Taller 5. Controles de calidad para muestras biológicas

Taller 5. Controles de calidad para muestras biológicas

Taller 5. Controles de calidad para muestras biológicas
Coordina: Andrés C García Montero,
Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Ponentes: Carmen García Macías,
Servicio de Patología Molecular, CIC, Salamanca .
Rosa Pinto Labajo,
Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Anna Bosch Comas,
Biobanco IDIBAPS, Barcelona
Andrés C García Montero,
Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Taller 5: Controles de calidad para muestras biológicas
Controles de calidad de ácidos
nucleicos
Dra. Rosa María Pinto Labajo. Área de Control de
Calidad
Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de
Salamanca
CRITERIOS DE CALIDAD DE ADN Y ARN
Concentración
Pureza
Integridad
Funcionalidad
Trazabilidad
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CONCENTRACIÓN
- Espectrofotometría:
Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda
específica, a partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un
soluto en una solución.
Ley de Lambert-Beer: una relación lineal entre
absorbancia A (DO) y concentración
A = DO = αlc (1)
α : coeficiente de extinción molar (probabilidad de que el
fotón sea absorbido por el material a esa λ
l: distancia que recorre la luz para atravesar el material
c: concentración
1 unidad de absorbancia en 1cm de trayectoria óptica para
ADN de doble cadena = 50 µg/ ml y para ARN = 40 µg/ ml
CONCENTRACIÓN
- Espectrofotometría: Nanodrop ND1000
Ventajas:
- concentración y pureza
La capacidad de absorción a una λ específca de las
posibles sustancias contaminantes
- sencillo, rápido y económico
Incovenientes:
-basa
la cuantificación en la medida de absorbancia 260 nm
de todos los nucleótidos
ADN degradado
ADN monocatenario
oligonucleótidos
ARN
-No discrimina entre ADN y ARN
-No aporta información sobre la integridad
CONCENTRACIÓN DE ADN
- Fluorimetría :
Fundamento: determinación de la concentración en función de la fluorescencia
emitida por un fluoróforo de unión específica al ADN de doble cadena.
Cuantificación relativa: necesario realizar una recta patrón con
un ADN estándar (íntegro) de concentración conocida
PicoGreen®, SYBR Green ®, QuantiFluor™
Ventajas:
- concentración e integridad
Unión exclusiva a ADN de doble cadena
Inconvenientes:
- coste elevado, metodología más compleja (gran precisión)
-No aporta información sobre la pureza del ADN
RELACIÓN PicoGreen®/ Nanodrop ND1000
R< 1
CONCENTRACIÓN DE ADN
Promedios Nanodrop
MEDIDAS DE CONCENTRACIÓN (ng/ul))
Método: precipitación con sales
“salting out”
<>
A
B
C
D
E
118,00
187,30
479,50
256,50
104,80
Picogreen
MEDIDAS DE CONCENTRACION (ng/ul))
<>
A
B
C
D
E
1
98,29
168,27
408,33
216,74
96,11
2
96,78
170,30
418,98
217,24
92,24
3
97,40
161,98
415,83
216,49
90,88
<>
A
B
C
D
E
PromediosPicogreen
MEDIDAS DE CONCENTRACION
(ng/ul))
97,49
166,85
414,38
216,82
93,08
Ratios pico/nano
muestra óptima de ADN: R > 0.8
A
B
C
D
E
0,83
0,89
0,86
0,85
0,89
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10
11 12
A
B
C
concentración Nanodrop ND1000
ng/ µl
A4 B3
58,8 65,8
B6
68
B9
50
B10 C2
45.5 45,5
C3
42
concentración PicoGreen®
ng/ µl
A4
50
B3
50
B6
50
B9 B10
12.5 11
C2
25
C3
31.2
RELACIÓN PicoGreen®/ Nanodrop
A4
B3
B6
B9 B10 C2
C3
0,85 0,76 0,74 0,25 0,24 0,55 0,74
CONCENTRACIÓN DE ARN
- Fluorimetría :
Metodología: RT-PCR a tiempo real
Fundamento: determinación de la concentración en función de la fluorescencia emitida por un
fluoróforo de unión al ADN sintetizado
Los fluoróforos pueden ser de dos tipos: a) fluoróforos con afinidad por el ADN
b) sondas especificas para fragmentos del ADN
Cuantificación relativa: necesario realizar una recta patrón con un ADN estándar
(íntegro) de concentración conocida.
Ventajas:
- concentración
e integridad mediante el cálculo de los valores de ciclo de umbral o Ct
Hay que tener en cuenta que el tamaño de los fragmentos amplificados es
limitado
- detección de contaminación por ADN
- funcionalidad
Inconvenientes:
- coste elevado, metodología más compleja, interpretación de los resultados
- no aporta información sobre presencia de contaminantes en la muestra
PUREZA
Capacidad de absorbancia a una λ determinada de las posibles sustancias contaminantes
presentes en una solución de ADN .
A280: proteínas, fenol (A270)
A230: sales caotrópicas, fenol, hidratos de carbono
RELACIÓN DE ABSORBANCIAS
< 1,6
A260/A280
ADN
A260/A230
A260/A280
ARN
A260/A230
Contaminación c. aromáticos
PUREZA ÓPTIMA
1,8 – 2,0
> 2,1
PUREZA ÓPTIMA
2.0-2.2
2,0 - 2,1
≥ 1.8
~2,0
Contaminación ARN
PUREZA ÓPTIMA
Pureza aceptable
PUREZA ÓPTIMA
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PUREZA
ADN alta pureza
ARN alta pureza
A260/280: 1.87
A260/280: 2,04
A260/230: 2.46
A260/230: 1,68
Contaminación con fenol
ng/µl: 255.1
A260/280: 1.68
A260/230: 1.25
Precipitación
con etanol y sales
ng/µl: 140.0
A260/280: 1.90
A260/230: 2.37
Relación A260/230
A230
sales caotrópicas,
fenol,
hidratos de carbono
Puede resultar muy variable dependiendo del tampón que utilicemos
como blanco en la medida del espectrofotómetro
muestras
10-3
10-4
10-5
10-6
10-8
muestras
10-3
10-4
10-5
10-6
10-8
concentración
56,18
57,36
57,7
56,7
54,8
concentración
55,78
55,98
55,41
54,83
53,2
A260/280
1,91
1,97
1,91
1,87
1,88
A260/280
1,9
2,01
1,94
2,01
2,03
A260/230
-6,6
-6,8
-7,25
-6,39
-5,95
A260/230
2,25
2,39
2,26
2,3
2,35
Buffer TE
Buffer kit
bolas magnéticas
Si diluimos una muestra a la mitad de concentración en un tampón salino la
relación 260/280 se mantiene constante (la muestra tiene la misma pureza), sin
embargo el ratio 260/230 disminuye por el efecto del incremento proporcional de
sales respecto al ADN
ng/µl: 131.6
A260/280: 1.89
A260/230: 2.26
dilución 1/10
ng/µl: 11.1
A260/280: 1.86
A260/230: 1.72
INTEGRIDAD
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
agarosa 0,7%
≥ 50 ng
agarosa 1%
gDNA
28 S
18 S
integridad: una única banda definida
integridad: bandas ribosomales 28S
pureza: detección de presencia de
2:1
pureza: detección de presencia de
en la parte superior del gel
ARN en la parte inferior del gel
y 18S discretas en proporción 2:1
ADN en la parte superior del gel
CONCENTRACIÓN E INTEGRIDAD
Agilent 2200 TapeStation system
Quantitative range:
10-100 ng/ µl
25-500 pg/ µl
-Uso de geles multi-línea y microfluídos que permiten un ensayo semiautomático.
-Simplifica el manejo de muestras
-Requiere muy poca cantidad de muestra
-Permite evaluar la concentración y la integridad de una muestra
Integridad del ADN: DIN
DIN: DNA integrity number
Valor del 1 al 10 que define la integridad de una muestra de ADN
10: valor de una muestra íntegra
1: valor de una muestra con alto nivel de degradación
20445: DIN 8. 9 amplifica todas las bandas por Long PCR
múltiple (17,05 kb).
Amplif 5000 pb: DIN 6.2 amplifica hasta 5 kb.
13-21 FFPE: DIN 1.5 amplifica débilmente 600 y 300 pb.
Amplifica con intensidad 200 pb.
4B-04 Qiagen: DIN 1.5 amplifica débilmente 300 pb.
Amplifica con intensidad 200 pb.
5B-43 f/C: DIN 1.3 amplifica débilmente 300 pb.
Amplifica con intensidad 200 pb.
Integridad del ARN: RINe
RINe: RNA integrity number
10: valor de una muestra íntegra
1: valor de una muestra con alto nivel de degradación
RINe= RIN 2100 Bioanlyzer (Agilent)
RIN <6 ARN degradado
RIN > 7
RIN > 4-7
Arrays
qRT-PCR
RINe es una medida repetitiva pero puede diferir
del valor de RIN (en la misma muestra).
FUNCIONALIDAD DEL ADN
DIGESTIÓN del ADN con ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
1
λ-HindIII
23 kb
2
FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD DEL ADN
LONG PCR MÚLTIPLE
5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente
amplificación en 6 cromosomas diferentes
amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb
Long PCR Múltiple:
ADN molde: 10 ng/ µl
1
2
3
4
5
6
PUNTUACIÓN
7
intensidad
fuerte
débil
λ-Hind III
1
kb
23.1
9.4
6.5
4.3
2.3
2.0
2
3
4
5
6
7
H20
Calidad del ADN
kb
17.5
7.0
5.0
3.0
2.4
2.0
10
8
7
9.5
7.5
6.5
5
4.5
3
2.5
10-9.5: muestra ótpima
≥ 6.5: muestra aceptable
4.5: muestra calidad
comprometida
‹ 4.5: rechazar muestra
4.5: muestra calidad comprometida
enviar al investigador informando de su calidad
TEJIDOS FFPE
ADN
(van Beers et al., 2006)
pb
- ADN muy fragmentado
- modificaciones químicas
del ADN por formalina
años:
11, 6, 22, 20,18, 11, 8 , 7 , 19, 17, 16,
Funcionalidad del ADN
- PCR múltiple (100 ng ADN molde)
4 amplicones de 100, 200, 300, 400 pb
7 muestras amplificaron fragmentos ≥ 200 pb
CGH array
(comparative genomic hybridisation)
TEJIDOS FFPE
6 muestras extraídas de tejidos parafinados con el método kit QiAamp® mini
(Qiagen) diferentes edades de bloque.
11
10 7
6
2 A 2B
M
1000
800
600
400
pb
M 11 10
7
6
1000
900
700
500
300
200
100
600 pb
2 A 2B
1000
900
700
500
300
200
100
pb
100 ng molde
pb
300 pb
M 11 10
7
6 2A
Con este método la capacidad
de amplificación de 4 de las 6
muestras está limitada a 200
pb .
La edad del bloque no estaría
relacionada con la capacidad de
amplificación de la muestra.
2B
200 pb
FUNCIONALIDAD DE ARN
REACCIÓN DE RT-PCR
- funcionalidad: síntesis de cDNA (ADN complementario) a partir de ARN
mediante una retro-transcriptasa y amplificación de secuencias específicas de
ADN.
- pureza: si hay ADN en la muestra la amplificación de una región
interexónica dará lugar adicionalmente a un producto mayor del esperado.
primer
5’
amplicón
intrón
5’
3’ gDNA
exón
3’ RNA
cDNA
FUNCIONALIDAD DE ARN
Resultado PCR utilizando cDNA como molde:
kb
M
1
2
3
M: marcador tamaño molecular
3.0
1500 pb
1.0
0.5
400 pb
1: gDNA (control de la PCR)
2: cDNA
3: cDNA con contaminación de
ADN genómico
TRAZABILIDAD
Laboratory Integrated Management System
- Etiquetas y lectores de
códigos de barras
- Microtubos 2D-coded
- Automatización (Robots)
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TRAZABILIDAD
IDENTIFICACIÓN DE SEXO: PCR de Sexo
SEXO: amplificación gen ZF (Fredsten y Villesten, 2004)
cromosoma X: inserción de un elemento Alu de 423 pb
cromosoma Y: no existe elemento Alu
PCR sexo
λ-Hind III
1
2
3
4
5
1560 pb
B1
1137 pb
hombre
mujer
TRAZABILIDAD
PERFIL GENÉTICO por MICROSATELITES o STR´s
STR´s: “ Short Tandem Repeats”
-secuencias cortas de 2-7 pb que se repiten a lo largo de todo
el genoma
-el número de repeticiones es único en cada individuo
-la amplificación de estas regiones constituye el perfil o huella
genética del individuo
5 pares de oligonucleótidos
PCR MÚLTIPLE
CHLC (Cooperative Human Linkage Center) markers
Sheffield JC et al (1995), Gastier JM et al (1995)
TRAZABILIDAD
VALIDACIÓN DEL PROTOCOLO
AND molde 100 ng
50% Hi-Gel Matrix (Biotools) y 0,7% agarosa estándar
4 individuos en dos reacciones de PCR diferentes una con Tm a 55ºC y
otra con Tm a 58ºC
1
2
3
4
φx174 HaeIII
310
281 / 271
234
194
118
TRAZABILIDAD
A = 2
¿qué muestra
es A?
1
Células en cultivo
ADN en solución
2
A (11130)
A
1
2
MUCHAS GRACIAS
www.bancoadn.org
[email protected]
EPICENTRE Forum 5 (3)
|Multiplex PCR Amplification of STRs from DNA Isolated with the MasterAmp™ Buccal Swab DNA Extraction
Kit|
Haiying Grunenwald, Epicentre Technologies
Introduction
Short Tandem Repeats (STRs) consist of short (3-7 bp), repetitive sequence elements that are distributed throughout the
human genome. The highly polymorphic nature of these markers makes them powerful tools for human identification.
STRs are often used by laboratories performing parentage determination, forensic analysis, genetic linkage map
construction, or any other application requiring genetic profiling.1
Typically for genetic analysis, at least two STRs are simultaneously amplified in a single-tube PCR reaction (multiplex
PCR). Success in multiplex PCR depends on both the quality of the genomic DNA used in the analysis and the PCR
amplification conditions. Standard techniques used to obtain genomic DNA for STR analysis often involve blood draws
and lengthy isolations. We have shown that the MasterAmp™ Buccal Swab DNA Extraction Kit can be used to isolate
human genomic DNA from buccal (cheek) cells in less than one hour without blood draws.2 Here, we demonstrate
multiplex PCR amplification of five sets of STRs from four individuals using MasterAmp PCR reagents and human
genomic DNA isolated with the MasterAmp Buccal Swab Kit.
Methods
Isolation of human genomic DNA using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit
Human genomic DNA was isolated from buccal cells of four different individuals using the MasterAmp Buccal Swab
DNA Extraction Kit. The procedure is outlined in Table 1. The extracted DNA was resolved on a 1% agarose gel and
visualized by ethidium bromide staining.
Table 1. MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Protocol Outline.
1. Thoroughly rinse subject's mouth twice with water.
2. Press the brush firmly against the inside of the cheek and rotate the brush 20 times. Move the brush to the
other cheek and repeat.
3. Place the brush into the tube containing DNA Extraction Solution and rotate.
4. Mix by vortexing and incubate the tube at 60°C for 30 minutes.
5. Mix by vortexing and incubate the tube at 98°C for 10 minutes. Repeat.
6. Pellet debris by centrifugation at 4°C for 5 minutes.
7. Carefully transfer the supernatant (containing the genomic DNA) to a new tube and store at -20°C.
Multiplex PCR amplification of CHLC markers
Cooperative Human Linkage Center (CHLC) markers are a group of STRs consisting of tri- and tetranucleotide
repeats.3,4 The CHLC marker loci are highly polymorphic. Genomic DNA from different individuals are differentiated
by the number of copies of these repeats contained within the amplified regions. PCR products from CHLC loci range
between 100-300 bp. Since our study involved one female and three males, we selected 5 sets of CHLC primers that
amplify regions of both the X chromosome (four sets of primers) and the Y chromosome (one set of primers). These
primers were also selected to minimize the possibility of generating PCR products of similar size.
The isolated human genomic DNA was PCR amplified using the following 5 sets of CHLC primers: DXS7132,
GATA31E08, DYS390, GATA175D03, and DXS6789. Primer sequences, location, and expected PCR product length
for each primer set are listed in Table 2. To determine the optimal multiplex PCR conditions, preliminary reactions
were carried out with genomic DNA from one individual using the MasterAmp PCR Optimization Kit. MasterAmp
PCR PreMix A was the optimal PreMix for this multiplex PCR reaction (data not shown). Each 50 µl multiplex PCR
reaction contained 25 pmoles of each primer, 1X MasterAmp PCR PreMix A (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl,
1.5 mM MgCl2, 200 µM each dNTP), 15 µl of buccal DNA (84-250 ng), and 1.25 units of MasterAmp Taq DNA
Polymerase. The samples were incubated at 94°C prior to the addition of MasterAmp Taq Polymerase. Then the
samples were incubated at 94°C for 2 minutes, followed by 30 cycles of: 1 minute at 94°C, 1 minute at 55°C, and 1
minute at 72°C; followed by 4 minutes at 72°C. Fifteen microliters of each reaction were resolved by electrophoresis on
a 3% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining.
Results
Figure 1 shows the human genomic DNA isolated using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit. The
extracted DNA has a high molecular weight.
Figure 1. Human genomic DNA extracted from buccal cells. Approximately 5% (8.5 µl)
of the extracted human genomic DNA was separated on a 1% agarose gel. DNA was
visualized by ethidium bromide staining. Lane M, DNA ladder; Lanes 1-4, human genomic
DNA from 4 different individuals.
Four of the five sets of CHLC primers: DXS7132, GATA31E08, GATA175D03, and DXS6789, amplify regions of the
X chromosome, whereas DYS390 amplifies a region of the Y chromosome. For the female sample, we expected to see
no amplification from primer set DYS390 (Y chromosome), and therefore no PCR product in the 205-221 bp range.
The other four primer sets were expected to result in either one or two PCR products depending on heterozygosity. For
the male samples, a single PCR product from each of the five primer sets was expected.
Figure 2 shows the multiplex PCR results. The amplification products from the female sample are shown in Lane 2 and
amplification results from the three male samples are shown in Lanes 4, 6, and 8. As expected for the female sample
(Lane 2), there is no amplification product between 205-221 bp from DYS390. There is one PCR product in the 118150 bp size range from DXS6789; two PCR products from GATA175D03 due to heterozygosity (in the size range 170186 bp); one product at approximately 250 bp from GATA31E08 (226-254 bp); and two PCR products in the size range
283-299 bp from DXS7132, again due to heterozygosity. For the male samples in Lanes 6 and 8, there is clearly a
single PCR product from each of the five primer sets. Lane 4 shows the appearance of a doublet at ~230 bp from
DYS390 and GATA31E08 (DYS390 produces products between 205-221 bp and GATA31E08 produces products
between 226-254 bp), and therefore this sample also shows amplification from each primer set. Multiplex PCR analysis
of these CHLC markers resulted in four distinct patterns for these four individuals (Figure 2). Further statistical analysis
would be needed to determine the significance of these comparisons.
Figure 2. Multiplex PCR amplification of CHLC markers from
buccal DNA. Multiplex PCR of five sets of CHLC markers was
carried out using human genomic DNA extracted from buccal cells as
described in the text. Fifteen microliters of each reaction were
resolved on a 3% agarose gel and visualized by ethidium bromide
staining. Lanes 1, 3, 5, 7, 100 bp DNA ladder; Lane 2, multiplex PCR
from a female sample; Lanes 4, 6, and 8, multiplex PCR from the
three males samples. Multiplex PCR products in Lanes 2, 4, 6, and 8
correspond to the human genomic DNA samples shown in Figure 1 in
Lanes 1, 2, 3, and 4, respectively.
Summary
Human genomic DNA isolated from buccal cells using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit was an
excellent template for the multiplex PCR amplification of STRs. This DNA extraction system is both fast and noninvasive. In addition, use of the MasterAmp PCR Optimization Kit made it easy to determine the optimal conditions for
the multiplex PCR analysis.
References
1. Edwards, A. et al. (1991) Am. J. Hum. Genet. 49, 746.
2. Watson, J. (1997) Epicentre Forum 4 (1), 6.
3. Sheffield, J.C. et al. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1837.
4. Gastier, J.M. et al. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1829.