Lactobacillus delbrueckii - Alimentos Hoy

Lactobacillus delbrueckii - Alimentos Hoy

Recibido 28/07/2012, Aceptado 30/07/2012, Disponible online 31/0/2014
DESARROLLO DE UNA BEBIDA VEGETAL A PARTIR DE HARINA DE ARROZ CON
ADICIÓN DEL PROBIÓTICO (Lactobacillus delbrueckii)
María Patricia Chaparro Gonzalez1, Luz Mary Figuero Zea1, Angela María Otálvaro Alvarez1*
Programa de Ingeniería de Alimentos, Universidad de La Salle. Carrera 2 # 10-70, bloque D
piso 7.
E-mail: *[email protected]
1
Resumen
Durante el proceso de obtención de arroz blanco, hay pérdidas asociadas con los granos
partidos, éstas representan un 4% de la producción. El objetivo de este estudio fue utilizar
este material en el desarrollo de una bebida funcional. Para ello se realizó hidrólisis
enzimática de la harina de arroz con: α-amilasa BAN 800 MG (Novozyme), actuando durante
30minutos a 150 rpm, pH 7,0 y 70 °C, y glucoamilasa AMG 800 BG (Novozyme), actuando
durante 60 minutos a 150 rpm, pH 4,5 y 60 °C para la obtención de un hidrolizado. Este
hidrolizado, con una concentración de azúcares reductores de 0,78 ± 0,08 g/g de harina se
utilizó como base para la formulación de la bebida que incluyó la adición del probiótico
Lactobacillus delbrueckii subespecie delbrueckii NRRL B-763 (1 mL de una
suspensión1x107UFC / mL de solución) y el ajuste del pH a 5,5. La bebida formulada se
incubó durante 72 horas, para incrementar la concentración de los probióticos antes del
almacenamiento.
Como resultado se obtuvo una bebida obtenida de color crema, aroma y sabor agradables.
Asimismo, los resultados mostraron que bajo las condiciones evaluadas de incubación: 37 °C
en aerobiosis y la misma temperatura en anaerobiosis, aunque la cantidad de azúcares
reductores se redujo y el pH disminuyó, la concentración del prebiótico no se mantuvo en la
requerida para una bebida funcional (luego de las 72 horas su concentración en la bebida
paso de 6,4x106 a 7,23 x104 UFC/mL). Esto sugiere que es necesario modificar algunas
variables del proceso. Se sugiere a futuro añadir una concentración más alta del probiótico
en la etapa de formulación de la bebida y no realizar la etapa de incubación, pasando
directamente al almacenamiento bajo condiciones de refrigeración.
Palabras clave: arroz, Lactobacillus delbrueckii, probióticos, bebida vegetal, hidrólisis
enzimática.
Abstract
During the process to obtaining white rice, it was observed losses associated with
brokengrains, approximately 4% of production. The goal of this research was to use this
materialin development of a functional drink. This was achieved by enzymatic hydrolysis of
riceflour: BAN α-amylase 800 MG (Novozyme), acting for 30 minutes at 150 rpm, pH 7,0 and
70 °C, and glucoamylase AMG 800 BG (Novozyme), acting for 60 minutes at 150 rpm, pH 4,5
and 60 °C to obtain a hydrolyzed. This hydrolyzed with a reducing sugar concentration of
0,78 ± 0,08 g /g of flour was used as a basis for formulating the beverage which included the
addition of probiotic Lactobacillus delbrueckii delbrueckii subspecies NRRLB-763 (1 mL of a
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suspension 1x107 CFU/mL solution) and adjusting the pH to 5,5. The beverage made was
incubated for 72 hours, to increase the concentration of probiotics before storage.
The result was a drink cream color and smell and flavor acceptable. The results also showed
that under the incubation conditions evaluated: 37 °C aerobically and anaerobically the same
temperature, although the amount of reducing sugars and the pH decreased, the
concentration of the probiotic did not continue in that required for a functional beverage (after
72 hours its concentration in the beverage change from 6,4x106 to 7,23x104 CFU/mL).This
suggests the need to modify some process variables. In the future it will be necessary add a
higher concentration of probiotic in the formulation stage of the beverage and not perform the
incubation step, going directly to storage under refrigeration.
Key words: Rice, Lactobacillus delbrueckii, probiotic, vegetal beverage, enzymatic
hydrolysis.
I.
Introducción
Cada día alrededor del mundo se
desarrollan diferentes investigaciones
sobre alimentos funcionales, es decir
aquellos que además de aportar nutrientes
ofrecen otros beneficios adicionales sobre
la salud humana, este es el caso de
preparaciones que incluyen probióticos,
prebióticos y minerales (Agustina et al,
2007; Gómez et al., 1999).
Los probióticos por ejemplo, son
microbios vivos que producen efectos
fisiológicos benéficos para la salud tanto
en
humanos
como
en
animales
(FAO/WHO, 2001; Parvez et al, 2006).
Dentro de estos se incluyen Lactobacillus,
Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus,
Leuconostoc,
E.
coli,
Bacillus,
Bifidobacteriumy
Saccharomyces
cerevisiae. Los efectos de las cepas
probióticas están relacionados con la
modulación del sistema inmunológico, la
prevención
y
tratamiento
de
las
infecciones gastrointestinales, efectos
antihipertensivos, la regulación de la
motilidad intestinal, abastecimiento y
biodisponibilidad de nutrientes y factores
de crecimiento (Sander, 2001; FAO/OMS,
2001; Mercenier et al, 2003; Parvez et al,
2006; Agustina et al., 2007; Hatakka, et al,
2007; Boudet, 2007; WGO, 2008; Prado F.
et al, 2008; Mennickent S. y Green, 2009).
En el caso de los prebióticos estos
incluyen
una
gran
variedad
de
polisacáridos de tipo oligosacáridos,
galacto oligosacáridos, lactulosa, lactitol y
fructo oligosacáridos como la inulina, que
se encuentran en una gran variedad de
vegetales y que son ampliamente
utilizados en la industria alimentaria (Marti
del Moral et al., 2003; Holzapfel W., 2002).
Cuando dentro de un producto se
encuentra la combinación apropiada de
probióticos y prebióticos es posible que el
mismo desarrolle un efecto simbiótico,
donde la asociación de estos dos
componentes es complementaria y
posiblemente sinérgica, potencializando
sus efectos individuales (Oliveira G. &
González M., 2007; Cumming et al, 2001;
Manzanares et al., 2006).
Los vehículos comúnmente usados
para la administración de probióticos son:
medicamentos, suplementos dietéticos y
alimentos
fermentados.
Resultando
necesario que estos mantengan las
concentraciones
requerida
de
microorganismos viables (106 y 1011
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UFC/mL) durante todo el periódo de su
vida útil, para que se comporten como
alimentos funcionales (Marin et al., 2009;
González et al., 2008).
Los probióticos
comúnmente se
encuentran en alimentos lácteos, sin
embargo,
actualmente
en
países
desarrollados se producen y comercializan
con éxito productos no lácteos como
vehículos de agentes probióticos basados
en sustratos vegetales como frutas, avena,
yuca, soja, arroz (Prado, 2008). Esto
debido a que existen segmentos de la
población que por razones médicas,
culturales o religiosas tienen limitaciones
para el consumo de lácteos (Prado F. et
al., 2008; Vandenplas, 2002).
En Colombia la alergia a la leche y la
intolerancia a la lactosa son condiciones
médicas de alta incidencia en la población
infantil y adulta, que restringen el uso de
ésta y sus derivados como vehículos de
probióticos. Otro inconveniente que
presentan las bebidas lácteas como fuente
de probióticos es su uso en pacientes con
galactosemia y en situaciones donde el
consumo de alimentos ricos en grasas
saturadas está contraindicado. Para estos
casos está recomendado el reemplazo de
los productos lácteos usados como
vehículos de los probióticos por productos
hipoalergénicos y leches de origen vegetal
(Plaza, 2003), que puedan ser ingeridas
de manera habitual.
El arroz (Oryza sativa L) es un alimento
básico de la canasta familiar. Este cereal,
se produce en 114 países y es el alimento
de más de la mitad de la población
mundial (ONU,2009). El valor nutricional
del arroz se encuentra asociado a su
composición que incluye proteína (7,3%) y
carbohidratos (79,95%), además de otros
componentes como fibra, minerales
(potasio y fósforo), vitaminas, aminoácidos
y ácidos grasos. Según FAO (2011), la
producción mundial de arroz se sitúa en
699 millones de toneladas (466 millones
de toneladas de arroz elaborado). En el III
Censo Arrocero realizado en 2007 en
Colombia, la producción de arroz paddy
seco fue de 2,7 millones de toneladas que
representan
aproximadamente
1,89
millones de toneladas de arroz blanco
(Fedearroz, 2008).
Durante el procesamiento del grano
que incluye una etapa de trilla, se obtiene
arroz integraly cascarilla de arroz.
Después el arroz integral pasa a un
proceso de pulimiento a partir del cual se
obtiene el arroz blanco y el salvado,
existiendo perdidas asociadas a los
granos partidos, que representan un 4% e
la producción. Estos granos tienen un
valor comercial 50% inferior al del arroz
blanco. En el documento 52, del MADR
sobre la Cadena del Arroz, se menciona
que en el mercado colombiano suele
hacerse una distinción entre arroz blanco
de primera, el cual tiene un porcentaje de
grano partido inferior al 10%, y el de
segunda, superior al 10%. Además se
indica que cuando el grado de grano
partido es superior al 10%, este arroz
blanco partido se clasifica en dos: el arroz
partido grande o Cristal (% de grano
partido entre 50% y 75%, vendido como
insumo para la fabricación de pastas
alimenticias, sopas y cervezas) y el arroz
partido pequeño o Granza (tamaños
inferiores a un cuarto de grano, utilizado
en la preparación de concentrados para
animales y cerveza).
De otro lado el arroz es un sustrato que
permite el desarrollo de mohos, bacterias
y levaduras; estudios han demostrado que
es útil como sustrato para bacterias ácido
lácticas, especialmente de géneros de
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lactobacillus (Murooka et al., 2008; Meroth
et al., 2004). Asimismo, se ha indicado
que el alto contenido de amilosa en los
gránulos
de
almidón
favorece
significativamente la supervivencia de
Bifidobacterium (otro probiótico) a nivel
intestinal debido a que aumenta su
resistencia frente al pH y a los ácidos
biliares (Wang et al, 1999).
En este sentido, una bebida vegetal
producida a partir de los granos rotos de
este cereal, por sus características
nutricionales proporcionaría condiciones
adecuadas para mantener la viabilidad de
un microorganismos probiótico y de ese
modo posibilitar que la bebida actúe como
vehículo de introducción de estas cepas
contribuyendo a mejorar la salud de la
población (Chaparro et al, 2011), además
de contribuir a dar valor a los
subproductos de la cadena del arroz. En
trabajos anteriores, desarrollados por el
grupo de investigación, se había evaluado
el uso de la harina de arroz como sustrato
para el cultivo de Lactobacillus casei,
encontrando que ésta favorecía el
crecimiento de esta cepa, razón por la cuál
surgió la inquietud por elaborar una bebida
funcional a partir de un hidrolizado de
harina de arroz que incluyera un prebiótico
como Lactobacillus delbrueckii reconocido
por sus beneficios terapéuticos (Chaparro
et al., 2011).
II. Materiales y Métodos
Como
materia
prima
para
la
elaboración de la bebida vegetal se
utilizaron granos de arroz partido, variedad
Fedearroz
50.
Este
material
fue
acondicionado por medio de las siguientes
etapas: (1) molienda, para la que se
empleó un molino universal turbo de pines
pulverizador de granos, (2) tamizaje, para
colectar la fracción retenida en la malla
correspondiente a 180 µm (tamaño que
favorece el acceso de las enzimas a la
estructura del almidón mejorando el
rendimiento
de
la
hidrólisis),
(3)
gelificación y licuefacción del almidón,
procesos
llevados
acabo
por
calentamiento de una suspensión de la
harina de arroz en agua y que también
contribuye a mejorar el rendimiento de la
hidrólisis ya que afecta directamente la
estructura de las moléculas.
Luego de este acondicionamiento, se
procedió a desarrollar la hidrólisis
enzimática de la harina gelificada, este
procedimiento se desarrolló en dos
etapas, en la primera de ellas se utilizó
una α-amilasa (BAN 800, Novozyme,
actuando durante 30 minutos a 150 rpm,
pH 7 y 70 °C en un agitador orbital Thermo
4333) que contribuyó a la licuefacción del
almidón y en la segunda etapa, se utilizó
una glucoamilasa (AMG 800 BG,
Novozyme, actuando durante 60 minutos a
150 rpm, pH 4,5 y 60 °C) para llevar a
cabo la sacarificación y obtenerlos
azúcares reductores esperados como
resultado de este proceso. Para cuantificar
los resultados de las hidrólisis se
determinaron azúcares reductores por el
método DNS en un espectrofotómetro
Spectronic 4001/4.
Con el hidrolizado obtenido, se formuló
la bebida que se inoculó con la cepa
probiotica
Lactobacillus
delbrueckii
subespecie delbrueckii NRRL B-763.
Seguidamente se incubó durante 72 horas
a 37 °C, en condiciones de anaerobiosis y
aerobiosis utilizando una incubadora
Binder BD 53-UL. Durante este periodo se
hizo seguimiento de azúcares, biomasa y
pH. Esperando obtener al finalizar este
tiempo una concentración de probióticos
adecuada para considerar el producto
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como funcional y proceder a evaluarlo
durante su etapa de almacenamiento.
III.
Resultados y Discusión
Respecto a la hidrólisis enzimática de
la harina de arroz, luego del proceso con
α-amilasa se alcanzó una concentración
de azúcares reductores (AR) de 0,31
±0,04 g/g de harina de arroz. Y luego de la
segunda hidrólisis en la que se empleó
glucoamilasa AMG 800 BG, se llegó a una
concentración de AR de 0,78 ± 0,08 g/g de
harina. Estos ensayos se desarrollaron por
duplicado.
Figura1.Harina de arroz lista para la hidrólisis e hidrolizado obtenido.
El hidrolizado obtenido se inoculó con la cepa Lactobacillus delbrueckii subespecie
delbrueckii NRRL B-763 y se inició el seguimiento de pH, AR y biomasa, que arrojó los
resultados presentados en las figuras 2, 3 y 4.
Figura 2.Comportamiento de azúcares reductores durante la incubación en condiciones de
aerobiosis y anaerobiosis.
Se observa en la figura 2, que mientras en el cultivo a condiciones de anaerobiosis y
37 °C se consume el 46% de los azúcares reductores disponibles, en el cultivo en aerobiosis
a 37 °C este consumo solo llega a un 34%, indicando que las condiciones de anaerobiosis
favorecen el consumo de la fuente de carbono disponible.
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Figura 3.Comportamiento del pH a lo largo del tiempo de incubación del microorganismo en
condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.
Respecto a la variación del pH a lo
largo del cultivo, observada en la figura 3,
se aprecia que el comportamiento de los
cultivos aerobios y anaerobios es muy
similar, sufriendo un descenso importante
de pH (de más de una unidad) durante las
primeras 24 horas. Efecto que se asocia a
la actividad del microorganismo y a su
capacidad de producir ácidos.
Respecto a la figura 4, en donde se
observa la viabilidad del microorganismo,
se observa que durante el tiempo de
estudio el microorganismo no evidenció un
incremento en UFC/mL, a pesar del
consumo de sustrato y la variación en el
pH observados. Es más, no sé logró
mantener la concentración presente al
momento de iniciar el estudio, indicando
que dada la concentración de probióticos
luego de la incubación, la bebida no
cumple con la concentración mínima
requerida para ser considerada como
funcional, razón por la cual no se evaluó
durante un periodo de almacenamiento.
Figura 4.Viabilidad del microorganismo durante el tiempo de incubación en condiciones de
aerobiosis y anaerobiosis.
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En cuanto a las condiciones de la
bebida luego de la inubación, los grados
Brix alcanzados fueron de 11, el pH
cercano a 4,0, y dentro de las
características sensoriales se destacaron
su color crema almendra, su sabor
marcado por un dulce intenso, su textura
fluida y su aroma suave. Coincidiendo casi
todas estas características con bebidas
vegetales disponibles a nivel comercial.
Se sugiere que dados los resultados de
este trabajo, en donde se observaron
problemas para mantener la concentración
del probiótico, sería conveniente adicionar
a la formulación un prebiótico, que acorde
a lo escrito por Chockchaisawasdee y
Stathopoulos (2011), permitiera ayudar a
mantener la viabilidad de los probióticos
durante el tiempo de almacenamiento.
Asimismo, se establece que la bebida no
debe ser incubada durante un tiempo tan
largo y que luego de ser formulada debe
ser almacenada en condiciones de
refrigeración (Tymczyszyn et al., 2011).
Los resultados obtenidos también
sugieren que la cepa de Lactobacillus
delbrueckii subespecie delbrueckii NRRL
B-763, bajo las condiciones de estudio,
tiene un comportamiento diferente a la
cepa Lactobacillus casei, en cuanto a
mantenimiento y producción de biomasa,
puesto que con ésta última en un trabajo
anterior se había reportado un incremento
en la biomasa de dos órdenes de
magnitud para unas condiciones de
proceso similares (Chaparro et al., 2011).
IV.
Conclusiones
Mediante el proceso desarrollado se
logró obtener una bebida vegetal a partir
del arroz partido con características
sensoriales aceptables.
La cepa Lactobacillus delbrueckii
subespecie delbrueckii NRRL B-763, bajo
las condiciones de estudio, no mantiene la
concentración requerida en la bebida
vegetal para ser considerada como
probiótica.
Se sugiere que para estudios
posteriores sería importante trabajar con
combinaciones de la cepa estudiada con
un prebiótico que actuará como protector
durante el tiempo de almacenamiento de
la bebida
permitiendo mantener la
concentración del microorganismo en un
valor superior a 106 UFC/mL.
Finalmente, se observó que el periodo
de incubación utilizado para incrementar la
concentración del cultivo tiene un efecto
contrario y por tanto no favorece los
objetivos esperados.
V. Referencias
Agustina, R., Lukito, W., Firmansyah,
A., Suhardjo, H., Murniati, D. Dindels, J.
(2007).The effect of early nutritional
supplementation with a mixture of
probiotic,
prebiotic,
fiber
and
micronutrients in infants with acute diarhea
in Indonesia. Asia Pac J Clin. Nutr. 16(3):
435-442.
Boudet, R. V. (2007). Uso de Pre y
Probióticos en Alergía (abstract). In: 1»
Jornadas Nacionales de Alergía en
Pedriatría, Córdoba, Argentina.
Chaparro M. P., Figueroa L. M.,
Otálvaro A. M. (2011). Evaluación de la
harina de arroz (Fedearroz 50) como
sustrato para la producción de probioticos,
CIBIA VIII, Perú.
Chockchaisawasdee S., Stathopoulos
C. (2011). Viability of Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus delbrueckii
Vol 22, No 32 (2014), Revista Alimentos Hoy - 31
ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus
and Lactobacillus casei in fermented milk
supplemented
with
isomaltooligosaccharides derived from banana
flour. Journal of Food and Nutrition
Research 50(2):125–132.
Journal of Dental Research, 86(2):125130.
Cumming J. H. (2001). Probiotic
digestion and fermentation. Amercian
Journal of Clinical Nutrition. 73 :415-420.
Manzanares W. A. (2006). Probióticos,
Prebióticos y Simbióticos en pacientes
críticos. Revista Brasilera de Nutrición
Clínica 21(2) 155-162.
FAO/WHO.
(2001).
Health
and
nutritional properties of probiotics in food
including powder milk with live lactic acid
bacteria - Joint Food and Agricultural
Organization of the United Nations and
World
Health
Organization
Expert
Consultation Report, Cordoba, Argentina.
Holzapfel W.S. (2002). Introduction to
pre and probiotics. Food Research
International. 35(2-3):109-116.
Marin Z., Cortés M., Montoya O.
(2009). Evaluación de la viabilidad del
crecimiento de la cepa nativa Lactobacillus
plantarum LBPM 10 y la cepa comercial
Lactobacillus casei ATCC 393 en pulpa de
uchuva y en solución isotónica de glucosa.
Vitae, 16(2) 210-7.
FAO. (2011). Seguimiento del Mercado
del
Arroz.
Disponible
en:
http://www.fao.org/docrep/014/am491s/am
491s00.pdf, consultado el: 20 de Julio de
2012.
Marti del Moral A., Moreno-Aliaga J.,
Martínez Hernández A. (2003). Efecto de
los prebióticos sobre el metabolismo
lípidico. Nutrición Hospitalaria 18(4):181-8.
Fedearroz. (2008). III Censo Nacional
Arrocero, cubrimiento cosecha A y B 2007.
Produmedios, Fedearroz, Bogotá.
Mennickent, S. Green K. (2009). Los
probióticos y su utilidad terapeútica.
Ciencia Ahora, 24: 31-38.
Gómez C., González V. G., Mejía G.
A., Ramírez P. A. (1999). Proceso
biotecnológico para la obtención de una
bebida refrescante y nutritiva. Interciencia
24(2): 205-210.
Mercenier A., Pavan S., Pot B. (2003).
Probiotics as biotherapeutic agentes:
Present knowledge and future prospects.
Current Pharmaceutical Design 9: 175191.
González, B. A. Dominguéz, R.
Alcocer, B. R. (2008). Use of Aloe vera
juice as substrate for growth of
Lactobacillus plantarumandL. casei. CyT
a- Journal of Food,6(2): 152-157.
Meroth C., Hammes W., Hertel, C.
(2004). Characterisation of the Microbiota
of Rice Sourdoughs and Description of
Lactobacillus spicherisp. nov. System.
Appl. Microbiol. 27: 151–9.
Hatakka K., Ahola A., Yli- Knuuttila H.,
Richardson M. (2007). Probiotics reduce
de prevalence for oral Candida in the
Elderly-a- randomized controlled trial.
Murooka Y., Yamshita M. (2008).
Traditional healthful fermented products of
Japan. J. Ind Microbiol Biotechnol 35:
791–798.
Vol 22, No 32 (2014), Revista Alimentos Hoy - 32
Oliveira G., González I. (2007).
Probióticos y prebióticos en la práctica
clínica. Nutrición Hospitalaria 22(2):32-4.
Parvez S., Malik K., Ah Kang S., Kim,
H. (2006). Probiotics and their fermented
food products are beneficial for health.
Journal of Applied Microbiology 100: 11711185.
Plaza AM, Tortajada M, Varea V, Giner
MT, Martín MA, Sierra JI. (2003).
Alimentación del lactante con una reacción
adversa a las proteínas de la leche de
vaca. Acta Pediatr. Esp 61:249- 254.
Prado F. Parada J. Pandey A., Soccol
C. (2008). Food Research International
41(2):111-123.
WGO
(Wold
Gastroenterology
Organization). (2008). Guías prácticas de
la OMGE: Probióticos y Prebióticos. Ed.
WGO. 2008.
Agradecimientos.
Las autoras agradecen a USDA ARS
Culture Collection- BFPM Research Unit /
National Centrer for Agricultural Utilization
Research , por la donación de la cepa
Lactobacillus
delbrueckii
subespecie
delbrueckii NRRL B-763. Y a la
Federación
Nacional
de
Arroceros
(Fedearroz) por facilitar la materia prima
objeto de este estudio.
Sanders, M. (2001). Probiotics in
human diet: what is their role? American
Dietetic Association Annual Meeting, St
Louis, MO. USDA. National Nutrient
Database for Estandar Reference, (2008),
Release 21. Washington D.C. Ed. USDA
Tymczyszyn E., Gerbino E., Illanesn
A., Gómez-Zavaglia A. (2011). Galactooligosaccharides as protective molecules
in the preservation of Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus. Criobiology
62 (2):123-9
Vandenplas Y. M. (2002). Concenso
sobre probióticos, agentes bioterapeúticos
en el manejo de las diarreas. Acta
Pediatríca de México, 23: 243-249.
Wang X., Brown I., Evans A., Conway
P. (1999). The protective effects of high
amylosemaize
(amylomaize)
starch
granules of the survival ofBifidobacterium
spp. in the mouse intestinal tract. Journal
of Applied Microbiology 87: 361-9.
Vol 22, No 32 (2014), Revista Alimentos Hoy - 33