometa se pueden
emplear diversas enzimas. Las enzimas más comúnmente empleadas son
la formamidopirimidina ADN-glicosilasa (Fpg), que reconoce purinas
modificadas en el imidazol, o la endonucleasa III (Endo III), que reconoce
pirimidinas oxidadas. La enzima hOGG1 sin embargo, es la más eficaz en
la determinación específica del daño oxidativo más frecuente (8-OHdG)
puesto que, al contrario de las demás, no reconoce bases alquiladas
(Smith et al., 2006). Al incubar los leucocitos durante el ensayo del cometa
con hOGG1, ésta reconocerá las bases modificadas 8-OHdG, indicativas de
daño oxidativo, y las eliminará de la secuencia de ADN generando un sitio
abásico, que durante la incubación en medio alcalino dará lugar a una rotura
de cadena. Así, el porcentaje de ADN presente en las colas de los cometas
generados tras la incubación con esta enzima será mayor y reflejo del daño
oxidativo presente en las células.
58
1.4. Interés del estudio y aplicaciones
El trabajo a realizar tiene interés como estudio individual en cuanto a
la información que se obtendrá sobre los efectos de la selenometionina
en humanos, y sus futuras aplicaciones como suplemento en la dieta de
individuos enfermos o susceptibles de padecer una determinada enfermedad.
No obstante, el mayor interés que puede presentar este estudio es como parte
de un estudio más global sobre el papel del Se en el organismo y sus posibles
efectos antioxidantes, ya que aportaría información interesante y relevante
sobre su empleo, delimitaría las condiciones para su correcta utilización y
podría aportar datos importantes de cara a entender el/los motivos por los
que los compuestos de Se son beneficiosos para determinados individuos, por
ejemplo pacientes con procesos cancerígenos en desarrollo.
En esta línea, el hecho de emplear la bleomicina (un fármaco empleado
en quimioterapia) como agente inductor de daño oxidativo nos permitirá
establecer una posible relación del efecto que tendrá la selenometionina,
posible antioxidante, en pacientes tratados con este medicamento. Por otro
lado, la metodología empleada en la estimación de la capacidad de reparación
del ADN, el ensayo de competencia de reparación, tiene interés y aplicación
en el campo de la Biomedicina, como técnica citogenética para visualizar
problemas en la reparación del ADN en poblaciones de individuos enfermos
o susceptibles de estarlo, y en la Toxicología, en estudios tanto in vitro como
poblacionales, de exposiciones a cualquier agente cuya posible toxicidad se
quiera testar. La incapacidad para reparar el ADN dañado es la principal
causa del cáncer.
En base a todo lo descrito anteriormente, las aplicaciones de este estudio
podrían ser:
1. Documentar los efectos de la exposición selenometionina a diferentes
concentraciones con el fin de descartar posibles alteraciones en el ADN
(roturas de cadena o daño oxidativo) producidas por este compuesto y
establecer los niveles óptimos para su empleo en la dieta.
2. Evaluar la posible influencia de la selenometionina en la maquinaria
de reparación celular y en la capacidad específica de reparar el daño
oxidativo, estrechamente relacionado con diversas patologías del
sistema nervioso, cardiorrespiratorio y muscular así como la aparición
y el desarrollo de procesos neoplásicos.
59
3. Avanzar en el campo, actualmente en desarrollo, de la estimación
de la capacidad de reparación celular, mediante la aplicación de una
técnica cuantitativa recientemente descrita, el ensayo de competencia
de reparación del ADN, que puede ser empleada para numerosos
estudios de exposición ocupacional, ambiental, o estudios de
cohortes en general, siendo muy útil en los trabajos sobre procesos
cancerígenos.
2. OBJETIVOS
Dado que la SeMet es un compuesto de Se y, como tal, productor de
especies reactivas de oxígeno y otros metabolitos secundarios que pueden
alterar el genoma, pero es también un importante elemento traza y un posible
agente anticancerígeno empleado ya como suplemento en determinadas
dietas, resulta imprescindible caracterizar y delimitar sus efectos sobre
el ADN y sobre los mecanismos que intervienen en su reparación. Es por
ello que en este estudio nos hemos planteado evaluar el efecto de la SeMet
sobre el material genético de leucocitos humanos aislados y su posible papel
protector en la reparación del daño inducido experimentalmente en el ADN
por bleomicina, estudiando de forma general su implicación sobre las roturas
de cadena (simple y doble) y los sitios abásicos, así como específicamente
sobre el daño oxidativo. Para esto hemos formulado los siguientes objetivos:
1. Evaluar los efectos genotóxicos de la SeMet utilizando el ensayo
del cometa y analizar la posible existencia de una relación
dosis-respuesta.
2. Comprobar los efectos genotóxicos de la bleomicina para validar su
utilización como agente inductor de daño en el ADN en el ensayo de
competencia de reparación.
3. Analizar los efectos de la SeMet sobre la inducción, reparación y
persistencia del daño en el ADN en general, y especificamente del
daño oxidativo, causados por la bleomicina mediante la utilización
del ensayo de competencia de reparación.
60
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Diseño experimental
Este estudio se ha dividido en dos partes experimentales. En la primera
parte se evaluó el potencial genotóxico de la SeMet. Se cultivaron leucocitos
humanos en presencia de distintas concentraciones de este compuesto (1, 5, 10,
50 y 100μM), junto con un control negativo, y se realizó el ensayo del cometa
según el protocolo estándar para evaluar daño en el ADN, y la incubación
con la enzima hOGG1 para detectar daño oxidativo. En base a los resultados
obtenidos se seleccionó la concentración más adecuada para llevar a cabo el
ensayo de competencia de reparación del ADN en el resto del trabajo.
En la segunda parte se utilizó la técnica del ensayo de competencia de
reparación del ADN, empleando bleomicina como agente inductor y el ensayo
del cometa (con y sin incubación con hOGG1) como test de genotoxicidad,
para analizar el efecto de la SeMet sobre la capacidad de reparación celular del
daño causado por la bleomicina. Para ello se cultivaron leucocitos en presencia
de SeMet durante distintas fases: fase de cultivo (A), fase de inducción de
daño (B), fase de reparación (C), fases AB y fases ABC, incorporando en
cada caso los controles correspondientes.
3.2. Obtención de muestras
Para la realización de este estudio in vitro se han empleado leucocitos
mononucleares (linfocitos y monocitos) extraídos de sangre periférica
humana. Las muestras de sangre se obtuvieron de 3 donantes voluntarios
varones no fumadores (D1-D3) de edades comprendidas entre 20 y 30
años que firmaron un consentimiento informado previo a la realización del
estudio. El Comité de Ética de la Investigación de la Universidade da Coruña
(CEI-UDC) aprobó el protocolo experimental empleado en la realización de
este trabajo (informe Nº PI 1/2007).
Las muestras de sangre se recogieron en tubos con heparina de litio. El
aislamiento de los leucocitos mononucleares se realizó mediante centrifugación
en un gradiente de densidad de Ficoll. Para ello un volumen de 10 ml de
sangre se diluyó en proporción 1:1 en tampón fosfato pH 7.4 (PBS) (Phosphate
Buffered Saline Tablets, Sigma) y fue depositado sobre un volumen equivalente
de solución de Ficoll (Lymphocyte Isolation Solution, Rafer). Tras someterlo
a centrifugación durante 30 min a 2100 rpm, se recogió la nube linfocítica y
61
se realizaron dos lavados con 10 ml de PBS. El botón celular resultante se
resuspendió en medio de congelación (50% suero bovino fetal, 40% RPMI
1640, 10% DMSO) y se congeló a -80ºC utilizando para ello un contenedor
que garantiza el descenso gradual de la temperatura a razón de 1ºC/min
(NALGENE® Cryo 1ºC Freezing Container, Nalgene Nunc International),
minimizando así el posible daño celular durante la criopreservación.
3.3. Ensayo del cometa
Parar evaluar la posible genotoxicidad de la SeMet sobre el ADN celular,
se empleó ensayo del cometa siguiendo el protocolo general descrito por
Singh et al. (1988), con algunas modificaciones posteriores (Laffon et al.,
2005). Además, se ha utilizado también la variante de este ensayo que
introduce una incubación con la enzima de reparación hOGG1, que genera
roturas de cadena a partir de los lugares donde hay guaninas oxidadas
(8-OHdG), lo que permite evaluar específicamente el daño de carácter
oxidativo (Collins, 2004).
3.3.1. Descongelación de leucocitos y tratamiento con SeMet
El día anterior a realizar el ensayo del cometa, los leucocitos fueron
retirados de la cámara de -80ºC y descongelados en un baño a 37ºC. Se
colocaron en un medio de cultivo compuesto por 4.5 ml de RPMI 1640
suplementado con 15% suero bovino fetal, 1% fitohemaglutinina, 1%
L-glutamina (200mM) y 1% penicilina (5000U/ml)/estreptomicina (5000µg/
ml) (todo de Invitrogen). Se añadió la SeMet (1, 5, 10, 50 y 100μM) de forma
que los tratamientos constituyesen el 1% del volumen final del cultivo. El
control negativo se estableció sin la adición de ningún tratamiento.Todos los
tubos se mantuvieron en estufa a 37ºC durante 20h para garantizar que los
leucocitos, que circulan en sangre periférica en fase G0, se encontrasen en
fase G1 gracias a la estimulación del crecimiento mitótico propiciada por la
fitohemaglutinina.
3.3.2. Preparación de los microgeles y lisis
Transcurrido el tiempo de cultivo los tubos se retiraron de la estufa, se
centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min y se resuspendieron en medio RPMI
1640. Se evaluó la viabilidad celular mediante la técnica de exclusión del
62
colorante azul de tripán, resultando en todos los casos superior al 80%. Las
células fueron luego nuevamente centrifugadas y resuspendidas primero en
PBS y luego en 150 μl de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5% en tampón
fosfato, y depositadas en dos puntos sobre portaobjetos ya cubiertos con una
primera capa de agarosa normal al 0.5% en agua destilada y deshidratados
por calentamiento a 65ºC durante 15min. Sobre cada gota se depositó un
cubreobjetos y se colocaron sobre hielo durante 15min. Una vez solidificada
la agarosa se retiraron los cubreobjetos. Posteriormente se procedió a la lisis
celular, para lo que se sumergieron los portaobjetos en una solución de lisis a
pH 10 compuesta por NaCl 2.5M, Na2EDTA 100mM, Tris-HCl 10mM, NaOH
250mM y Triton X-100 1%, permaneciendo 1h en oscuridad a 4ºC. Durante
todos los pasos posteriores se mantuvieron estrictas condiciones de oscuridad
para evitar daños adicionales sobre el material genético. Los portaobjetos en
los que se realizó el ensayo del cometa tradicional pasan directamente a la
electroforesis después de la lisis; aquellos portaobjetos en los que se evaluó
el daño oxidativo son sometidos al tratamiento con la enzima de reparación
antes de la electroforesis.
3.3.3. Tratamiento con hOGG1
Tras la lisis se llevó a cabo el tratamiento con la enzima hOGG1 en
aquellos portaobjetos donde se evaluaría el daño oxidativo, siguiendo el
protocolo propuesto por Smith et al. (2006). Para ello, los portaobjetos fueron
previamente lavados 3 veces durante 5 min con un tampón compuesto por
EDTA 0.5 mM, BSA 0.2 mg/ml, KCl 0.1M y Hepes 40 mM pH 8, se añadieron
50 μl de hOGG1 (0.0016 U/μl) preparada en tampón sobre cada gota, se depositó
un cubreobjetos sobre ellas y se incubaron en la estufa a 37ºC durante 10min.
Los controles siguieron el mismo protocolo que los portaobjetos con enzima,
pero empleando 50 μl de tampón sin enzima en el tratamiento.
3.3.4. Electroforesis, neutralización y tinción
Los portaobjetos, retirándoles previamente el cubreobjetos, se sumergieron
entonces en una solución alcalina en el tanque de electroforesis, ubicado sobre
una cubeta con hielo, para facilitar el desenrollamiento del ADN y expresión
de los sitios álcali-lábiles. La solución, de pH>13, estuvo compuesta por
Na2EDTA 1 mM y NaOH 300 mM. Tras 20min de incubación se inició el
proceso electroforético de 20min de duración a 300 mA y 25 V (0.83V/cm).
63
A continuación se procedió a la neutralización de las muestras mediante
3 lavados de 5min con una solución de pH 7.5 elaborada con Tris-HCl 0.4
M. Todos los portaobjetos fueron codificados para asegurar la realización
de un estudio “ciego” y teñidos con 60 μl de 4,6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) 5 μg/ml.
3.3.5. Captura y análisis de las imágenes
La captura de las imágenes fue realizada mediante el programa Leica
QWIN (Leica Imaging Systems), evaluando como parámetro estimador
del daño en el ADN el porcentaje de ADN en la cola del cometa (%TDNA),
medido éste desde el centro estimado de la célula. Se analizaron un total
de 100 células por tratamiento y donante, 50 procedentes de cada una de
las réplicas.
3.4. El ensayo de competencia de reparación del ADN
Ya que en el ensayo de competencia de reparación se ha utilizado el ensayo
del cometa como test de genotoxicidad, ambos ensayos comparten elementos
comunes en sus protocolos, coincidiendo en los pasos de descongelación de
leucocitos, preparación de los microgeles, tratamiento con la enzima hOGG1,
lisis, electroforesis, neutralización, tinción y captura de imágenes, que ya se
han explicado previamente. La diferencia fundamental radica en el tratamiento
con el agente inductor de daño, la bleomicina, y en el tiempo durante el cual
se permite la reparación del daño inducido, lo que determina las distintas
fases del protocolo: cultivo (A), inducción de daño (B) y reparación (C).
Tras la descongelación y transcurridas las 20h de cultivo, los leucocitos
se retiraron de la estufa, se centrifugaron a 1500 rpm durante 10min y se
resuspendieron en medio RPMI 1640. Entonces se añadió la bleomicina
(20 μg/ml) se incubaron 30 min a 37ºC. Posteriormente las células fueron
centrifugadas en PBS 3 min a 9000 rpm, para eliminar los posibles restos
de bleomicina, y nuevamente centrifugadas en las mismas condiciones
y resuspendidas en RPMI 1640. Para los tratamientos sin reparación, las
células se centrifugaron de nuevo directamente, y para los tratamientos con
reparación se incubaron durante 15 min a 37ºC antes de realizar la tercera
centrifugación. El botón celular resultante se resuspendió en agarosa y se
prepararon los microgeles, continuando con el protocolo anteriormente
descrito para el ensayo del cometa.
64
3.5. Análisis estadístico
La normalidad de la variable obtenida en el estudio (%TDNA) se evaluó
mediante el test de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Dado que se
alejaba significativamente de la distribución normal, se asumieron los tests
no paramétricos como los más adecuados para su utilización en el análisis
de los datos. Se empleó por tanto el análisis de Kruskal-Wallis para varias
muestras independientes que nos permitió, complementado con el test U de
Mann-Whitney, establecer la existencia de diferencias significativas entre
los distintos tratamientos realizados. La existencia de una posible relación
dosis-respuesta para la SeMet se evaluó mediante el coeficiente de correlación
de Pearson. El nivel de significación fue fijado en 5%. Todos los análisis
estadísticos se llevaron a cabo mediante el paquete estadístico SPSS para
Windows, versión 15.0 (2007) (Illinois, USA).
4. RESULTADOS
4.1. Genotoxicidad de la selenometionina
Figura 5. Resultados del ensayo del cometa en leucocitos humanos tratados con SeMet.
aP≤0.05, bP≤0.01, diferencia significativa respecto al control.
Con el fin de evaluar la posible genotoxicidad de la SeMet sobre leucocitos
humanos y determinar en base a ello la concentración óptima a emplear en
el estudio de su influencia sobre la capacidad de reparación del ADN, hemos
realizado el ensayo del cometa utilizando 5 concentraciones distintas (1, 5,
10, 50 y 100µM), además de un control negativo. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 5, tomando como parámetro cuantitativo el porcentaje
promedio de ADN en la cola del cometa (%TDNA) determinado a partir del
65
análisis de 100 células por donante. Tras la realización del análisis estadístico,
todos los tratamientos muestran un descenso en el %TDNA respecto al control,
llegando a alcanzar diferencia significativa únicamente en los tratamientos de
50 y 100μM. Se ha obtenido además correlación significativa negativa entre el
daño en el ADN y la concentración de SeMet (r=−0.870, P≤0.05) (Figura 6).
Figura 6. Relación dosis-respuesta entre la concentración de SeMet testada y el daño en
el ADN inducido en leucocitos humanos.
Después de llevar a cabo el ensayo del cometa modificado con la
incubación con la enzima de reparación hOGG1 se obtuvieron los resultados
que se presentan en la Figura 7. Al realizar el análisis estadístico a todos los
datos, se detectó un aumento significativo en la concentración 1μM en relación
al control sin SeMet. Por el contrario, el tratamiento de 50 μM muestra un
descenso significativo del parámetro evaluado con respecto al control. En la
evaluación del daño oxidativo tras el tratamiento con hOGG1 se observó que
tanto el control como las concentraciones de SeMet 1, 5 y 10 μM mostraron un
aumento significativo de daño con respecto al tratamiento sólo con buffer. Las
concentraciones más altas analizadas (50 y 100 μM), en cambio, no mostraron
diferencias significativas.
Ya que los resultados obtenidos en esta parte del estudio indican que la
concentración de SeMet 50 μM no induce roturas de cadena ni daño oxidativo
en el ADN (Figura 5) y que, por el contrario, parece mostrar cierto efecto
antioxidante (Figura 7), elegimos esta concentración para utilizarla en los
restantes ensayos del presente estudio con el fin de evaluar su influencia sobre
la capacidad de reparación del ADN.
66
Figura 7. Resultados del ensayo del cometa tras los tratamientos con SeMet empleando
la enzima hOGG1. aP≤0.05, bP≤0.01, diferencia significativa respecto al control; cP≤0.05,
dP≤0.01, diferencia significativa respecto a la misma concentración sin emplear enzima.
4.2. Genotoxicidad de la bleomicina
Previo al estudio de la interacción de la SeMet con la capacidad de reparación
del ADN evaluamos los efectos genotóxicos de la bleomicina, compuesto
que se utilizaría como agente inductor de daño en el ensayo de competencia
de reparación del ADN, sobre leucocitos humanos realizando nuevamente
el ensayo del cometa, con posterior tratamiento con enzima hOGG1 para
estudiar por separado la inducción específica de daño oxidativo. El daño en el
ADN presente tras el tratamiento con bleomicina resultó significativamente
mayor que su correspondiente control, tanto antes como después del tiempo de
reparación (Figura 8). No obstante, tras la reparación, el %TDNA disminuyó
significativamente con respecto al detectado inmediatamente después de la
inducción con bleomicina.
Figura 8. Resultados del ensayo del cometa tras el tratamiento con bleomicina. bP≤0.01,
diferencia significativa respecto al control; dP≤0.01, diferencia significativa respecto al
tratamiento sin reparación.
67
Al aplicar el tratamiento con la enzima hOGG1 se pone de manifiesto
un aumento significativo del daño en el ADN respecto al control, tanto antes
como después de la reparación (Figura 9). En relación al propio tratamiento
con hOGG1, antes de la reparación se obtiene un aumento significativo del
%TDNA respecto al tratamiento sólo con tampón, que desaparece tras el
tiempo de reparación testado. Además, después de la reparación se obtiene
un descenso significativo del daño evaluado con respecto al detectado antes
de ese periodo.
Figura 9. Resultados del ensayo del cometa tras el tratamiento con bleomicina
empleando la enzima hOGG1 (bP≤0.01, diferencia significativa respecto al control; dP≤0.01,
diferencia significativa respecto al mismo tratamiento sin emplear enzima; eP≤0.01, diferencia
significativa respecto al tratamiento sin reparación).
4.3. Efecto de la selenometionina sobre la inducción de daño
Con el objeto de evaluar de qué manera influye la SeMet en la inducción de
daño por bleomicina, tratamos los leucocitos con SeMet en la fase A, durante
el tiempo inicial de cultivo, en la fase B, simultáneamente al tratamiento con
bleomicina, y durante ambas fases AB. El daño fue posteriormente evaluado
mediante el ensayo del cometa y los datos obtenidos se recogen en la Figura 10.
Al tratar con SeMet durante la fase B de inducción de daño y conjuntamente
en las fases AB de cultivo y de inducción, el daño disminuye con respecto
al detectado al emplear sólo bleomicina, llegando a resultar este descenso
significativo en el último caso. Sin embargo, el tratamiento durante la fase A
de cultivo resultó en un incremento significativo de daño.
Después de realizar la incubación con la enzima hOGG1 los tratamientos
con SeMet en las fases A y B experimentaron un ligero descenso de daño
68
no significativo (Figura 11). Sin embargo, el tratamiento durante ambas
fases conjuntamente produjo un aumento significativo en el %TDNA. La
incubación con la enzima generó incremento en el daño encontrado respecto
a la incubación sólo con buffer en el tratamiento sólo con bleomicina y con
este compuesto junto con SeMet durante las fases B y AB.
Figura 10. Efecto de la SeMet sobre la inducción de daño por bleomicina (BLM).
bP≤0.01, diferencia significativa respecto al tratamiento sólo con bleomicina.
Figura 11. Efecto de la SeMet sobre la inducción de daño por bleomicina (BLM) tras
incubación con hOGG1. aP≤0.05, bP≤0.01, diferencia significativa respecto al tratamiento
sólo con bleomicina; dP≤0.01, diferencia significativa respecto al mismo tratamiento sin
emplear enzima.
4.4. Efecto de la selenometionina sobre la reparación del daño
Para evaluar la influencia de la SeMet sobre la capacidad de reparación
de los leucocitos, evaluamos el daño existente tras el periodo de reparación
69
habiendo tratado con SeMet de nuevo en las fases A, B, AB y ahora también
en la fase C, durante la reparación, y en la combinación de las tres fases ABC.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 12.Tras la reparación, los
tratamientos con bleomicina y SeMet en las fases C, AB y ABC muestran un
descenso del daño evaluado en relación con el tratamiento sólo con bleomicina,
resultando significativo únicamente en el segundo caso.
Figura 12. Efecto de la SeMet sobre la reparación del daño inducido por bleomicina
(BLM). bP≤0.01, diferencia significativa respecto al tratamiento sólo con bleomicina.
Los datos recogidos tras la incubación con la enzima hOGG1 nos aportan
información específica acerca la influencia de la SeMet sobre la reparación
del daño oxidativo inducido previamente por la bleomicina. Los resultados
pueden observarse en la Figura 13.
Figura 13. Efecto de la SeMet sobre la reparación del daño inducido por bleomicina
(BLM) tras incubación con hOGG1. aP≤0.05, bP≤0.01, diferencia significativa respecto
al tratamiento sólo con bleomicina; cP≤0.05, dP≤0.01, diferencia significativa respecto al
mismo tratamiento sin emplear enzima.
70
Todos los tratamientos, salvo los cultivados con SeMet en fase A y en
fases ABC, muestran un incremento significativo del %TDNA respecto a
su incubación sin enzima. No obstante, este daño oxidativo es menor que el
detectado para el tratamiento sólo con bleomicina en los tratamientos en fases
A, B y AB, resultando este descenso significativo en el primer y último caso.
4.5. Efecto de la selenometionina sobre la persistencia del daño
La influencia de la SeMet sobre la persistencia del daño inducido por
bleomicina en los leucocitos ha sido evaluada mediante un análisis comparativo
con los datos recogidos tras el tratamiento con bleomicina, antes y después del
tiempo de reparación. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 14.
En el tratamiento sólo con bleomicina, así como en los tratamientos con
bleomicina y SeMet en las fases A y AB, se produce un descenso del daño
inducido tras el periodo de reparación, llegando a alcanzar la significación
estadística en los dos primeros.
Figura 14. Efecto de la SeMet sobre la persistencia del daño inducido por bleomicina
(BLM). bP≤0.01, diferencia significativa respecto al mismo tratamiento sin reparación.
La evaluación del efecto de la SeMet sobre la persistencia del daño tras
la incubación con la enzima hOGG1 se muestra en la Figura 15. En todos
los tratamientos se encontró un descenso significativo del daño evaluado a
nivel de 0.01 tras el periodo de reparación en relación con el daño medido
inmediatamente después de la inducción con bleomicina.
71
Figura 15. Efecto de la SeMet sobre la persistencia del daño inducido por bleomicina
(BLM) tras incubación con hOGG1. bP≤0.01, diferencia significativa respecto al mismo
tratamiento sin reparación.
4.6. Eficacia de reparación
Los resultados obtenidos pueden también analizarse utilizando el
índice Eficacia de Reparación (RE), que viene determinado por la relación
entre la diferencia entre el daño inducido y reparado y el daño inducido
(Cebulska-Wasilewska et al.,2003). Se calcula según la fórmula:
en donde %TDNATto0 indica el daño en el ADN detectado tras el tratamiento
correspondiente sin reparación, y %TDNATto15 indica el daño en el ADN para
el mismo tratamiento después de los 15min de reparación.
En la Figura 16 se muestran los resultados obtenidos para la RE, tanto
respecto al daño general en el ADN como respecto al daño específicamente
oxidativo, evaluado tras la incubación con la enzima hOGG1. Todos los
tratamientos con SeMet incrementan la RE del daño en el ADN respecto
al tratamiento sólo con bleomicina, excepto el realizado en fase B, aunque
no significativamente. De igual forma la RE del daño oxidativo aumentó
en todos los tratamientos, excepto durante la fase C, llegando a alcanzar la
significación estadística en la fase AB.
72
Figura 16. Influencia de la SeMet sobre la eficacia de reparación (%RE) del daño
inducido por bleomicina. aP≤0.05, diferencia significativa respecto al tratamiento sólo con
bleomicina.
5. DISCUSIÓN
5.1. Utilización de selenometionina
El Se es un elemento traza imprescindible para el correcto desarrollo de
muchos procesos celulares. Entre las principales funciones que desempeña
en el organismo está la de formar parte de las selenoproteínas, muchas de las
cuales son enzimas de la maquinaria antioxidante y por tanto indispensables
en los procesos de defensa celular (Letavoyavá et al., 2006). No obstante,
según en la forma y concentración en la que se encuentre, el Se también
puede resultar tóxico para las células. Aunque son varios los factores que
influyen en la toxicidad del Se (edad, estado fisiológico del organismo, ruta
de administración, etc.), en general se piensa que ésta se fundamenta en dos
razones principales: por un lado la capacidad de producir especies reactivas
de oxígeno (ROS) durante su metabolismo (Spallholz, 1994 y 1997), y por
otro la reducción a otros compuestos mutagénicos que se forman a partir de
los compuestos originales de Se (Whiting et al., 1980).
A pesar de esta toxicidad en determinadas condiciones, se ha descrito un
posible papel anticancerígeno del Se (Clark et al., 1996; Yu et al., 1997; Feng et
al., 1999; Finley y Davis, 2001; Reid et al., 2002). Los mecanismos sugeridos
para la prevención de cáncer por el Se incluyen los efectos sobre la muerte
celular programada, la reparación del ADN, su papel en las selenoenzimas,
73
los efectos sobre el sistema inmune, actividad antiangiogénica y la inhibición
específica del crecimiento de células tumorales por algunos metabolitos del
Se (Rayman, 2000 y 2005; El-Bayoumy, 2001; Whanger, 2004).
Se tiene constancia por muchos estudios de que el Se es tóxico en
cantidades algo más altas que las recomendadas. Sin embargo está bien
establecido que la administración de Se más efectiva para la protección contra
el cáncer es a niveles elevados, a menudo llamados niveles supra-nutricionales
o farmacológicos (Aboul-Fadl, 2005). Dada esta enorme paradoja resulta de
vital importancia delimitar las condiciones de administración y realizar más
estudios in vitro para definirlas, así como realizar estudios más exhaustivos
que evalúen los posibles efectos genotóxicos a distintos niveles y la influencia
sobre la maquinaria de reparación celular. Incrementar el número de
investigaciones en este sentido podría evitar los resultados adversos que
están dando algunos primeros estudios de incidencia de cáncer en humanos
utilizando suplementos de Se (Duffield-Lillico et al., 2003).
Varios son los motivos por los que se ha escogido la SeMet frente
a otras formas químicas del Se para llevar a cabo este estudio. En primer
lugar los alimentos ricos en Se suelen presentar mayoritariamente esta forma
química por lo que, de entre todas las variantes del Se, la SeMet resulta la
forma más adecuada para llevar a cabo una aportación de este elemento en
la dieta (Schrauzer, 2000a; Letavayová et al., 2006). Otras características,
principalmente metabólicas, avalan esta afirmación: se incorpora de forma
inespecífica a la estructura de las proteínas, lo que permite el almacenamiento
celular y tisular de Se para su empleo posterior, no genera tantas especies
reactivas de oxígeno como otros compuestos de Se que siguen rutas metabólicas
distintas, es incorporado al interior de las células más rápidamente que otros
compuestos de Se como el selenito o la selenocisteína, su metabolismo
específico hace que se requieran unos niveles más altos de SeMet que de
otras formas de Se para dar lugar a los mismos efectos tóxicos (Beilstein y
Whanger, 1987; Smith et al., 2004; Letavoyavá et al., 2006) y es hidrolizada
a metilselenol, un metabolito activo del Se presuntamente responsable de
su actividad quimiopreventiva (Ip, 1998; Ip et al., 1999; Wang et al., 2002;
Cho et al., 2004). Además, la SeMet se administra vía oral (Ip, 1999) y los
resultados obtenidos de ensayos clínicos en fase I indican que la SeMet puede
ser administrada en dosis bastante elevadas sin llegar a producir toxicidad
significativa (Reid et al., 2004; Fakih et al., 2006).
74
En humanos, uno de los primeros estudios con SeMet como suplemento
de la dieta (Griffiths et al., 1976) ya puso de manifiesto los beneficios que
podía presentar este compuesto al concluir que prácticamente la totalidad
de la SeMet era retenida por el organismo, siendo la eliminación de Se en
la orina y en las heces muy pequeña. Observaron también que, al comparar
estos resultados con los obtenidos en un estudio previo siguiendo el mismo
protocolo (Thomson y Stewart, 1974), la asimilación de la SeMet era mucho
mayor que la del selenito. Los posteriores resultados del trabajo de Thomson
et al. (1993) en mujeres también apoyan el uso de SeMet como suplemento
en humanos por ser más efectiva que otros compuestos de Se, debido a que
su asimilación y biodisponibilidad para las células era mayor. Otro estudio
posterior realizado nuevamente en mujeres (Robinson et al., 1997) añadió a
estas observaciones previas, la capacidad de la SeMet de contribuir a mantener
los niveles de Se en el organismo sin efectos adversos para el mismo.
Algunos estudios con SeMet in vitro e in vivo ya apuntan a un posible
efecto beneficioso de este compuesto (Rafferty et al., 1998; Seo et al., 2002a
y b), sin embargo debido a la gran controversia que genera y a los múltiples
resultados que da el empleo del Se, es necesario realizar estudios más
exhaustivos que evalúen los posibles efectos genotóxicos a distintos niveles y
la influencia sobre la maquinaria de reparación celular.
A lo largo de este estudio se han evaluado los efectos de la exposición a la
SeMet sobre el material genético y sobre la maquinaria de reparación celular
de leucocitos humanos. Se ha estudiado la relación de este compuesto con el
daño inducido en el ADN en general y también con el daño específicamente
oxidativo. También se evaluó la influencia de la SeMet sobre la capacidad de
los leucocitos para reparar estas lesiones inducidas previamente por un agente
radiomimético: la bleomicina.
5.2. Genotoxicidad de la selenometionina
Para evaluar el efecto de la SeMet sobre el ADN y determinar la
concentración óptima para su empleo posterior se ha seleccionado el ensayo
del cometa como test de genotoxicidad. Este ensayo en su versión alcalina
se considera como un estimador muy sensible del daño en el ADN inducido
por una gran cantidad de compuestos genotóxicos, ya que detecta de manera
inespecífica las roturas de cadena sencilla y doble y los sitios apurínicos
o apirimidínicos sensibles al álcali que se generan a partir de aductos
75
(Singh et al., 1988; Olive et al., 1992). Pero además este ensayo permite
también, mediante pequeñas modificaciones en su protocolo, evaluar de forma
inespecífica distintos tipos de lesiones en el ADN como: entrecruzamientos
entre ambas cadenas, presencia de bases modificadas, daño oxidativo, etc.
(Collins et al., 2001; Olive y Banáth, 2006). Esta versatilidad, junto con
la sencillez y sensibilidad del método, son las que han hecho que se haya
considerado este ensayo como el idóneo para realizar el presente estudio.
El parámetro cuantitativo que se ha empleado como estimador del daño
ocasionado sobre el ADN ha sido el porcentaje de ADN en la cola del cometa
(%TDNA), relacionado de forma directa con la cuantía de roturas de cadena
sencilla que se producen por efecto de un agente genotóxico (Singh et al.,
1988). El %TDNA es el parámetro más útil, pues conlleva una relación lineal
con la frecuencia de roturas, no se ve afectado relativamente por los ajustes
del umbral de fluorescencia, y permite la discriminación del daño en el rango
más amplio posible (en teoría de 0 a 100%), además aporta una indicación
muy clara de la apariencia real de los cometas (Collins, 2004). Algunos
autores han sugerido además que en determinados casos donde la longitud de
la cola del cometa no distingue claramente entre las distintas dosis, entonces
la cuantificación del %TDNA puede representar una variación más clara del
daño. Por otro lado, las lesiones inducidas en el ADN muestran colas distintas
en el ensayo del cometa según el agente que las produzca. Los radicales de
oxígeno por ejemplo generan una cola de longitud similar a la de otros agentes
pero de diferente intensidad, por lo que en el caso de estudiar daño oxidativo es
preferible escoger el %TDNA, que tiene en cuenta esa intensidad al evaluar el
daño (Olive et al., 1992; Mckeley-Martin et al., 1993; Anderson et al., 1994).
Algunos estudios con Se han dado como resultado un daño oxidativo
en las células u organismos estudiados como consecuencia de la exposición
a este compuesto. Se ha llegado a la conclusión de que la toxicidad del Se
se manifestará de forma aguda o crónica cuando el daño oxidativo que
provoca supere las defensas antioxidantes que posee la célula (Nogueira et
al., 2004). El balance entre prooxidantes y antioxidantes, no sólo en el caso
del Se sino de cualquier compuesto, es crucial para la supervivencia y la
funcionalidad en organismos aerobios. Un desequilibrio favoreciendo a los
prooxidantes y/o desfavoreciendo antioxidantes es lo que se conoce como
estrés oxidativo (Arteel y Sies, 2001). Con el fin de determinar si la SeMet
induce la producción ROS provocando con ello la consecuente aparición del
76
daño oxidativo, introducimos el empleo de la enzima hOGG1 en el ensayo
del cometa original para evaluar de forma específica este tipo de daño.
La enzima hOGG1 es una glicosilasa de la maquinaria de reparación
de células de mamíferos que participa en la vía de reparación por escisión
de bases. Esta enzima es capaz de reconocer específicamente las guaninas
modificadas por la adición de un grupo hidroxilo a la posición 8, originando
8-hidroxi-2’-desoxiguanosina (8-OHdG). Cuando el balance oxidativo
celular se desestabiliza, bien por causas endógenas bien por agentes exógenos,
se generan un elevado número de ROS que pueden interaccionar con el
ADN desestabilizándolo y dañándolo. La guanina es la base más propensa
a la oxidación y, de los 20 aductos de ADN producto del estrés oxidativo
conocidos, la formación de 8-OHdG es el daño más frecuente (Angerer et
al., 2007). La importancia de reconocer específicamente las bases 8-OHdG,
mediante del empleo de la enzima hOGG1, radica por tanto en el hecho de
que se trata de elementos potencialmente mutagénicos y de que su presencia
en el ADN es consecuencia directa de la exposición a ROS por lo que son
consideradas como un buen biomarcador de estrés oxidativo (Boiteux y
Radicella, 1999; Kuo et al., 2007).
Las enzimas más frecuentemente utilizadas, hasta la fecha, para
la detección de daño oxidativo mediante el ensayo del cometa son la
endonucleasa III (endoIII), que reconoce pirimidinas oxidadas (Collins et al.,
1993), y la formamidopirimidina ADN-glicosilasa (fpg), que es específica para
purinas oxidadas, incluyendo la 8-OHdG (Collins et al., 1996). Sin embargo,
en este estudio se ha utilizado hOGG1 debido a que recientemente se ha
demostrado su mayor especificidad frente al daño oxidativo, ya que tanto
la endoIII como la fpg también reconocen daño provocado por alquilación
(Smith et al., 2006).
Durante el ensayo del cometa se incubaron los leucocitos con hOGG1
con el fin que esta enzima reconociese las bases 8-OHdG indicativas de
daño oxidativo y las eliminase de la secuencia de ADN. Tras su actuación
se generaron sitios abásicos que dieron lugar, debido a las condiciones
fuertemente alcalinas en las que se desarrolla el ensayo, a roturas de cadena.
Así, la cantidad de ADN presente en las colas de los cometas generados tras
la incubación con esta enzima será mayor y representará el daño oxidativo
presente en las células.
77
Los resultados obtenidos en el ensayo del cometa sin incubación con
enzima (Figuras 5 y 6) muestran la existencia de una correlación negativa
entre la dosis de SeMet empleada y el daño detectado, resultando este descenso
significativo en las concentraciones más altas. Estos datos obtenidos sugieren
por tanto que la SeMet no sólo no ejerce efectos genotóxicos sobre el ADN
sino que por el contrario reduce el daño basal presente en las células estudiadas.
Estos resultados apoyarían las hipótesis de otros autores que sugieren que una
pequeña cantidad de SeMet en la dieta (inferior a 200 μg/día) puede proteger
a la célula del daño endógeno (Schrauzer, 2001; Letavoyavá et al., 2006).
Tras el tratamiento con hOGG1 se encontró un incremento significativo en
el promedio de %TDNA en las células del control y en las concentraciones de
SeMet 1, 5 y 10μM con respecto a las mismas condiciones sin enzima (Figura 7),
lo que apoya el uso de esta enzima junto con el ensayo del cometa como buen
indicador del daño oxidativo en el ADN (Smith et al., 2006). Sin embargo,
no se encontraron diferencias en los tratamientos 50 y 100 μM con respecto
a la incubación con buffer, lo que sugiere un posible papel antioxidante de la
SeMet en las concentraciones más altas evaluadas. Además, la concentración
de SeMet 50 μM experimenta un descenso significativo respecto al daño
oxidativo basal mostrado por el control, dato que señala nuevamente a
un efecto protector de este compuesto frente al daño oxidativo. Los datos
recogidos en la bibliografía muestran que los niveles de Se en los fluidos
corporales (suero, plasma y sangre total) son más bajos en los pacientes con
cáncer que en los sujetos control (revisado en Alaejos et al., 2000) indicando
además que, frecuentemente, la diferencia entre las poblaciones no es mayor
que las concentraciones de Se correspondientes a 50 y 100 µm de SeMet (4
y 8 mg/l). Nuestros resultados apoyan por tanto que la administración de un
suplemento de SeMet para llegar a alcanzar estos niveles orgánicos puede ser
beneficiosa para la prevención del cáncer.
Al contrario de estos resultados positivos encontrados en las
concentraciones más altas testadas, tras la incubación con la enzima se
encontró que la concentración 1μM mostraba un incremento significativo
del daño oxidativo respecto al control sin SeMet. Trabajos anteriores ya
describen efectos adversos de cantidades limitadas de SeMet en el organismo
(Waters et al., 2005; Vega et al., 2007). Estos estudios concluyeron que a
concentraciones demasiado bajas, al igual que ocurre en cantidades demasiado
elevadas, la SeMet podía inducir daño en el ADN, disminuir la actividad de la
78
glutation-peroxidasa produciendo un incremento en el daño oxidativo, causar
alteraciones del sistema inmune y, en consecuencia de todo ello, aumentar el
riesgo a desarrollar procesos neoplásicos.
Confirmando estudios anteriores que ya ponían de manifiesto la relevancia
de la concentración y la forma química de Se empleadas (Shamberger, 1984;
Ip, 1998; Schrauzer, 2001), vemos que las distintas concentraciones de SeMet
testadas en este trabajo influyen en el efecto que ejerce este compuesto sobre
el ADN. Al estudiar la genotoxicidad de la SeMet observamos que el daño
evaluado disminuye conforme aumenta la concentración de SeMet, mientras
que en el caso específico del estudio del daño oxidativo los efectos que ejercerá
la SeMet son beneficiosos o perjudiciales según sea la concentración empleada.
En base a los resultados obtenidos y debido a todas estas observaciones
decidimos emplear la concentración de 50 μM durante los restantes ensayos
del presente estudio, puesto que a esta concentración la SeMet no es genotóxica
ni induce daño oxidativo en el ADN y, por el contrario, parece mostrar cierto
efecto antioxidante.
5.3. El ensayo de competencia de reparación del ADN
El organismo está constantemente expuesto a numerosos agentes que
pueden alterar su material genético favoreciendo la aparición y desarrollo
de numerosas patologías, entre ellas el cáncer. Para protegerse de ese daño,
las células poseen una serie de mecanismos de defensa y de reparación
encargados de disminuir en la medida de lo posible las lesiones que causan
estos agentes y de esta forma minimizar los efectos finales resultantes (Wood,
1996). Estos procesos de reparación del ADN representan mecanismos que
permiten la supervivencia de la célula ya que, además de corregir los errores
propios de la replicación, juegan un papel decisivo frente a los agentes tóxicos
tanto exógenos (radiación, compuesto químicos, virus, etc.) como endógenos
(radicales libres, metabolitos secundarios, etc.) que pueden afectar al genoma.
Errores o deficiencias en estos procesos de reparación producen una cascada
de acumulación de aberraciones en el genoma, afectando también a las
propias proteínas que intervienen en la reparación y culminando en la llamada
inestabilidad genética, punto de partida de multitud de procesos neoplásicos
(Buermeyer et al., 1999; De Boer y Hoeijmakers, 2000).
La importancia de estudiar la capacidad individual de reparar lesiones en
el ADN radica, por tanto, en la observación de que mecanismos deficientes de
79
reparación del genoma se han relacionado con la presencia de gran cantidad de
patologías y procesos neoplásicos, y de que alteraciones en estos mecanismos
pueden variar la susceptibilidad de los individuos expuestos a un determinado
mutágeno. La incapacidad para reparar el ADN dañado es además la principal
causa del cáncer (Au, 1993; Au et al., 1996a; Berwick y Vineis, 2000).
La relación entre los distintos compuestos de Se y la capacidad de
reparación celular ha sido ya descrita y establecida (Stewart et al., 1999;
El-Bayoumy, 2001; Hartwig et al., 2003). Muchos autores defienden
que el papel protector que puede desempeñar el Se frente al cáncer y a
otras patologías viene determinado por su presencia en las selenoenzimas,
muchas de las cuales son importantes proteínas de la maquinaria de
reparación celular y participan activamente en procesos de reparación de
daño oxidativo (Combs Jr. y Gray, 1998; Ganther, 1999; Rayman 2005). Es
por esto que en varios estudios de administración de Se en la dieta se han
encontrado incrementos en la capacidad de reparación celular (Seo et al.,
2002a; Abul-Hassan et al., 2004). No obstante, en contra de esta hipótesis
está el trabajo de Gladyshev et al. (1998), que evaluaron la expresión de
varias selenoproteínas antioxidantes en tres tipos de células cancerígenas
y las compararon con células normales. La glutation-peroxidasa fue
disminuyendo mientras que la tiorredoxín-reductasa fue aumentando en
todas las células cancerígenas comparadas con todas las líneas celulares
(o tejidos) control. Si las funciones antioxidantes de estas proteínas fueran
de alguna forma la base de la actividad anticancerígena del Se, se podría
esperar que hubiera una expresión en paralelo de ambas enzimas.
Para evaluar cómo afecta una exposición a SeMet a la maquinaria de
reparación de leucocitos humanos hemos utilizado el ensayo de competencia
de reparación del ADN in vitro. El ensayo de competencia de reparación del
ADN es un ensayo citogenético en el que las células son forzadas, mediante
distintos métodos de inducción, a reparar las lesiones producidas en el ADN.
Evaluando estas lesiones y comparándolas con un control tendremos una
estimación directa de la capacidad de reparación que poseen esas células (Au
et al., 1991). Este ensayo puede ser utilizado para determinar una respuesta
anormal de reparación del ADN debida, por ejemplo, a patologías como
síndrome de Down; también es capaz de responder a exposiciones excesivas
a tóxicos como indicador de deficiencia en la reparación del ADN (en el
caso concreto del butadieno, por ejemplo, se llegó a establecer una relación
causa-efecto (Au et al., 1995a)) y puede ser empleado en estudios in vivo e
80
in vitro (Au et al., 1996b). Es además más sensible para detectar alteraciones
biológicas por exposición a tóxicos que otros ensayos citogenéticos estándar
(Au et al., 2001).
Aunque los mecanismos por los que se producen anomalías en la reparación
son desconocidos, se cree que estas anomalías pueden estar causadas por un
bloqueo de los procesos de reparación del ADN o por mutaciones en genes que
codifican para enzimas de reparación (Au, 1993). Puesto que la reparación del
ADN es un proceso que implica un gran número de enzimas y vías distintas,
defectos en algún punto de la maquinaria, por pequeños que sean, afectarán
a la capacidad final de reparar el daño, por lo que podrán ser detectados
mediante el ensayo de competencia de reparación del ADN. Esta elevada
sensibilidad de este ensayo permite también poner de manifiesto alteraciones
en la capacidad de reparación muy tenues y difícilmente detectables por otros
medios. Las exposiciones ambientales a bajas concentraciones de mutágenos
pueden producir aberraciones cromosómicas que no se manifiestan de forma
inmediata, pero pueden también causar alteraciones en los mecanismos
de reparación. Esto implica que muchas células que tienen defectos en la
reparación en principio muy sutiles, tras el ensayo de competencia de
reparación se amplifican y pueden ser visualizados (Au, 2001). Por lo tanto,
la extensa y multiplicada respuesta al ensayo de competencia de reparación
hace de éste un método más sensible que los ensayos de genotoxicidad
tradicionales (Au, 2007).
El empleo del ensayo del cometa como test de genotoxicidad en la
realización del el ensayo de competencia de reparación del ADN constituye
una poderosa herramienta para la determinación de la capacidad de reparación
y presenta importantes ventajas frente a otros métodos. Además se estableció
que la aplicación de este ensayo era un buen biomarcador de daño genotóxico
y de capacidad de reparación de daño en el ADN (Cebulska-Wasilewska et
al., 2005a). Lo realmente novedoso de esta combinación de técnicas y la
ventaja frente a otras técnicas similares es la posibilidad de cuantificar la
reparación por la evolución del daño a diferentes tiempos, realizando el ensayo
inmediatamente después de tratar las células con el mutágeno y nuevamente
tras el correspondiente periodo de reparación, durante el cual las células
permanecen en cultivo (Rajaee-Behbahani et al., 2001; Schmezer et al., 2001).
Se pueden realizar también otras evaluaciones de daño a tiempos intermedios
para estudiar la dinámica de la reparación. Esta determinación del daño a
diferentes tiempos nos permite establecer una relación entre ADN dañado y
81
ADN reparado, obteniendo así el porcentaje de reparación en cada población
de estudio. Lo que significa que al combinar el ensayo de competencia
de reparación con el ensayo del cometa obtenemos una medida directa y
cuantitativa de la capacidad de reparación, que puede reflejarse mediante el
empleo de distintos índices: de eficacia de reparación, de daño residual tras la
reparación y de sensibilidad al mutágeno empleado como inductor (CebulskaWasilewska et al., 2005a y 2005b).
Para realizar el estudio del efecto de la SeMet sobre la capacidad de
reparación celular mediante el ensayo de competencia de reparación hemos
cultivado leucocitos con esta forma de Se en tres fases distintas del estudio
(fase de cultivo A, fase de inducción de daño B y fase de reparación C) y
combinaciones de éstas (fases AB y fases ABC), y posteriormente se evaluó
el daño existente en las células para cada uno de los tratamientos, antes y
después de reparar, y se comparó con un control. Para llevar a cabo el ensayo
decidimos emplear la bleomicina como agente inductor de daño, el ensayo del
cometa como test de genotoxicidad y el tratamiento con la enzima hOGG1
como medida específica del daño oxidativo.
5.3.1. Genotoxicidad de la bleomicina
Empleamos la bleomicina como agente inductor de daño en el ensayo de
competencia de reparación porque es un conocido agente radiomimético que
causa roturas de cadena sencilla y doble, así como daño oxidativo en el ADN
por liberación de radicales libres (Milic y Kopjar, 2004). Las condiciones
utilizadas en el ensayo, con y sin incubación con hOGG1, permiten
determinar y estudiar por separado la dinámica de ambas lesiones. Por otro
lado, la bleomicina es un medicamento empleado en quimioterapia por lo
que, teniendo en cuenta que el Se es un conocido agente quimiopreventivo,
se pueden relacionar los resultados obtenidos en este estudio con los efectos
anticancerígenos del Se empleado como suplemento en la dieta de pacientes
con cáncer y establecer una posible interacción entre ambos compuestos.
Varios estudios clínicos empleando Se mostraron que éste influye sobre los
efectos de los agentes quimioterapeúticos usados en tratamientos contra el
cáncer (Aboul-Fadl, 2005). Duffiel-Lillico et al. (2003) realizaron un amplio
estudio in vivo sobre 1312 hombres y mujeres con un historial de dos o más
carcinomas de células basales o uno o más carcinomas de células escamosas
de piel a los que durante 10 años se suplementó en la dieta para estudiar si
82
este suplemento podía prevenir el cáncer de piel no melanómico. Tras este
tiempo observaron que no sólo no había diferencias significativas entre los
suplementados con Se y los tratados con placebo, sino que el suplemento
aumentaba significativamente el riesgo de carcinoma de células escamosas
y de cáncer de piel no melanómico, y apuntaron como posible causa de esto
la interacción con los medicamentos empleados para tratar estas patologías.
Concluyeron que era posible que esos fármacos anularan o incluso revertieran
los efectos del Se administrado.
Los resultados del tratamiento con bleomicina (Figura 8) muestran un
incremento significativo del daño en el ADN con respecto al control tanto
antes como después del periodo de reparación. No obstante, tras la reparación,
el porcentaje de ADN en la cola ha disminuido significativamente con
respecto al detectado inmediatamente después de la inducción con bleomicina.
Tras la incubación con hOGG1 (Figura 9), el daño presente también es
significativamente mayor antes y después de reparar con respecto al control sin
bleomicina. Pero, nuevamente, tras la reparación se reduce significativamente
el daño medido. Estos resultados coinciden con las aportaciones de Povirk
y Austin (1991) y Milic y Kopjar (2004), que defienden que la bleomicina es
un potente agente genotóxico que induce roturas de cadena y daño oxidativo
en el ADN celular, y con los trabajos de Schmezer et al. (2001) y Glei y
Pool-Zobel (2006), que concluyen que la mayor parte del daño inducido por la
bleomicina se repara en los primeros 15 min tras el tratamiento.
5.3.2. Efecto de la selenometionina sobre la inducción de daño
Los datos obtenidos para cada uno de los tratamientos con SeMet en las
diferentes fases del estudio (Figura 10) muestran que este compuesto influye en
la inducción del daño que la bleomicina ejerce sobre el ADN de los leucocitos
estudiados. En los tratamientos con SeMet en fase de cultivo A, este daño
es significativamente mayor mientras que disminuye en los tratamientos con
SeMet en la fase de inducción de daño B y en ambas juntas AB respecto al
tratamiento sólo con bleomicina, significativamente en el último caso.
Tras el tratamiento con la enzima (Figura 11) ocurre lo contrario, en el
tratamiento con SeMet en fase A el daño oxidativo detectado es menor que
el que presentan las células del tratamiento sólo con bleomicina mientras
que en las fases B y AB, este daño aumenta. Estos resultados indican que la
SeMet podría actuar como elemento protector frente a las roturas de cadena
83
inducidas si el cultivo con SeMet se realiza durante la fase B o conjuntamente
en las fases A y B y como antioxidante si los leucocitos son cultivados con
este compuesto previamente al tratamiento con bleomicina. Estos resultados
coinciden con otros previos en donde se describe un efecto protector de la
SeMet frente al daño inducido por varios agentes, químicos o físicos, en el
ADN (Roussyn et al., 1996; Rafferty et al., 2003). Concuerdan también con
otro estudio que muestra las propiedades antigenotóxicas de este compuesto
de Se sobre el daño inducido en el ADN por la doxorrubicina, un fármaco
anticancerígeno, tanto en ratas (Santos et al., 2007) como en linfocitos humanos
(Santos y Takahashi, 2008). En relación a otros fármacos quimioterapéuticos,
Rao et al. (1998) demostraron que la SeMet protege contra la nefrotoxicidad
inducida por el cisplatino sin interferir en su actividad antitumoral, y Cao et
al. (2004) concluyeron en su estudio que la SeMet protege selectivamente
contra la toxicidad inducida por varios agentes quimioterapéuticos al tiempo
que aumenta la actividad antitumoral y la tasa de curación.
5.3.3. Efecto de la selenometionina sobre la reparación del daño
El tiempo permitido para la reparación del daño inducido por bleomicina
se fijó en 15~min puesto que éste es el tiempo establecido por Schmezer et
al. (2001) como el óptimo para analizar la reparación del daño inducido por
la exposición a bleomicina. Además, estudios previos realizados en nuestro
laboratorio también confirman este hecho, ya que no se encontraron diferencias
significativas entre el daño evaluado tras un periodo de reparación de 15 min
frente al obtenido tras un periodo de reparación de 30 min.
Los resultados obtenidos después del periodo de reparación (Figuras
12 y 13) nos indican que la SeMet favorece la reparación del daño causado
por la bleomicina, ya sean roturas de cadena o daño oxidativo, especialmente
cuando se aplica durante la fase de cultivo previa al tratamiento
conjuntamente con la fase de inducción de daño. Si el tratamiento con SeMet
ocurre durante la fase de reparación sucede que aumenta la reparación de
daño en general pero disminuye la reparación específica de daño oxidativo,
llegando a alcanzar un incremento significativo de este daño con respecto al
tratamiento sólo con bleomicina.
El papel de Se en la reparación del ADN fue puesto de manifiesto por
primera vez cuando se demostró que un tratamiento con Se mejoraba la
capacidad de reparación de células previamente dañadas con radiación UV
84
debido al aumento en la actividad de los complejos proteicos encargados de
dicha reparación (Seo et al., 2002a). Otro estudio demostró recientemente
que el tratamiento previo con SeMet induce una respuesta de reparación del
ADN dependiente de p53, elevando la expresión de las proteínas responsables
del reconocimiento del ADN dañado e incrementando la tasa de reparación
celular, protegiendo de esta manera al ADN frente a las exposiciones
posteriores a agentes inductores de daño (Fischer et al., 2007). Inducir la
reparación del ADN podría ser un mecanismo de quimioprevención que muy
pocos compuestos han demostrado tener (Collins et al., 2003). Zhang et al.
(2008) indicaron además que el Se sólo aumenta la reparación del ADN en los
tejidos normales como consecuencia de la modulación selectiva del Se sobre
el Nrf2 de tejidos tumorales y normales (Kim et al., 2007), lo que apoya el
empleo de un suplemento de SeMet en los pacientes de cáncer tratados con
fármacos quimioterapéuticos.
No obstante, los resultados de esta parte del estudio ponen también de
manifiesto que, según la fase en la que se administre, la SeMet puede actuar
reduciendo o incrementando el daño oxidativo en las células. Esto coincide
con lo descrito en otros trabajos que señalan el doble papel biológico que
puede representar el Se (Miller et al., 2001; Drake, 2006). Este compuesto
puede ejercer un efecto prooxidante o antioxidante, llegando en consecuencia
a resultar nocivo o beneficioso para el organismo receptor en base a las
características que presente el compuesto y al propio organismo. El Se actúa
como antioxidante formando parte de las selenoproteínas, muchas de las
cuales son importantes enzimas de la maquinaria de reparación celular como
la glutation-peroxidasa y la tiorredoxin-reductasa. Y actúa como prooxidante
generando ROS y promoviendo en consecuencia la oxidación del ADN in vivo
(Letavayová et al., 2006).
5.3.4. Efecto de la selenometionina sobre la persistencia de daño
Al comparar los datos recogidos en nuestro ensayo en los distintos
tratamientos antes y después de reparar vemos que, tras la reparación el daño
originalmente inducido por la bleomicina se reduce en todos los tratamientos
salvo en el cultivo con SeMet en fase B (Figura 14). Al estudiar específicamente
el daño oxidativo reparado vemos que de nuevo en todas las fases del estudio
sin excepción se reduce significativamente el daño oxidativo medido tras el
periodo de reparación con respecto al existente inmediatamente después del
85
tratamiento con bleomicina (Figura 15). Se verifica así que el tiempo permitido
en el estudio para la reparación es generalmente suficiente para reparar las
roturas de cadena simple y doble, los sitios álcali-lábiles y el daño oxidativo
inducido por la bleomicina.
La influencia de la SeMet sobre la persistencia del daño inducido por la
bleomicina en cada uno de los tratamientos es diferente. En la evaluación del
daño global en el ADN, en el tratamiento con SeMet en fase A el descenso del
%TDNA detectado tras la reparación es mayor que el evaluado en el tratamiento
sólo con bleomicina por lo que la persistencia del daño es considerablemente
menor, en la fase AB apenas se aprecia variación y en la fase B aumenta la
persistencia con respecto al tratamiento sólo con bleomicina. Tras la incubación
con la enzima hOGG1, en la fase A aumenta la persistencia de daño, en la fase
B se mantiene y en la fase AB disminuye con respecto a los valores obtenidos
en el tratamiento sólo con bleomicina. Estas observaciones indican que el
cultivo con SeMet en fase A favorece el descenso del daño general inducido
con bleomicina mientras que el tratamiento con este compuesto en las fases A
y B conjuntamente favorecería una reparación específica del daño oxidativo.
El cultivo en fase B, en cambio, no sería beneficioso en ninguno de los dos
tipos de daño. Estos resultados confirmar la idoneidad del tratamiento con
SeMet en las fases A y B conjuntamente para obtener efectos protectores
contra el daño inducido por la bleomicina.
5.3.5. Eficacia de reparación
Los resultados obtenidos en este estudio se pueden exponer también
mediante el empleo de un índice llamado “eficacia de reparación” (RE, repair
efficence) (Cebulska-Wasilewska et al., 2003). Mediante la representación
gráfica de los índices RE calculados podemos ver que la influencia de la
SeMet en la capacidad de reparación celular para cada uno de los tratamientos
del estudio (Figura 16).
En relación a la eficacia de la reparación del daño en general, los
índices indican que la SeMet aumenta la eficacia de reparación en todos
los tratamientos, salvo en el cultivo en fase B, aunque este incremento no
llega en ningún caso a alcanzar significación estadística. En cuanto al daño
específicamente oxidativo, el cultivo con SeMet en cualquiera de las fases
o combinaciones de éstas aumenta la eficacia de reparación de las células,
especialmente en el caso concreto del tratamiento conjunto en las fases A y
86
B. Estos resultados ponen de manifiesto el efecto positivo que ejerce la SeMet
sobre la capacidad de reparación del daño inducido en los leucocitos del estudio,
especialmente cuando se aplica antes o simultáneamente con la bleomicina,
y apoyan los mecanismos de quimioprevención de la SeMet basados tanto en
sus propiedades antioxidantes como su capacidad de interferir en las vías de
reparación del ADN (Santos y Takahashi, 2008).
6. CONCLUSIONES
En resumen, en el presente trabajo se han obtenido las siguientes
conclusiones:
1. La SeMet no ejerce actividad genotóxica sobre leucocitos humanos en
el rango de dosis evaluado, presentando una relación dosis-respuesta
negativa que determina la existencia de cierto efecto protector a las
dosis de 50 y 100µM, tanto sobre el daño en el ADN en general como
sobre el daño oxidativo.
2. Se ha confirmado la validez de la bleomicina como agente inductor de
daño en el ADN y de daño oxidativo, y del periodo de 15 min como el
más adecuado para que se produzca la reparación de la mayor parte
del daño inducido por este compuesto.
3. La presencia de SeMet ejerce un efecto protector frente a la inducción,
reparación y persistencia del daño en el ADN y del daño oxidativo
inducidos por la bleomicina, especialmente si el tratamiento se realiza
durante las fases de cultivo e inducción de daño conjuntamente.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por un proyecto de la Xunta de Galicia
(INCITE08PXIB106155PR). Durante su realización, V. Valdiglesias ha
disfrutado de una beca predoctoral de la Universidade da Coruña.
87
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Composición en macronutrientes, aminoácidos
y minerales de algunos invertebrados marinos
no utilizados habitualmente como alimento
C. Taboadaa*, R. Millána, I. Migueza, E. Fernández-Pulpeirob
a
Departamento de Fisiología. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de
Compostela. 15782 Santiago de Compostela. España.
b
Departamento de Zología y Antropología Física. Facultad de Biología. Universidad de
Santiago de Compostela. 15782 Santiago de Compostela.España
*E-mail: [email protected]
RESUMEN
Se analizó la humedad, proteína, grasa, minerales y contenido en
aminoácidos de los invertebrados marinos Paracentrotus lividus (Lamarck,
1816), Marthasteria glaciales (Linnaeus, 1758), Monodonta lineada (Da
Costa, 1778), Holothuria forskali Delle Chiaje, 1823, Patella vulgata Linneus,
1758, Actinia equina (Linneus, 1758), Anemonia viridis (Forskal, 1775) y
Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1718, especies que habitualmente no
se consumen, con el fin de deducir su posible utilidad como alimentos. El
contenido en proteína osciló entre un 9 y un 13,5% y el de grasa entre un
0,22 y un 5,48% de materia seca. En todas las especies los amino ácidos
más abundantes fueron el ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, arginina,
treonina y alanina mientras que el contenido en minerales varía ampliamente
entren las distintas especies. Tanto por la composición como por la calidad de
la proteína, las especies objeto de estudio parecen adecuadas para consumo
humano y explotación comercial.
Palabras clave: Amino ácidos, grasa, invertebrados marinos, minerales,
proteína.
96
Abstract
The moisture, protein, total lipid, mineral contents and amino acid
compositions of the marine invertebrates Paracentrotus lividus (Lamarck,
1816), Marthasteria glaciales (Linnaeus, 1758), Monodonta lineada (Da
Costa, 1778), Holothuria forskali Delle Chiaje, 1823, Patella vulgata Linneus,
1758, Actinia equina (Linneus, 1758), Anemonia viridis (Forskal, 1775) and
Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1718, species not traditionally used as
foodstuffs, were determined in order to deduce their potential usefulness.
Protein content ranged from 9 to 13.5% dry weight and total lipid content
ranged from 0.22 to 5.48% dry weight. Aspartic acid, glutamic acid, glycine,
arginine, threonine and alanine were the predominant amino acids in the
above mentioned species. Mineral content has been shown to vary according
to the species. The composition of the marine invertebrates under study and
the good quality of their proteins make them suitable for consumption and
commercial exploitation.
Key words: Amino acids, marine invertebrates, minerals, lipids, protein.
INTRODUCCIÓN
El creciente número de publicaciones de los últimos años relacionando la
dieta con diversas enfermedades crónicas, despierta gran interés por alimentos
que resultan beneficiosos para la salud y reduzcan la incidencia de enfermedades
(Sloan, 1999; Roche, 2006). En este sentido, los invertebrados marinos son
una buena fuente de proteínas de alta calidad ya que su composición en
aminoácidos está bien equilibrada, son además ricos en minerales y vitaminas
y tienen un contenido en grasa relativamente bajo. Muchos se utilizan como
alimentos o como suplementos y cada vez se reconoce más su papel destacado
en nutrición (Soriguer y col., 1997). Pero precisamente este reconocimiento
de los efectos beneficiosos de los productos marinos en el consumidor, tiene
como consecuencia que los stocks de aquellos que se usan tradicionalmente
como alimentos hayan declinado por sobreexplotación (Venugopal y Shahidi,
1995) y de ahí el interés de encontrar especies nuevas, desconocidas o no
utilizadas que puedan tener valor como alimento, bien sea para su utilización
directa para consumo humano o como surimí, hidrolizados, concentrados de
proteína, etc. (Wijkstrom, 2004; Rossano y col., 2005).
97
Los alimentos de origen marino son una buena fuente de ácidos omega-3,
con un destacado potencial en nutrición y beneficiosos para la salud y sus
proteínas poseen una composición en amino ácidos bien equilibrada, por lo
que podrían ser utilizados directamente como fuente de aminoácidos o en
preparaciones como dispersiones o hidrolizados (Shahidi, 2004).
Pero antes de que estas especies que tradicionalmente no se explotan se
utilicen como alimentos o en la industria alimentaria, se necesita información
sobre su composición nutritiva para compararla con la de aquellas habitualmente
utilizadas y poder así deducir su posible utilidad.
Por ello, en este trabajo analizamos el contenido en humedad, grasa y
proteína de los siguientes invertebrados marinos recogidos en las costas
de Galicia: Paracentrotus lividus (erizo), Marthasteria glaciales (estrella
de mar), Monodonta lineata (caramujo), Holothuria forskali (pepino de
mar), Patella vulgata (lapa), Actinia equina (actinia) y Anemonia viridis
(anemona) así como la de Mytilus galloprovincialis (mejillón) con la cual
se compararon. Desde el punto de vista nutricional, no sólo es importante la
cantidad de proteína sino también su calidad, que depende de la composición
en amino ácidos, razón por la cual se determinó este parámetro en las especies
anteriormente mencionadas. Por otra parte, en los organismos vivos, el
daño oxidativo a macromoléculas puede controlarse mediante dos tipos de
sistemas antioxidantes, uno de ellos está representado por enzimas capaces
de eliminar especies reactivas de oxígeno, como la superóxido dismutasa,
peroxidasa y catalasa, dependientes de cobre, selenio, hierro, manganeso y
cinc (Passi y col., 2002), lo que justifica el interés de averiguar también su
contenido en minerales.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Material utilizado
Todas las especies estudiadas se recogieron en las costas de Galicia y se
trasladaron al laboratorio, lo antes posible, en recipientes refrigerados con
agua de mar. Las determinaciones se realizaron en la vianda de mejillón,
caramujo, pepino de mar, lapa, actinia y anémona y en las gónadas de erizo y
estrella de mar. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
98
2.2. Composición en macronutrientes
La determinación de humedad se realizó por desecación a 105º C hasta
peso constante utilizando un analizador Scaltec SMO 01 (AOAC, 2001).
La cantidad total de proteína se determinó en cada muestra por
conversión del contenido en nitrógeno determinado por el método Kjeldahl
(AOAC, 2001).
Para el cálculo del contenido en grasa se utilizó el procedimiento de
extracción con éter etílico usando el sistema Shoxlet system (AOAC, 2001).
Con Anemonia viridis y Actinia equina, las determinaciones se realizaron
tanto con el material crudo como después de someterlo a fritura en aceite de
oliva para eliminar los polipéptidos tóxicos termolábiles que contienen.
2.4. Análisis de aminoácidos
El contenido en aminoácidos de las proteínas se determinó mediante HPLC.
Para ello se situaron las muestras en recipientes con ClH 6M, se hidrolizaron
a 110º y cada solución se secó en rotavapor. Los residuos disueltos en ClH
20 mM y filtrados se derivatizaron mediante un sistema AccQ Tag (Waters,
Milford, MA). El sistema HPLC consistió en una bomba binaria, un módulo
desgasificador y un detector de fluorescencia, todos ellos Waters, usando una
longitud de onda de excitación y emisión de 250 y 395nm respectivamente.
Los cromatogramas se registraron con un software Breeze. Las soluciones
patrón de aminoácidos se obtuvieron de Waters, excepto para la norleucina,
que se preparó en agua MilliQ a partir de un estándar individual (Sigma
Chemicals Co, USA, Ref. N-8513).
2.5. Contenido en minerales
El contenido en minerales se determinó mediante la técnica de
espectrometría de emisión óptica ICP-OES en un espectrofotómetro Parkin
Elmer 4300DV. Para la preparación de los blancos y de las muestras de las
especies marinas ensayadas, se siguió el método de Förstenr y Wittmann (1983)
modificado. Para ello se situaron las muestras en recipientes con H2O2 al 30%
(Merck Suprapur) y se calentaron progresivamente hasta que se volvieron
99
transparentes. Los residuos obtenidos tras la evaporación se disolvieron en
HNO3-HCl (1:3) (Merck Supapur), se digirieron a 110º C y se filtraron.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudiamos la composición del músculo de cinco invertebrados marinos
y las gónadas de dos, todos ellos de escaso valor en el mercado, y se
compararon con la del mejillón, molusco que se considera un buen alimento,
con objeto de conocer las posibilidades que presentan estas posibles nuevas
fuentes de alimento.
Tabla 1. Composición en macronutrientes (%) de invertebrados marinos.
Además, el contenido en aminoácidos de todas ellas, se comparó con el
de la caseína puesto que, junto con la albúmina, se considera una proteína
patrón.
3.1. Humedad, proteína y grasa
El contenido en agua, proteína y grasa de las especies estudiadas se
recoge en la Tabla 1. El porcentaje de humedad osciló entre un 78,4 %, en
el caso del caramujo, y el 92,1% para actinia, siendo 85% el valor obtenido
100
con el mejillón. En general, la humedad de pescados y mariscos utilizados
para consumo humano se sitúa entre el 60 y el 85% (Sikorski y col., 1990).
El menor contenido en grasa correspondió a la holoturia con sólo un 0,22%
y el valor más elevado se registró en las gónadas de la estrella de mar con un
5,48%, siendo 1,9 el porcentaje de grasa que contiene el mejillón. Como cabía
esperar, las muestras frescas de huevas son las que presentan niveles más
altos de grasa, así como las sometidas a proceso de fritura. Comparando estos
datos con los que se pueden recoger en la bibliografía para invertebrados
marinos, el contenido lipídico de la oreja de mar oscila entre un 0,70%
según datos de González y col. (2001) y un 0,80% en el trabajo publicado
por Dunstan y col. (1996). King y col. (1990) señalan valores de grasa en
marisco de consumo habitual, que se sitúan entre el 0,7% de las vieras y el
3,1% en mejillones, mientras que Gökoolu y Yerlikaya (2003) consideran que
el contenido lipídico del cangrejo de mar es prácticamente irrelevante en su
composición. En un reciente trabajo realizado por Sirot y col. (2008) sobre la
composición lipídica de mariscos y pescados consumidos en Francia, indican
un 0,4% en berberechos, el 1,1% en mejillones, un 0,55% para las ostras y un
1,8% para el caramujo, cifra esta última algo superior a la que obtuvimos en
nuestro estudio. De todos modos, hay que tener presente que el contenido en
agua y humedad depende del tamaño de las especies y de la época entre otros
factores, siendo mayores las variaciones en moluscos que en crustáceos. En
relación con la proteína, se sitúa en un rango que va desde un 9% en el caso de
actinias hasta un 13,5% para lapas, correspondiéndoles valores intermedios
a éstos al resto de las especies. Sikorski y col. (1990), encontraron niveles
proteicos entre el 10 y el 24% en pescados e invertebrados marinos. De todos
modos, si consideramos solamente los datos publicados para invertebrados
que actualmente están en el mercado, como es el caso de la almeja, la ostra o
el berberecho, podemos ver que las especies objeto de este trabajo tienen una
cantidad de proteína similar o incluso superior.
En resumen, en lo que respecta a macronutrientes, podemos afirmar
que la composición encontrada en los invertebrados marinos objeto de este
estudio concuerda con los datos publicados para otras especies habituales
en la dieta humana.
101
Tabla 2. Composición en aminoácidos (mg amino acido/g proteína) de los invertebrados
marinos estudiados.
3.2. Composición en aminoácidos
La composición en aminoácido, expresada en mg de amino ácido/g de
proteína, se indica en la Tabla 2. Todas las especies analizadas contienen todos
los amino ácidos esenciales, y el ácido aspártico, glicina, arginina, treonina,
alanina y ácido glutámico fueron los amino ácidos
Tabla 2 (Continuación).
102
predominantes en la fracción proteica a pesar de que este último se encontró
en todas las muestras en valores inferiores a los de la caseína. El glutámico
fue también muy abundante en cangrejo de mar, seguido de aspártico,
arginina, lisina y leucina, según los datos publicados por Nack y col. (2004)
así como en muchos cefalópodos (Zlatanos y col. 2006). El ácido glutámico
es también el predominante en holoturias, seguido de glicina y aspártico,
con leucina y lisina presentes en cantidades elevadas (Zhong y col., 2007),
mientras que en ostras los más abundantes son también el ácido glutámico
pero en este caso junto con la taurina (Tapiero y Tew, 1996). Glutámico,
treonina y alanina, junto con otros compuestos, son responsables del olor
y sabor característicos de los productos marinos en general, y además,
la arginina intensifica estas propiedades organolépticas, aminoácido, por
otra parte, muy adecuado para el consumo humano por ser precursor del
óxido nítrico, importante vasodilatador. En caso del glutámico, aunque se
considera un aminoácido no esencial, hay que tener presente que pasa a
ser condicionalmente esencial en casos de traumatismos, cirugías, sepsis,
quimioterapia y radioterapia, situaciones en las que la utilización excede a la
síntesis. Además, la sal sódica del glutámico se añade a diversos alimentos
para mejorar e intensificar el sabor (Tapiero y col., 2002). Según los resultados
obtenidos, las huevas de estrella de mar contienen en general valores más
altos de aminoácidos esenciales que el mejillón, lo que también ocurre con
el caramujo con excepción de fenilalanina, lisina e isoleucina. El contenido
en treonina en caramujos y estrella de mar es incluso superior al de la
Tabla 3. Composición mineral de los invertebrados marinos estudiados. El contenido en
Mn, Fe, Zn, Cu y Se se expresa en μg/g materia seca y el de K y Ca en mg/g materia seca.
caseína, proteína considerada de referencia por la FAO.
103
El aminoácido limitante es la metionina excepto en el caso del caramujo,
en el que aunque es baja la cifra para este aminoácido, es la histidina el que
está presente en menor concentración.
3.3. Composición mineral
Los datos correspondientes a macrominerales y elementos traza
analizados se recogen en la Tabla 3, en la que se puede ver que los resultados
varían en función de la especie considerada. Manganeso, hierro, zinc, cobre
y selenio son minerales que están implicados en los mecanismos de actividad
antioxidante en humanos, por lo que su inclusión en la dieta puede ser
beneficioso. Generalmente el marisco es una buena fuente de zinc y ostras,
almejas y mejillones lo son también de hierro (King y col., 1990). Análisis de
camarones realizados por Tsanev y col. (1996), revelaron un alto contenido
en hierro, cobre, manganeso y zinc. También encontramos que el caramujo es
más rico en minerales antioxidantes, salvo en selenio, que el mejillón, siendo
especialmente alta la cantidad de cobre que contienen. Además, caramujo
y lapa son ricos en hierro, mientras que a las huevas de estrella de mar les
corresponden los valores más altos de zinc, elemento de función estructural
e imprescindible para el normal crecimiento y maduración. Por su parte el
selenio es un elemento traza esencial que actúa a través de su presencia en
diversas proteínas biológicamente activas (Young, 1981; Holben y Smith,
1999). Actúa como antioxidante inhibiendo la oxidación de lípidos ya que
entre las selenoproteínas, la glutatión peroxidada, que se encuentra en
células de diferentes tejidos así como en plasma, es la enzima antioxidante
mejor caracterizada (Burk, 1997). La concentración de selenio en alimentos
marinos incrementa en el orden siguiente: moluscos < crustáceos < pescados
(Chien, y col., 2003).
Con respecto al calcio, aunque el marisco es rico en este mineral, la
cifra más alta se encontró en holoturias, 139.5 mg/g frente a 80 mg/g en
mejillón, valores ambos superiores a 30 mg/g citado por Heu y col. (2003) en
camarones.
El potasio es fundamental para el buen funcionamiento del sistema
nervioso y para el ritmo normal del corazón, y su deficiencia generalmente
causa trastornos cognoscitivos, intolerancia a la glucosa y alteraciones en el
ritmo cardíaco. Teniendo en cuenta que los alimentos de origen marino son
104
ricos en sodio, su contenido en potasio es importante a la hora de mantener
una ratio sodio/potasio equilibrada.
Ni cobalto ni plomo se encontraron en las partes comestibles de las
especies analizadas.
En conclusión, teniendo en cuenta la composición de los invertebrados
marinos objeto de este trabajo, y la buena calidad de su proteína que se
puede deducir de su contenido en aminoácidos, parecen adecuados para su
explotación comercial y podrían ser útiles para consumo humano. El elevado
contenido en minerales antioxidantes junto con el papel que se le atribuye a
la administración oral de arginina para mejorar la función cardiovascular, los
hace susceptibles de la necesidad de profundizar en el estudio de los efectos
de la ingesta de estas especies, que incluso podrían llegar a considerarse
alimentos funcionales.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Xunta de Galicia. Proyecto número
PGIDT01PX120310PR.
105
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Desarrollo de bancos de germoplasma
de castaño y alcornoque mediante
crioconservación de ápices caulinares y
embriones somáticos
NIEVES VIDAL1, ANA M. VIEITEZ1, M. ROSARIO FERNÁNDEZ 2
y BEATRIZ CUENCA2
1
Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Apartado 122,
15780 Santiago de Compostela
2
TRAGSA, Departamento de Mejora Agroforestal, Crta. Maceda-Valdrey, Km. 2,
32700 Maceda, Ourense
Correspondencia: [email protected], [email protected]
RESUMEN
Los experimentos descritos en este trabajo demuestran la posibilidad de
conservar, a largo plazo, germoplasma de castaño y alcornoque mediante la
crioconservación de ápices caulinares y embriones somáticos, respectivamente.
En ambos casos los explantos se han precultivado en un medio con alto
contenido en sacarosa y posteriormente se han sometido al tratamiento de
vitrificación mediante la solución PSV2 antes de la inmersión rápida en
nitrógeno líquido (NL). Los 23 clones de castaño crioconservados sobreviven
a la acción del NL, pero la capacidad de recuperación de la formación de
brotes (con porcentajes entre el 4 y el 53%) sólo fue posible en 16 de los clones
estudiados. Cuando el compuesto Supercool al 0.1% se añadió a la solución de
vitrificación PVS2, los porcentajes de supervivencia y recuperación de brotes
aumentaron en los 8 clones estudiados.
Los embriones somáticos de los 17 clones de alcornoque sometidos
a crioconservación recuperan su capacidad embriogénica, con tasas de
108
recuperación que varían entre el 25 y el 100%. El protocolo de crioconservación
para esta especie se ha simplificado en relación a los publicados previamente.
Los resultados obtenidos permiten, por vez primera, el desarrollo de un
banco de germoplasma con fines aplicados de castaño y alcornoque.
Palabras clave: Ápices caulinares, banco de germoplasma, Castanea
sativa, crioconservación, embriones somáticos, nitrógeno líquido, Quercus
suber.
ABSTRACT
This work describes experiments demonstrating the feasibility of
long-term conservation of both shoot tips of European chestnut and somatic
embryos of cork oak by cryopreservation. In both cases, the explants have
been pre-cultured on high-sucrose medium followed by the application of
PVS2 vitrification solution prior cryostorage. Shoot recovery was obtained in
16 of the 23 chestnut clones tested, and the rates increased with the use of the
compound Supercool during the vitrification procedure.
The somatic embryos of the all cork oak genotypes assayed (17) were
successfully cryopreserved. The protocol for cryopreservation of cork oak
has been simplified in relation to those previously published.
The results obtained show the possibility, for the first time, of the
development of an applied gene bank for chestnut and cork oak.
Key words: Castanea sativa, chestnut, cork oak, cryopreservation, germplasm
bank, liquid nitrogen, Quercus suber, shoot tips, somatic embryos.
INTRODUCCIÓN
Se estima que el valor económico derivado de los beneficios que
proporciona la biodiversidad al ser humano está comprendido entre los
13.000 y 54.000 millones de dólares por año. Sin embargo, sería enormemente
limitante evaluar los beneficios de la biodiversidad solamente en términos
económicos ya que permite al hombre disfrutar de otro tipo de beneficios
entre los que se encuentran los científicos, estéticos, humanísticos, morales,
109
naturalísticos e incluso negativos, como puede ser la ansiedad derivada del
estudio de su degradación (Kellert, 2005).
Muchos científicos están convencidos que la Tierra está inmersa en un
episodio de extinción masiva de las especies (Wilson, 1993). En el reino
vegetal, más de 33.000 especies de plantas vasculares están amenazadas, lo
que supone el 12.5% del total, que se calcula en 270.000 especies. Aunque se
están dando pasos para relativizar la crisis de la biodiversidad su perspectiva
es incierta más allá del siglo XXI, a no ser que los éxitos en conservación se
aceleren muchísimo (Avise y col., 2008).
Las colecciones de semillas, colecciones en campo, huertos semilleros
y los bancos clonales (bien in situ o ex situ) son las formas tradicionales
de almacenamiento y conservación de los recursos genéticos vegetales. En
el primer caso, sólo especies con semillas “ortodoxas” pueden conservarse
por largos períodos de tiempo sin pérdida de su capacidad germinativa; sin
embargo, las especies con semillas “heterodoxas” o recalcitrantes tienen una
viabilidad muy limitada y su conservación en colecciones convencionales es
problemática. Por otra parte, las colecciones en bancos clonales tienen algunas
limitaciones: es necesaria una elevada superficie de terreno y una mano de
obra especializada para su mantenimiento y conservación y estas colecciones
están siempre expuestas tanto a incidencias abióticas (tormentas, fuego,
inundaciones) como al ataque de agentes bióticos (plagas, enfermedades) que
pueden poner en peligro, en cualquier momento, la propia supervivencia de
la colección.
Las tecnologías del cultivo in vitro de tejidos vegetales ofrecen la
posibilidad de desarrollar sistemas de almacenamiento y conservación de los
recursos genéticos altamente eficaces que pueden ser complementarios a los
bancos convencionales de germoplasma. Para que el sistema sea viable, es un
requisito imprescindible que la especie a almacenar disponga de un protocolo
de regeneración bien definido, para poder obtener plantas completas una vez
pasado el período de almacenamiento. De los sistemas disponibles, el más
sencillo es el almacenamiento del germoplasma producido in vitro a baja
temperatura (2-4º C). Como ventajas en el uso de este método se pueden
citar las escasas necesidades de espacio físico y los bajos costes laborales
(los subcultivos del material pueden alargarse desde las 4 semanas en el
mantenimiento rutinario de los cultivos hasta los 2 años), la eliminación de
problemas relacionados con patógenos y la reducción de la erosión genética
110
si se consiguen condiciones óptimas del almacenamiento (Engelmann, 1991).
Diferentes factores parecen regular el éxito del almacenamiento en frío de
los cultivos in vitro: el estado fisiológico de los brotes, el tipo de explanto,
el medio de cultivo, el tipo de contenedor, la temperatura y las condiciones
de luz (Orlikowska, 1992). Utilizando este sistema, han podido almacenarse
durante 12 meses a 2-4º C cultivos de diferentes clones de castaño, roble y
cerezo (Janeiro y col., 1995). También se han obtenido frecuencias cercanas
al 100% de viabilidad en 7 de los 8 clones o cultivares de Camellia japonica
L. y Camellia reticulata Lindley almacenados en frío durante 12 meses
(Ballester y col., 1997) o en cultivos de Fagus sylvatica durante 18 meses. En
el trabajo de camelia se comprobó también que la encapsulación de los ápices
en perlas de alginato es menos efectiva que el almacenamiento in vitro, ya
que después de 75 días de almacenamiento sólo sobrevivieron el 10% de los
ápices encapsulados.
A pesar de lo expuesto anteriormente, cuando es posible, la crioconservación
(conservación del material vegetal en nitrógeno líquido, NL) es el método más
seguro y más económico para la conservación a largo plazo de las especies que
son propagadas vegetativamente o que tienen semillas que son recalcitrantes
(heterodoxas) al almacenamiento (Pence, 1995). La condición indispensable
para iniciar un proceso de crioconservación es disponer de un sistema de
regeneración de plantas factible y repetitivo (por ejemplo, a partir de ápices
caulinares o embriogénesis somática), que permita la recuperación de
plantas completas después de que las células, órganos o tejidos hayan estado
inmersos en NL. Aunque inicialmente los métodos de crioconservación se
llevaron a cabo mediante un acondicionamiento de las células de los tejidos
con crioprotectores y posterior enfriamiento lento, hoy día es más común
utilizar metodologías basadas en la vitrificación de los tejidos, es decir, la
transición del agua celular directamente de la fase líquida a una fase amorfa o
vítrea, evitando la formación de cristales de hielo intra e intercelular (Sakai,
1995). El método de vitrificación conlleva el tratamiento de las muestras con
sustancias crio-protectoras, deshidratación de los tejidos con soluciones de
vitrificación con elevado potencial osmótico y enfriamiento inmediato por
inmersión directa de las muestras en NL.
Es nuestra intención aplicar los procesos de crioconservación a dos
especies forestales de enorme interés ecológico, ambiental, social, económico,
etc.: castaño y alcornoque. Ambas especies están amenazadas bien por el
ataque de patógenos o por una explotación irracional.
111
La Estrategia Forestal Española (MIMAM, 1999) del Ministerio de
Medio Ambiente, asume una postura activa para la mejora y conservación
de la biodiversidad, estableciendo la necesidad de crear una serie de
herramientas entre las que cabe señalar la Red de Mejora y Conservación de
Recursos Genéticos Forestales. Por otra parte la mejora genética forestal se
encuadra en el llamado Eje A.3 del Plan Forestal Español (2002) donde, entre
otras, se consideran medidas como la determinación de la variabilidad genética
de las especies forestales, establecimiento de las plantaciones de mejora,
conservación, etc. La Ley de Montes (2003) establece en su artículo 53
que “el Ministerio de Medio Ambiente en colaboración con las Comunidades
Autónomas elaborará y desarrollará programas de ámbito nacional que
promuevan la mejora genética y la conservación de recursos genéticos
forestales”. Por otra parte uno de los objetivos específicos de la Estrategia
Española para la Conservación y Uso Sostenible de los Recursos Genéticos
Forestales (MIMAM, 2006) es apoyar los trabajos de mejora genética y
conservación de recursos forestales. En el marco de todas estas políticas
y medidas nacionales de conservación, que a su vez derivan de medidas
europeas previas, se encuadra la trasposición de la Directiva 1999/105/CE
a través del Real Decreto 289/2003 de 7 de marzo sobre Comercialización
de Materiales Forestales de Reproducción (MFR) que se aplica a aquellos
materiales que vayan a ser empleados en plantaciones con fines forestales,
bien sea con carácter productor, protector o conservador de biodiversidad.
La aplicación del RD establece que los materiales forestales comercializados
para ser empleados en las plantaciones, correspondientes a 68 especies
forestales y 3 géneros con híbridos artificiales, deben de estar inscritos en
el Catálogo Nacional de Materiales de Base. En el anexo 1 del RD figura la
especie Castanea sativa y entre los híbridos artificiales se recogen también
los del género Castanea. El castaño es una especie susceptible del ataque de
enfermedades fúngicas como son la tinta y el chancro.
Entre el año 2000 y 2005, el Departamento de Mejora Agroforestal
(DMA) de TRAGSA en Maceda (Ourense) realizó una selección exhaustiva
de ejemplares de castaño, empleando los datos del III Inventario Forestal
Nacional, superpuestos con el Mapa Forestal, localizando en zonas de fuerte
afección de la enfermedad, parcelas donde el castaño fuese primera o segunda
especie. Se seleccionaron un total de 206 pies candidatos muestreando un total
de 18.808,84 ha contenidas en 513 teselas del Mapa Forestal con presencia
de castaño, en las zonas 1 y 2 de regresión del castaño según Bohuier (1979)
112
(Rodriguez y col, 2005). Siguiendo metodologías ya definidas (Vieitez
y col.,1986; Sánchez y col., 1997), estos 206 clones se han establecido in
vitro para iniciar su propagación (Cuenca y col, 2009) y se han comenzado
las tareas de testaje de resistencia y caracterización molecular que permita
concluir el grado de resistencia que presentan los materiales con certeza.
Durante el tiempo que duren los ensayos en campo, será necesario asegurar
la conservación del germoplasma seleccionado, muy valioso no sólo como
posibles genotipos a reproducir e incluir en el Catálogo Nacional de Materiales
de Base (CNMB) sino también como base genética amplia de un posible plan
de mejora genética del castaño.
Por otra parte, esta misma empresa realizó entre 2002 y 2007 una
selección de alcornoques plus escogidos por su calidad y producción de
corcho, en diferentes rodales selectos de cuatro Regiones de Procedencia
extremeñas. Se seleccionaron en total 105 árboles con criterios productivos
además de sanitarios y al mismo tiempo, cuidando de mantener una adecuada
representación de los diferentes rodales que asegurara una elevada diversidad
genética. Estos árboles han sido clonados mediante embriogénesis somática
siguiendo la metodología definida por Hernández y col. (2003) en el caso de
clonación de alcornoques adultos, y la metodología definida por Bueno y col.
(1992) en el caso de clonación de progenies. De este modo, en la actualidad
disponemos de líneas embriogénicas correspondientes a 33 genotipos adultos,
y se pretende clonar el máximo de árboles plus seleccionados. Se dispone
además, de varios cientos de líneas embriogénicas correspondientes a las
progenies de 73 de estos árboles, que fueron inducidas a partir de materiales
embrionarios. Se han establecido ya tres parcelas con este tipo de materiales,
con el objetivo de validar la superioridad productiva de los genotipos
adultos, así como la heredabilidad del carácter a través de las progenies. El
objetivo último, es de nuevo, proponer al Catálogo Nacional de Materiales
de Base (CNMB) los clones seleccionados de alcornoque o bien huertos
semilleros establecidos con estos genotipos, como materiales cualificados. La
crioconservación sería la herramienta que asegurara la conformidad genética
de los materiales durante el período de ensayo, así como la conservación a
largo plazo de los materiales seleccionados para futuras actuaciones de mejora
en esta especie.
En el presente estudio se pretende investigar la posibilidad de crioconservar
el material de castaño y alcornoque previamente seleccionado en el DMA de
TRAGSA y definir las condiciones de desarrollo de un banco de germoplasma
113
a nivel aplicado. Puesto que en castaño el material es mantenido in vitro y usado
para micropropagación a través del desarrollo de yemas axilares, se utilizará
el proceso de crioconservación de ápices caulinares (Vidal y col., 2005)
mientras que, en el caso del alcornoque, la colección del material vegetal
se encuentra en forma de líneas embriogénicas mantenidas mediante
embriogénesis repetitiva o secundaria, por lo que se utilizará el sistema de
crioconservación de embriones somáticos (Martínez y col., 2003; Valladares
y col., 2004). En ambas especies se partirá de protocolos pre-establecidos y se
adaptarán, según necesidades, a cada uno de los clones y especies en estudio.
Este es el primer intento de desarrollar bancos de germoplasma estables para
el mantenimiento, a largo plazo, de estas dos especies.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de cultivo
Se han utilizado cultivos de brotes de castaño (Castanea sativa Mill)
de 23 clones seleccionados de origen adulto (Tabla 1) y establecidos in
vitro en el DMA (Maceda, Ourense). El material vegetal fue seleccionado
en campo por sus características de aparente resistencia a la enfermedad de
la tinta y en el momento presente están llevándose a cabo los ensayos de
resistencia frente a Phytophthora cinnamomi y P. cambivora, causantes de
la enfermedad de la tinta.
Por otra parte, se han utilizado 17 líneas embriogénicas de alcornoque
(Quercus suber L) establecidas a partir de árboles seleccionados por su forma,
tamaño, condición fitosanitaria y calidad del corcho localizados en 15 rodales
selectos de 4 regiones de procedencia de Extremadura (Tabla 5).
Los cultivos de castaño se mantienen rutinariamente mediante
proliferación de brotes axilares en medio basal GD (Gresshoff y Doy, 1972)
suplementado con 0.4 µM de N6-benzyladenina (BA), 0.09 M de sacarosa
y 0.7% (w/v) Bacto agar a pH 5.6 y los subcultivos se llevan a cabo cada 5
semanas. Por su parte, las líneas embriogénicas de alcornoque, mantenidas
mediante embriogénesis secundaria, se subcultivan mensualmente en medio
basal consistente en los macronutrientes de Schenk y Hildebrant (1972)
(medio SH), micronutrientes, vitaminas y Fe-EDTA de Murashige y Skoog
(1962), 0.09 M de sacarosa, 0.6% agar y sin reguladores de crecimiento. Los
cultivos de las dos especies se incuban en cámaras de crecimiento bajo un
114
fotoperíodo de 16 h suministrado por lámparas fluorescentes de luz blanca y
fría (50-60 µmol m-2 s-1) con un régimen de 25ºC en el período de luz y 20ºC
en el de oscuridad.
Crioconservación de ápices caulinares de castaño
Se ha seguido el método descrito por Vidal y col. (2005) y Jorquera y
col. (2005) modificado y adaptado al material vegetal disponible. A partir de
cultivos de 3 a 5 semanas (Fig. 2A), se aislaron brotes de 10 mm de longitud que
incluyen las yemas apical y axilares y se transfirieron a placas Petri con medio
GD suplementado con 0.2 µM BA, almacenándose en frío a 3-4ºC durante
2 - 3 semanas bajo una luz tenue. Después de esta etapa de endurecimiento,
se aislaron de la yema apical (bajo microscopio estereoscópico y en la cabina
de flujo estéril, Fig. 2B) ápices caulinares de 0,5-1 mm de tamaño que
comprenden el meristemo apical y entre 3 y 6 primordios foliares (Fig. 2C).
Estos ápices se precultivaron en medio basal con 0.2 M de sacarosa durante
48 horas a 4ºC. Posteriormente, los ápices se dispusieron en crioviales y se
sumergieron durante 20 minutos y a temperatura ambiente en una mezcla
crioprotectora (“loading solution”, Matsumoto y col., 1994) compuesta por
2 M glicerol + 0.4 M sacarosa y a continuación se deshidrataron en una
solución de vitrificación PVS2 modificada (Sakai y col., 1990) consistente en
30% glicerol, 15% etilenglicol y 15% de dimetilsulfóxido (DMSO) en medio
de cultivo GD con 0.4 M de sacarosa. El tiempo de exposición a la solución
de PSV2 fue de 120 minutos a 0ºC. Finalmente los ápices se suspendieron en
crioviales conteniendo 0.6 ml de PVS2 y se sumergieron en NL (Fig. 2D).
En algunos ensayos, se ha estudiado la adición del compuesto Supercool
(polyvinyl alcohol/vinyl acetate copolímero) al 0.1% a la disolución
crioprotectora sobre la supervivencia y recuperación de brotes.
Para determinar la viabilidad del material crioconservado, parte de los
crioviales que contienen los ápices se retiraron del tanque de NL al menos
24-48 h más tarde de iniciado el proceso, se calentaron en un baño de agua a
40ºC durante 2 minutos, y se eliminó la solución PVS2 que se reemplazó por
medio basal GD líquido suplementado con 1.2 M sacarosa durante 20 minutos.
El medio de recuperación consistió en el medio basal GD suplementado
con 2.2 µM BA, 2.9 µM ácido indolacético (AIA) y 0.9 µM zeatina. Los
explantos se colocaron inicialmente sobre papel de filtro dispuesto sobre el
medio de recuperación con agar reducido (0.6%) durante 24 h y luego fueron
transferidos a medio de recuperación fresco con agar normal (0.7%). Las
transferencias se repitieron a las 2 y 4 semanas. Después de 8 semanas de
115
cultivo, se determinó la supervivencia de los cultivos como el porcentaje de
explantos que han sobrevivido al efecto del NL (% supervivencia). Estos
explantos fueron transferidos a tubos que contienen medio GD y 0.4 µM
BA y a las 12 semanas se calculó el porcentaje de explantos que muestran
desarrollo de brotes (% recuperación), es decir, entre los explantos vivos,
aquéllos que forman nuevos brotes mayores de 1 mm. Se utilizaron tres
repeticiones por tratamiento y clon, con 12 ápices por repetición y cada
experimento se repitió 2 veces.
Crioconservación de líneas embriogénicas de alcornoque
Se ha seguido el método descrito por Valladares y col. (2004) con
modificaciones. Las muestras consistieron en grupos de embriones somáticos
(2-4 mg) en estado globular-torpedo aislados de los cultivos embriogénicos 3
semanas después del último subcultivo (Fig. 3A). Estos grupos de embriones
(Fig. 3B) se precultivaron durante 3 días en medio SH basal que contiene
0.3 M sacarosa, se transfirieron posteriormente a crioviales y se sumergieron
en la misma solución de vitrificación PVS2 utilizada en el caso del castaño
preparada en medio GD con 0.4 M sacarosa. Después de 60 minutos a
temperatura ambiente, los grupos de embriones se resuspendieron en 0.6 ml
de PVS2 y los crioviales se sumergieron directamente en NL (Fig. 3C). Para
determinar la eficacia del procedimiento, parte de los embriones se retiraron de
los tanques de NL, 24-48 horas después de la inmersión, se sumergieron en un
baño de agua a 40ºC y se eliminó la solución PVS2. Se lavaron con medio que
contiene sacarosa 1.2 M y se transfirieron a placas con medio SH solidificado
con la concentración de agar reducido (0,5%) sobre papel de filtro, siendo
transferidos a las 24 horas a jarras de cultivo con medio SH solidificado con
agar en la concentración normal (0,6%). La capacidad de recuperación de los
cultivos (% recuperación) se determinó como el porcentaje de explantos que
mostraron recuperación de la capacidad embriogénica 8 semanas después de
aislarlos del NL.
Con el objetivo de simplificar la metodología de crioconservación y
adaptarla a las posibilidades prácticas de la empresa, se realizó una serie de
experimentos para determinar la necesidad o no del uso de placas con papel
de filtro durante las 24 primeras horas tras la descongelación. Asimismo se
determinó la influencia de la duración del periodo de precultivo en sacarosa
0,3 M sobre los porcentajes de recuperación de la capacidad embriogénica.
En la Figura 1, se presenta, de forma esquematizada, la metodología
seguida para la crioconservación del castaño y del alcornoque.
116
Figura 1. Esquema de las etapas necesarias para la crioconservación de ápices caulinares
de castaño (izquierda, 9 etapas) y embriones somáticos de alcornoque (derecha, 6 etapas).
RESULTADOS
El método de crioconservación basado en el proceso de vitrificación es
muy similar en el caso de los ápices caulinares de castaño y en el de los
embriones somáticos de alcornoque (Fig. 1). Debido a la propia naturaleza
del tejido utilizado (Fig. 2A, B, C), el procedimiento de la conservación de
los ápices de castaño requiere de 3 etapas más que en el caso del alcornoque
(Fig. 3A), como son el endurecimiento en frío de los cultivos, la utilización
de una disolución protectora y la transferencia de los cultivos a las 24 h, 2 y 4
semanas después de retirarlos del NL.
Crioconservación de ápices caulinares de castaño
En los 23 genotipos de castaño crioconservados, los ápices que fueron
retirados del contenedor de nitrógeno líquido para evaluar su capacidad
de recuperación presentaban inicialmente un color verde, pero a las pocas
horas de su transferencia al medio de recuperación todos los explantos
adquirieron un aspecto necrosado. Una vez transcurridas dos semanas
117
desde la transferencia, comenzaron a aparecer zonas verdes que indicaban
la reactivación del crecimiento en los explantos aparentemente necrosados.
En algunos casos este nuevo crecimiento dio lugar a la formación de nuevos
brotes (Fig. 2F) que pudieron observarse bajo microscopio estereoscópico a
partir de las 4 semanas desde la transferencia, mientras que en otros casos
sólo se obtuvo tejido desorganizado (callo) o a lo sumo la expansión de alguna
hoja que terminó encalleciéndose (Fig. 2E). El hecho de que no todos los
explantos que sobreviven formen brotes viables explica que los porcentajes de
Figura 2. Proceso de crioconservación de ápices caulinares de castaño. A, cultivo
de brotes en proliferación; B, yema terminal; C, ápice caulinar utilizado como explanto
en crioconservación; D, tanque de NL; E, cultivo en el que sólo se ha formado callo
después de la recuperación del NL; F, formación de nuevos brotes en cultivos recuperados
del NL; G, proliferación de brotes derivados de un ápice crioconservado; H, plantas
completas regeneradas.
supervivencia sean sustancialmente mayores a los de recuperación de brotes.
Los brotes formados pueden multiplicarse (Fig. 2G) y enraizarse (Fig. 2H),
regenerando, de estas forma, plantas completas.
118
En la Tabla 1, se muestran los resultados obtenidos después de la
crioconservación de 23 clones de castaño. Al cabo de 8 semanas se constata la
supervivencia del 100% de los clones estudiados pero en 7 clones no se logró
la recuperación de los cultivos. Esto significa, como se apuntó anteriormente,
que en todos los clones de castaño crioconservados en NL hay explantos que
sobrevivieron pero en los citados 7 clones sólo se obtuvo formación de callo y
no de desarrollo de brotes. El porcentaje de supervivencia no está relacionado
con la capacidad de recuperación de los cultivos ya que hay clones con valores
del 89% (clon CO31) y del 96% (clon PO39) que finalmente no consiguen
recuperarse. El porcentaje de recuperación de brotes está relacionado,
claramente, con el genotipo y varía desde valores tan bajos como el 2-4% (en
los clones CO30 y PO20, respectivamente) hasta valores del 53% en el clon
P034.
En otra serie de experimentos se trató de estudiar el posible efecto
beneficioso de la adición del compuesto Supercool sobre la supervivencia y
recuperación de los cultivos. Se comprobó (Tabla 2) el efecto positivo de la
Tabla 1. Efecto de la inmersión en nitrógeno líquido (NL) sobre la supervivencia y recuperación
de la capacidad de multiplicación de ápices caulinares de 23 clones de castaño. Datos tomados a las
8 (supervivencia) y 12 semanas (recuperación) después del tratamiento con NL.
119
adición de este compuesto a la supervivencia de los clones estudiados con
porcentajes que, en la mayoría de clones, alcanza el 100%. La excepción es
el clon C030 en el que se observa un ligero aumento de la supervivencia con
respecto a la acción de la solución crioprotectora PVS2 sin Supercool. En los
clones que muestran recuperación de brotes con la solución PSV2, la adición
de Supercool duplica el porcentaje de recuperación, incluso en el clon P029,
la recuperación es 3 veces mayor que sólo con PVS2. Sin embargo, no se
obtuvo efecto positivo alguno en aquellos clones en que la recuperación es
ya nula o muy baja (clones P039, C030, C017), excepto en el clon PO20 en
donde la recuperación alcanza el 8% en presencia de Supercool.
Tabla 2: Influencia de la adición de Supercool 0,1% a la solución crioprotectora en la
supervivencia y recuperación de brotes de 8 clones de castaño.
Crioconservación de líneas embriogénicas de alcornoque
Al igual que en el caso de los ápices de castaño, en el caso de los embriones
somáticos de alcornoque una vez que fueron retirados del tanque de nitrógeno
líquido para evaluar su capacidad de recuperación, adquirieron un aspecto
necrosado a las pocas horas de su transferencia al medio de recuperación.
Transcurridos unos 10 días de la descongelación y transferencia a medio de
recuperación, comenzó a hacerse evidente la reactivación del crecimiento con
la aparición de nuevas estructuras embriogénicas que surgían de los explantos
iniciales mediante un proceso de embriogénesis secundaria (Fig. 3D, E). Los
120
Figura 3. Proceso de crioconservación de embriones somáticos de alcornoque. A, cultivo
embriogénico proliferando mediante embriogénesis repetitiva de donde se aíslan los grupos de
embriones (B) que serán sometidos a crioconservación en el tanque de NL (C). D y E, nuevos
embriones somáticos regenerados a partir de los explantos crioconservados en NL.
embriones, una vez aislados, pueden somaterse a los procesos de maduración
y germinación y regenerar plantas completas.
El protocolo inicial de crioconservación de alcornoque (Valladares y col,
2004) incluye la inoculación de los embriones somáticos en placa sobre papel
de filtro estéril y con la concentración de agar reducida durante las primeras
24 horas tras la descongelación y el lavado. Uno de los objetivos de nuestro
trabajo consistió en simplificar y flexibilizar el protocolo de crioconservación
para adaptarlo al manejo de un gran número de clones tratando de eliminar
la etapa de inoculación sobre papel de filtro. En los 3 clones de Q. suber
estudiados (Tabla 3) la eliminación de la inoculación o siembra sobre papel
de filtro de los explantos no sólo no tiene efectos contraproducentes sino
que parece favorecer ligeramente la recuperación de los cultivos (si bien las
diferencias no son estadísticamente significativas). Por este motivo en los
experimentos siguientes con los 14 clones restantes se eliminó este paso del
protocolo de crioconservación.
121
Tabla 3. Tasas de recuperación embriogénica (% + error estándar) de embriones
somáticos de 3 clones de alcornoque crioconservados y sembrados en medio de recuperación,
bien directamente sobre el agar o tras un paso previo de 24 horas sobre papel de filtro. Los
datos corresponden a medias de 3 repeticiones con 10 explantos cada una, y han sido tomados
a las 8 semanas desde la aplicación de los tratamientos.
Por otra parte, también se evaluó el efecto de la duración del precultivo
en sacarosa 0,3 M sobre la recuperación de la capacidad embriogénica de
los explantos crioconservados, que en el protocolo original estaba fijada
en 3 días. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4. En uno de
los genotipos (clon DII3A (597/04)) la tasa de recuperación embriogénica
es del 100%, independientemente de los días que hayan permanecido en el
medio de precultivo. En los otros dos genotipos no se observan diferencias
significativas en los porcentajes de recuperación, lo que indica que cualquiera
de los periodos ensayados es igualmente eficiente para lograr la recuperación
de la capacidad embriogénica de los cultivos de alcornoque.
Tabla 4. Tasas de recuperación embriogénica (% + error estándar) de embriones somáticos
de 3 clones de alcornoque precultivados durante 1, 2 o 3 días en medio basal suplementado
con sacarosa 0,3 M y crioconservados en nitrógeno líquido. Los datos corresponden a medias
de 3 repeticiones con 10 explantos cada una, y han sido tomados a las 8 semanas de la
descongelación e inoculación en el medio de recuperación.
122
Una vez adaptado el protocolo original de crioconservación de embriones
somáticos de alcornoque, se procedió al inicio del desarrollo del banco de
germoplasma con las entrada de 17 clones. A diferencia de lo observado en
el caso del castaño, en todos los explantos que mostraron reactivación del
crecimiento se obtuvieron nuevos embriones somáticos (de 6 a 10 nuevos
embriones por explanto original reactivo, por término medio) que permitieron
la recuperación del cultivo. En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos
en los ensayos de crioconservación de las líneas embriogénicas de alcornoque.
El porcentaje de recuperación claramente depende del clon, pero todos los
clones ensayados sobreviven al efecto del NL. El clon Rozo 1A(66/02) es
el que presenta una reactividad más baja (25%) mientras que los clones
DII3A (597/04), DII3A/02 y Chap A(752/04) alcanzan el 100% de explantos
reactivos.
Teniendo en cuenta tanto el número de explantos que todavía están
crioconservados como los porcentajes de recuperación calculados, puede
decirse que la supervivencia de los clones ensayados está garantizada mientras
se efectúa la evaluación en campo de los mismos.
Tabla 5. Efecto de la inmersión en nitrógeno líquido (NL) sobre la reactividad de los
embriones somáticos de 17 líneas embriogénicas de alcornoque. Datos tomados 8 semanas
después del tratamiento con NL.
123
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos demuestran claramente que es posible el
desarrollo de bancos de germoplasma aplicados mediante el uso de ápices
caulinares de castaño o embriones somáticos de alcornoque almacenados por
tiempo indefinido en nitrógeno líquido. El banco, localizado en el DMA de
TRAGSA en Maceda (Ourense), dispone en la actualidad de 16 genotipos
de castaño y 17 de alcornoque perfectamente viables una vez recuperados
del NL. El banco continuará completándose con nuevas entradas a medida
que se conozcan los resultados de los ensayos que se llevan a cabo en la
actualidad, permitiendo, de esta forma, la evaluación en campo de los
genotipos crioconservados durante el período de tiempo que fuese necesario.
Cuando se analizan los resultados obtenidos en el proceso de
crioconservación de castaño y alcornoque, el tipo de explanto utilizado en
cada especie puede ser el hecho diferencial. El ápice caulinar de castaño
utilizado en los ensayos contiene el meristemo apical y entre 3 y 6 primordios
foliares que pueden contener células ya vacuoladas y muy diferenciadas y,
por tanto, con más dificultades para superar el proceso de vitrificación. La
formación de hielo intracelular durante el proceso de crioconservación lleva a
la ruptura celular y consecuentemente a la muerte de los tejidos. En un estudio
previo, Vidal y col. (2005) estudiaron el efecto del tamaño del ápice caulinar
en la recuperación de los cultivos de castaño después del tratamiento con
NL y encontraron que 0.5-1 mm era el tamaño más adecuado para permitir
la recuperación de los cultivos. En términos generales se acepta que cuanto
menor es el tamaño del ápice mayor y más homogéneo es el número de células
de tipo meristemático pequeñas y poco vacuoladas, requisito importante en
criogénesis, mayor es el éxito de la crioconservación. El tamaño del ápice ha
tenido también una gran importancia en diferentes especies (Tagaki y col.,
1997; Escobar y col., 1997; Niino y col., 1997). Además del tamaño como
factor limitante, al aislar el ápice de la yema terminal del explanto se produce
un daño físico debido al corte de los tejidos, daño que puede extenderse a todo
el explanto y condicionar el proceso de crioconservación.
El estado fisiológico de la planta madre de la que se aísla el ápice en
el momento de su aislamiento (Reed, 2000), el propio genotipo o la adición
de distintos agentes crioprotectores pueden también afectar el éxito de
la crioconservación del castaño. En el primer caso, aquéllos clones de
castaño que no superaron el proceso de crioconservación (Tabla 1), podrían
124
someterse a condiciones de crecimiento diferentes (contenido de reguladores
de crecimiento en el medio de cultivo, tratamientos de luz/oscuridad, etc.)
que pudiesen dar lugar al aislamiento de ápices caulinares más proclives a la
crioconservación. No es descartable que, a pesar de las mejoras potenciales
que puedan introducirse, el propio genotipo sea el causante de la falta de
recuperación en parte de los clones estudiados ya que no todos los genotipos
responden igual a los mismos tratamientos (Vidal y col., 2005). Por otra
parte, un hecho a resaltar de los resultados obtenidos en nuestro trabajo es el
efecto positivo del polímero Supercool cuando se adiciona a la solución de
vitrificación PVS2. La utilización de este crioprotector tuvo su reflejo en el
aumento de la supervivencia y de la recuperación de los cultivos. El Supercool
inhibe la formación de hielo en soluciones acuosas o crioprotectoras (Wowk y
col., 2000) y ha mejorado la crioconservación de ápices caulinares de patata
(Zhao y col., 2005). Además del Supercool, existen otros tipos de compuestos
crioprotectores, entre los que se encuentran proteínas anticoagulantes que
fueron utilizadas con éxito (Xia y col., 2000), aunque su elevado precio limita
su aplicación a gran escala.
La capacidad de recuperación de los embriones somáticos de alcornoque
tras la crioconservación es mayor que la de los ápices caulinares de castaño.
En su conjunto, el embrión somático está formado por células de naturaleza
embriogénica, de pequeño tamaño, poco vacuoladas y en división, lo que
representa una mayor capacidad para el almacenamiento en NL que las
estructuras más complejas como son los ápices caulinares. El estado de
desarrollo de los embriones tiene una influencia notable en la posterior
recuperación (Valladares et al. 2004). Por eso, hemos utilizado embriones en
los estados globular y torpedo que responden mejor al almacenamiento en
NL que los embriones más diferenciados como son los que están en estado
cotiledonar. Además, los embriones somáticos se separan unos de otros con
una gran facilidad, no se produce un daño físico por escisión del tejido a
crioconservar, ya que pueden individualizarse facilmente. Por otra parte,
con que una célula de carácter embriogénico quede viva, puede regenerar un
embrión, mientras que con los ápices caulinares es necesario que sobreviva el
conjunto de la estructura organizada que constituye el meristemo, ya que, si
sólo sobreviven unas pocas células, lo que se origina es un callo.
Cuando embriones somáticos de castaño se someten a crioconservación
(Corredoira y col., 2004) se obtienen también mejores tasas de supervivencia
125
y recuperación que con los ápices caulinares. Utilizando esta metodología ha
sido posible también la crioconservación de líneas transgénicas de castaño
transformadas con genes marcadores (Corredoira y col., 2007). Teniendo en
cuenta estos resultados, parecería lógico que los bancos criogénicos de castaño
se conformasen mediante cultivos embriogénicos (que también permiten la
propagación clonal) en vez de ápices caulinares. Sin embargo, a día de hoy,
es más factible el establecimiento in vitro de cultivos de castaño obtenidos
mediante el desarrollo de yemas axilares (de cuyos brotes se aíslan los ápices
caulinares) que la inducción de embriogénesis somática a partir de explantos
de individuos adultos.
En nuestro estudio se ha simplificado el protocolo inicialmente propuesto
para la crioconservación de Q. suber (Valladares y col., 2004). Se ha determinado
que no es necesario inocular los explantos crioconservados sobre papel de
filtro durante las primeras 24 horas tras la descongelación y lavado. Este
paso había sido concebido inicialmente para eliminar los exudados que se
producen en las primeras horas tras la siembra, pero los resultados obtenidos
sugieren que o bien los exudados carecen de efecto tóxico o que la ausencia
de manipulación de los explantos durante este periodo es beneficioso. Otra
simplificación del protocolo está relacionada con el tiempo de permanencia
de los embriones en el medio de precultivo con elevadas concentraciones
de sacarosa. No se encontraron diferencias significativas entre 1 y 3 días de
precultivo, lo que es una ventaja a la hora de programar y llevar a cabo todo
el proceso de crioconservación.
Con el aumento de la tecnología de la crioconservación se ha hecho
evidente la necesidad de garantizar la fidelidad del germoplasma almacenado
en NL. La información disponible hasta el momento sobre los estudios
moleculares en especies leñosas recuperadas del NL confirman la estabilidad
genética de los cultivos, corroborando, de esta forma, la fiabilidad de las
técnicas criogénicas en la conservación de especies leñosas (Lambardi y
col., 2002). Recientemente, este aspecto se ha confirmado en ensayos de
crioconservación de embriones somáticos de roble (Sánchez y col., 2008).
La mayoría de la investigación reciente sobre la crioconservación de
cultivos embriogénicos en especies forestales está relacionado con las
coníferas, en cuya explotación comercial esta técnica es rutinariamente
aplicada a las líneas embriogénicas que están siendo evaluadas en campo (Cyr,
2000). En especies caducifolias, la aplicación práctica de esta tecnología está
126
menos avanzada; sin embargo, los resultados obtenidos en el presente trabajo
demuestran que la crioconservación a largo plazo de genotipos seleccionados
de castaño y alcornoque es posible y, por tanto, el desarrollo aplicado de
bancos de germoplasma para la conservación de forma indefinida de estas dos
especies es factible.
AGRADECIMIENTOS
El trabajo ha sido parcialmente financiado a través de los proyectos
RECATI, código PGDIT07MRU003E (Plan INCITE, Xunta de Galicia)
y SEFEAL, código CIT-010000-2007-5 (proyecto del Plan Nacional de
Investigación Científica, Desarrollo e Inovación Tecnológica (I+D+i 20042007) en la parte dedicada al fomento de la investigación técnica del Ministerio
de Educación y Ciencia).
Se agradece al equipo del Dr. Mariano Toribio el haber suministrado
las líneas embriogénicas de alcornoques adultos inducidas en el Instituto
Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario y al
equipo de la Dra. Mª Ángeles Bueno el suministro de las líneas embriogénicas
de progenies utilizadas en este trabajo e inducidas en el Instituto Nacional de
Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (en ambos casos, a través
del proyecto SEFEAL).
127
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ESTUDO ANTROPOLÓXICO DOS RESTOS ÓSEOS
RECUPERADOS DA NECRÓPOLE DA COVA DO SANTO,
PARDOLLÁN, RUBIÁ, OURENSE. UNHA NECRÓPOLE DA
IDADE DO BRONCE EN GALICIA.
OLALLA LÓPEZ-COSTAS1
1
Área de Antropoloxía Física, Dpto. de Zooloxía e Antropoloxía Física, Facultade de
Bioloxía, Universidade de Santiago de Compostela. Avda. Lope Gómez de Marzoa s/n
Campus Sur. 15782 Santiago de Compostela, A Coruña.
Correspondencia: e-mail [email protected]
RESUMO
No presente estudo analizamos os primeiros restos óseos humanos
recollidos na Cova do Santo en Ourense, datada na idade do Bronce. Este
xacemento é único en Galicia, pola súa cronoloxía e a boa conservación do
material óseo atopado no interior. As pezas estudadas non se atopáton en
contexto anatómico e pertencen a individuos adultos novos ou subadultos,
homes e mulleres, destacando unha importante representación de ósos infantís.
Identificáronse restos de un mínimo de 9 esqueletos. Estes individuos de
morfoloxía mediterránea en sentido amplo presentan unha talla supramedia
a outras series peninsulares coetáneas. A porcentaxe de traumatismos e
entesoexóstoses é destacada influída probablemente polo médio montañoso
que rodea ao xacemento. As patoloxías dexenerativas e infecciosas non están
presentes ou mostran un grao leve. Trátase dunha poboación nova cunha
actividade física dura.
Palabras clave: Antropoloxía Física, Galicia, idade do Bronce, necrópole.
132
ABSTRAC
An anthropological study was undertaken on the first human remains
recovered from the necropolis of Cova do Santo, Ourense. The site is located
inside a cave and date to the Bronze Age. The bones studied were found
disarticulated and represent subadults and young adults, males and females in
the sample. A minimal number of 9 individuals were identified. They were of
middle to tall height and the typology is Mediterraneous in senso lapto. The
prevalence of trauma and musculoskeletal stress markers is noticeably high,
perhaps influenced by the mountainous region. There were no degenerative
joint lesions or if present, levels were low. It seems a young population with a
hard physical activity.
Key words: Bronze age, Galicia, necropolis, physical anthropology.
INTRODUCIÓN
Unha necrópole de época prehistórica é sempre un achado importante,
máis aínda sé se trata de Galicia, onde as alteracións tafonómicas son moi
graves chegando a descompoñer case a totalidade da materia orgánica. A
Cova do Santo situase no lugar denominado Pardollán, na parroquia de San
Estevo do mesmo nome, próximo ao linde da provincia de Ourense coa de
León. É unha zona de xeoloxía calcárea, moi diferente da común en Galicia.
Esta área caracterízase por posuír terreos básicos onde é usual a presenza de
covas e abrigos; ambos feitos permiten unha boa preservación do material
arqueolóxico. Debido a que as covas son un refuxio natural para a fauna e
un hábitat ocupacional humano é relativamente normal atopar nelas restos
de outras épocas. Pero o caso da Cova do Santo ten un especial interese xa
que no seu interior acháronse un numero elevado de ósos, tanto humanos
como animais, que semellan ser depositados nun mesmo período cronolóxico
(López Costas, 2008).
A entrada á gruta encóntrase nun lugar elevado dende o que se divisa
a o val do Sil. O seu interior divídese en tres cámaras; unha de primeiro
acceso ou “A”, e outras dúas que parten desta última; a chamada“B”(Figura
1) situada cara o suroeste e a “C”, ao sur, cuio acceso atópase impracticable.
Segundo parece, a actual entrada dende o exterior sería secundaria a un
derrubamento que colapsasou a entrada orixinal situada a máis dun metro
133
en vertical baixo a agora presente (información proporcionada polos
arqueólogos). Nas tres cámaras da Cova do Santo atopáronse numerosos ósos
humanos e animais en superficie, mesturados coas pedras e coa terra do chan.
Non hai certeza de que os achados continúen en profundidade pero é moi
probable que así sexa. Así mesmo, existen numerosos ósos introducidos nas
fendas das paredes laterais (Figura 2). Polo tanto, o escenario semella un
Figura 1. Vista xeral da cámara B.
Figura 2. Restos óseos humanos e animais no interior dunha fenda, nunha das paredes
laterais da cámara B.
caos aleatorio de osos, pedras e terra, sendo a cámara “A” a que máis reflicte
esta situación.
134
MATERIAL E MÉTODOS
Nesta primeira fase de estudo recolléronse os ósos das cámaras A
e B que pola súa situación, nas vías naturais de paso ou en zonas con alta
probabilidade de desprendemento, puideran resultar danados nas futuras
intervencións. Ningunha mostra foi tomada da cámara C pola dificultade
do acceso. Todos os materiais, un total de 61 pezas óseas, foron colectados
en Febreiro do ano 2008. Tres pezas foron empregadas para a datación
radiocarbónica, situándoas, e polo tanto tamén ao resto do xacemento, na
Idade do Bronce.
Os restos estudados presentan un estado de conservación moi bo, aínda
que algúns teñen roturas recentes. Neste estudo exporánse os resultados
obtidos nunha mostra do material depositado na cova. Preténdese analizar
aspectos como os grupos de idade que estan representados, se hai individuos
de ambos sexos, ou achegarnos aos estados de saude e enfermidade dos
mesmos. Para elo identificouse cada peza diferenciando os ósos de procedencia
humana, e procedeuse á determinación do sexo, idade e a un coidadoso estudo
antropométrico e paleopatolóxico. A metodoloxía específica de observación
consignarase a cada un dos apartados.
RESULTADOS
A distribución dos ósos dentro da cova non parece seguir ningún patrón.
Non se atopou correspondencias sobre a presenza dos restos nunha ou noutra
cámara. Ningún dos ósos está en contexto anatómico, polo que estes puideron
ser trasladados á cova unha vez esqueletizados ou enterrados nela e movidos
despois coetáneamente ou no transcurso dos séculos.
Distribución por Idades
A paleodemografía proporciónanos unha aproximación ao perfil da
poboación. Para a clasificación por idades identificáronse as pezas pertencentes
a adultos e subadultos, precisándose posteriormente os intervalos de anos
(infantís I: 0 a 6 anos, infantís II: 7 a 12, xuvenís: 13 a 19, adultos propiamente
ditos: 21 a 40, maduros: 41 a 60, e senís: maiores de 61 anos).
Na determinación nos individuos adultos usouse o método de evaluación
do grado de cerre das suturas craniais e a sincondrose esfeno-basilar Broca,
135
ref. Olivier e Demoulin (1976), Masset (1982), Meindl e Lovejoy (1985), o cerre
da liña epifisaria, Brothwell (1987), o inicio do desgaste dental de Brothwell
(1987), a superficie auricular do ilion, Lovejoy e col. (1985). A pesar de que
se coñecen outros métodos estes non se empregaron debido a ausencia do
material sobre o que están desenvolvidos.
Pertencentes a adultos e atopados na cámara A estudáronse, un cranio,
unha mandíbula, catro vértebras e cinco costelas, unha escápula, tres coxais,
un úmero e unha tibia, tres radios e tres fémures, cinco peronés e un óso
animal probablemente ovicáprido. Da cámara B recuperáronse fragmentos
de outro cranio, unha escápula, catro vértebras e unha costela, un coxal, un
cúbito e un peroné, dúas tibias, seis fémures, un astrágalo e dous ósos de
ovicáprido.
Puidose determinar a idade en catro dos coxais, dous pertencen a adultos
novos entre 20 e 30 anos, e outros dous a individuos de entre 35 e 40 anos.
Ningún coxal atópase nas fases dexenerativas típicas da madurez.
O cálculo da idade da morte nos individuos subadultos realizouse
mediante o grado de peche das metáfises, Pyle e Hoerr (1955), McKern e
Stewart (1957), Brothwell (1987), a lonxitude dos osos longos sen as súas
epífises Stloukal e Hanakova (1978) e a erupción dentaria, Ubelaker (1989).
Nos individuos perinatais emprégaronse as táboas de Moorrees e col. (1963) e
os criterios de Fazekas e Kósa (1978) para casos forenses.
Na cámara A atopáronse dúas mandíbulas pertencentes a individuos de
entre 4 e 6 anos; un ilio, un fémur e unha tibia, todos eles dereitos, pertencentes
a infantes dende 5 a 8 anos; e unha clavícula, unha vértebra dorsal, un cúbito e
dúas tibias xuvenís. E na cámara B achouse un fragmento de parietal dereito
infantil. Polo tanto, hai presenza de, polo menos, dous individuos infantís, un
entre 4 e 6 anos e outro entre 6 e 8 anos, e un individuo xuvenil de entre 17 e
20 anos.
Distribución por sexos
A determinación sexual fíxose nos individuos adultos e xuvenís coa fin de
detectar a presenza de ambos sexos na cova. A distinción sexual realizase en
base á morfoloxía pélvica, Stewart (1968), Phenice (1969), Krogman e Iscan
(1986), á morfoloxía craneal e mandibular, Ferembach e col. (1974, 1978), Keen
136
(1950), e as dimensións do esqueleto postcraneal Alemán e col. (1997). Tendo
en conta as características propias da poboación galega, López e col. (2007).
Os catro coxais foron clasificados coma masculinos, e dous fémures
dereitos e un esquerdo coma femininos. Concluíuse que, ó menos, catro
individuos son homes e dúas mulleres.
N.M.I.
Cos restos desarticulados calculouse o número mínimo de individuos ou
N.M.I., tendo en conta o número de pezas óseas repetidas, o maior número
de articulacións individualizadas, as unidades patolóxicas, e algúns criterios
tafonómicos. O cálculo do número mínimo de individuos da mostra recollida
fíxose sen ter en conta en que cámara se atoparon.
Entre o material recollido hai un mínimo de cinco adultos e tres nenos.
Nos adultos, atopáronse catro coxais esquerdos masculinos e cinco fémures
esquerdos, dos cales dous foron clasificados coma femininos. Polo tanto
o número de individuos adultos elévase a seis se temos en conta o sexo.
Sumándolle os subadultos e tendo en conta a determinación sexual o N.M.I. é
de nove, aínda que pola morfoloxía e características probablemente o número
de adultos sexa maior e con seguridade o de subadultos.
Táboa 1. Estaturas calculadas segundo os diferentes autores. Os fémures identificados
como Rex4-a e Rex4-b poderían pertencer a un mesmo individuo.
137
Estatura
A estatura é un marcador que proporciona información sobre a herencia e
orixe dos individuos, xa que ten un alto compoñente xenético, pero tamén sobre
outros factores como a nutrición e o estado de saúde da poboación. A talla
estimouse coas fórmulas de Pearson (1899), Trotter e Glesser (1958), Olivier e
Demoulin (1976) e Mendonça (2000) (Táboa 1). As estaturas calculadas coas
pezas estudadas están na media das outras necrópoles peninsulares próximas
no tempo (Táboa 2), aínda que lixeiramente superiores. Este feito podería ter
a súa explicación no compoñente xenético, xa que a maioría das necrópolis
estudadas en Galicia presentan valores de estatura altos, López e col. (2007).
Táboa 2. Comparación dos valores máximo e mínimo da poboación estudada cos
promedios de outras peninsulares; estaturas calculadas mediante o método de Pearson.
Patoloxía
O estudo dos estados de saúde e enfermidade danos información sobre
os modos de vida das poboacións antigas e a súa adaptación ao entorno. A
avaliación patolóxica fíxose de maneira visual e macroscópica, seguindo os
criterios de Aufderheide e Rodríguez-Martín (1998), Campillo (2001), Ortner
(2003).
So se puido avaliar a patoloxía maxilodentaria en tres casos, dous deles
pertencen a individuos infantís. A saude oral destas pezas é boa, sen marcas
de hipoplasia de esmalte ou periodontite. Na mandíbula adulta destacamos un
desgaste moderado sen presenza de caries e coa pérdida dun molar.
As patoloxías dexenerativas fálannos das condicións de vida dos
individuos e axudannos na determinación da idade. Dúas das 6 vértebras
138
dorsais e as dúas lumbares estudadas presentan modificación diagnosticadas
como osteoartrose, aínda que en grao moi leve. Tamén atopánse afectadas
o estremo vertebral de 1 das 6 costelas presentes e a articulación distal de
dous fémures, ambas en grao leve. Estes resultados coinciden coa idea de
poboación nova obtida na determinación da idade.
Tres pezas teñen alteracións traumáticas, os traumatismos están moi
influidos polo habitat, nun medio con numerosas colinas e barrancos
coma este cabe agardar un procentaxe de fracturas alto. A mais grave e
unha fractura consolidada nun ilio esquerdo, Rex8k (Figura 3) a nivel
da liña semicircular posterior. É probable que o trauma comprometera a
articulación sacro ilíaca e repercutira no movemento do glúteo maior, este
individiuo desenrolou unha artrose secundaria na rexión sacroilíaca. Así
Figura 3. Fractura consolidada nun coxal esquerdo.
Figura 4. Periostite inactiva en diáfise de tibia dereita.
139
mesmo, achouse unha hernia discal na carilla distal dunha vértebra dorsal
(Rex1b), con 9mm. de lonxitude. Por último, a presenza dunha fractura
consolidada no terzo proximal da diáfise dun peroné (Rex8t), producíndose
unha leve torsión froito da consolidación e un principio de artrose na
articulación coa tibia, de orixe secundario á fractura. As entesoexóstosis,
como as fracturas, falannos dos patróns de actividade física das persoas.
A existencia de entesofitos nos osos longos das extremidades inferiores é
frecuente, non así nas superiores ou outros ósos.
A presenza de enfermidades infecciosas é sempre dificil de interpretar,
éstas indícannos que o individuo está afectado pero tamén a supervivencia
do mesmo un tempo prolongado. Atopamos marcas de periostite inactiva na
diáfise dunha tibia dereita, Rex8q (Figura 4). Ademais o maxilar dun cranio
(Rex6a) presenta unha osteolise infecciosa que se encontra baixo estudo na
actualidade.
Morfoloxía e antropometría
O exame morfolóxico e antropométrico fíxose macroscópicamente,
segundo Martin e Saller (1957), Olivier (1960), Olivier e Demoulin (1960),
Ferembach (1974), Knussmann (1988). Tamén se documentou a presenza de
carácteres morfolóxicos discretos ou epixenéticos no cranio Berry e Berry
(1967), e no esqueleto postcraneal, Finnegan e Faust (1974), Finnegan (1978).
Os individuos clasifícanse como mediterráneos en sentido amplo, segundo os
criterios de Lopez e col. (2000), Pons(1949). Destaca a presenza de numerosos
ósos wormianos nos cranios, e da chamada fosa de Allen nun fémur esquerdo
(Rex8k).
Tafonomía
Coa fin de comprender mellor como foi a deposición dos restos na cova e,
en xeral que sucedeu dende a morte dos individuos ata hoxe, estudáronse as
alteracións tafonómicas. Para o exame visual seguíronse as recomendación de
Botella e col. (1999). O estado de conservación dos restos é moi bo e só aqueles
que se atopaban na cámara A próximos ao acceso dende o exterior, tiñan
alteración por fungos e raíces. Moitos ósos están fracturados recentemente
140
por atoparse en zonas de tránsito onde foron pisados ou presionados baixo as
pedras. Algúns ósos presentan na súa superficie unha película de carbonato
cálcico. Todos estes feitos levannos a concluír que o material leva depositado
no interior da cova un periodo de tempo moi prolongado.
CONCLUSIÓNS
No enterramento da Idade do Bronce na Cova do Santo atópanse
representadas a maioría dos grupos de idade e ambos sexos, habendo unha
ampla presencia de pezas infantís e xuvenís. O número de individuos alí
depositado semella ser bastante amplo.
As pezas estudadas falannos dunha poboación nova cunha inusual
presenza de traumatismos. As fracturas aparecen consolidadas correctamente
polo que tiveron que ser tratadas ou o paciente cumplir repouso. Os marcadores
musculo-esqueléticos indican que a actividade física dos individuos podería
ser bastante dura. O número mostral non nos permite estudar diferentes
patróns de actividade entre hombes e mulleres. Os marcadores relacionados
co estrés medioambiental estan pouco presentes e as patoloxías infecciosas
crónicas observadas atópanse inactivas, aínda que as infeccións probablemente
constituíron a primeira causa de morte.
A morfoloxía das pezas analizadas é semellante as outras necrópoles
galegas estudadas; a tipoloxía clasifícase como mediterranea en sentido amplo
e os individuos teñen tallas dentro da media das poboacións peninsulares
pero son lixeiramente máis altos. Por último a preservación dos restos e moi
boa e as alteracións tafonómicas débense a fracturas recentes consecuencia
da situación das pezas nos lugares de tránsito. A tafonomía indica que o
material leva depositado no interior da cova moito tempo.
Como conclusión final dicir que somos conscientes de que é moi dificil
obter unha idea do estado de saude da poboacion con tan poucos restos e
estando estes desarticulados. Neste estudo tratamos de obter unha idea
preliminar sobre esta necrópole, única na nosa comunidade. A pesar de que
é posible que as caracteristicas que aquí se expoñen non sexan aplicables
a todolos individuos depositados na Cova do Santo, si están presentes nas
persoas ás cales as pezas óseas estudadas pertenceron.
141
AGRADECEMENTOS
O presente traballo inclúese nas actividades da bolsa FPU da autora.
Este traballo forma parte do proxecto de investigación: “Antropoloxía dos
restos óseos humanos de Galicia. Estudio paleobiodemográfico, morfolóxico,
paleopatolóxico, paleoepidemiolóxico e de etnoxénesis da poboación galega”,
financiado pola Consellería de Cultura e Deporte, Patrimonio Cultural, da
Xunta de Galicia.
Grazas á Dirección Xeral de Patrimonio Cultural e a o Servizo de
Arqueoloxía, da Xunta de Galicia polo seu apoio e financiación. Agradecer
ao arqueólogo Fidel Méndez Fernández, director da intervención, a súa
confianza e axuda. Unha especial mención ao Catedrático de Antropoloxía da
Universidade de Santiago de Compostela Prof. Tito A. Varela pola súa axuda
e apoio e aos veciños de Pardollán.
142
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ESTIMACIÓN DE LA EVAPOTRANSPIRACIÓN DIARIA
A PARTIR DE PRONÓSTICOS METEOROLÓGICOS
EN GALICIA
J.A. RODRÍGUEZ-SUÁREZ1,2*, S. FEIJÓO1, B. SOTO1
1
Departamento de Bioloxia Vexetal e Ciencias do Solo, Facultade de Ciencias,
Universidade de Vigo, 32004 Ourense, Spain
2
Departamento de Ciencias da Navegación e da Terra, Facultade de Ciencias.
Universidade da Coruña, 15008 A Coruña, Spain
*Correspondencia e-mail : [email protected]
RESUMEN
Se ha determinado la evapotranspiración de referencia (ETo) a partir de
los pronósticos meteorológicos realizados por MeteoGalicia (Conselleria de
Medio Ambiente, Xunta de Galicia) en 3 estaciones climatológicas. En cada
estación se ha estimado la ETo mediante los métodos FAO-Penman Monteith
(FAO-PM) y Hargreaves (MHar) a partir de los pronósticos realizados con 1, 2
y 3 días de antelación. Las estimaciones de ETo se han comparado con la ETo
calculada mediante el método FAO-PM a partir de los valores observados.
Las estaciones climatológicas seleccionadas están ubicadas en zonas con
diferentes características climáticas: Ribadeo, Ourense y Pontevedra.
El método de MHar proporciona las mejores estimaciones en Ourense
y Pontevedra, mientras que el método FAO-PM tiende a sobrestimar la ETo
debido a la baja correlación entre la velocidad del viento pronosticada y
observada. Sin embargo, en Ribadeo las estimaciones mediante el método
FAO-PM son mejores que las obtenidas mediante el método MHar.
Palabras clave: Evapotranspiración de referencia, FAO-Penman Monteith,
pronósticos meteorológicos.
146
ABSTRACT
Reference evapotranspiration (ETo) was determined on 3 weather stations
from weather forecasts realized by MeteoGalicia (Conselleria de Medio
Ambiente, Xunta de Galicia). In each station, ETo was calculated by means
of FAO-Penman Monteith (FAO-PM) and Hargreaves methods from weather
forecasts made 1, 2 and 3 days in advance. The predicted ETo was compared
with an Eto obtained with FAO-Penman Monteith method applied to measured
values of meteorological parameters. The weather stations selected for this
study were in Ribadeo, Ourense and Pontevedra.
In Ourense and Pontevedra, best predicted ETo values were obtained with
Hargreaves’ method, and FAO-PM overestimated ETo due to low quality of
wind velocity prediction. Nevertheless, the FAO-PM method was the most
accurate for ETo predictions in Ribadeo.
Keywords: FAO-Penman Monteith, reference evapotranspiration,
weather forecast messages
INTRODUCCIÓN
La evapotranspiración (ET) es la combinación de dos procesos separados
por los que el agua se pierde por evaporación desde la superficie del suelo y
mediante la transpiración de los vegetales. Este proceso conjunto constituye
uno de los componentes fundamentales del ciclo hidrológico. Depende
fundamentalmente de factores climáticos: radiación solar, temperatura,
humedad relativa, presión de vapor, presión atmosférica y viento; y de factores
de cultivo: tipo de cultivo, variedad o etapa de desarrollo.
La medida de la ET no es sencilla. Su determinación directa necesita de
equipos específicos de alto coste y medida compleja, con el inconveniente
de que estos procedimientos, en general, no son adecuados para mediciones
rutinarias (Jensen y col., 1990; Al-Ghobari, 2000). Una alternativa más sencilla
consiste en su estimación a partir de datos meteorológicos, desarrollándose
a lo largo de los años multitud de ecuaciones teóricas, empíricas o
semiempíricas, para su cálculo. De todas ellas la FAO ha establecido como
método de referencia internacionalmente recomendado el FAO-Penman
Monteith (FAO-PM) (Allen y col., 1998), por ser el más preciso y obtener
los mejores resultados al ser comparado con medidas experimentales en gran
147
variedad de climas y regiones del mundo (Chiew y col., 1995; García y col.,
2004; Gavilan y col., 2006; Popova y col., 2006; Jabloun y Sahli, 2008). El
método FAO-PM permite calcular una ET de referencia, ETo, definida como
“la tasa de evapotranspiración de una superficie de pasto verde que cubre
totalmente el suelo y que no presenta restricciones de agua”, la cual permite
comparar la ET entre diferentes regiones y épocas del año, además de entre
diferentes cultivos.
En el caso de Galicia, la evapotranspiración potencial presenta unos
valores medios anuales en torno a 700 mm, aunque puede variar según la
zona entre 500 y 800 mm. Esta variación se debe a que, aún considerando
el clima gallego como un clima suave de influencia oceánica muy lluvioso,
su irregular orografía propicia la existencia de múltiples microclimas con
fuertes variaciones en un área menor de 200 Km2 (Castillo Rodríguez y col.,
2006). A lo largo del año los mayores valores de ET se dan en primavera y
verano (Soto y Díaz-Fierros, 1996) coincidiendo con los meses en los que las
precipitaciones son menores y en los que la demanda de agua aumenta, sobre
todo para regadío. En consecuencia, en esta época del año es indispensable
una gestión adecuada de los recursos hídricos que garantice un suministro
suficiente de agua para todas las demandas existentes. En este sentido, es
necesario conocer con exactitud el valor de la ET ya que es un parámetro
fundamental en estudios hidrológicos y agrícolas tales como diseño y
programación de sistemas de riego, prevención de incendios, regulación
de embalses, producción agrícola y forestal, o planificación de los recursos
hídricos y usos del territorio, entre otros (Castillo y Castelví, 2001; Mardikis
y col., 2005; Chauhan y Shrivastava, 2009).
Dada la importancia de la determinación adecuada de la ET, disponer de
herramientas que permitan conocer su valor con antelación y precisión resulta
de gran ayuda en la mejora de la gestión de los recursos hídricos. En esta línea,
la determinación de la ETo con varios días de antelación podría realizarse a
partir de los pronósticos realizados por los servicios de meteorología (Jiabing
y col., 2007). En Galicia, MeteoGalicia (Conselleria de Medio Ambiente
e Desenvolvemento Sostible, Xunta de Galicia) realiza predicciones de las
condiciones meteorológicas con una antelación de varios días y estos datos
son publicados diariamente y están a disposición de los usuarios.
En este trabajo se ha evaluado la calidad de la ETo predicha con 1, 2 y
3 días de atelación en diferentes zonas de Galicia a partir de los pronósticos
148
meteorológicos realizados por MeteoGalicia, disponibles vía Web (www.
meteogalicia.es). Los objetivos planteados en este estudio son: (1) estimar
la ETo por diferentes métodos a partir de los pronósticos meteorológicos; 2)
analizar la calidad de estas estimaciones comparándolas con la ETo calculada
por el método de referencia FAO-PM a partir de datos observados y 3)
determinar la influencia del tiempo de antelación, 1, 2 ó 3 días, en la calidad
de las predicciones de la ETo.
MATERIAL Y METODOS
Datos meteorológicos
Estaciones Meteorológicas
Para realizar este estudio se han seleccionado tres estaciones meteorológicas
pertenecientes a la red de Estaciones de MeteoGalicia. Concretamente se trata
de la estación Ourense-Ciencias (Ourense), Lourizán (Pontevedra), y Pedro
Murias (Ribadeo), cuyas características y localización se muestran en la
Tabla 1 y Figura 1.
Tabla 1. Localización de las estaciones meteorológicas empleadas en este estudio.
Las 3 estaciones se han seleccionado por su situación en zonas de
características climáticas diferentes: oceánico húmedo de temperaturas suaves
(Pedro Murias, Ribadeo), oceánico húmedo de temperaturas moderadas con
riesgo de sequía estival (Lourizán, Pontevedra) y clima oceánico continental
(Ourense-Ciencias, Ourense).
Los datos de temperatura máxima (Tmax) y mínima (Tmin), humedad
relativa (HR) y radiación solar (Rs) registrados en estas estaciones se han
empleado para el cálculo de la ETo mediante FAO-PM y los resultados se han
149
Figura 1. Localización de las estaciones meteorológicas empleadas en este estudio.
comparado con los obtenidos empleando los pronósticos meteorológicos con
1, 2 o 3 días de antelación mediante los métodos FAO-PM y MHar.
Modelos de predicción meteorológica
MeteoGalicia durante el año 2008 ofreció a través de su web (http://www.
meteogalicia.es) pronósticos meteorológicos realizados con diferentes modelos:
ARPS con resolución de 6, 18 y 54 km2, GFS, y MM5 con resolución de 10
y 50 km2. Este servicio da la posibilidad de descargar series temporales de
pronósticos de temperatura, módulo y dirección del viento, humedad relativa
y precipitación con hasta tres días de antelación para diferentes ciudades
gallegas.
Para este estudio se ha utilizado las series temporales del modelo ARPS.
Se recogieron para cada día los pronósticos realizados con 1, 2 y 3 días de
antelación para las ciudades de Ourense, Pontevedra y Ribadeo entre el 19
de febrero de 2008 y el 1 de septiembre de 2008 con el fin de emplear esta
información para el cálculo de la ETo. Se ha elegido este periodo por ser la
época del año en la que se dan las mayores demandas hídricas por los cultivos
y las menores precipitaciones, y por tanto mayores necesidades de riego que
es necesario conocer con anterioridad con el fin de hacer una gestión y uso
adecuado del agua.
150
Cálculo de la ETo
El método FAO-Penman Monteith
El método FAO-PM es el método de referencia recomendado
internacionalmente para el cálculo de la ETo diaria (mm día-1). La expresión
empleada para su cálculo es la siguiente:
[1]
donde Rn es la radiación neta en la superficie del cultivo (MJ m-2 día-1), G el
flujo de calor del suelo (MJ m-2 día-1), T la temperatura media del aire a 2 metros
de altura (ºC), u2 la velocidad media del viento a 2 metros de altura (m s-1),
es la presión de vapor de saturación (kPa), ea la presión real de vapor (kPa),
Δ la pendiente de la curva de presión de vapor (kPa ºC-1) y γ es la constante
psicrométrica (kPa ºC-1). Complementariamente Allen y col. (1998, 2006)
propusieron una serie de ecuaciones para poder calcular los parámetros de la
ecuación [1] a partir de datos meteorológicos de T, HR, u2 y Rs.
Los pronósticos de Rs del modelo ARPS no son ofrecidos en la web de
MeteoGalicia, por lo que este parámetro tuvo que estimarse a partir de Tmax y
Tmin diarias por el método descrito por Allen y col. (1998, 2006) según el cual:
[2]
donde Rse es la radiación solar estimada (MJ m-2 día-1), Ra es la radiación
extraterrestre (MJ m-2 día-1), Tmax es la temperatura máxima del aire (ºC), Tmin
es la temperatura mínima del aire (ºC) y kRs un coeficiente de ajuste (ºC-0.5).
La radiación extraterrestre, Ra, se calcula mediante la expresión:
[3]
donde Gsc es la constante solar (0.082 MJ m-2 min-1), dr distancia relativa
inversa Tierra-Sol, ωs el ángulo de radiación a la puesta del sol [rad], φ es la
latitud [rad] y δ la declinación solar [rad].
151
El parámetro kRs de la ecuación [2] es un coeficiente de ajuste empírico
que toma diferentes valores en zonas costeras y zonas de interior. Aunque el
método recomienda valores de 0.16 para zonas de interior y 0.19 para zonas
costeras, en este trabajo se ha calculado su valor para cada estación a partir
de los registros históricos de Rs, Tmax y Tmin de cada una de ellas. Los valores
obtenidos son de 0.13 (n = 1130, R 2 = 0.85) para la estación de Ourense,
0.17 (n = 2532, R 2 = 0.82) para la estación de Pontevedra, y 0.21 (n = 2357,
R 2 = 0.77) para la estación de Ribadeo, los cuales difieren ligeramente de los
valores recomendados.
La ETo calculada por el método FAO-PM a partir de los pronósticos (ETpro)
fue comparada con la ETo calculada por el método FAO-PM con los valores
registrados en cada estación (ETPM).
El método Hargreaves
El método de Hargreaves (MHar) (Hargreaves y Samani, 1985) es un
método alternativo para el cálculo de la ETo que cuenta con la ventaja de
requerir menos parámetros para su determinación:
[4]
donde ETHar es la ETo (mm día-1), Tmed es la temperatura media diaria (ºC),
Tmax es la temperatura máxima diaria (ºC), Tmin la temperatura mínima diaria
(ºC), y Ra la radiación extraterrestre (mm día-1) que se calcula de acuerdo a la
ecuación [3].
Antes de aplicar este método en una región deben compararse sus
resultados con los obtenidos mediante el método de referencia (FAO-PM).
Si es necesario, el método debe ser ajustado determinando los coeficientes
empíricos de correlación de la forma:
[5]
donde b y a son los coeficientes de ajuste.
En este trabajo se ha ajustado previamente este método para cada estación
empleando los registros históricos de Rs, u2, HR, Tmed, Tmax y Tmin. A partir de
ellos se ha calculado la ETo por ambos métodos obteniéndose los parámetros
de calibrado a y b que se recogen en la Tabla 2.
152
Tabla 2. Coeficientes de ajuste (b y a) obtenidos entre el método de Hargreaves y
el método de referencia (FAO-PM) para cada estación de estudio. R2 es el coeficiente de
correlación y n es el número de datos empleados en el ajuste.
En general, existe una buena correlación entre la ETo obtenida por ambos
métodos, sobre todo en las estaciones de Ourense-Ciencias y Lourizan, R 2
de 0.91 y 0.93 respectivamente, mientras que en la estación de Ribadeo se ha
obtenido un R 2 de 0.81. Al igual que con la ETpro, la ETHar se ha comparado
con la ETPM para comprobar la validez y precisión del método propuesto.
Análisis de los resultados
Para comprobar la bondad de las estimaciones realizadas se ha recurrido
a los siguientes índices estadísticos:
(a) Coeficientes de regresión lineal b y R2, en los que b es el coeficiente
de regresión poblacional o pendiente de la línea recta y R2 el coeficiente
de correlación lineal. Cuanto más próximos sean los dos a 1 mejor es la
estimación.
(b) El error relativo (RE):
donde RMSE es el error cuadrático medio, N es el número de observaciones,
O los valores observados, P los valores estimados, y Ō la media de los
observados. Cuanto más próximo a 0 sea el valor de este índice menor es el
error cometido en la estimación.
(c)
El índice de Willmott (1982) (d):
donde Pi´ = Pi – Ō y Oi´ = Oi – Ō. Un valor de d igual a 1 índica una estimación
perfecta.
153
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis de los parámetros meteorológicos pronosticados
Temperatura máxima y mínima
En la Tabla 3 se recogen los resultados obtenidos al comparar los valores
pronosticados con diferentes días de antelación (1, 2 y 3) con los valores de los
parámetros meteorológicos observados. Tmax y Tmin son los parámetros mejor
estimados por el ARPS en las tres estaciones, obteniendo en prácticamente
la totalidad de los casos valores de b dentro del rango 1±0.1, R2 entre 0.63 y
0.79 y un RE por debajo de 0.15. En consecuencia los valores de d son también
buenos y prácticamente en su totalidad superiores a 0.9. Los pronósticos
realizados con 1, 2 y 3 días de antelación son muy semejantes entre sí, si
bien todos los resultados mejoran ligeramente cuanto menor es el período de
antelación del pronóstico.
Tabla 3. Índices estadísticos obtenidos al comparar los valores pronosticados y
observados de los parámetros empleados en el cálculo de la ETo en cada estación y día de
antelación del pronóstico.
154
Humedad relativa
La HR es un parámetro globalmente bien pronosticado, valores de b entre
0.90-0.96 con un RE bajo. Sin embargo los R2 obtenidos, especialmente en
la estación de Pedro Murias, indican poca precisión en su estimación. En
consecuencia, los valores del índice d son peores que los obtenidos con la
temperatura, aunque en general pueden considerarse aceptables. De nuevo, las
estimaciones a 1 2 y 3 días son muy similares en las tres estaciones mejorando
el resultado cuanto menor es el periodo de antelación del pronóstico.
Velocidad del viento
El parámetro peor estimado por el modelo ARPS es u2. Todos los
parámetros estadísticos indican que no existe relación entre los valores
pronosticados y observados, sobre todo en el caso de las estaciones de OurenseCiencias y Lourizán, donde los valores de b indican que los pronósticos están
sobrestimados, superando los valores pronosticados en más del doble a los
valores observados.
Radiación solar
La Rs estimada a partir de los pronósticos de Tmax y Tmin se ajusta
adecuadamente a la observada con prácticamente todos los valores de b dentro
del intervalo 1.0 ± 0.1. Al igual que la HR, presenta cierta dispersión que
explica los bajos valores de R2 y un RE no tan bueno como el obtenido con la
HR o la T. A pesar de esto, el valor d está razonablemente cercano a 1, siempre
por encima de 0.7, pudiendo considerarse que la Rs esta adecuadamente
estimada.
Tabla 4. Índices estadísticos obtenidos al comparar ETopro (pronostico de ETo calculado
mediante el método de FAO-PM) con EToPM (ETo calculada mediante el método FAO-PM a
partir de los datos registrados) para cada estación y día de antelación del pronóstico.
155
Estimación de la ETo a partir de los pronósticos meteorológicos
Método FAO-Penman Monteith
Los resultados obtenidos en el cálculo de la ETpro se recogen en la Tabla 4
y Figura 2, donde se representa la ETpro con 3 2 y 1 días de antelación frente
la ETPM para cada estación de estudio.
Figura 2. ETo diaria calculada por el método FAO-PM para cada estación a partir de los
pronósticos meteorológicos realizados con 1 2 y 3 días de antelación, frente a la ETo diaria
calculada a partir de los datos meteorológicos registrados en cada estación por el método
FAO-PM.
Existe una buena correlación entre ETpro y ETPM en las tres estaciones
ya que el valor del índice b es muy próximo a 1 y d está siempre por encima
156
de 0.8. En Ourense-Ciencias y Lourizán se obtiene un buen R2, entre 0.67 y
0.75, pero en Pedro Murias no supera un valor de 0.52, consecuencia muy
probablemente de la dispersión que ya presentaban las estimaciones de HR y
Rs para esta zona. A pesar de los aceptables valores de b, d y R2 obtenidos en
Ourense-Ciencias y Lourizán, la ETpro está ligeramente sobrestimada en estas
estaciones como se puede observar claramente en la Figura 2, donde la nube
de puntos aparece desplazada por encima de la línea 1:1.
Para identificar la causa que provoca esta sobrestimación se ha separado
la ETPM y la ETpro en los dos factores que conforman el cálculo de la ETo
mediante el método FAO-PM: el factor aerodinámico dependiente del viento
y factor radiactivo dependiente de la radiación y temperatura. En la Figura 3
se muestra la ETPM y la ETpro calculada con un día de antelación para OurenseCiencias, separadas ambas en su factor aerodinámico y radiactivo.
Figura 3. ETo calculada por el método FAO-PM separada en sus factores aerodinámico
(a) y radiactivo (b) calculada a partir de los pronósticos meteorológicos con un día de
antelación (línea continua) y de los datos registrados (línea discontinua) en la estación
Ourense-Ciencias.
157
En la Figura 3 se puede observar como la parte de la ET debida al factor
radiactivo pronosticada y observada son muy similares, apareciendo ambas
líneas prácticamente superpuestas. Sin embargo, el factor aerodinámico
estimado es superior al obtenido a partir de los datos observados. Con toda
seguridad, emplear los altos pronósticos de u2 realizados por el ARPS para
estas localidades da lugar a una esta sobrestimación de la ETo. Este hecho,
junto con la dispersión que presentan las estimaciones en Pedro Murias,
provocan que el ER en las tres estaciones sea alto. A pesar de los aspectos
señalados, podemos considerar el método propuesto como una herramienta
de gran potencial para la estimación con antelación de la ETo ya que los
valores obtenidos de b, R2 y d son buenos y se podría mejorar solucionando
la baja calidad de los pronósticos de u2 y la precisión de las estimaciones de
HR y Rs. Por último, debemos señalar que al igual que con los parámetros
meteorológicos, prácticamente no existe diferencia en utilizar los pronósticos
a 1, 2 ó 3 días, mejorando ligeramente los resultados cuanto menor es el
período de antelación del pronóstico.
Método de Hargreaves
En la Figura 4 y Tabla 5 se recogen los valores de ETo obtenidos utilizando
MHar.
Tabla 5. Índices estadísticos obtenidos al comparar ETHar (pronostico de ETo calculado
mediante el método de HArgreaves) con la EToPM EToPM (ETo calculada mediante el método
FAO-PM a partir de los datos registrados) para cada estación y día pronosticado.
158
Figura 4. ETo diaria calculada por el método Hargreaves para cada estación a partir
de los pronósticos meteorológicos realizados con 1 2 y 3 días de antelación, frente a la ETo
diaria calculada a partir de los datos meteorológicos registrados en cada estación por el
método FAO-PM.
Con este método se consigue una buena correlación entre ETMHar y
ETPM en las estaciones de Ourense-Ciencias y Lourizán, con valores de b
muy próximos a 1 y R2 entre 0.60-0.67, aunque ligeramente inferiores a los
pronósticos obtenidos con el método FAO-PM (ETpro). Sin embargo, estos
buenos resultados no se repiten en la estación Pedro Murias donde se obtienen
unos valores de b en torno a 0.80 y un R2 de 0.22-0.33. Si a esto le sumamos
159
un RE por encima de 0.35 y un d inferior a 0.7, podemos concluir que este
método no es adecuado en esta estación.
El problema derivado del uso de los pronósticos de u2 encontrado con
FAO-PM en las estaciones de Ourense-Ciencias y Lourizán no se repite con
MHar ya que este método no requiere este parámetro. En consecuencia,
el RE mejora notablemente, sobre todo en Ourense-Ciencias en donde se
reduce prácticamente a la mitad, y también el índice d que sube a valores
por encima de 0.9.
Una vez más, los resultados obtenidos con los diferentes períodos de
antelación en el pronóstico son muy similares. MHar se muestra como un
método válido para las estaciones de Ourense-Ciencias y Lourizán, pero no en
la de Pedro Murias donde no se consigue una estimación adecuada de la ETo.
Comparación método FAO-PM y Hargreaves
A la vista de los resultados obtenidos, ninguno de los dos métodos
evaluados, FAO-PM y Hargreaves se ha mostrado como adecuado para el
pronóstico de la ETo en el conjunto de las estaciones. Sin embargo, en función
de los resultados obtenidos, podemos separar por un lado las estaciones de
Ourense-Ciencias y Lourizán y por otro Pedro Murias. En las primeras,
los dos métodos han funcionado de manera muy similar obteniéndose
unos resultados que ofrecen valores de a, b y R2 muy similares. FAO-PM
obtiene R2 ligeramente mejores, pero el error que se produce al emplear los
pronósticos de u2 del ARPS, como ya se comentó en apartados anteriores,
provoca que la ETpro esté sobrestimada y en consecuencia los RE obtenidos
sean mayores. MHar al no emplear este parámetro en sus cálculos presenta un
RE mucho menor y un índice d por encima de 0.9, siendo por tanto el método
recomendado para estas estaciones. En la estación de Pedro Murias, MHar
no ha funcionado adecuadamente, obteniéndose valores de b y R2 claramente
inferiores a 1. FAO-PM funciona mucho mejor, valores de b en torno a 1
pero con R2 bajos indicando baja precisión en la estimación. Probablemente,
las características climáticas de esta zona sean la causa de esta mayor
imprecisión. La temperatura es uno de los parámetros con más peso en la ETo
y es el mejor pronosticado por el ARPS. El clima de Ribadeo, caracterizado
por temperaturas suaves, hace que este parámetro tenga menor peso en el
global de la ETo, aumentando por tanto el peso del resto de variables, peor
160
pronosticadas, y por tanto aumentando el error de la estimación. Este mismo
motivo explicaría también los malos resultados obtenidos con MHar.
Por otra parte, si atendemos a la ETo acumulada durante el período estudiado
(Tabla 6) podemos ver como no existe prácticamente diferencia en usar los
pronósticos con 1, 2 ó 3 días de antelación en el valor de ETo obtenido.
Tabla 6. ETo acumulada (en mm) durante el período de estudio calculada según el
método FAO-PM y ETo acumulada según los pronósticos meteorológicos realizados con 1,
2 y 3 días de antelación y calculada mediante Hargreaves y FAO-PM. Entre paréntesis se
muestra la diferencia en porcentaje respecto a la ETo obtenida mediante FAO-PM.
De nuevo podemos ver como el método FAO-PM se muestra el más
adecuado en la estación de Pedro Murias, con un error en la ETo acumulada
durante todo el periodo inferior al 5%, mientras que en las estaciones de
Ourense-Ciencias y Lourizán es el método MHar el que mejor funciona,
con un error inferior al 5% en el caso de Ourense-Ciencias y del 10% en
Lourizán.
CONCLUSIONES
En este trabajo se ha evaluado la calidad de las estimaciones de la ETo
con varios días de antelación (1, 2 o 3) en 3 localizaciones de Galicia a partir
de los pronósticos meteorológicos realizados por MeteoGalicia. Para ello se
han empleado los métodos FAO-PM y MHar y los pronósticos meteorológicos
realizados por el modelo ARPS con 1 2 y 3 días de antelación.
161
Los valores de ETo obtenidos mediante ambos métodos se han comparado
con los calculados por el método FAO-PM a partir los valores registrados
en cada estación. Los resultados muestran que la ETo pronosticada presenta
valores satisfactorios en todos los casos, con excepción del método de MHar
en la estación de Pedro Murias. En las estaciones de Ourense-Ciencias y
Pontevedra, a pesar de que con ambos métodos se obtiene un buen ajuste
con la ETo observada, valores de b en torno a 1 y R2 por encima de 0.65, es
recomendable el uso del método de MHar debido a que FAO-PM sobrestima
la ETo como consecuencia de emplear los inadecuados pronósticos de u2
realizados por el modelo ARPS. Probablemente, con unos pronósticos
de u2 adecuados el método FAO-PM sería el que obtendría unos mejores
resultados.
En la estación de Pedro Murias es preferible el método FAO-PM ya
que MHar no consigue estimaciones adecuadas, como indican los índices
estadísticos empleados. De las tres estaciones también es en esta donde
peores resultados se obtienen con FAO-PM, ya que a pesar de que b está
dentro del rango 1±0.1, el valor de R2 es bajo, entre 0.38 y 0.51, indicando que
la precisión de las estimaciones es baja. El clima de esta zona caracterizado
por temperaturas más suaves provocan que este parámetro, el cual es el mejor
estimado por el ARPS, tenga menos peso en el global de la ETo aumentando el
del resto de parámetros, peor estimados, induciendo más error en su cálculo.
Es destacable que prácticamente en todos los casos estudiados son mínimas
las diferencias obtenidas en el cálculo de la ETo empleando pronósticos
meteorológicos con 1, 2 o 3 días de antelación, si bien, cuanto más corto es el
periodo de antelación mejor es la precisión en la estimación de la ETo.
En definitiva, podemos considerar la metodología propuesta como una
herramienta adecuada para estimar con antelación la ETo, siendo de gran
interés su aplicación en la gestión y diseño de regadíos, gestión de recursos
hídricos, o en la prevención de incendios.
162
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Difusiones démicas y componentes
de la estructura genética del NW africano.
Perspectivas multivariantes de
STRs autosómicos
B. CAEIRO*, A. FERREIRO, D. BEIROA, J. A. RODRÍGUEZ-PÉREZ,
F. PICCHI-FIGUEIRA, M. M. REGUEIRO
Área de Antropoloxía Física, Facultade de Bioloxía, Universidade de Santiago de
Compostela, Campus Sur, 15782 Santiago de Compostela
*
Correspondencia: [email protected]
RESUMEN
Se aborda el estudio de una batería de STRs autosómicos de DNA en una
muestra de 160 individuos de la población general del Norte de Marruecos.
El análisis de los modelos mutacionales apunta al SMM como el mecanismo
principal en la génesis de la variabilidad alélica.
Los Análisis Cladístico y Multivariante evidencian que las poblaciones del
NW africano presentan una composición genética rica y compleja, resultante de
contribuciones genéticas muy diversas. El aporte Negroide establecido desde
le África subsahariana queda registrada como un componente minoritario en
el perfil de los actuales habitantes del NW africano que, mayoritariamente,
se emparentan biológicamente con las poblaciones del grupo Caucasoide,
debido fundamentalmente a expansiones procedentes de Oriente Medio
(Neolítico e Islamización). No obstante, las evidencias genéticas apoyan la
hipótesis de una presencia temprana del componente caucasoide en la región,
estimada entre 40.000-25.000 años a.C., de la que los actuales bereberes son
herederos directos.
Palabras clave: ADN, estructura genética, marcadores genéticomoleculares, norte de África, poblaciones africanas, polimorfismo genético, STR.
164
ABSTRACT
The analysis of the genetic polymorphism of autosomal STRs among 160
unrelated individuals from Northern Morocco has been accomplished. The
distribution of gene frequencies points out to SMM as the uppermost source
of allele diversity.
Cladistic and Multivariant Analyses call attention to the intrincate and rich
genetic composition displayed by the NW African populations. The analyses
disclose a minor Subsaharian contribution into the genetic structure of NW
Africa, which in actual fact are genetically close related to the Caucasoid main
group. This consideration is mainly attributed to demic expansions arose from
the Near East region (essentially the Neolithic and Islam expansions). Even
though, early Caucasoid contributions can still be recorded at the present time
among the Berber populations, as the direct descendants of these first modern
humans inhabiting the region 40,000-25,000 years b.p.
Key words: African populations, DNA, genetic polymorphism, genetic
structure, northern Africa, short tandem repeats.
INTRODUCCIÓN
La difusión démica y el subsiguiente flujo génico constituye un mecanismo
de capital relevancia para comprender el proceso y naturaleza biológica de
la expansión de los humanos modernos. El NW de Africa es sin duda un
ejemplo ilustrativo, dado que se ubica en un emplazamiento geográfico que
aglutina aportaciones Europeas desde la fachada nordmediterránea, así como
aportes subsaharianos, y finalmente un tercer componente que procedente de
Oriente Medio se expansiona a lo largo de la franja norteafricana. Las distintas
poblaciones que actualmente habitan el Norte de África, no proceden de un
único evento migratorio que posteriormente se ha diferenciado en la región,
sino que un elevado número de poblaciones y civilizaciones han dejado su
huella tanto genética como cultural en las poblaciones actuales.
El registro paleontológico aporta evidencias de restos correspondientes
a los humanos modernos en el NW africano, con una antigüedad estimada
en 40.000 años (Alimen, 1987), de una tipología cro-magnoide, semejante a
la de sus homólogos europeos de la época. Tales poblaciones se relacionan
estrechamente con la industria lítica Ateriense, ampliamente distribuida
165
por la región y que se vería reemplazada, sin una clara continuidad, por la
industria Iberomauritana, desarrollada en el periodo comprendido entre
22.000 y 9.5000 años atrás (Newmann, 1995). Ésta, a su vez se propaga
por la orilla mediterránea, a lo largo de la costa hasta alcanzar el NW del
continente, concluyendo en la vertiente atlántica, al W, y Mauritania, hacia el
Sur (Camps, 1974). Tal expansión se produce en un contexto de condiciones
climáticas sensiblemente más favorables que las actuales, dado que por
entonces el Sahara alcanzaba su máximo grado de humedad, previa a su
progresiva desertificación.
Poblaciones de substrato caucasoide y subsahariano confluyeron,
desde el N y S, respectivamente, en la franja Sahariana, de modo que se
desarrollaron diversas culturas Pre y Neolíticas, como lo acredita el registro
arqueológico (Doutour y col., 1988). La expansión Neolítica procedente de
Oriente Medio alcanza el NW africano hace 5.500 años estableciendo, así,
contacto con la cultura capsiense, que, desarrollada en el Mesolítico significaba
una continuación evolutiva de la cultura Iberomauritana (Ferembach,
1985; Camps-Fabrer, 1989). Finalmente, ya en etapas históricas, diferentes
invasiones alcanzan la zona, siendo la expansión islámica (siglo VII A.D.) la
que, irradiando desde Oriente Medio, ocasiona mayor repercusión y alcance.
Los estudios de las poblaciones actuales fueron inicialmente llevados
a cabo con marcadores genéticos “clásicos” (antígenos eritrocitarios y
leucocitarios, proteínas plasmáticas y alozimas) (Mahmnoud y col., 1987;
Cavalli-Sforza y col., 1994; Pinto y col., 1994; Arnáiz-Villena y col., 1995;
Kandil y col., 1999). Tales estudios se desarrollaron a partir de una información
genético-poblacional dispersa e incompleta, que limita severamente tanto la
relevancia como la consistencia de las conclusiones. Más recientemente,
otras aproximaciones llevadas a cabo con marcadores genéticos de ADN
(básicamente mt-DNA y Y-SNPs) (Pinto y col., 1994; Rando y col., 1998;
Lucotte y col., 2001; Bosch y col., , 2001; Maca-Meyer y col., 2003) mediante
el análisis filogeográfico de matri y patrilinajes, han permitido avanzar
notablemente en el conocimiento de los substratos genéticos pretéritos de
las poblaciones actuales. No obstante tales estudios presentan un enfoque
geográficamente local, destinados básicamente a rastrear e identificar
diversos legados genéticos reflejados en la actual composición biológica de
poblaciones puntuales.
166
En el intrincado marco de componentes genéticos que han configurado
el paisaje genético del NW de África, el presente trabajo aborda el análisis de
una batería de marcadores de ADN, del grupo de los STRs (“Short Tandem
Repeats”) autosómicos. Tal estudio se apoya asimismo en el amplio numero de
datos genético-poblacionales, disponibles en la actualidad, tanto para el N. de
Africa, como para las poblaciones de las áreas geográficamente concurrentes
(Europa circunmediterránea, Oriente Medio, África subsahariana), que serán
clave para perfilar y aportar solidez a nuestros análisis, al proporcionar un
marco poblacional diverso, superando asimismo las limitaciones y sesgos
inherentes a marcadores uniparentales.
MATERIAL Y METODOS
Muestra
La muestra estadística se obtuvo a partir de individuos de ambos sexos, no
emparentados biológicamente, seleccionados al azar a partir de la población
general árabe del Norte de Marruecos. Cada individuo seleccionado responde
a los requerimientos de autoctonía, al menos dos generaciones previas, y sus
procedencias geográficas corresponden a las regiones de TittÁoouen, Fes, Al
Hoseima, Taza, Nadar y Oudjda (Fig.1). Las muestras fueron obtenidas tras
consentimiento de los donantes, y respetando los requerimientos éticos y de
confidencialidad de la convención de Helsinki.
Figura 1. Norte de Marruecos. Agrupaciones regionales. 1: Titt’aouen; 2: Al Hoseima;
3: Taza; 4: Fes, 5: Nador; 6: Oudjda
167
De cada individuo se procedió a la extracción de 2 mL de sangre
venosa periférica, tratada con EDTA-Na2 (10%, w/v) (10 µL/mL sangre).
El paquete celular se obtuvo tras una inicial centrifugación a 3.000 r.p.m.,
10 min. El DNA fue obtenido mediante extracción con solventes orgánicos
(fenol/cloroformo/isoamílico) (Maniatis y col., 1982), con modificaciones
propias. Tras su extracción y cuantificación, el DNA fue almacenado a -20ºC
hasta su análisis.
La amplificación de los STRS se llevó a cabo mediante PCR en un
GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems). Los
monoplexes se desarrollaron en un volumen total de reacción de 12,5 uL
(10-50 ng DNA molde, 200 uM cada d-NTP, Tris-ClH 20 mM, pH 8.4), de
acuerdo con las siguientes secuencias de primers:
HUMTPOX (Anker y col., 1992)
PRIMER1:5´-CAC TAG CAC CCA GAA CCG TC-3´
PRIMER2:5´-CCT TGT CAG CGT TTA TTT GCC-3´
HUMTH01 (Gill y col., 1992)
PRIMER1:5´-GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC CTC-3´
PRIMER2:5´-GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3´
HUMVWA31/A (Kimpton y col., 1992)
PRIMER1:5´-CCC TAG TGA ATG ATA AGA ATA ATC-3´
PRIMER2:5´-GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG-3´
CSF1PO (Hammond y col., 1994)
PRIMER1:5´-’AAC CTG AGT CTG CCA AGG ACT AGC-3’
PRIMER2:5´-TTC CAC ACA CCA CTG GCC ATC TTC-3 ’
FGA (Mills y col., 1992)
PRIMER1: 5´-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3´
PRIMER2: 5´-CTT CTC AGA TCC TCT GAC AC-3´
Electroforesis
La separación molecular de los fragmentos amplificados se efectuó
mediante electroforesis horizontal en geles ultrafinos de poliacrilamida
(PAGE), (120 mm x 220 mm x 0,4 mm) con valores de C: 5% y T entre
5% - 10%, dependiendo del tamaño molecular del STR. En cada uno de los
STRs, la electroforesis se llevó a cabo con tampón Tris-ClH 0,375 M, pH 8,8
para el gel, y Tris-Glicina 0,125 M, pH 8,8, para el puente, aplicando un voltaje
168
constante de 7,8 V/cm, y condiciones de refrigeración a 4º C. Completada la
separación electroforética, el revelado de las bandas se desarrolló mediante
tinción por Silver Staining de acuerdo con las condiciones descritas previamente
(Budowle y col., 1991), con modificaciones propias (Luis y Caeiro, 1996).
Análisis estadístico
El análisis del equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) se llevó a cabo
mediante el test exacto basado en las cadenas de Markov (Guo y Thompson,
1992) (valor de dememorización 1.000; 1.000 interacciones /batch), según
“GENEPOP Statistical Package” (Raymond y Rousset, 1995). La corrección
de Bonferroni se aplicó mediante SISA (Simple Iteractive Statistical
Analysis) (Uitenbroeck, 1997). Los modelos mutacionales para la estimación
del número de alelos/locus se desarrollaron mediante IAM (Ewens, 1972) y
SMM (Kimura y Crow, 1964; Kimura y Ohta, 1978).
El Análisis de Escalamiento Multidimensional (“Multidimensional
Scaling”) (MDS) se desarrolló a partir del paquete estadístico SPSS v.15.0
1. El Análisis de Componentes Principales (PCA) se efectuó mediante la
aplicación del NTSYS vs 1.79 (Rolf y Slice, 1992). Los árboles genéticos se
elaboraron mediante estrategias de Neighbor Joining (Saitou y Nei, 1987) a
partir de la matriz de Distancias Genéticas de Reynolds (Reynolds y col., 1983)
y DA de Nei (Nei y col., 1983). La estimación de los valores de bootstraping
de la consistencia estadística de las ramas de los árboles, se efectuó mediante
PHYLIP Software Statistical Package version 3.63 (Felsenstein, 2004). Los
Filogramas se efectuaron mediante el Tree Wiew version 1.6.6 (Win 32)
R.D.M. PAGE, 2001.
RESULTADOS Y DISCUSION
En la Tabla 1 se relaciona la distribución de frecuencias alélicas y
los parámetros biostadísticos correspondientes a la batería de los STRs
investigados en el presente estudio. Se han encontrado hasta un total de
38 variantes alelicas (promedio: 7, 6 ± 0.1172 alelos/locus). Los valores
insesgados de Heterozigosidad (He) (Nei y Roychoudhury, 1974) oscilan
entre 0.6951 para el TPOX y 0.8557 para el locus FGA, determinando así un
valor promedio de He = 0.7698.
169
Tabla 1. Frecuencias alélicas de los loci TPOX, VWA, TH01; FGA, CSF1PO en la
población del Norte de Marruecos. He: Heterozigosidad esperada; s.e.: Error típico; HW(P):
Test exacto de probabilidad de equilibrio Hardy-Weinberg; N: número total de alelos
examinados.
170
El análisis de la distribución de las frecuencias fenotípicas teóricas y
empíricas indica que no existen evidencias estadísticas que cuestionen el
carácter panmíctico de la población para los loci examinados. Los valores de
HWE configuran valores de p que se enmarcan en el intervalo comprendido
entre 0.9142 (TPOX) y 0.3328 (CSF1PO) (Tabla 1). Tal resultado se ve reforzada
tras la aplicación de la corrección de Bonferroni ( p corregido=0.001). Los
análisis de los modelos mutacionales (Tabla 2) apuntan al SMM como el
modelo que mejor explica la diversidad alélica reflejada, y al slipage como
el mecanismo molecular básico en la génesis de tal variabilidad alélica
(Chakraborty y Daiger, 1991; Kimura y Ohta, 1978). La consideración conjunta
del número de alelos/locus, He y valores de SMM, sugiere que no existen
evidencia de subestructura poblacional o de efectos de “cuello de botella”
(“bottlenecks”) que hayan incidido de manera relevante en el reciente devenir
evolutivo de la población (Deka y col., 1992).
Al objeto de dotar de un significado biológico, en un marco poblacional
suficientemente amplio, los valores de las frecuencias alélicas obtenidas
en nuestro estudio, fueron integrados junto con los datos disponibles en la
literatura científica. Establecemos así cuatro grandes áreas: Norte y NW
Tabla 2. Nº de alelos/locus observados y esperados por los modelos mutacionales
IAM/SMM.
africano, África subsahariana, Continente Europeo y Oriente Medio, en
estrechamente relacionada con nuestra población, tanto démica como
geográficamente. Con ello, se fundamentan las bases requeridas para la
interpretación de la estructura e historia evolutiva de nuestra población el
marco del NW africano, desde una perspectiva genético-molecular.
171
El Substrato Caucasoide
Los valores de Distancia de Genética de Reynolds (Reynolds y col.,
1983) se elaboraron a partir de la distribución de frecuencias de un total de
84 variantes alélicas diferentes. A partir de la matriz de distancias se diseñó
el dendrograma sin raíz, mediante la aplicación de estrategias de Neigbor
Joining (Saitou and Nei, 1987) (Fig. 2). Destaca, por una parte, la coherencia
biológica de las agrupaciones resultantes, así como la robustez y consistencia
estadística de las ramas, como lo reflejan los elevados valores de bootstrap. Las
poblaciones norteafricanas y de Oriente Medio, ocupan posiciones centrales,
derivando respectivamente de puntos nodales que en la topografía del árbol se
sitúan muy próximos entre si, y que en la figura se señalan con sendas flechas.
Tal proximidad sugiere una estrecha relación genética en origen, que tras la
progresiva diferenciación de las ramas, desemboca en los perfiles biológicos
de las actuales poblaciones.
Los análisis estadísticos llevados a cabo desde perspectivas radicalmente
diferentes, proporcionan conclusiones que son congruentes con las
anteriores, a la vez que amplían el horizonte de exploración de los
resultados. La Proyección en el plano I/II del Análisis de Multidimensional
Figura 2. Distancias Genéticas de Reynolds: Árbol sin raíz y valores de Bootstraping
172
Scaling (MDS) pone de manifiesto la relevancia de la Dimension I (70.82%
de la varianza), a lo largo de la cual se produce la distribución, en áreas
netamente diferenciadas, de los grandes grupos poblacionales objeto de
estudio (Figura 3). Ello se refleja en una gradación de Norte a Sur de la
distribución los clusters, desde las poblaciones nórdicas y centroeuropeas, que
ocupan las posiciones mas positivas de la Dimensión, hasta las poblaciones
subsaharianas (proyecciones más negativas) que se ubican en las posiciones
opuestas, pasando por circunmediterráneos (europeos y norteafricanos).
Las poblaciones de substrato caucasoide, tanto norteafricanas como
europeas si bien se esparcen en áreas diferentes, todas ellas comparten
valores positivos en sus proyecciones a la Dimensión I. En otras palabras,
Figura 3. Multidimensional Scaling. Poblaciones. Subsaharianas: ANG (Angola);
CAV (Cabo Verde); GUI1 (Guinea-Bissau); GUI2 (Guinea ecuatorial); HUT (Hutus); KEN
(Kenia); MOZ (Mozambique); NAM (Namibia); RWA (Ruanda); TAN (Tanzania); TUT
(Tutsi); USN (Afroamericanos USA); XHO (Xhosa,Sudáfrica). Norteafricanas: BER1
(Bereberes Marruecos Central); BER2( Bereberes E Marruecos); BER3 (Bereberes Egipto);
BER4 (Bereberes Túnez); EGI (Musulmanes Egipto); MAR1(Musulmanes Marruecos);
MAR2(Musulmanes N Marruecos), TUN(Túnez). Europeas: ALE (Alemania); AND
(Andalucía); AUS (Austria); BEL (Bélgica); CHI (Chipre), CLM (Castilla-La Mancha); FIN
(Finlandia); GRE (Grecia); MAL (Malta); POL (Polonia); POR (Portugal); SIC (Sicilia).
esto indica que en la actualidad se ha producido una diferenciación démica
que, en la Figura 3 se expresa en la delimitación de clusters bien definidos.
Tal modelo sugiere la existencia de un substrato ancestral común, previo a la
diferenciación de las poblaciones actuales.
173
El origen del componente caucasoide de las poblaciones norteafricanas
es en la actualidad objeto de debate. El registro osteológico atestigua la
presencia de poblaciones de humanos modernos en la región, con una
antigüedad estimada en 40.000 años. Presentaban una tipología arcaica del
tipo Cromagnoide, estrechamente asociados a la expansión de la industria
Ateriense, que se expandía por todo el NW desde el Maghreb hasta el
Sahara. Consiguientemente, la tipología de tales ocupantes se relacionaba
estrechamente con la de sus homólogos europeos nordmediterráneos de la
época ( Camps, 1974; Alimen, 1987; Doutour y col., 1988). Otros autores
Figura 4. Análisis de Componentes Principales. Valores de proyección al Eje II.
postulan una introducción tardía del componente caucasoide en el NW
africano, como consecuencia de la expansión Neolítica, procedente de Oriente
Medio, a lo largo de la costa Norte del continente. No obstante, esta hipótesis
no encaja con las evidencias paleontológicas que atestiguan la presencia de
componentes caucasoides diferenciados, en algunas poblaciones del NW
africano (v.g, bereberes), decenas de miles de años antes de la expansión
Neolítica, y como lo corroboran asimismo los análisis de los marcadores
genéticos. El análisis detallado de la información extraída a partir de los
marcadores autosómicos de ADN aporta claves esclarecedoras. En la Fig. 4,
se reflejan los valores de proyección al eje II de los eigenvectores, tras el
Análisis de Componentes Principales. Dicho eje II es especialmente relevante
en la diferenciación de los clusters caucasoides. Se aprecia que las muestras
bereberes presentan sistemáticamente proyecciones positivas, claramente
alejadas de las restantes poblaciones, (árabes norteafricanos, Oriente Medio
y europeas), cuyas posiciones se solapan entre si. Esto parece indicar que
en tanto entre los bereberes ya existía un substrato caucasoide diferenciado
tal como lo indican sus proyecciones al Eje II, las restantes poblaciones aun
no habían diferido entre si. De modo que estas ultimas parecen descender
de un antecesor común, también caucasoide, pero de naturaleza genética
diferente al bereber, y cuyo origen es comparativamente mas reciente, lo que
explicaría que, consecuentemente, sus poyecciones al Eje II se solapen entre si.
174
Los alelos TPOX*9, D8S1179 ( alelos 13 y 14), D3S1358 (alelos 16 y 17) juegan
un papel decisivo.
A partir de la información proporcionada por los patrones filogeográficos
de los subclados del Haplogrupo I, derivados de la mutación M170, se estima
que el inicio de la divergencia entre las poblaciones de Oriente Medio y el
continente europeo se originaría hace 25.000 años aproximadamente (Torroni
y col., 1998; Semino y col., 2000; Cinnioglu y col., 2004). La integración de
este dato en lo referente al poblamiento del NW africano con la información
discutida en párrafos anteriores, respalda la idea de la presencia temprana de
los primeros componentes caucasoides en el NW Africano en los predecesores
directos de los actuales bereberes, y cuyo origen surge en el intervalo
cronológico comprendido entre los 40.000 y 25.000 años.
La Expansión Islámica
La contribución genética resultante de la expansión islámica producida a
lo largo de la costa Norte del continente africano, constituye un segundo pilar
fundamental para explicar la incardinación de las poblaciones norteafricanas
dentro del grupo caucasoide. Tal expansión, de Este a Oeste originada desde
Oriente Medio, no es sólo de carácter socio-cultural sino también de índole
genética, y como tal ha dejado un profundo impacto en la actual composición
del panorama genético norteafricano. A diferencia de otras contribuciones
démicas acaecidas en la región, en el caso de la expansión islámica se dispone
de una información precisa tanto en lo referente al período cronológico como
en la identificación de las poblaciones paternas implicadas, así como de la
ruta seguida en tal difusión.
En la Figura 5 se presentan los resultados de los análisis de la contribución
genética debida a la islamización a partir de los patrones de distribución de las
frecuencias alélicas, mediante Análisis de Componentes Principales. Al objeto
de centrar la atención en este aspecto, se han considerado preferentemente
poblaciones norteafricanas y de Oriente Medio, tomando las europeas, como un
referente vinculado. Por una parte, la proyección I/II (86.74 %de la varianza total)
pone de manifiesto una gradación de las proyecciones poblacionales a lo largo del
Eje I como consecuencia del flujo génico E-W. Las poblaciones genéticamente
más próximas a las del Oriente Medio tienden a ser las del Este norteafricano.
Por el contrario, la población de Marruecos aquí estudiada (MAR1) ocupa
175
Figura 5. Análisis de componentes principales. Proyección I/II. ÁREA I: BER1
(Bereberes Marruecos Central); BER2 (Bereberes E Marruecos); BER3 (Bereberes Egipto);
BER4 (Bereberes Túnez); COP (Coptos, Egipto); EGI (Musulmanes Egipto); MAR1
(Musulmanes Marruecos); MAR2 (Musulmanes N Marruecos); SAH (Sáhara occidental);
TUN (Túnez); TUN2 (Zriba, Túnez). ÁREA II: ARA (Arabia Saudí); GEO (Georgia); IRK
(Irak); IRN (Irán); JOR (Jordania); QAT (Qatar); SIR (Siria), TUR (Turquía), YEM (Yemen).
ÁREA III: ALE (Alemania); AND (Andalucía); BEL (Bélgica); BIE (Bielorrusia); CAL
(Calabria, Italia); CHI (Chipre); CLM (Castilla-La Mancha); GRE (Grecia); HUN (Hungría);
MAL (Malta); POL (Polonia); POR (Portugal); SER (Serbia); SIC (Sicilia).
en el plano posiciones distanciadas, agrupándose con otras muestras del
NW africano (MOR2, ARG TUN, SAH, MZBT). Tal gradación debida a los
fenómenos de flujo génico se plasma en diversas aleloclinas, particularmente
los alelos TPOX*8, CSF1PO (alelos 10 y 12), D5S818*13, D13S317*9; TH01
(alelos 9 y 10), VWA*15, D21SS11*28. Es, asimismo, interesante notar la
influencia de las poblaciones de Oriente Medio, en las muestras europeas
circunmediterráneas, especialmente las más orientales (Chipre, Grecia,
Malta) las que presentan una mayor cercanía, en el plano, al área en la
que se distribuyen las muestras de Oriente Medio, en contraposición a las
mediterráneas occidentales (Península Ibérica: Andalucía, Portugal; CastillaLa Mancha). Tal patrón de distribución reproduce en el mediterráneo europeo
la gradación Este a Oeste referida en la costa norteafricana.
Los patrones filogeográficos sugieren que la contribución genética
impresa en las actuales poblaciones del Norte Africano no obedece tanto
a un mero aporte puntual y masivo, por una invasión territorial, sino más
176
bien, a una difusión gradual y progresiva de Este a Oeste. Una vez unificados
en el ámbito cultural (lingüístico, religioso, etc), como consecuencia de la
expansión islámica, en los territorios conquistados, en los últimos trece siglos
aproximadamente, se desarrollan condiciones favorables para una mayor
permeabilidad y difusión genética, tal como lo demuestran los patrones
clinales mostrados en los Análisis Multivariantes. Tal interpretación se ve
asimismo apoyada por los resultados derivados del análisis del mt-DNA,
cuya herencia materna (contribución femenina) define modelos de gradación
de los matrilinajes a lo largo de la costa norteafricana (Pinto y col., 1994;
Maca-Meyer y col., 2003). En consecuencia, tales resultados parecen
descartar que la contribución biológica acarreada por la islamización en el
Africa nordsahariana se haya limitado a una mera contribución puntual por
una invasión (masculina) masiva.
Tanto los análisis de PCA como los MDS proponen que la difusión
démica que acompañó a la expansión islámica se produjo preferentemente
a lo largo de la franja costera y regiones adyacentes. A tal efecto, los alelos
TPOX*9, D3S1358 (alelos 16 y 17), D8S1179 (alelos 13 y 14), VWa *12 son
especialmente informativos. Tanto por la información derivada de la Figura 4
como de la Figura 5, se aprecia que las poblaciones Bereberes, fragmentadas y
diseminadas en el interior geográfico norteafricano, experimentaron, ya desde
el Neolítico y etapas inmediatamente anteriores, la diferenciación biológica
subsiguiente a la deriva genética originada por el aislamiento geográfico
antes referido. Eso explica que en los Análisis de Componentes Principales se
distribuyan de manera dispersa y ocupen en el plano I/II posiciones periféricas,
claramente distanciadas de las otras poblaciones costeras norteafricanas. En
tales poblaciones bereberes, la expansión islámica parece haber tenido más
bien un significado cultural, en tanto que, comparativamente, el impacto
de la contribución genética parece haber sido escaso. En consecuencia, los
Bereberes parecen haber preservado hasta la actualidad una parte significativa
de la memoria genética de los primeros grupos paleolíticos de Homo sapiens
que habitaron la región.
La Contribución Subsahariana
El desierto del Sahara constituye una frontera natural entre el Norte
Africano y el África subsahariana. El Análisis de MDS de la distribución
de frecuencias alélicas, circunscrito a ambos contextos poblacionales
177
(Figura 3), es especialmente aclaratorio. La proyección I/II presenta a las
poblaciones norteafricanas agrupadas conjuntamente con las europeas
del ámbito circundemiterráneo, en un área específica y diferenciada,
netamente alejada de las proyecciones que agrupan al Africa subsahariana
(Cuadrantes II y III, respectivamente), lo que parecería indicar que el legado
genético de éstas últimas en la composición démica del NW africano no
ha sido particularmente relevante. Una parte substancial de los patrones de
agrupamiento es desempeñada por los alelos D13S317*9, D18S*13, TPOX*8,
TPOX*9, CSF1PO*13; FGA*21, TH01*9.3.
Si bien en la actualidad el Sahara constituye una barrera natural que
limita notablemente el flujo génico en ambas direcciones, los resultados
arriba señalados no parecen ser acordes con la historia demográfica de ambas
regiones. Esto es, durante miles de años el Sahara, lejos de las condiciones
climáticas actuales, estuvo habitado por poblaciones metamórficas resultantes
de la mezcla démica de componentes Caucasoides norteafricanos, y por
contribuciones Negroides, al Sur, tal como lo refleja el registro arqueológico
de la época (Camps, 1974; Newmann, 1995). Tal etapa alcanza su apogeo
de máxima humedad hace 9.000 a. C., el denominado “Sahara Fértil”. A
partir de entonces sobreviene una progresiva aridificación, que en etapas
sucesivas conduce a las condiciones desérticas actuales. Tal proceso climático
desencadenó la redistribución de los pobladores saharianos en dos direcciones
opuestas, hacia el Sur (Sahel) y hacia el Norte (Maghreb) y NW africano
(Alimen, 1987; Barry Cox y Moore, 1993). Teniendo en cuenta tales eventos
démicos, cabría esperar que en la composición genética actual del NW
africano, se registrase un significativo aporte genético del substrato Negroide,
notablemente superior al que se observa en la actualidad, a tenor de los datos
aportados por los STRs autosómicos. Pero tal no es el caso.
Por otra parte, de acuerdo con la información histórica disponible,
conocemos que las poblaciones de los Afroamericanos (USN) y Cabo Verde
(CAV) constituyen claros ejemplos actuales de poblaciones metamórficas
originadas como consecuencia de un repetido aporte caucasoide sobre un
substrato negroide inicial, de naturaleza bantú. (Parra y col., 1995, 1998). Se
advierte que las posiciones en que se ubican Afroamericanos USA (USN) y
Cabo Verde (CAV), claramente se incardinan en el área en la que se distribuyen
las poblaciones subsaharianas, no obstante, en ambas poblaciones se aprecia
un claro acercamiento a las regiones del plano propias de las poblaciones
178
caucasoides, demostrando su carácter de poblaciones híbridas. Por el contrario,
las poblaciones norteafricanas no reflejan tales pautas, lo que parece sugerir
una historia evolutiva netamente diferente.
Cabría preguntarse si tales resultados indican que en las poblaciones
del NW africano ha habido un escaso aporte genético subsahariano. Un
análisis más detenido nos indica que tal apreciación no es suficientemente
sólida; es importante tener en cuenta que las muestras subsaharianas que
relacionan en la Figura 3 corresponden a poblaciones de substrato y cultura
bantú, cuyo perfil genético es de naturaleza diferente al componente negroide
de las primigenias poblaciones autóctonas saharianas. Por consiguiente,
el alejamiento de las posiciones que se advierte en la proyección, entre
poblaciones subsaharianas y NW africano no impugna una significativa
contribución genética subsahariana, acaecida en etapas pretéritas, en el
transcurso del período de convivencia en el Sahara Fértil. La expansión bantú
que introdujo y expandió el Neolítico en el África subsahariana desde hace
5.000 años aproximadamente (Cavalli-Sforza y col., 1994; Newmann, 1995) de
manera progresiva reemplazaría y desbancaría a otras poblaciones negroides
autóctonas, tecnológicamente menos desarrolladas, hasta su confinamiento y
extinción final. Ello explicaría la ausencia de estas últimas en el actual paisaje
genético del África subsahariana, habiendo así experimentado un proceso
parejo al que todavía se puede observar, en la actualidad, en las poblaciones
de Pigmeos y Khoisánidos.
179
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La Corriente de Malvinas:
¿una vía de dispersión para cnidarios
bentónicos de aguas frías?
M. O. ZAMPONI
CONICET. Laboratorio de Biología de Cnidarios (LABIC)
http://www.labic.8m.com
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ciencias Marinas.
Universidad Nacional de Mar del Plata. Funes 3250. B760 2AYL Mar del Plata. Argentina.
e-mail: [email protected]
Fax: 0054 (00223) 475-3554
RESUMEN
La Corriente de Malvinas constituye una vía de dispersión para aquellas
especies de cnidarios bentónicos que tienen la mayor concentración en la
subregión Templada Fría (= subregión Patagónica o Magallánica).Los cnidarios
bentónicos como organismos suspensívoros pasivos encuentran en la Corriente
Circumpolar Antártica y en su continuidad la Corriente de Malvinas, zonas
de alta productividad biológica que contribuye al asentamiento de poblaciones
constituidas por especies poseedoras de un sistema esqueletal rígido ( calcáreo
o espicular).
Palabras clave: Corriente de Malvinas, cnidaria, organismos bentónicos.
ABSTRACT
The Malvinas´s Current is a dispersion way for species like cnidarians
that they have big concentration Polar Front. To be benthic cnidarians species
184
feeders passive organism find in the Antarctic Circumpolar Current and her
branch Malvinas´ Current, zones of high biologic productivity. This zones let
the settlement of species with a squeletal system (calcareous or spicule).
Key words: Cnidaria, Malvinas ´s Current, benthic organism.
INTRODUCCIÓN
El área del presente estudio está circunscripta a la región Subantártica o
Notal (Boschi, 1976), también denominada Antiboreal por Ekman (1953) y
Kramp (1959) y se extiende por el océano Pacífico hasta el sur de Chile. Esta
región está conformada por subregiones o provincias conocidas como subregión
Templada Cálida y Templada Fría, también denominadas respectivamente
subregión Argentina o Bonaerense y Patagónica o Magallánica. La primera
de ellas se extiende hacia el norte hasta Cabo Frío a una latitud de 23°S y hacia
el sur hasta los 43°/44°S; la subregión Templada Fría comprende el litoral de
Tierra del Fuego, Islas Malvinas y la plataforma patagónica y su límite norte
se establece aproximadamente entre los 34° y 35°S.
Figura 1. Aspecto general de la Región Antartica y Región Subantartica.
185
Figura 2. Detalle de la región Subantartica.
La región subantartica o Notal corresponde a la plataforma continental
del sudeste de Sudamérica y dicha región tiene como principal componente
océanico a la Corriente Circumpolar Antartica que da origen a la Corriente
de Malvinas que en su recorrido baña la plataforma continental de Argentina
y zonas adyacentes.
La Corriente de Malvinas, al desplazarse hacia el norte, sirve de vía de
dispersión a poblaciones de cnidarios bentónicos que generalmente tienen
mayor concentración en el extremo sur de la subregión Templada Fría.
186
MATERIAL Y METODOS
El material utilizado en este análisis fueron diversas especies de
cnidarios bentónicos pertenecientes a la subclase Leptothecatae y a los
órdenes Stylasterina, Gorgonacea, Pennatulacea, Alcyonacea, Actiniaria y
Scleractinia.
El área de distribución de las especies corresponde a la denominada
región Subantártica o Notal situada entre 35° y 55°LS. Dicha área fue dividida
en una cuadrícula de 5° de LS y 5° de LW para precisar lo más aproximado
posible los puntos de encuentro de las diversas coordenadas que indican la
posición de hallazgo de las epecies indicadas.
Dada la diversidad de cnidarios bentónicos existentes en el área de estudio
se seleccionaron aquellas especies que tienen distribución en la Corriente
Circumpolar Antártica y que también se localizan en la subprovincia
Patagónica o Magallánica, para luego ser halladas a través de la Corriente de
Malvinas en sectores de la subprovincia Argentina o Bonaerense.
Las fuentes de consulta bibliográfica para el actual estudio fueron los
trabajos de Blanco y col. (1994, 2000a, b, 2003), Cairns (1982, 1983), Pérez
(1999) y Riemann-Zurneck (1973, 1978, 1980, 1986).
RESULTADOS
La Corriente de Malvinas y zona de influencia.
El agua de la plataforma continental argentina es de origen subantartico y
la misma ingresa a la plataforma entre las Islas Malvinas y Tierra del Fuego,
modificada por el aporte de aguas diluidas del Estrecho de Magallanes (Piola
y Rivas, 1997). Las aguas del extremo norte de la Corriente Circumpolar
Antártica da origen a la Corriente de Malvinas, aunque debido al elevado
transporte de esta última, el impacto de la descarga continental no es
significativa y la salinidad de esta agua es en general del orden de 33,75 UPS
o superior. En la boca del Estrecho de Magallanes se observa un mínimo de
salinidad (S < 32,5 UPS) que se extiende hacia el NNE próximo a la costa
hasta 47°S, para luego separarse de ésta y ubicarse en la plataforma central.
187
El mínimo de salinidad (S <33,6 UPS) se detecta frente a Mar del Plata (38°S)
entre 140 y 180 km de la costa.
Entre Tierra del Fuego y las Islas Malvinas existen regiones relativamente
profundas y la circulación parece seguir los complejos contornos de la
batimetría. El flujo en regiones profundas y cerca del talud es relativamente
rápido comparado con el que se produce sobre la plataforma; la densidad de
esta agua es superior a la de la plataforma ubicada al norte y al oeste. Esta
masa de agua fluye hacia el sur de las Islas Malvinas para reencontrarse con el
flujo principal de la Corriente de Malvinas cerca de 53°S 56°W, mientras que
la influencia de esta agua sobre la plataforma continental es escasa.
En los golfos San Jorge, Nuevo, San José y San Matías se restringe el
intercambio con el mar abierto y las aguas resultan influenciadas por la fuerza
atmosférica; estas características del flujo atmosférico y la limitada renovación
de las aguas producen una amplitud térmica anual en los golfos que en el mar
abierto. Las aguas cálidas alcanzarían el litoral bonaerense (41°S) en octubre,
la península Valdés en enero y el golfo San Jorge en febrero; este flujo estaría
compuesto por aguas de origen subantártico y las aguas cálidas del sur del
litoral bonaerense estarían asociadas a intrusiones de la Corriente de Brasil.
Boltovskoy (1970 y 1981) sugiere que la presencia de aguas cálidas en el
litoral bonaerense se restringe al norte de los 40°S y que la misma se debe
principalmente al calentamiento estacional.
Las provincias zoogeográficas Argentina y Magallánica han sido
tradicionalmente reconocidas para este sector del Atlántico Sudoccidental, a
partir de información hidrográfica y biológica, de manera tal que la distribución
de especies se halla relacionada con la dinámica de la Corriente Circumpolar
Antártica y su prolongación en la conocida Corriente de Malvinas.
Los resultados de campañas oceanográficas a través de las asociaciones
bentónicas corroboran la clásica división zoogeográfica y sugieren la
posibilidad de subdividir el sector Atlántico de la provincia Magallánica en
dos distritos: uno interno asociado a la Corriente Patagónica (Brandhorst y
Castello, 1971) y otro externo relacionado a la Corriente de Malvinas (Bastida
y col., 1992 en Bastida y col., 2007). Según Bastida y col. (1992), estos distritos
podrían ser denominados Patagónico y Malvinense respectivamente.
188
Listado de las especies halladas
Subclase Leptothecatae
Abietinella operculata (Jaderholm, 1903)
Acryptolaria conferta (Allman, 1877)
Hebella striata Allman, 1888
Lafoea fruticosa (M. Sars, 1851)
Synthecium robustum Nuttin, 1904
Phialella chilensis (Hartlaub, 1905)
Amphisbetia operculata (Linnaeus, 1758)
Sertularella conica Allman, 1877
Sertularella gayi gayi (Lamouroux, 1821)
Sertularella robusta Coughtrey, 1876
Symplectoscyphus magellanicus (Marktanner-Turneretscher, 1890)
Symplectoscyphus subdichotomus (Kirchenpauer, 1884)
Symplectoscyphus filiformis (Allman, 1888)
Symplectoscyphus modestus (Hartlaub, 1900)
Orden Stylasterina
Sporadopora dichotoma (Moseley, 1876)
Errina echinata (Moseley, 1879)
Errina labiata (Moseley, 1879)
Errina lowei Cairns, 1983
Stylaster densicaulis Moseley, 1879
Orden Gorgonacea
Primnoella biserialis Wright y Studer, 1889
Primnoella compressa Kukenthal, 1908
Convexella magelhaenica (Studer, 1879)
Thouarella acanthina (Wright y Studer, 1889)
Thouarella antarctica Valenciennes, 1846
Orden Pennatulacea
Renilla reniformes (Pallas, 1766)
Orden Alcyonacea
Alcyonium paessleri May, 1899
Alcyonium patagonicum (May, 1899)
Orden Actiniaria
Actinostola crassicornis (Hertwig, 1882)
Bolocera tuediae subsp. occidua (McMurrich, 1893)
Hormathia pectinata (Hertwig, 1882)
Amphianthus aff. lacteus (McMurrich, 1893)
Isosicyonis alba (Studer, 1879)
Isotealia antarctica Carlgren, 1899
Antholoba achates Dana, 1849
Orden Scleractinia
Fungiacyathus marenzelleri (Vaughan, 1906)
Desmophyllum cristagalli Milne Edwards y Haime, 1848
Bathelia candida Moseley, 1881
Flabellum thouarsii Milne Edwards y Haime, 1849
Flabellum areum Cairns, 1982
Flabellum curvatum Moseley, 1881
Javania cailleti (Duchassaing y Michelotti, 1864)
189
190
Distribución latitudinal de cnidarios bentónicos de aguas frías.
Se han determinado 41 especies de cnidarios pertenecientes a los
siguientes taxa:
Leptothecatae:
Stylasterina:
Gorgonacea:
Pennatulacea:
Alcyonacea:
Actiniaria:
Scleractinia:
14 especies
5 especies
5 especies
1 especie
2 especies
7 especies
7 especies
La distribución de las mismas puede observarse en las Figs. 3-8.
Del análisis de las cartas de distribución pareciera indicar que en
general hay mayor concentración de especies en la subregión Patagónica
o Magallánica, especialmente para los taxa Leptothecatae, Stylasterina,
Actiniaria y Scleractinia.
Esta mayor concentración podría ser explicada zoogeograficamente como
que la subregión Patagónica podría ser considerada el centro de dispersión
de las especies estudiadas. A través de la Corriente Circumpolar Antártica
y su originaria Corriente de Malvinas, se distribuyen dichas especies a lo
largo de la plataforma continental hasta los 30°LS (Fig. 7) y 35° LS (Fig. 8)
respectivamente.
Asi como la subregión Patagónica es considerada centro de dispersión,
también constituye el genocentro del género Renilla (Pennatulacea)
(Zamponi, 2001) y de la especie Bolocera tuediae subs. occidua (Actiniaria)
(Riemann-Zurnek, 1980). Esta subespecie tiene su especie vicariante en
Bolocera tuediae subs tuediae de distribución en el océano Atlántico Norte.
Es posible que las características oceanográficas de la región sean
favorables para el desarrollo y poblamiento de especies que se hallan formadas
por un sistema esqueletal calcáreo y de espículas y/o escleritas. La formación
de estos tipos de esqueletos requieren de un habitat más o menos estable y lo
menos vulnerable posible.
La relación entre este tipo de ambiente y la formación de un sistema
esqueletal rígido es tratado en la sección siguiente del artículo.
Figura 3. Distribución de especies de Leptothecatae.
191
192
Figura 4. Distribución de especies de Stylasterina.
Figura 5. Distribución de especies de Gorgonacea.
193
194
Figura 6. Distribución de especies de Pennatulacea y Alcyonacea.
Figura 7. Distribución de especies de Actiniaria.
195
196
Figura 8. Distribución de especies de Scleractinia.
197
Estabilidad Ambiental y Formación Esqueletal
Los taxa mencionados merecen ser analizados desde una perspectiva
morfológica y ecológica, ya que, los mismos incluyen:
1. especies que carecen de un sistema esqueletal rígido.
2. especies con sistema esqueletal calcáreo. (Figs. 9 y 10)
3. especies con sistema esqueletal de espículas y/o escleritas. (Fig. 11)
El primer grupo pertenece a los taxa Leptothecatae y Actiniaria, mientras
que al segundo conjunto pertenece los órdenes Stylasterina y Scleractinia y al
último grupo son los Gorgonacea, Pennatulacea y Alcyonacea.
Aquellas especies con sistema esqueletal calcáreo y con sistema esqueletal
espicular requieren de un habitat generalmente estable y lo menos perturbable
posible, ya que los procesos de formación de esqueleto calcáreo como espicular
exigen de cierto equilibrio ambiental.
El proceso de calcificación es complejo y comienza en el extremo basal
del pólipo, donde la epidermis está constituida por un epitelio escamoso,
profundo y lateralmente interdigitado. El organismo captura los iones Ca+
del medio externo para depositarlo extracelularmente y formar los septos
y travéculas, mientras que los iones CO3= también tomados del exterior se
depositan en el interior del citoplasma celular. Si el ambiente es estable y en
equilibrio los iones Ca+ se depositan bajo la forma de aragonita, pero si el
ambiente presenta alteraciones producidas por causas diversas, se interrumpe
la deposición de Ca+ bajo la forma aragonita, y los mismos se disponen
irregularmente formando un esqueleto débil que se rompe o quiebra por la
acción de corrientes y olas, originando en el tiempo organismos débiles que
traerá como consecuencia la extinción de la especie.
En las especies con sistema esqueletal espicular, el proceso de formación
de las espículas es menos exigente que el de la calcificación, no obstante
también aquí se requiere de cierta estabilidad ambiental. Las espículas que
son intracelulares se originan a partir de células especiales denominadas
escleroblastos; éstas se sitúan en la base de las células ectodérmicas y pasan
a la mesogloea donde aumentan de volumen y el citoplasma se llena de
198
granulaciones calcáreas amorfas que se agrupan en una concreción central
que se van engrosando poco a poco hasta tener el tamaño de un núcleo. La
concreción central va adquiriendo forma irregular y el centro se separa en dos
mitades o núcleos mediante un eje protoplasmático. La espícula ahora está
formada y continúa la acumulación de calcita y poco a poco la cobertura de
protoplasma se estira y el esclerito termina totalmente recubierto de una capa
citoplasmática ligeramente más importante en la vecindad de los núcleos. Las
espículas se hallan formadas por dos componentes esenciales, uno orgánico
y el otro mineral, internamente relacionados entre ellos; en este complejo, el
elemento mineral está constituido por una mezcla de microcristales de calcita
asociados a una trama orgánica.
Los dos procesos son mecanismos lentos que toman tiempo de realización,
con lo cual se debe tratar que los ambientes donde se desarrollan estas
especies sean protegidos y tenidos en cuenta en las políticas ambientalistas,
para asegurar que dichas especies se perpetúen en el tiempo y constituyan
patrimonios faunísticos de alto valor biotecnológico.
Figura 9. Especies de Stylasterina con sistema esqueletal calcáreo.
1.Sporadopora dichotoma.(x 0.84); 2. Errina echinata. (x 0.38); 3. E. labiata. (x 0.90) 4.;
E. lowei. (x 1.84); 5. Stylaster densicaulis. (x 0.63). (según Cairns, 1983).
199
Figura10. Especies de Scleractinia con sistema esqueletal calcáreo.
1. Bathelia candida. (x 1.2); 2. Flabellum thouarsii. (x 24.9); 3. F. areum.(x 25.8); 4. F.
curvatum. (x 40.7); 5. Javania cailleti. (x 10.2); 6. Desmophyllum cristagalli. (x 66.4). (según
Cairns, 1982).
Figura 11. Especies de Alcyonacea, Gorgonacea y Pennatulacea con sistema esqueletal
de espículas y/o escleritas.
1. Alcyonium paessleri.( tamaño natural); 2. A. patagonicum. (tamaño natural); 3. Thouarella
acanthina. (tamaño natural); 4. Convexella magelhaenica (tamaño natural);. 5. Primnoella
biserialis. (tamaño natural); 6. P. compressa. (tamaño natural); 7. Renilla reniformes.
(tamaño natural).
200
CONCLUSION
Las zonas de alta productividad biológica están generalmente asociadas a
sistemas frontales, que en zonas someras con mareas de gran amplitud hace
que la fricción con el fondo genere frentes, que separan la región estratificada
más rica en nutrientes, de la verticalmente homogénea; en consecuencia
la existencia de sistemas frontales en las proximidades de la península de
Valdés, en el golfo San Jorge, a lo largo de casi toda la costa comprendida
entre 50°S y la Isla de los Estados, alrededor de las Islas Malvinas y el
Banco Burdwood, estaría explicando de la alta concentración de especies
de cnidarios hallados en dichas zonas que tendría relación directa con el rol
de organismos suspensivoros (filtradores y carnívoros) (Zamponi, 2006) que
tienen los cnidarios en los ecosistemas.
White y Petersen (1996) han demostrado que perturbaciones de la presión
atmosférica, el viento, la cobertura del hielo marino austral y la temperatura
superficial del océano se propagan con la Corriente Circumpolar Antártica y
afectaría la totalidad de la plataforma continental. Este conjunto de factores
influirían a lo largo del año, sobre la mayor o menor concentración de especies
lo cual hace suponer que aquellas especies que poseen un esqueleto rígido se
concentren en zonas donde los factores mencionados tengan una influencia
menor, para de esta manera el ambiente sea lo más propicio posible para el
asentamiento y desarrollo de la especie.
El asentamiento de las diferentes poblaciones también estaría favorecido
por los fondos duros, que son afloramientos de material litificado con diferente
grado de consolidación. Los afloramientos no ocupan más del 2% de la
superficie de la plataforma y se distribuyen dispersamente uniendo el borde
oriental de la subregión Argentina o Bonaerense con el extremo nororiental
de la subregión Patagónica o Magallánica. Dichos afloramientos constituyen
elevaciones sobre la plataforma ubicados a 85-100 m de profundidad; otros
afloramiento pero aislados se encuentran en la inmediaciones de Islas de los
Estados e Islas Malvinas.
Los afloramientos indicados y las corrientes oceánicas, tienen gran
influencia sobre las estrategias de alimentación de estos organismos
suspensivoros que favorecidos por los sistemas frontales crean zonas de
alta productividad. El resultado de estos fenómenos permite un movimiento
continuo de aguas profundas que puede contribuir al proceso de resuspensión,
201
que es esencial para el desarrollo y posterior asentamiento de comunidades
bentónicas como lo constituyen este grupo de cnidarios.
La conjunción de factores oceanográficos y topográficos sumados a la
riqueza de nutrientes y oxigenación de la Corriente de Malvinas, hace que la
mayor concentración de especies se establezca en la subregión Templada Fría
(= subregión Patagónica o Magallánica), ya que es la zona de influencia de esta
corriente. Dicha corriente al continuar su recorrido, sigue aportando riqueza
en nutrientes y abundante oxigenación constituyendo una vía de dispersión
para las especies, haciendo que muchas de ellas puedan distribuirse hasta
los límites norte de la subregión Templada Cálida (= subregión Argentina o
Bonaerense).
AGRADECIMIENTOS
El autor agradece a la Sra. Graciela Testa (CONICET) la asistencia técnica
en la compaginación del texto y las ilustraciones, sin la cual hubiese sido difícil
ordenar. El trabajo ha sido realizado a través del PIP n˚ 5071 (CONICET) y
EXA n˚ 362/06 (UNMdP).
202
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VIDA DA
REAL ACADEMIA GALEGA DE CIENCIAS
206
MEMORIA DAS ACTIVIDADES DA REAL ACADEMIA
GALEGA DE CIENCIAS
2008
INSTAURACIÓN
DÍA DO CIENTÍFICO GALEGO
O Presidente dá Real Academia Galega de Ciencias (RAGC), Profesor Ernesto Vieitez,
no último Pleno da RAGC do ano 2006, celebrado nas instalacións do Real Club do Mar de
Aguete, Pontevedra, propón a instauración dunha homenaxe de recoñecemento a aqueles
científicos que, ben nacidos en Galicia ou non, pero que realizasen a súa carreira científica en
Galicia, contribúan ao desenvolvemento do coñecemento e da innovación de maneira notable
e significativa. É dicir, propón a posibilidade de instaurar o Día do Científico Galego, como
recoñecemento e homenaxe a todas as persoalidades relevantes que traballaron no campo da
investigación científica. Entende que a sociedade galega está, dalgunha forma, en débeda
cos científicos que, directa ou indirectamente contribuíron de forma relevante ao progreso
da rexión.
Así como hai un día adicado ás letras galegas e a un escritor concreto, parece lóxico
pensar que o mesmo poida suceder con aquelas persoas que dedicaron, en Galicia, a súa vida
profesional ao engrandecimiento das ciencias experimentais.
O Pleno discute a iniciativa, que é acollida con gran satisfacción por todos os
Académicos, propoñéndose desde a denominación da xornada ata diseñar unha lista de
posibles candidatos.
O Pleno entende que, unha iniciativa desta envergadura, require unha planificación
moi seria e precisa, polo menos nos seus primeiros anos, a fin de que poida ir calando na
sociedade galega para que un día, esta poida asumir a celebración como algo propio. Non
se entende unha iniciativa desta índole sen o apoio incondicional do Goberno Autonómico,
autoridades académicas, autoridades provinciais e locais e incluso o sector industrial. La
RAGC toma a iniciativa no evento e ofrécese para desevolver esta andaina. Pero non pretende
ser o único actor patrimonial do evento xa que é consciente que a base do éxito da proposta
é a colaboración de todos os estamentos involucrados.
207
O primeiro que se pretende conseguir é dar a coñecer ás achegas científicas dos nomeados,
que avances na ciencia e na tecnoloxía achegaron e cales foron as repercusións dos seus
descubrimentos. Coa instauración do Día do Científico Galego preténdese, así mesmo,
sensibilizar aos poderes públicos sobre a necesidade de apoiar de forma continua e ao maior
nivel posible a investigación científica na rexión.
Poderase demostrar a través desta conmemoración que, ainda con poucos medios materiais,
insignes científicos galegos fixeron achegas importantísimas non só no ámbito rexional senón
tamén no nacional e internacional. A sociedade galega terá coñecemento dos logros dos seus
científicos máis renomeados e poderá chegar a comprender que o investimento que se faga
en ciencia dará uns froitos que beneficien a toda a sociedade. É evidente que, ao amparo dos
exemplos dos mellores científicos, aparecen cada vez máis vocacións en novos que algún día
poidan emular e superar, os éxitos dos seus predecesores.
Poden resumirse estes argumentos no feito de que o obxectivo final do Día do Científico
Galego está en sensibilizar aos poderes públicos e á sociedade galega en xeral da importancia
do apoio unánime á ciencia e á tecnoloxía, base para o desenvolvemento dunha sociedade
avanzada e libre.
Dende o primeiro momento que se expuso a iniciativa no Pleno do 6 de Xullo de 2006,
tívose claro que a data idónea era a do 23 de Abril, día na que se publicou no BOE a constitución
oficial da RAGC (23 Abril 1977).
Houbo coincidencia no Pleno da RAGC da existencia de investigadores ilustres que
poderían formar a lista de candidatos: desde o Padre Sarmiento e Isidro Parga Pondal ata
Cruz Gallástegui ou Luis Iglesias. Con todo, pronto xurdiu o nome de D. Enrique Vidal
Abascal como o candidato máis firme para ser considerado como o primeiro homenaxeado.
Coinciden en D. Enrique Vidal dous feitos incuestionables, ademais dos seus propios méritos
científicos: cumprirse en 2008 o centenario do seu nacemento (12 de Outubro de 1908), e ser
un dos fundadores e primeiro Presidente da Real Academia Galega de Ciencias.
Ernesto Viéitez Cortizo
Presidente
208
Prof. Dr. Enrique Vidal Abascal con orbígrafo deseñado por él para o cálculo de órbitas planetarias.
ENRIQUE VIDAL ABASCAL: O FACTOR HUMANO E A
INTELIXENCIA COLECTIVA.
SEMBLANZA, por Félix Vidal Costa
Excelentísima Sra. Conselleira de Educación e Señor Director Xeral, Excelentísimo
Señor Presidente da Academia Galega de Ciencias e membros da Academia, Excelentísimo
Sr. Presidente do Consello da Cultura Galega, Magnífico Señor Reitor da Universidade
de Santiago, Magnífico Señor Reitor da Universidade da Coruña, Excelentísimo Señor
ex-Presidente da Xunta de Galicia, Ilustrísimos Señores Decanos, en particular da Facultade
de Matemáticas da Universidade de Santiago, Señor Director do Observatorio Astronómico
da Universidade de Santiago, Ilustrísimo Señor Alcalde de Lalín, Señora representante da
Alcaldía de Santiago de Compostela, outras autoridades e representantes doutras Institucións,
benqueridos familiares e amigos, miñas donas, meus señores.
Permítanme que, en primeiro lugar, exprese ao Señor Presidente da Academia Galega de
Ciencias e aos meus colegas académicos a nosa máis profunda gratitude, a miña e a dos meus
familiares, por decidir dedicar a Primeira Edición do Día do Científico Galego ao noso pai,
Enrique Vidal Abascal. También quisiera decir ya ahora el gran honor y satisfacción que es
209
para nosotros contar con la compañía de todos ustedes en este acto, muy especialmente con la
compañía de nuestra querida amiga la profesora Doña Antonia Ferrín Moreiras, que fue una
estrecha colaboradora de nuestro padre antes y durante el periodo de gestación de la Sección
de Matemáticas de la Universidad de Santiago, de cuya creación se celebra precisamente este
año su cincuentenario.
Mis colegas académicos me han hecho un gran honor al pedirme que haga en este acto
una semblanza de mi padre. Pero al mismo tiempo me han puesto en una delicada situación,
precisamente por la proximidad afectiva, que podría incidir en la siempre necesaria objetividad
de cualquier acto académico. Sin embargo, fueron sensibles a mis aprensiones y aceptaron
que mi intervención fuese corta, y que estuviese esencialmente centrada en lo que podríamos
denominar “el factor humano” de sus actividades científicas. Así pues, no comentaré nada sobre
sus contribuciones personales en varios aspectos de la Astronomía primero y de la Geometría
Diferencial después, aspectos que abordarán posteriormente en este acto, naturalmente con
mucha más autoridad que yo, dos de sus más brillantes discípulos, los profesores Luís Cordero
y Manuel de León. Otros aspectos acaban de ser evocados, con mucho afecto y pertinencia,
por la Señora Conselleira de Educación, la profesora Laura Sánchez Piñón.
La familia de mi padre tenía una larga tradición de servidores del Estado: su padre fue,
en los años 20 del siglo pasado, Director General de Hacienda siendo ministro Don José Calvo
Sotelo, y fue posteriormente Presidente del Consejo de Cuentas del Estado. Pero antes había
estado en la Delegación de Hacienda de Oviedo, lo que explica el lugar de nacimiento de mi
padre, y había sido Delegado de Hacienda en Ourense y posteriormente en A Coruña, lo que
a su vez explica que una parte de los estudios de bachillerato de mi padre los realizase en
esa última ciudad. Su abuelo y bisabuelo paternos habían sido jueces en Galicia. Su abuelo
materno, de Cantabria, fue también juez y magistrado.
Esta larga tradición familiar de servidores de lo público influyó probablemente para que
mi padre se decantase por ser profesor de matemáticas en vez de arquitecto, como dudaba
al empezar a estudiar “Ciencias Exactas” en Madrid (los dos primeros años de esa carrera
siendo muy comunes a las dos opciones, y el dibujo y la pintura siendo su otra gran vocación).
Fue su bisabuelo paterno el que hizo construir a principios del siglo XIX la que mi familia
llamaba “la casa de Lalín”, que colindaría con la que posteriormente construiría la familia
Aller. Esa cercanía sería uno de los orígenes de la gran amistad entre las dos familias, en
particular la de mi abuelo primero y después la de mi padre con el gran astrónomo Don
Ramón María Aller Ulloa, amistad que tendría tan profundas consecuencias en la vocación
por las matemáticas de mi padre y en una buena parte de su vida profesional. Además de
santiagués, mi padre siempre se sintió lalinense: Fue allí donde se inscribiría en su juventud
en el Partido Galleguista, y más tarde sería nombrado hijo adoptivo de Lalín, en 1984, siendo
su alcalde Don José Cuiña Crespo.
También se sintió, desde su regreso a Santiago de Compostela en 1941, ya como
Catedrático de Instituto y profesor de la Universidad, fuertemente comprometido con esa
ciudad y con su Universidad, compromisos que serían ampliamente reconocidos siendo, en
1995, descubierta por el alcalde Gerardo Estévez una placa conmemorativa en su casa de la
210
calle de la Rosa. Unos meses más tarde, el Ayuntamiento de Santiago puso su nombre a una
calle de la ciudad. Ese mismo año se celebró en la Universidad de Santiago de Compostela
un solemne “Acto Académico In Memoriam do Profesor Enrique Vidal Abascal”, en el cual
hicieron sendas semblanzas, con gran afecto y conocimiento de causa, los Profesores D. Xosé
Masa Vázquez, del Departamento de Geometría y Topología de la Universidad de Santiago,
D. Andres Lichnerowicz, del College de France y el entonces Rector de la Universidad de
Santiago, Profesor D. Darío Villanueva Prieto.
Dos documentos esenciales para entender su profundo compromiso con Galicia son su
Discurso de Ingreso en la Real Academia Galega das Letras, en 1971, y el Discurso Inaugural,
leído en la Solemne Apertura del Curso Académico 1973-74 de la Universidad de Santiago
de Compostela, compromiso que sería reconocido por la concesión de la Medalla Castelao de
1989 (creo que entonces se concedía una sola medalla anual), siendo Presidente de la Xunta de
Galicia Don Gerardo Fernández Albor, “a toda unha vida dedicada a Galicia”. Anteriormente
había sido nombrado, en 1974, “Officier dans l’Ordre des Palmes Académiques” por el
Gobierno Francés, en reconocimiento de su compromiso con la cultura y la ciencia de ese
país. Esos compromisos han tenido una gran influencia en sus planteamientos y actividades
científicas. Como ya he indicado antes, tales actividades así como las numerosas distinciones y
premios que le fueron concedidos por ellas, serán evocadas posteriormente por los Profesores
Cordero y de León.
Otra experiencia sin duda decisiva para la formación intelectual de mi padre fue su
estancia en Ginebra en su juventud, en el año 1934, en el Instituto de Investigación que
dirigía Jean Piaget, que en aquel momento era el más importante e influyente estudioso
de la fenomenología del aprendizaje. Pienso que esa experiencia suiza, que años más tarde
complementaría con su estancia en Lausanne, en el Departamento del celebre matemático
George de Rahm, contribuyó a conformar dos de los rasgos esenciales de su personalidad
como profesor y como matemático: El primero, de carácter pedagógico, se puede resumir
diciendo que tanto en sus clases y seminarios como en sus libros y publicaciones, siempre
se proponía explicar con claridad y sencillez incluso las ideas y los resultados matemáticos
más complejos: Siempre insistía en que ser ininteligible no es sinónimo, ni mucho menos,
de ser profundo.
Otro aspecto de su personalidad científica en el que también influyeron sus tempranas
experiencias suizas, y que creo que es crucial para entender una buena parte de sus
planteamientos profesionales, es el que él mismo denominó “inteligencia colectiva”. Para
aclarar a lo que se refería, me voy a permitir reproducir un párrafo de la semblanza que en el
año 1962 le solicitó la Revista Matemática Hispano Americana sobre el matemático español
Julio Rey Pastor, fallecido ese mismo año. Pero antes decir brevemente que Rey Pastor ha
sido sin duda el más influyente matemático español de la primera mitad del siglo XX, cuyas
inteligencia y brillantez mi padre las comparaba a las de Don José Ortega y Gasset. Pero
como el mismo Rey Pastor reconocería en su discurso de entrada en la Academia de Ciencias
de Madrid en 1956, gran parte de sus trabajos (los de Rey Pastor) y de los de sus discípulos
estaban, decía literalmente Don Julio, “fuera de cauce”.
211
Pues bien, en su semblanza de Rey Pastor mi padre escribía: “Ese fuera de cauce, hay
que decirlo con dura sinceridad para hacer honor al legado del egregio maestro, desfasó a la
matemática española por otros cincuenta años. Todavía pesan hoy (les recuerdo que mi padre
está escribiendo eso en el año 1962) como un farragoso lastre en algunos de nuestros más
significados matemáticos esos años, aún recientes, durante los que una de las asignaturas más
importantes de la carrera era la Geometría descriptiva, y los métodos gráficos y sintéticos eran
estudiados en España con el ardor que nuestros antepasados ponían, por ejemplo, en atravesar
los Andes. No es pues ánimo ni deseo lo que nos falta, ni siquiera inteligencia individual, ni
insignes maestros, pero sí, en cambio, eso que pudiéramos denominar “inteligencia colectiva”,
que acierte a ponernos en la ruta fecunda y a la que solo se llega por un meditado plan discutido
conjuntamente. Para las empresas de uno solo basta con que uno acierte. Para las empresas
colectivas es preciso buscar la manera de sumar los saberes y las voluntades. En la labor
científica, como en muchas otras labores, se aplica la bien conocida regla, la recordaba Jean
Cocteau hace poco en un congreso en Niza, que dice que uno y uno son once”.
La promoción en Galicia de la “inteligencia colectiva” fue sin duda la principal motivación
profesional de mi padre, mucho mayor que cualquier ambición científica de carácter personal.
Este planteamiento fue el que motivó sus afanes para conseguir que se reconociese en España
y en la propia Universidad de Santiago la enorme valía de su maestro, el gran astrónomo Don
Ramón María Aller Ulloa y para que se le construyese en el campus de nuestra Universidad
un modesto observatorio astronómico.
Fue también ese planteamiento el que le llevó a promover primero, y a conseguir después
poner en marcha, a partir de octubre de 1957, la Sección de Matemáticas de la Universidad
de Santiago, arranque para el que contó en ese primer curso crucial con la ayuda del propio
Don Ramón Aller (que ya tenía entonces 79 años, pero al ser Catedrático Extraordinario no
se jubilaba…) y con la de la profesora Antonia Ferrín. Esa Sección de Matemáticas, a la que
se incorporarían años más tarde otros profesores, era la cuarta creada en España, después
de las ya tradicionales de Madrid, Barcelona y Zaragoza.
Es evidente que incluso sin ese afán de mi padre por promover la “inteligencia colectiva”
en Galicia, se habría terminado por crear una Facultad de Matemáticas en la Universidad de
Santiago. Pero en ese caso, este año probablemente se estaría celebrando el 25 aniversario
de su creación, como ha sido recientemente el caso de la Facultad de Física, en vez del 50
aniversario. Y Galicia, con la que mi padre se sentía tan comprometido, se quedaría una vez
más en el furgón de cola. Como solía decir el gran físico Niels Bohr, “es muy difícil hacer
predicciones, sobre todo del futuro”, pero quizás sin ese adelanto de 25 años, de una generación,
hoy no se hablaría de hacer en Santiago una de las sedes, incluso la principal, del Centro
Estatal de Matemáticas. Además, se trataba de la primera creación, desde hacía muchos años,
de una nueva Sección (antecedente de una nueva Facultad) en la Universidad de Santiago, y
su incidencia en algunos planteamientos “conceptuales” del conjunto de la Universidad fue
probablemente apreciable.
En cualquier caso, y esto ya no es una especulación, una vez creada la Sección de
Matemáticas, y siguiendo con su afán de promover la “inteligencia colectiva”, mi padre impulsó
212
una potente, y en aquel entonces pionera, política de relaciones con los más importantes
centros internacionales de matemáticas, logrando que visitasen Santiago no pocos de los más
prestigiosos matemáticos de aquellos años, enviando a sus discípulos a hacer largas estancias
en los mejores Institutos de Investigación y en las mejores Universidades, y organizando, en
1963, lo que sería el primer Congreso Internacional de Matemáticas celebrado en España.
Todo ello, y algo más (un importante “algo más”), hizo que la Sección de Matemáticas
de la Universidad de Santiago en general, y el Departamento de Geometría y Topología muy
en particular, fuese uno de los protagonistas de lo que, por contraste con el “fuera de cauce”
que denunciaba en 1956 Don Julio Rey Pastor, podríamos denominar el “encauzamiento” de
la matemática española, a partir de los años 60 y 70 de siglo pasado. Y ese “algo más” es en
realidad otro crucial “factor humano”, en palabras de mi padre “la inteligencia, la vocación
y el esfuerzo del grupo de jóvenes licenciados (ahora ya no tan jóvenes...., este comentario es
mio) que hicieron sus tesis de doctorado en Matemáticas en Santiago durante aquellos años”. El
éxito de la joven Sección de Matemáticas, y especialmente el éxito de sus discípulos era para
mi padre la mejor constatación de su acierto como “sembrador de inteligencia colectiva” y la
mejor recompensa a sus esfuerzos. En su último artículo periodístico, escrito a los 85 años,
todavía decía, con la generosidad del verdadero maestro, “e un orgullo pra min verme superado
polos que foron meus discípulos. Ese é o mais grande honor para un profesor”.
Sei que me estou alongando máis aló do tempo que eu mesmo me impuxera, pero non
quixese rematar esta semblanza sen referirme brevemente á propia Real Academia Galega
de Ciencias, organizadora deste acto, a pesar de que xa o fixo con moita máis autoridade o
seu Presidente, o Profesor Ernesto Viéitez. Non me resisto a nomear ás seis persoas, naquel
entón todos membros da Real Academia Galega das Letras, que o 26 de xaneiro de 1973
presentaron a solicitude de constitución da Academia Galega de Ciencias a o Ministerio de
Educación e Ciencia. A copia da solicitude deuma, así como unha boa parte dos documentos
que consultei para preparar esta semblanza, o meu irmán Enrique. Citándoos na mesma
orde coa que as súas sinaturas aparecen no documento de solicitude, eran: Enrique Vidal
Abascal, Isidro Parga Pondal, Luis Iglesias Iglesias, Domingo García Sabel, Antonio Fraguas
y Fraguas e Eugenio Torre Enciso. Creo que a motivación central do meu pai para promover
e participar, de xeito particularmente activo, nesa aventura intelectual era, unha vez máis,
a promoción da “intelixencia colectiva” en Galicia. Esta vez mediante a creación dunha
institución que xa existía noutras partes de España (nesos anos a Academia de Ciencias de
Madrid era, como decía con certa ironía meu pai, “casi municipal”), que complementaba a
outras institucións científicas galegas, moi especialmente a Universidade. Como cada vez que
recibía algunha distinción, seguramente o meu pai hoxe tamén diría “sentirse abrumado” pola
vosa xenerosa decisión, benqueridos Presidente e colegas académicos, de que lle dedicaseis
a primeira edición do “Día do Científico Galego”. E tamén se sentiría orgulloso, benquerido
Presidente, da evolución desta Academia e estaría esperanzado de que entre todos, académicos,
institucións de tutela, Universidades e centros de investigación, seremos capaces de facela
aínda máis útil para o progreso de Galicia, para o cal será cada vez máis crucial o progreso
da “intelixencia colectiva” galega.
213
Y termino con una cita que pretende resumir otros aspectos de la personalidad de mi
padre, y no solo de su “factor humano” profesional, aspectos que obviamente no he podido
evocar aquí. La cita es del Narciss y Goldmund de Hermann Hesse y dice: “¡Crear sin tener que
pagar por ello el precio de vivir! ¡Vivir sin tener que renunciar a la nobleza de crear!” Pienso
que mi padre fue en buena medida capaz, sin duda gracias a la ayuda de nuestra madre y casi
siempre disfrutando con todas las tareas que se proponía, de vivir y de crear, de ser realista
pero al mismo tiempo pionero y visionario, de ser buena persona y luchador por la libertad y
contra la injusticia y el sufrimiento humano, y de estar comprometido con su familia, con sus
amigos, con sus alumnos y discípulos, con su Universidad y con su país. Y por todo ello, y
quizás ese ha sido su mayor éxito, fue muy querido, como lo pone en evidencia la concesión
de tan apreciada distinción y la presencia de todos ustedes en este acto.
Moitas grazas
Santiago de Compostela, 23 de Abril de 2008,
Día do Científico Galego e
31 Aniversario da Creación da Real Academia Galega de Ciencias.
214
Presidencia do Día do Científico Galego;, o Prof. Dr. Senén Barro Ameneiro, Reitor da USC, Dona
Laura Sánchez Piñón, Conselleira de Educación e Ordenación Universitaria o Prof. Dr. Ernesto Viéitez
Cortizo, Presidente da RAGC, o Prof. Dr. Ramón Villares Paz, Presidente do Consello da Cultura Galega
e o Prof. D. José María Barja Pérez, Reitor da UDC.
DÍA DO CIENTÍFICO GALEGO, 2008
No ano 2008, instaurose o Día do Científico Galego. Con esta celebración preténdese
facer unha homenaxe de recoñecemento a aqueles científicos que, bien nados en Galicia ou
non, desenrrolaron a súa carreira científica en Galicia, e que contribuíron ao desenvolvemento
do coñecemento e da innovación de maneira notable e significativa.
Na súa primeira edición contouse coa presencia da Excma. Sra. Dña. Laura Sánchez
Piñón, Conselleira de Educación e Ordenación Universitaria, co Presidente do Consello da
Cultura Galega, Excmo. Sr. D. Ramón Villares Paz, e cos reitores das Univeresidades de
Santiago de Compostela e da Coruña, os Magfcos. Sres., D. Senén Barro Ameneiro e D. José
María Barja Pérez, así como con numerosas personalidades.
Adicado na súa primeira edición ao Prof. Dr. Enrique Vidal Abascal, con motivo do
centenario do seu nacemento. A celebración contóu coas seguintes intervencións:
-- Apertura do acto por parte do Prof. Dr. Ernesto Viéitez Cortizo, Presidente da
Real Academia Galega de Ciencias.
-- Intervención da Conselleira de Educación e Ordenación Universitaria, a Excma.
Sra. Dona Laura Sánchez Piñón.
215
-- Semblanza da familia, a cargo dun fillo do homenaxeado, e Membro de Número
da Real Academia Galega de Ciencia, o Profesor Dr. Félix Vidal Costa, co
título:“Enrique Vidal Abascal: o factor humano”.
-- Conferencia do Prof. Dr. Manuel de León Rodríguez, ex-alumno do homenaxeado e
Profesor de Investigación del Instituto de Matemáticas y Física Fundamental, CSIC
en Madrid, baixo o título:“Enrique Vidal Abascal, el sembrador de geometría”.
-- Conferencia do Profesor Dr. Luís A. Cordero Rego, ex-alumno do homenaxeado,
Catedrático de Xeometría e Topoloxía da Universidade de Santiago de Compostela
e Membro de Número da Real Academia Galega de Ciencias, co titulo:“Enrique
Vidal Abascal, o meu mestre”.
216
Presidencia da Apertura do Curso 2008.O CN. D. José Luís Urcelay Verdugo o Prof. Dr. Ernesto Viéitez
Cortizo, o Prof. Dr. Franco Fernández González e o Prof. Inv. Dr. Antonio Ballester Álvarez-Pardiñas.
APERTURA DO CURSO ACADÉMICO
No mes de febreiro tivo lugar a apertura do curso do ano 2008. A lección maxistral correu
a cargo do Prof. Dr. Tito A. Varela López, baixo o título “ADN móbil e secuencias Alu”
CONVENIOS
Este ano a Academia asinou os seguintes convenios de colaboración:
•• Coa Excma. Deputación Provincial Da Coruña, para o desenvolvemento dos XI
Avances en Ciencia e Tecnoloxía.
•• Coa Fundación Pedro Barrié de la Maza a Real Academia asinou un convenio de
colaboración destinado a publicacións.
•• Coa Fundación CaixaGalicia asinouse un convenio de colaboración para os
Premios de Investigación desta Real Academia, ós que concorren un gran
número de investigadores tanto na modalidade de Traballo de Investigación
coma na modalidade de Novos Investigadores, dotados con 15.000 e 9.000 euros
respectivamente, e para o Premio a un Traballo publicado (o en vías de publicación)
na Revista da Real Academia Galega de Ciencias, dotado con 3.000 euros.
•• Coa Consellería de Cultura e Deporte, en relación coa organización das XVII
Xornadas Luso – Galaicas de Ciencias e Desenvolvemento.
217
•• Coa Excma. Deputación de Lugo para a celebración do Curso de Conferencias de
Impactos Ambientais.
•• Co Colexio Oficial de Farmacéuticos da Provincia de Pontevedra para á
organización do ciclo de Conferencias Maxistrais sobre Avances en Ciencias
Farmacéuticas.
PUBLICACIÓNS
No ano 2008 a Real Academia Galega de Ciencias editou a Revista, financiada por
entidades públicas e privadas.
•• Publicouse o volume XXVI da Revista da Real Academia Galega de Ciencias, na
que se recollen traballos científicos dun amplo espectro de temas.
•• Xunto coa Revista, publicou o Volume XXVIa, volume especial adicado ao XXV
Aniversario da fundación da Facultade de Físicas da Universidade de Santiago de
Compostela.
218
CURSOS DE CONFERENCIAS
A Real Academia celebrou os seguintes cursos de conferencias:
XVII XORNADAS LUSO-GALAICAS DE CIENCIAS E
DESENVOLVEMENTO
A Real Academia ven celebrando ininterrompidamente dende 1990 ás Xornadas
Luso-Galaicas de Ciencias e Desenvolvemento, nas que se tratan moi diversos temas de
actualidade.
Celebradas os días 21, 22 e 23 de Outubro, no Salón de Actos do Pazo de San Roque,
en Santiago de Compostela, nestas xornadas contaron coa participación dos seguintes
conferenciantes:
Día 21 de outubro
•• Magfco e Excmo. Prof. Dr. Senén Barro Ameneiro. Reitor da Universidade
de Santiago de Compostela
“A responsabilidade social nas Universidades”
•• Prof. Dr. Nuno Filipe da Cruz Batista Mateus. Profesor do Dpto. de Química
da Facultade de Ciências da Universidade do Porto
“A química dos sabores do vinho”
•• Profa. Dra. Ilda da Conceiçâo Abreu de Noronha. Doutora do Departamento
de Botânica na Facultade de Ciencias da Universidade do Porto
“O pólen de milho transgénico. Implicaçao no desequilibrio ecológico das
colmeias”
Día 22 de outubro
•• Prof. Dr. Alexandre Lobo da Cunha. Profesor de Ciencias do Meio Aquático
da Universidade do Porto
“O peroxissoma: a investigaçao sobre um organelo celular”
•• Prof. Dr. Helder M. Crespo. Profesor do Dpto. de Física da Universidade
do Porto
“Lasers ultra-curtos estabilizados em fase absoluta: A luz controlada”
•• Prof. Dr. Félix Vidal Costa. Catedrático do Dpto. de Física da Materia
Condensada da Universidade de Santiago de Compostela. Membro de número
da Real Academia Galega de Ciencias
“Nanocousas versus cousas pequenas: algúns exemplos con superconductores”
Día 23 de outubro
•• Prof. Dr. Vicente Pérez Villar. Catedrático do Dpto. de Física da Materia
Condensada da Universidade de Santiago de Compostela. Membro de número
da Real Academia Galega de Ciencias
“Circulación abisal y cambio climático”
219
•• Clausura
Prof. Dr. Ramón Villares Paz. Presidente do Consello da Cultura
“A Primeira República Portuguesa e a súa influencia en Galicia”
Nestas Xornadas contouse coa participación de un centenar de asistentes, maioritariamente
universitarios, que seguiron atentamente ás exposicións dos conferenciantes, rematando con
pequenos debates e preguntas.
XI AVANCES EN CIENCIA E TECNOLOXÍA BIOCOMBUSTIBLES:
PRODUCION, USO E IMPACTO
Celebrados nos días 3, 4, 5, 6, 10, 11 e 12 do mes de novembro no Salón de Actos
no Pazo de San Roque, en Santiago de Compostela, coa participación dos seguintes
conferenciantes:
Día 3 de novembro
•• Prof. Dr. Miguel Ángel Ríos Fernández. Catedrático de Química Física.
Profesor Emérito da Universidade de Santiago de Compostela. Académico
Numerario da Real Academia Galega de Ciencias
“A encrucillada enerxética. Un reto para a ciencia e a innovación tecnolóxica”
Día 4 de novembro
•• Dr. Luis Ortiz Torres. Catedrático de Enxeñería Agroforestal da Universidade
de Vigo. Director da Escola Universitaria de Enxeñería Técnica Forestal
da Universidade de Vigo
“O impacto dos biocombustibles sólidos: Un reto e unha oportunidade histórica
para Galicia”
Día 5 de novembro
•• D. Juan José Losada López. Jefe de Seguridad Industrial de Bioetanol
Galicia, S.A.
“Presente e futuro da produción de Bioetanol. Estratexia do Grupo Abengoa”
Día 6 de novembro
•• Prof. Dr. Juan M. Lema Rodicio. Catedrático de Enxeñería Química da
Universidade de Santiago de Compostela. Director da Escola Técnica Superior
de Enxeñería da Universidade de Santiago de Compostela
“Oportunidades e retos da codixestión anaerobia de residuos agroindustriais”
Día 10 de novembro
•• Dr. Gregorio Antolín Giraldo. Director da División Químico-Alimentaria e
da Área de Biocombustibles da Fundación CARTIF
“Revalorización de biomasa residual mediante procesos integrados de gasificación
e extracción de compoñentes de alto valor agregado”
220
Día 11 de novembro
•• Dr. Manuel Bao Iglesias. Catedrático de Enxeñería Química da Universidade
de Santiago de Compostela e Académico Numerario da Real Academia Galega
de Ciencias
“Procesos productivos del Biodiesel: Presente e Futuro”
Día 12 de novembro
•• Clausura
D. Salustiano Mato de la Iglesia. Director Xeral de Investigación,
Desenvolvemento e Innovación da Xunta de Galicia
“A aposta galega en biocombustibles”
Este ciclo de conferencias ven celebrándose dende 1998, baixo o patrocinio da Deputación
Provincial Da Coruña. Nesta nova edición o interés surxido por estas conferencias levou a
que o aforo completárase ao cabo de dous días do inicio da fecha de inscripción.
XI Avances en Ciencia e Tecnología. O Excmo. Prof. Dr. Ernesto Viéitez Cortizo,
Presidente da RAGC, acompañado de D. Salustiano Mato de la Iglesia, Director
Xeral de I+D+i da Xunta de Galicia e do Prof. Dr. Tito A. Varela López, Membro
Numerario da RAGC, durante a conferencia que impartiu o Director Xeral.
221
CURSO DE CONFERENCIAS DE IMPACTOS AMBIENTAIS:
ENERXÍAS ALTERNATIVAS
Este ciclo de conferencias celebrouse os días 3, 4, 5, 10, 11, 12 e 13 de novembro
no Salón de Actos da Excma. Deputación Provincial de Lugo, participando os seguintes
conferenciantes:
Día 3 de novembro
•• D. Juan Casares Long. Catedrático de Enxeñería Química da universidade de
Santiago de Compostela
“A enerxía na sociedade tecnolóxica: cara un novo equilibrio”
Día 4 de novembro
•• D. Francisco Dans del Valle. Director da Asociación Forestal de Galicia
“Transformación da biomasa en enerxía térmica e eléctrica: experiencias
galegas”
Día 5 de novembro
•• D. Antonio Rigueiro Rodríguez. Catedrático do Departamentode Producción
Vexetal da Universidade de Santiago de Compostela. Membro de Número da
Real Academia Galega de Ciencias
“Residuos e cultivos agroforestáis para produción enerxética”
Día 10 de novembro
•• D. Manuel Bao Iglesias. Catedrático do Departamento de Enxeñería Química
da Universidade de Santiago de Compostela. Membro de Número da Real
Academia Galega de Ciencias
“Biocombustibles”
Día 11 de novembro
•• D. Ramón Velo Sabín . Profesor Titular do Departamento de Enxeñería
Agroforestal da Universidade de Santiago de Compostela
“Enerxía solar en Galicia”
Día 12 de novembro
•• D. J. Gregorio Iglesias Rodríguez . Profesor do Departamento de Enxeñería
Agroforestal da Universidade de Santiago de Compostela
“Enerxía mareomotriz en Galicia”
Día 13 de novembro
•• Clausura
Xerente de SOTAVENTO, S.A.
“Sotavento, centro de referencia en Galicia en investigación e divulgación en
Enerxías Renovables”
O ciclo de conferencias contou coa participación de máis de un centenar de asistentes,
aumentando así o número de inscriciones de anos pasados.
222
CICLO DE CONFERENCIAS MAGISTRALES SOBRE AVANCES
EN CIENCIAS FARMACÉUTICAS
A Real Academia reanudou o Ciclo de Avances en Ciencias Farmacéuticas que
viña organizando conxuntamente co Colexio Oficial de Farmacéuticos da Provincia de
Pontevedra.
Celebráronse en Vigo os días 16 de xuño e 13, 16 e 30 outubro no Salón de Actos do
Colexio Oficial de Farmacéuticos, e contaron coa participación dos seguintes conferenciantes:
Día 16 de xuño
•• Dr. Antonio Fontdevila Vivanco. Catedrático de Xenética. Universidade
Autónoma de Barcelona
“Medicina evolutiva: un enfoque darvinista da enfermidade”
Día 13 de outubro
•• D. Santiago Cuellar Rodríguez. Director do Dpto. Técnico do Consello Xeral
de Colexios Oficiais de Farmacéuticos
“Innovación científica dos novos medicamentos registrados en España”
Día 16 de outubro
•• Dr. Mª Isabel Loza García. Profa. Titular do Dpto. de Farmacoloxía.
Universidade de Santiago de Compostela
“Farmacoxenética e mellores resultados da farmacoterapia”
Día 30 de outubro
•• Dr. Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Catedrático de Farmacia. Universidade de
Salamanca. Xefe de Servicio de Farmacia. Hospital Clínico de Salamanca
“¿Son os medicamentos costo-efectivos?”
PREMIOS DE INVESTIGACIÓN, ANO 2007
No ano 2007, o Tribunal otorgou os seguintes premios:
Premio na modalidade de Traballos de Investigación, dotado con 15.000€:
Título: “Determinación de metales en algas marinas destinadas a la alimentación
humana producidas y procesadas en Galicia: desarrollo de metodología analítica
automática.”
Autor: Dona María del Carmen Yebra Biurrun. Universidade de Santiago de
Compostela.
Premio Promoción de Novos Investigadores menores de 28 anos, dotado con
9.000€:
Título: “Evaluación del efecto de la selenometionina sobre la reparación del
daño en el ADN”
Autor: Dona Vanessa Valdiglesias García. Universidade da Coruña
223
Premio a un Traballo publicado (o en vías de publicación) na Revista da Real
Academia Galega de Ciencias, dotado con 3.000€:
Titulo: “Respuesta de plantas de álamo a elevadas concentraciones de
plomo”
Autores: Don José Luís Couselo Bandín. Instituto de Investigacións Agrobiolóxicas
de Galicia, CSIC.
Premios de Investigación 2007. Membros da Real Academia Galega de Ciencias
e da Fundación Caixa Galicia, cos premiados.
224
COMPOSICIÓN DA REAL ACADEMIA
XUNTA DE GOBERNO
Ernesto Viéitez Cortizo, Presidente
Luis Asorey García, Vicepresidente
Antonio Ballester Álvarez-Pardiñas, Secretario
Tito A. Varela López, Tesorero
Francisco Río Barja, Bibliotecario
Presidentes das Seccións
SECCIÓNS
MATEMÁTICAS, FÍSICA E FÍSICA DO COSMOS
Luis Cordero Rego, Gerardo Rodríguez López, Félix Vidal Costa, Vicente Pérez-Villar.
QUÍMICA E XEOLOXÍA
Fernando Fraga Rodríguez, Francisco Guitián Ojea, Manuel Bao Iglesias, Franco Fernández
González, Miguel Angel Ríos Fernández, Antonio Ballester Álvarez-Pardiñas.
FARMACIA E BIOLOXÍA
Manuel Pereiro Miguens, Ernesto Viéitez Cortizo, Jesús Méndez Sánchez, Rafael Tojo
Sierra, Luis Asorey García
CIENCIAS TÉCNICAS
Odón Abad Flores, Valeriano Yepes Hernández de Madrid, Ramón de Vicente Vázquez,
Antonio Rigueiro Rodríguez.
CIENCIAS SOCIAIS E ECONÓMICAS
Luis Suárez-Llanos Gómez, Juan Quintáns Seoane, Xosé Manuel Beiras Torrado,
Francisco Río Barja, Tito A. Varela López.
CONSELLO DE PUBLICACIÓNS
Ernesto Viéitez Cortizo, Presidente
Antonio Ballester Álvarez-Pardiñas, Secretario
Francisco Río Barja, Bibliotecario
Luis Cordero Rego, Vocal
ACADÉMICOS NUMERARIOS
Dr. Ing. D. Odón Abad Flores
Cantalarrana, Ctra. de Samoedo, s/n. 15160 SADA (A Coruña)
Dr. D. Luis Asorey García
Plaza do Ferrol, 6-10 - 3º - 27001 LUGO
Prof. Dr. D. Manuel Bao Iglesias
Avda. de las Ciencias, 4A - 1ºD - 15706 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. José Manuel Beiras Torrado
Plaza de Mazarelos, 1 - 15703 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Luis Cordero Rego
República del Salvador, 19 - 1ºA - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Excmo. Prof. Dr. D. Ramón de Vicente Vázquez
Avda. del Mar. Edificio San Bernardo, 21 - 6º Izqda. - 15406 FERROL
Prof. Dr. D. Franco Fernández González
Fray Rosendo Salvado, 24 - 2º A - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Inv. Dr. D. Fernando Fraga Rodríguez
La Coruña, 35 - 7º B - 36208 VIGO
Prof. Dr. D. Manuel Freire Rama
c/ Monte dos Postes, 6 - 4º A - SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Francisco Guitián Ojea
Senra, 16 - 15702 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Inv. Dr. D. Jesús Méndez Sánchez
Pza. Dr. Puente Castro, 5 - 6º Dcha. - 15702 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Dr. D. Manuel Pereiro Miguens
República del Salvador, 3 - 6º B - 15702 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Vicente Pérez Villar
Avda. de las Ciencias, 4 A - 2º B - 15706 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Juan Quintás Seoane
Alcalá, 27 - 28014 MADRID
Prof. Dr. D. Antonio Rigueiro Rodríguez
Avda. Ramón Ferreiro, 32 - 7º B - 27002 LUGO
Prof. Dr. D. Francisco Río Barja
Sto. Domingo de la Calzada, 2 - 6º C - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Gerardo Rodríguez López
Fernando III El Santo, 33 - 3º B - 15702 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Luis Suárez-Llanos Gómez
La Rosa, 16 - 6º B - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Rafael Tojo Sierra
Orense, 9 - 7º - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
225
226
Prof. Dr. D. Tito A. Varela López
Fray Rosendo Salvado, 15 - Esc. 3, 7º L - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Prof. Dr. D. Félix Vidal Costa
Bugallido, Buceleiras - 15886 AMES (A Coruña)
Excmo. Prof. Dr. D. Ernesto Viéitez Cortizo
General Pardiñas, 28 - 2º Dcha. - 15701 SANTIAGO DE COMPOSTELA
Dr. Ing. D. Valeriano Yepes Hernández de Madrid
Fonte do Espiño, 3 - 15719 Liáns - OLEIROS (A Coruña)
Prof. Dr. D. Miguel Angel Ríos Fernández
Facultad de Química. Universidad de Santiago
Prof. Invest. Dr. D. Antonio Ballester Álvarez-Pardiñas
Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia - CSIC
ACADÉMICOS DE HONRA
Excma. Sra. Dña. Carmela Arias y Díaz de Rábago. Condesa de Fenosa.
Cantón Grande, 9. A Coruña.
Excmo. Prof. Dr. Federico Mayor Zaragoza.
Mar Caribe, 15. Majadahonda - 28220 Madrid.
Excmo. Prof. Dr. Carl A. Leopold.
1203 East Shore Drive. Ithaca, NY 14850. Estados Unidos.
227
ACADÉMICOS CORRESPONDENTES
Prof. Dr. Emil Den Tex. Geologische en Mineralogische. Institut der Rijksuniversiteit.
Univ. Leiden. Holanda
Prof. Dr. Benito Sánchez Rodríguez. Conde de Gondomar, 7. Pontevedra.
Prof. Dr. Luis Castedo Expósito. Química Orgánica. Facultad de Química. Santiago.
Prof. Dra. Mª Pilar Fernández Otero. Depto. de Fisiología Animal. Universidad de Navarra. Pamplona.
Prof. Dr. José L. Blanco González. Gran de Gracia, 7. 08012 Barcelona.
Prof. Dr. Jaime García Lombardero. Comisión de las Comunidades Europeas. Rue de la
Loi 200. B1049, Bruselas. Bélgica.
Prof. Dr. Lieven Vanhecke. Department of Mathematis. Katholieke Universiteit Leuven,
Departament of Mathematics, Celestijnenlaan 200 B, B-300. Leuven (Bélgica).
Prof. Dr. Jochen Kleinschmit. Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt. Abteilung
Forstpflanzenzüchtung. NFV-Abt. C-W-3513 Staufenberg-Escheroche, Alemania.
Prof. Dr. Roberto Salema. Instituto de Biología Molecular y Celular. Rua do Campo
Alegre, 823. 4100 Porto. Portugal.
Excmo. Prof. Dr. Santiago Grisolía. Fundación Valenciana de Estudios Avanzados. Pintor
López, 7. 46003 Valencia.
Prof. Dr. Fernando Noronha. Centro de Geología da Universidade do Porto. Praça Gomez
Teixeira. 4000 Porto. Portugal.
Prof. Dr. Gary J. Griffin. Departament of Plant Pathology, Physiology and Weed Science.
Virginia Polytechnic Institute and State University. Blacksburg, Virginia 24061-0331.
Estados Unidos.
228
PUBLICACIÓNS DA REAL ACADEMIA
DISCURSOS DE RECEPCIÓN DE NOVOS ACADÉMICOS
A determinación da arquitectura. Rafael Baltar Tojo, 1980.
As ciencias matemáticas, esas descoñecidas. Luis A. Cordero Rego, 1982.
Concepto de metodoloxía da antropoloxía biolóxica. Primeiras aplicacións na poboación
galega. Tito A. Varela, 1982.
Home e técnica. Odón Abad Flores, 1982.
Ideas sobre la investigación agraria. Valeriano Yepes Hernández de Madrid, 1984.
Evolución del crecimiento, maduración y desarrollo humano en Galicia, 1900-1980.
Rafael Tojo Sierra, 1984.
Ecuacións diferenciais e ciencia. Gerardo Rodríguez López, 1985.
O home dentro do sabio: Pedro Joseph de Bermés (1770-1824). Valentín Paz Andrade,
1985.
La historia de la micología médica. Manuel Pereiro Miguens, 1986.
La industrialización de la sardina hace 200 años. La pesca en Galicia en la época de
Cornide Saavedra. Francisco López Capont, 1986.
Oceanografía de la plataforma gallega. Fernando Fraga Rodríguez, 1987.
Cartografía Xurisdicional de Galicia no século XVIII. Provincia de Santiago. Francisco Río
Barja, 1988.
El matorral como recurso renovable. Manuel Bao Iglesias, 1989.
Polímeros de alta estabilidad térmica. Santiago González-Babé Ozores, 1991.
Sobre algúns aspectos experimentais das fluctuacións do parámetro de orde nos óxidos
de cobre super conductores. Félix Vidal Costa, 1992.
Historia y objetivos del diseño cuantitativo de fármacos. Franco Fernández González,
1993.
Acto de ingreso del Excmo. Prof. Dr. D. Camilo José Cela en la Rea1 Academia Galega
de Ciencias bajo la presidencia de S.A.R. el Príncipe de Asturias D. Felipe de Borbón
y Grecia, 1996.
Estructuras Dinámicas. Vicente Pérez Villar, 1998.
Las timosinas α en la Biología de las células de mamíferos. Manuel Freire Rama,
1998.
Génesis de la Ciencia Nuclear. La Radioactividad y el descubrimiento del Radio. Ramón
de Vicente Vázquez, 2000.
Antropología y transformismo. El pensamiento biológico y la posición crítica del P.
Agustino Zacarías Martínez Núñez (†). Arzobispo que fue de Santiago de Compostela.
Luis Asorey García, 2002.
Bosques e paisaxe en Galicia. Antonio Rigueiro Rodríguez, 2002.
Reflexiones sobre la Ciencia y la Técnica. Miguel Angel Ríos Fernández, 2004.
La biotecnología vegetal aplicada a la producción forestal. Antonio Ballester ÁlvarezPardiñas, 2004.
229
OUTRAS PUBLICACIÓNS
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume I, 1982.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume II, 1983.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume III, 1984.
Boletín da Academia Galega de Ciencias,volume IV, 1985.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume V, 1986.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume VI, 1987.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume VII, 1988.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume VIII, 1989.
Boletín da Academia Galega de Ciencias, volume IX, 1990.
Revista Academia Galega de Ciencias, volume X, 1991.
Revista Academia Galega de Ciencias, volume XI, 1992.
Revista Academia Galega de Ciencias, volume XII, 1993.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XIII, 1994.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XIV, 1995.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XV, 1996.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XVI, 1997.
Reglamento de la Real Academia Galega de Ciencias (modificado R.D. 70/1998)
(B.O.E. 18-2-1998).
Guía de las babosas ibéricas. José Castillejo Murillo, 1998, 156 pp.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XVII, 1998.
El desarrollo industrial pesquero en el siglo XVIII. Los salazoneros catalanes llegan a
Galicia. Francisco López Capont, 1999.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XVIII, 1999.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XIX, 2000.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XX, 2001.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXI, 2002.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXII, 2003.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXIII, 2004.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXIV, 2005.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXV, 2006.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXVI, 2007.
Revista Real Academia Galega de Ciencias, volume XXVII, 2008.
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CURSOS DE CONFERENCIAS PUBLICADOS
– “Homenaje a Cruz Gallástegui”, 1985, 191 pp.
– “La lluvia ácida”, 1987, 60 pp.
– “España y el Mercado Común”, 1988, 98 pp.
– “Especies frondosas en la repoblación de Galicia”, 1989, 67 pp.
– “Conferencias sobre el Río Miño”, 1989. l l2 pp.
– “Homenaje a Valentín Paz Andrade”, 1991, 95 pp.
– “Drogodependencias”, 1991, 132 ps.
– “El hombre y su entorno”, 1992, 120 pp.
– “Las especies frondosas en la repoblación de Galicia”, 1992, 125 pp.
– “La conservación del bosque”, 1992, 131 pp.
– “El cáncer, prevención y futuro”, 1993, 206 pp.
– “Xornadas Luso-Galaicas de Ciencias, 1990-1992”, 1993, 249 pp.
– “Biotecnologías”, 1994, 155 pp.
– “Las Rías Bajas y el Arco Atlántico”, 1995, 253 pp.
– “La pesca en Galicia: Presente y futuro”, 1996, 129 pp.
– “Biodiversidad forestal”, 1997, 148 pp.
– “La conservación del medio ambiente”, 1998, 221 pp.
– “La conservación del entorno humano”, 1999, 87 pp.
– “Biotecnologías: Biotecnología alimentaria”, 1999, 262 pp.
– “Recursos agroalimentarios de Galicia”, 1999, 182 pp.
– “Las aguas de la provincia de Ourense”, 1999, 126 pp.
– “Recursos naturales de Galicia”, 1999, 105 pp.
– “Energía y Futuro”, 2000, 246 pp.
– “Aspectos actuales del cáncer”, 2001, 143 pp.
– “IV y V Avances de Ciencia y Tecnología”, 2003, 403 pp.
– “XI Jornadas Luso-Galaicas de Ciencia y Desarrollo”, 2004, 125 pp.
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INSTRUCCIÓNS PARA OS AUTORES
1. A Revista da Real Academia Galega de Ciencias é unha publicación de difusión internacional
que publica artigos orixinais, de revisión ou notas relacionadas coa Química, Xeoloxía, Bioloxía,
Farmacia, Matemáticas, Física do Cosmos, Ciencias Técnicas, Ciencias Sociais e Económicas.
2. Presentación dos Artigos. O manuscrito orixinal xunto con dúas copias deberán ser enviados ó
Sr. Secretario da Real Academia Galega de Ciencias, San Roque, 2, 15704 Santiago de Compostela. España.
3. Preparación dos Manuscritos. Os traballos presentaranse a dobre espacio, incluíndo tablas e
lendas, en papel DIN-A4 (297 x 215 mm), con unha marxe de 2,5 cms. As páxinas irán numeradas consecutivamente. As posicións das táboas e ilustracións (debuxos ou fotografías) deberán ser
indicadas no texto; as táboas e lendas para as ilustracións incluiranse ó final en páxinas separadas.
Deberá incluirse un título reducido de non máis de 40 caracteres (incluindo espacios), para o encabezamento das páxinas, sempre que o título completo sexa máis largo que aquél. Os manuscritos
presentaranse terminados, en forma completa, e coa dirección do autor ou autores. Para a súa
aceptación e publicación, serán sometidos ó xuízo de tres censores.
Co fin de facilita-la composición da Revista da Real Academia Galega de Ciencias, os autores
deberán entregar xunto co traballo un CD que conteña os archivos de texto (preferentemente en
Microsoft Word 97 para Windows) e gráficos. Os gráficos almacenaranse en formato CorelDraw para
Windows (.CDR) ou en formato .EPS, e as fotografías deberán grabarse en formatos PhotoShop,
.TIFF ou .JPG (este último coa menor compresión posible). Para conseguir unha mellor calidade de
reproducción, é necesario que os archivos EPS, TIFF e JPG incluídos no diskette fosen gravados
directamente desde o programa de gráficos. Na etiqueta do diskette figurará o título do traballo e
o nome e iniciais do primeiro asinante.
(a) Resumo. Ó comenzo do traballo incluirase un resumo, que non debe exceder das 150 palabras,
no que se deberá reflectir concisamente o contido do traballo sen facer referencia ó texto principal.
Virá escrito no mesmo idioma do traballo e máis nun segundo idioma de uso común en publicacións científicas.
(b) Verbas claves. Adxuntarase unha selección ad hoc de verbas claves que se imprimirá co resumo.
Deberán presentarse coa súa traducción ó mesmo idioma utilizado no resumo.
(c) Bibliografía. As referencias bibliográficas ordenaranse alfabeticamente, ó final do traballo,
dispostas como nos exemplos seguintes:
Clutton-Brok, T.H., Harvey, P.H. (1977). Primate ecology and social organization. Journal of
Zoology, 183, 1-39.
Kawase, M. (1969). Root promoting substances in Salix alba. Physiol. Plant, 23, 159-170.
As citas no texto escribiranse como segue: Smith e Robinson (1984). Se a cita é de máis de dous
autores, pode usarse Smith et al (1979).
Corrección de probas. Os autores recibirán as probas do prelo para a súa corrección, debendo
evitarse as modificacións substanciais do manuscrito que, en caso de se producir, serán cargadas
ós autores. As probas deberán ser devoltas ó editor, debidamente corrixidas, dentro dos dez días
seguintes ó da súa recepción polo autor.
Separatas. Entregaranse 25 separatas gratuítas de cada traballo. As copias adicionais deberán ser
encargadas separadamente, realizando o pedido ó devolver as probas corrixidas.
232
INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES
1. La Revista de la Real Academia Gallega de Ciencias es una publicación de difusión internacional
que publica artículos originales, de revisión o notas relacionadas con la Química, Geología, Biología,
Farmacia, Matemáticas, Física del Cosmos, Ciencias Técnicas, Ciencias Sociales y Económicas.
2. Presentación de los Artículos. El manuscrito original junto con dos copias deberán ser enviados
al Sr. Secretario de la Real Academia Gallega de Ciencias, San Roque, 2, 15704 Santiago de
Compostela. España.
3. Preparación de los Manuscritos. Los trabajos se presentarán a doble espacio, incluyendo tablas y
leyendas, en papel DIN-A4 (297 x 215 mm), con un margen de 2,5 cms. Las páginas irán numeradas
consecutivamente. Las posiciones de las tablas e ilustraciones (dibujos o fotografías) deberán ser
indicadas en el texto; las tablas y leyendas para las ilustraciones se incluirán al final en páginas
separadas. Deberá incluirse un título reducido de no más de 40 caracteres (incluyendo espacios),
para el encabezamiento de las páginas, siempre que el título completo sea más largo que aquél. Los
manuscritos se presentarán terminados, en forma completa, y con la dirección del autor o autores.
Para su aceptación y publicación, serán sometidos al juicio de tres censores.
Con el fin de facilitar la composición de la Revista de la Real Academia Gallega de Ciencias, los
autores deberán entregar junto con el trabajo un CD que contenga los archivos de texto (preferentemente en Microsoft Word 97 para Windows) y gráficos. Los gráficos se almacenarán en formato
CorelDraw para Windows (.CDR) o en formato .EPS, y las fotografías deberán grabarse en formatos
PhotoShop, .TIFF o .JPG (este último con la menor compresión posible). Para conseguir una mejor
calidad de reproducción, es necesario que los archivos EPS, TIFF y JPG incluídos en el diskette
fuesen grabados directamente desde el programa de gráficos. En la etiqueta del diskette figurará el
título del trabajo y el nombre e iniciales del primer firmante.
(a) Resumen. Al comienzo del trabajo se incluirá un resumen, que no debe exceder de las 150
palabras, en el que se deberá reflejar concisamente el contenido del trabajo sin hacer referencia
al texto principal. Vendrá escrito en el mismo idioma del trabajo y en un segundo idioma de uso
común en publicaciones científicas.
(b) Palabras claves. Se adjuntará unha selección ad hoc de palabras claves que se imprimirá con
el resumen. Se deberán presentar con su traducción al mismo idioma utilizado en el resumen.
(c) Bibliografía. Las referencias bibliográficas se ordenarán alfabeticamente, al final del trabajo,
dispuestas como en los ejemplos siguientes:
Zoology, 183, 1-39.
Kawase, M. (1969). Root promoting substances in Salix alba. Physiol. Plant, 23, 159-170.
Las citas en el texto se escribirán como sigue: Smith e Robinson (1984). Si la cita es de más de
dos autores, puede usarse Smith et al (1979).
Corrección de pruebas. Los autores recibirán las pruebas de imprenta para su corrección, debiendo
evitarse las modificaciones substanciales del manuscrito que, en caso de producirse, serán cargadas
a los autores. Las pruebas deberán ser devueltas al editor, debidamente corregidas, dentro de los
diez días siguientes al de su recepción por el autor.
Separatas. Se entregarán 25 separatas gratuitas de cada trabajo. Las copias adicionales deberán ser
encargadas separadamente, realizando el pedido al devolver las pruebas corregidas.
233
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
1. The Revista de la Real Academia Galega de Ciencias is a Journal with international distribution
which publishes research papers and notes in various areas of Chemistry, Geology, Biology, Pharmacy, Mathematics, Physic, Technology, and Social and Economical Sciences.
2. Submission of Manuscripts. The original typescript and two copies should be sent to the Sr.
Secretario de la Real Academia Gallega de Ciencias, San Roque, 2, 15704 Santiago de Compostela. Spain.
3. Rules for the Manuscript. Papers should be written in double spacing throughout (including tables,
legends and footnotes), on one side of DIN-A4 (297 x 215 mm) paper with a margin of 2.5 cm all
round. The position of tables and illustrations (pictures or photographs) should be indicated in the
text: tables and legends for illustrations should be typed separately at the end of the manuscript.
A short running title of not more that 40 characters (including spaces), suitable for page headings,
should be suplied if the full title is longer than this. Manuscripts should be submitted in a complete
and finished form and with the author’s complete address. Before aceptation for publication, they
will be submitted to three referees.
In order to help with the composition of the Revista de la Real Academia Galega de Ciencias, authors
should hand in together with their work a CD containing text files (Microsoft Word 97 for Windows
is the prefered program) and graphics. Graphics should be saved in CorelDraw for Windows (.CDR)
or as .EPS, and photos should be saved in PhotoShop, .TIFF o .JPG formats (JPG’s with as little
compression as possible). In order to obtain the best possible print quality, the EPS, TIFF and JPG
files included on the disk should be saved directly from the graphics programme. The disk label
should feature the title of the work and the surname and initials of the main author.
(a) Abstract. An abstract will be printed at the head of all papers; abstracts should not exceed 150
words, and should be intelligible to the general reader without reference to the main text. Abstracts
should be written in the same language as the paper and in a second language of common use in
the scientific literature.
(b) Key words. An ad hoc selection of key words should be supplied; this will be printed with the
abstract.
(c) References. References should be listed alphabetically at the end of the paper, arranged as in
the following examples:
Zoology, 183, 1-39.
Kawase, M. (1969) Root promoting substances in Salix alba. Physiol. Plant, 23, 159-170.
Citation in the text should read thus: Smith and Robinson (1984). When a citation has more than
two authors, Smith et al. (1979) may be used.
Corrections. The publisher provides proofs for checking. Corrections must be restricted to typographical errors; those that represent substantial alterations from the submitted manuscript may be
carged to the author. Corrections should be returned to the editor within at most ten days.
Reprints. For each published contribution, 25 reprints will be sent free of charge. Additional copies
may be purchased; the order form shoul be returned with the proofs.

Sin título-1 - Real Academia Gallega de Ciencias

Transcripción

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Sr. Redactor Jefe del DIARI DE BARCELONA Tamarit, 155 08015