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1 república bolivariana de venezuela universidad del zulia
1 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA DE INMUNOLOGÍA, MENCIÓN INMUNOLOGÍA EXPERIMENTAL EXPRESIÓN DE CITOCINAS EN LA MUCOSA GÁSTRICA DE URBANOS VENEZOLANOS INFECTADOS CON Helicobacter pylori Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela, para optar al grado de Magíster Scientiarum en Inmunología, mención Inmunología Experimental. Autor: M.C. Edgardo José Mengual Moreno C.I. V.- 14.357.160 Tutora Académica: Dra. Tania Beatriz Romero Adrián C.I.V.- 4.707.138 Asesora Metodológica: Dra. Jorymar Yoselyn Leal Montiel C.I.V.- 12.305.138 Maracaibo, Febrero de 2010 2 EXPRESIÓN DE CITOCINAS EN LA MUCOSA GÁSTRICA DE URBANOS VENEZOLANOS INFECTADOS CON Helicobacter pylori Autor: M.C. Edgardo José Mengual Moreno Firma:____________________________ C.I. V-14.357.160 Dirección: La Pomona calle 105 #18A-191 Teléfonos: 0261-7234435; 0416-5307892 Correo electrónico: [email protected] Tutora: Dra. Tania Beatriz Romero Adrián Firma: _____________________________ C.I. V-4.707.138 Dirección: Avenida 69. N. 7749. Quinta Leantamelia. Sector Panamericano – La Limpia al Lado de la Clínica López Vicuña. Teléfono: 0261-7532659; 0424-6053262 Correo electrónico: [email protected] Asesor Metodológico: Dra. Jorymar Yoselyn Leal Montiel Firma: ______________________________ C.I. V-12.305.138 Dirección: Urbanización Rosal Sur. Avenida 48, calle 13, casa 13-152Teléfono: 0261-7422363; 0414-6676098 Correo electrónico: [email protected] 3 DEDICATORIA A la memoria de mi padre Juan Mengual; ejemplo de constancia, sacrificio y lucha por alcanzar los sueños. A mi madre Gladys Moreno, mujer de constante deseos de superación profesional A mi esposa Alilibeth Pirela, mujer con quien comparto con mucho amor todas mis metas y logros alcanzados. A mis hijos Abraham David y David Alejandro, fuente de mi mayor inspiración y deseos de superación. A mis hermanos Juan Mengual y Eduardo Mengual A mis queridos profesores de la Maestría de Inmunología, mención Inmunología Experimental. Al personal Docente y de Investigación del Instituto de Investigaciones Biológicas, Facultad de Medicina. A mis familiares y amigos incondicionales. Edgardo José Mengual Moreno 4 AGRADECIMIENTOS A Dios Todopoderoso, en quien confío todos mis problemas, salud, metas, finanzas y proyectos. A mis familiares, especialmente a mis padres y esposa, quienes con su amor y apoyo incondicional brindado. A la Dra.Tania Romero, por las enseñanzas impartidas, apreciados consejos, esfuerzos por hacer cumplir los objetivos del proyecto de Investigación, incansable búsqueda de conocimientos y su valioso esfuerzo por formar profesionales de la Inmunología. A la MSc. Alisbeth Fuenmayor, por su amistad incondicional, apoyo académico y profesional en el aislamiento de H. pylori y estandarización de citocinas en la mucosa gástrica. A la Dra. Ileana Hernández, por su apoyo académico, amistad y enseñanza del método científico. A las Dras. Maribel Lizalzabal y Gisela Romero, por la confianza deposita al formar parte del equipo de Investigación, en calidad de Especialistas en Gastroenterología del proyecto de Investigación Al Dr. Jesús Mosquera, por su enseñanza en calidad de investigador experto en la estandarización e interpretación de las citocinas en la mucosa gástrica por inmunohistoquímica Al Dr. Gabriel Arismedi, por la colaboración en el diagnostico histopatológicos de H. pylori y el grado de inflamación de la mucosa gástrica. Al Dr. Hector Pons y la Dra.Yasmir Quiroz, por su apoyo en la cuantificación de las citocinas de la mucosa gástrica. 5 A la MSc. María Nelly Ramos, Lic. Nivea Abreu y Lic. Neila Bohórquez, por su colaboración en el procesamiento de biopsias gástricas. A las Dras. Jorymar Leal y Francisca Monsalve por su apoyo académico. Al Consejo de Desarrollo Humanistico Condes-LUZ, por el financiamiento otorgado. Al personal que labora en Servicio de Gastroenterología del Hospital Universitario de Maracaibo. Al personal Docente y de Investigación que labora en el Instituto de Investigaciones Biológica, Facultad de Medicina-LUZ. Muchas Gracias… Edgardo José Mengual Moreno 6 INDICE DE CONTENIDO Pág. RESUMEN………………………………………………………………..………………... 7 ABSTRACT…………………………………………………………………..…………….. 8 INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….. 9 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………... 13 RESULTADOS…………………………………………………………………………….. 20 DISCUSIÓN………………………………………………………………………………... 24 CONCLUSIONES………………………………………………………........................... 29 RECOMENDACIONES…………………………………………………………………… 30 ÍNDICE DE REFERENCIAS……………………………………………………………… 31 7 Edgardo José Mengual Moreno. “EXPRESIÓN DE CITOCINAS EN LA MUCOSA GÁSTRICA DE URBANOS VENEZOLANOS INFECTADOS CON Helicobacter pylori”. Trabajo de grado para optar al titulo de Magíster Scientiarum en Inmunología, mención Inmunología Experimental, División de Estudios para Graduados, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela. Marzo de 2010. 1-37 p. RESUMEN El Helicobacter pylori (H. pylori) induce una respuesta inmunitaria celular Th1 y altera la acidez gástrica mediada por citocinas proinflamatorias. No existen estudios previos que cuantifiquen las citocinas gástricas en esta patología en Venezuela. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de citocinas en la mucosa gástrica de urbanos venezolanos infectados con H. pylori. Se estudiaron 43 individuos adultos urbanos (mestizos e indígenas), con síntomas dispépticos, que acudieron al servicio de gastroenterología del Hospital Universitario de Maracaibo y aceptaron que les fuera realizada una endoscopia digestiva alta. Se obtuvo durante la endoscopia biopsias del antro gástrico para el diagnostico de H. pylori (prueba de ureasa, cultivo bacteriano y diagnostico histológico) y la expresión de citocinas. Esta última fue determinada mediante técnicas de inmunohistoquímica en biopsias parafinadas. Las citocinas (IL-1β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ), presentaron mayor expresión en mestizos H. pylori+ comparado con mestizos H. pylori- (p<0,04), Wayuu H. pylori- (p<0,03) y Wayuu H. pylori+ (p<0,01). No se observó diferencias en las citocinas de mucosa gástrica entre Wayuu con y sin infección. Estos resultados sugieren que la sobre expresión de citocina proinflamatorias en mestizos H. pylori+, podría aumentar el riesgo de lesiones gástricas, los Wayuu presentan menor expresión de citocinas y la infección por H. pylori+ no modifica las citocinas, por lo que el tipo de cepa circulante y las características genéticas, pudieran estar protegiendo a esta etnia frente a la infección por H. pylori. Se recomiendan futuras investigación que determinen el tipo de cepa bacteriana, el polimorfismo de citocinas, el grado de inflamación y el estado secretor de la mucosa gástrica en Wayuu y mestizos. Palabras claves: Helicobacter pylori, citocinas, enfermedad acido péptica y Wayuu. e-mail: [email protected]. 8 Edgardo José Mengual Moreno. “CITOKINES EXPRESSION ON GASTRIC´S MUCOSE OF Helicobacter pylori-INFECTED URBAN VENEZUELANS”. Tesis de grado para optar al titulo de Magíster Scientiarum en Inmunología, mención Inmunología Experimental, División de Estudios para Graduados, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela. Marzo de 2010. 1-37 p. ABSTRACT Helicobacter pylori (H. pylori) induces a Th1 response cellular and alters the gastric acidity by proinflammatory cytokines, There are not previous studies that quantify gastric cytokines in Venezuelans. The objective was to evaluate the cytokine expression in gastric mucosa of urban Venezuelans H. pylori-infected. 43 urban adults subjetc were studied with dyspeptic symptoms, who consulted to gastroenterology department at Universitary Hospital of Maracaibo and accepted that an upper endoscopy was made. Gastric antrum specimen were obtained during endoscopy for: diagnosis H. pylori infection (urease test, bacterial culture and histological diagnosis) and cytokine expression was determined by immunohistochemistry in paraffin specimen. IL-1β, TNFα, IL-4 e IFN-γ cytokines showed higher expression in H. pylori+ mixed subjects compared with H. pylori-mixed subjects (p<0.04); Wayuu H. pylori- (p<0.03) and Wayuu H. pylori+ (p<0.01). No differences were observed in gastric mucosal cytokines between Wayuu with and without infection. These results suggest that overexpression of proinflammatory cytokines in mixed H. pylori+ subjets, could increase the risk of gastric lesions, the Wayuu have decreased expression of cytokines and H. pylori-infection does not alter the cytokines, Whereas, the circulating strain type and genetic characteristics, may be protecting against H. pylori-infection in this ethnic group. Future research, could determine the H.pylori-strains type, cytokines´ polymorphism, inflammation degree and secretory status of gastric mucosa in mixed and Wayuu subjects. Key words: Helicobacter pylori, cytokines, acid-peptic disease and Wayuu. e-mail: [email protected] 9 INTRODUCCIÓN Helicobacter pylori (H. pylori) es un bacilo gram-negativo, espiralado, microaerofílico y flagelado que tiene como hábitat el epitelio gástrico. Se localiza en las conexiones epiteliales intercelulares o en su superficie a través de estructuras de adherencia especial denominadas “puentes de unión”, produce una serie de enzimas, entre ellas la ureasa que cumplen funciones metabólicas para la bacteria y generan un microambiente favorable a la misma en el epitelio gástrico. Es considerado no invasivo, sin embargo se ha demostrado la capacidad de invadir células epiteliales gástricas1-3. Estudios epidemiológicos han demostrado que la infección por H. pylori alcanza cifras significativas a nivel mundial, estimándose que cerca del 50% de la población es colonizada por este microorganismo, razón por la cual ha sido calificado como una de las bacterias más comunes de la humanidad. Existen variaciones en su distribución geográfica y las enfermedades inducidas por el microorganismo son más frecuentes en adultos e individuos de edad avanzada. La incidencia de la infección entre países desarrollados y en vías de desarrollo es significativamente diferente, siendo considerablemente mayores en los primeros, en estrecha relación con las deficientes condiciones socioeconómicas, nutricionales, higiénicas y ambientales que caracterizan a dichas regiones4. Paradójicamente, la mayoría de los Individuos colonizados permanecen asintomáticos durante el curso de su vida y sólo en un pequeño grupo la infección progresa hacia: una gastritis antral, con propensión al desarrollo de úlceras gastro-duodenales y reducido riesgo de cáncer; o una gastritis que afecta el cuerpo y/o el antro gástrico, con mayor probabilidad de evolución hacia cáncer gástrico, por lo tanto, H. pylori es factor necesario pero no suficiente, para cáncer gástrico5. Estas enfermedades gastroduodenales contribuyen significativamente a la morbimortalidad local y mundial, por lo que son consideradas un problema de salud pública6. El desarrollo de entidades clínicas como úlcera gastroduodenales, gastritis crónica, adenocarcinoma gástrico y linfoma gástrico primario dependen de propiedades inherentes al ambiente, a la cepa de H. pylori (alta virulencia de algunas cepas 10 infectantes), a la predisposición genética y a la respuesta inmunológica del hospedero, a las infecciones concurrentes entre otros factores7. El Zulia, estado que concentra el más alto porcentaje de pobladores en nuestro país, se encuentra entre los estados de mayor prevalencia de infección por H. pylori en Venezuela8. Al analizar la tasa de morbilidad y mortalidad de cáncer gástrico en el Zulia, poseen una baja tasa9. Los factores a inherente a la cepa o factores de virulencia de H. pylori, juegan un importante papel en la patogénesis de las enfermedades gastroduodenales, ya que las cepas virulentas son más agresivas y causan daño tisular e incrementan el riesgo de desarrollar manifestaciones clínicas severas. Lo anterior combinado a otros factores como el estado nutricional y la respuesta inmune del huésped son determinantes10. La mayor diferencia genética entre las cepas de H. pylori más virulentas y menos virulentas son los grupos de genes de patogenicidad asociados a citotoxicida (cagPAI). Estos son 31 genes los cuales codifican a un Sistema de Secreción Tipo IV (TFSS de sus siglas en ingles) que participan en el origen de la patología asociada al H. pylori (Backert S y Cols., 2002). El TFSS permite a la bacteria H. pylori inocular moléculas efectoras en el citoplasma de la célula del hospedero11-12. La proteína CagA, traslocada por el TFSS del H. pylori, es fosforilada en residuos de tirosina por la familia de las cinasa Src e induce rearreglo del citoesqueleto celular de actina. El TFSS media la inducción de la respuesta pro inflamatoria en las células del hospedero13-14. Los peptidoglicanos translocados por el TFSS son detectados por moléculas Nod1 de reconocimiento del patógeno intracelular, las cuales estimulan señales en cascadas que permite la activación de los factores de transcripción como: El kappa B nuclear. Estos factores estimulan la síntesis y secreción de citocinas proinflamatorias. Los efectos combinados de cagPAI en el citoesqueleto de actina y la respuesta pro-inflamatoria de las células del hospedero juegan un rol importante en la patogénesis. La proteína CagA es altamente inmunogénica y es codificada por el gen cagA (gen A asociado a citotoxina). El 50% a 70% de las cepas de la bacteria presentan este gen. Cepas que portan cagPAI son referidos como CagA+, y los pacientes infectados con esta cepa presentan una respuesta inflamatoria mayor y son más propensos a sufrir de úlcera 11 péptica y cáncer gástrico en poblaciones occidentales pero no en asiáticas15,16. Kersultyle D y Colaboradores17, clasificaron el cagPAI en cinco subtipos: Tipo I, cepas asiladas predominantemente de indígenas peruanos; Tipo II, cepas de China y Japón; y Tipo III cepas de India. Otra proteína es VacA, la cual es muy inmunogénica, induce vacuolización masiva de las células epiteliales in vitro y el 50% de las cepas de todos los H. pylori la secretan. Es importante en la patogénesis de la úlcera péptica y el cáncer gástrico. A pesar de que contribuye significativamente a la colonización gástrica de la bacteria en modelo murino, no es esencial para su crecimiento in vitro. Entre sus funciones se mencionan: formación de canales de membrana con salida de nutrientes al espacio extracelular, interferencia en la actividad endosomal y lisosomal, efecto sobre la señalización inducida por receptores de integrinas, afectación de funciones celulares dependientes del citoesqueleto, inducción de vacuolización después de su captación por pinocitosis, movilización hacia la mitocondria e inducción de apoptosis, así como, su introducción a través de las uniones epiteliales causando inhibición de la activación y proliferación de linfocitos T18-22. H. pylori es una bacteria de origen ancestral, adquirida intrafamiliarmente, durante la niñez y que persiste a lo largo de la vida. Estudios basados en combinaciones alélicas demuestra diferentes tipos de región señal (s): s1a, s1b, s1c y s2 y dos regiones medias (m): m1 y m2, que ha determinado que las cepas vacA de H. pylori tienen una distribución geográfica específica23,24. En africanos existen bacterias HpAfricana, en los Europeos HpEuropea, en los asiáticos del Este HpEAsia, en los Amerindios (HpEuropea y HpAmeridia) y en los mestizos (de Colombia y Venezuela) HpAfricano y Hp Europea. Las cepas Amerindias tienen baja diversidad y tendencia a desaparecer y no sobrevivir en hospederos no amerindios25. El gen vacA s1c de H. pylori, está presente exclusivamente en las personas originarias del este de Asia, siendo al parecer menos virulentas y patogénicas en comparación con las cepas europeas. Se conoce que los Piaroas (Indígenas venezolanos del Amazonas) tienen cepas Amerindias, que han sido transmitidas de generación en generación, desde que los Amerindios poblaron a después de haber cruzado el estrecho de Bering 12 hace unos 10 mil años, produciendo un reducción de la diversidad genética en cepas Amerindias26. Una vez que H. pylori coloniza el estómago de un individuo, puede persistir allí por décadas, a pesar de la respuesta inmunitaria sistémica. Las causas del fracaso del sistema inmunitario para controlar la infección, aún no se conocen. Sin embargo, las evidencias clínicas y experimentales indican que la respuesta inmunitaria frente al microorganismo es básicamente de tipo Th1, caracterizada por la secreción de mediadores proinflamatorios que produce alteración en la secreción acida gástrica27. Finalmente, los Wayuu son un grupo indígena de filiación lingüística Arawak, de mayor predominio en el Estado Zulia, cuyo territorio tradicional abarca la península de la Guajira, pero debido al fenómeno de occidentalización han migrado a la ciudad de Maracaibo, dedicándose al igual que los mestizos a labores relacionados con el comercio, la industria, expuestos a una variedad de contaminantes ambientales, así como el consumo de alimentos procesados y diferentes hábitos como tabáquicos y alcohólicos, patrones que caracterizan a las grandes ciudades28. Sin embargo, las diferencias étnicas pudieran revelar variaciones en la respuesta del hospedero ante la infección gástrica por H. pylori. Por lo antes mencionado, el objetivo del presente estudio fue evaluar la expresión de citocinas (IL-1B, IL4, TNFα y INFγ), en la mucosa gástrica de urbanos venezolanos mestizos y indígenas Wayuu infectados por H. pylori. 13 MATERIALES Y MÉTODOS DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN TIPO DE DISEÑO: Se realizó un estudio prospectivo, descriptivo y transversal, enmarcado en el área de la Inmunología gastrointestinal y dirigido a conocer las diferencias en la expresión de citocinas en la mucosa gástrica de individuos urbanos venezolanos infectados por H. pylori. ASPECTOS BIOÉTICOS: Este estudio se rigió por las normas éticas para la investigación en sujetos humanos, establecidas en la Declaración de Helsinki29, por lo cual todos los pacientes fueron invitados a participar de manera voluntaria, informándoseles las características del estudio, tanto de forma verbal como por escrito, a través de la hoja de Consentimiento Informado. Este Proyecto está enmarcado dentro de los lineamientos establecidos en el Código de Bioética del Fondo Nacional para la Ciencia y la Tecnología adscrito al Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Bolivariana de Venezuela30, y está avalado por el Consejo de Humanístico (Proyecto Condes-LUZ CC-0967-08) y el Consejo Técnico del Instituto de Investigaciones Biológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO La población estuvo constituida por todos los pacientes que acudieron de forma voluntaria al Servicio de Gastroenterología del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (S.A.H.U.M.), entre Junio de 2.008 y Septiembre de 2.009, siendo el muestreo no probabilístico e intencional. La muestra estuvo constituida por 50 pacientes urbanos quienes acudieron al referido Servicio, presentando síntomas sugestivos de Enfermedad Ácido-Péptica31. Se consideró pacientes urbanos aquellos individuos procedentes del Municipio Maracaibo, fueron excluidos los individuos procedentes de zonas rurales del Estado Zulia. 14 De acuerdo a la infección por H. pylori la muestra fue dividida en dos grupos: Grupo H. pylori negativo (-): Pacientes en quienes, aún presentando síntomas de enfermedad ácido-péptica, diagnostico endoscópico de gastropatía y hallazgo histológico de gastritis, no cumplieron con los criterios mínimos para ser considerados como portadores de infección activa por H. pylori, es decir, pacientes en quienes las tres pruebas utilizadas para el diagnostico de H. pylori (Prueba de Ureasa, Cultivo para H. pylori y diagnostico histológico de H. pylori), arrojaron resultaron negativas. La negatividad en las tres pruebas en este grupo fue considerado, con el objeto de aumentar la especificidad de las pruebas utilizadas, es decir, diagnosticar verdaderos negativos32. Grupo H. pylori positivo (+): Pacientes con síntomas de enfermedad ácido-péptica, diagnóstico endoscópico de gastropatía y hallazgos histológico de gastritis y portadores de infección activa por H. pylori. Se consideró infección activa cuando dos de las pruebas utilizadas para el diagnostico de H. pylori fuera positiva (Prueba de Ureasa, Cultivo para H. pylori y diagnostico histológico de H. pylori). Las positividad en más de dos pruebas fue utilizada como criterio para aumentar la sensibilidad de las pruebas, es decir diagnosticas verdaderos positivos32. Origen Étnico: Se consideró mestizos, pacientes procedente de la localidad (Municipio Maracaibo) que no presente de manera característica los rasgos faciales característicos de alguna de las etnias “puras” del Zulia (Wayuu, Añu, Yukpa, Yapreira y Afroamericanos), y que nieguen ser descendientes directos de alguno de los grupos étnicos antes referidos. Mientras que se consideró Indígenas Wayuu, pacientes procedentes de la localidad (Municipio Maracaibo) que presente de manera evidente los rasgos faciales característicos de dicha etnia (piel morena, rostro ovalado, cabello negro y liso, ojos asiáticos, acento propio del idioma Wayuu…), siempre y cuando refieran ser descendientes de padre, madre y abuelos Wayuu. En relación al origen étnico e infección gástrica por H. pylori la muestra fue dividida en 4 grupos: 1) mestizos H. pylori-, 2) mestizos H. pylori+, 3) Wayuu H. pylori- y 4) Wayuu H. pylori+. 15 CRITERIOS DE INCLUSIÓN: Se incluyeron todos los pacientes con edades comprendidas entre 20 a 50 años de edad, de cualquier género y procedentes del municipio Maracaibo del Estado Zulia, quienes presentaran síntomas crónicos sugestivos de enfermedad Ácido-Péptica31, previo consentimiento informado. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN: Se excluyeron todos los pacientes cuyo estado de salud crítico impidiera que se les practicaran las pruebas endoscópica o de laboratorio requeridas; quienes en el último mes hubiesen recibido o quienes estuviesen recibiendo tratamiento médico con: inhibidores de la secreción ácida gástrica (Antagonistas H2 o Inhibidores de la Bomba de Protones); agentes a los cuales H. pylori pudiera ser sensible (Ej.: metronidazol, amoxicilina, claritromicina y bismuto, entre otros), o con enfermedad hemorrágica activa u otras enfermedades crónicas debilitantes diagnosticadas, tales como cáncer, VIH positivo o síndrome de malabsorción intestinal. DESCRIPCIÓN DE MÉTODOS HISTORIA CLÍNICA: A todos los pacientes se les llenó una historia clínica, cuyos datos fueron obtenidos mediante interrogatorio. Se registraron datos relacionados con: edad, género, origen étnico, antecedentes patológicos de importancia, síntomas sugestivos de enfermedad Ácido Péptica que motivaron la consulta (acidez, dolor abdominal superior, sensación de llenura, eructos, regurgitación de alimentos, sensación subjetiva de mala digestión, vómitos, evacuaciones negruzcas, dificultad para deglutir), enfermedad actual y examen físico general. ENDOSCOPIA DEL TRACTO DIGESTIVO SUPERIOR: El estudio endoscópico del Tracto Digestivo Superior fue realizado por médicos especialistas en gastroenterología del S.A.H.U.M. Antes del iniciar el procedimiento a los pacientes se les aplicó vía oral, un anestésico tópico en spray en la región faríngea (Cifarcaina®), así como sedación endovenosa con Midazolam (Doricum®). En el caso de pacientes con riesgo cardiovascular, se solicitó una evaluación cardiovascular preoperatorio, y tanto la frecuencia cardiaca como la presión arterial fueron monitoreadas durante todo el procedimiento, mediante un monitor de signos vitales (Dynamap®). En el resto de los 16 casos, se monitoreó el pulso y la presión arterial, sólo en el momento en que se considerase necesario. Para iniciar el procedimiento diagnóstico, el videoendoscopio fue introducido mediante el método de visión directa, visualizando la anatomía de la hipofaringe y haciéndolo avanzar por la línea media, en dirección al cartílago cricofaríngeo, dando las instrucciones al paciente y orientando con la mano derecha hacia el esófago bajo visión directa, sosteniendo el control de mando con la mano izquierda33,34. Al llegar al estómago se visualizaron el fundus, el cuerpo y el antro gástrico. Se tomaron biopsias tipo “punch” de la región del antro gástrico, con un dispositivo especial del endoscopio diseñado para tal fin. Una biopsia del antro gástrico fue incluida en un medio de transporte estéril, para sembrar posteriormente un cultivo para H. pylori. Una segunda biopsia del antro fue incluida de inmediato en el vial destinado para la prueba de ureasa. Una tercera biopsia del antro fue incluida en paraformaldehído al 4% bufferado destinado a estudios histopatológicos e inmunohistoquímicos. Finalizado el procedimiento, constatado el estado de bienestar del paciente, los endoscopistas formularon un diagnóstico endoscópico. CULTIVO PARA H. pylori: La biopsia de mucosa antral destinada al cultivo para H. pylori fue colocada en un tubo de microcentrífuga (Eppendorf®), conteniendo 0,5 ml de solución salina fisiológica estéril como medio de transporte. La muestra se procesó en un lapso no mayor de 4 horas; para ello, se realizó una fina disección de la biopsia con una hojilla de bisturí, sobre un vidrio de reloj estéril. Este preparado se sembró en los medios de cultivo para aislamiento primario. Se emplearon dos medios enriquecidos, uno selectivo y uno no selectivo, teniendo ambos como base Agar Brucella suplementado con sangre de carnero al 5%. Al medio selectivo se le adicionaron 4 agentes antimicrobianos: vancomicina, trimetroprim, cefsulodin y anfotericina B. Ambos medios se incubaron en atmósfera microaerofílica húmeda (5% de O2, 10% de CO2 y 85% de N2), utilizando jarras de anaerobiosis y sobres generadores de gases (Campy Pak® o Anaerocult C®), con sistema de evaluación y reemplazo a una temperatura de 35 º C. Los cultivos fueron inspeccionados a los 3, 5 y 7 días. La identificación de los aislamientos fue realizada siguiendo el procedimiento descrito 17 previamente, basado en la morfología de las colonias y células características de H. pylori, y mediante pruebas de oxidasa, catalasa y ureasa positivas35. Todos los procedimientos de cultivo fueron realizados en el Laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad Medicina de LUZ. TEST DE UREASA: Esta prueba está basada en poner de manifiesto la fuerte actividad de ureasa de H. pylori, por medio de la cual este microorganismo puede metabolizar rápidamente la urea con la producción de CO2 y amonio. Una vez tomada la primera biopsia de antro gástrico, ésta se colocó en un tubo de microcentrífuga Eppendorf conteniendo 1,5 ml de agar urea (Difco®), preparado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Este se incubó a 35ºC durante un máximo de 24 horas, verificando periódicamente la aparición de cambios de color en el agar. La prueba fue considerada positiva cuando, dentro del lapso señalado, el indicador rojo de fenol contenido, cambio de un color ámbar suave a un rosado o fucsia intenso. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-CagA DE H. pylori: La presencia de anticuerpos IgG específicos Anti-CagA fueron estudiados empleando Helicoblot 2.0 (Genelabs Diagnostics, Singapore) en una muestra de suero sanguíneo, lo que permitió obtener información sobre los factores de virulencia de las cepas infectantes en los pacientes estudiados. Esta prueba permite identificar y localizar anticuerpos específicos contra estas proteínas de virulencia del microorganismo, en una fase sólida que contiene sus principales antígenos separados electroforéticamente. La banda detectada fue p120 (CagA). La sensibilidad y especificidad reportadas para esta prueba, empleando la histología y/o la microbiología es de 95%32. PROCESAMIENTO DE BIOPSIAS PARA EXAMEN HISTOPATOLÓGICO: Las biopsias recolectadas para estudio histopatológico, fueron procesadas para su observación al microscopio óptico, mediante los procedimientos ordinarios de fijación, deshidratación, inclusión en parafina, corte, desparafinado, fijación a la lámina y coloración con Hematoxilina - Eosina y con Giemsa Modificada, para detectar la presencia de H. pylori en la mucosa gástrica36. Se sometió cada muestra al procedimiento diagnóstico por dos anatomo-patólogos, a fin de poder determinar el 18 rango de error inter-observador. En general, al caracterizar el grado de gastritis, estadio I del Sistema OLGA prevaleció en la mayoría de los pacientes estudiados37. TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICA: La determinación de citocinas en la mucosa gástrica antral: IL-1β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ (Pierce Biotechnology), se realizó mediante coloraciones inmunohistoquímicas con el método ABC (Vestastain ELITE ABC®), peroxidasa-diaminobenzidina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Este método se fundamenta en la formación del complejo biotina-avidina (ABC) con anticuerpos primarios que reaccionan con los antígenos del tejido en estudio. La visualización se basa en la conversión enzimática de un sustrato cromogénico (3,3' diaminobenzidina) en un precipitado de color marrón, por la enzima peroxidasa de rábano (HRP) en el sitio de localización del antígeno, lo cual puede ser visualizado al microscopio de luz. Una alta sensibilidad de detección se alcanza empleando anticuerpos biotinilados secundarios de alta calidad, y streptavidina de alta sensibilidad conjugada a la peroxidasa. La streptavidina de alta sensibilidad interactúa únicamente con la biotina unida a los anticuerpos secundarios. Las coloraciones inmuhistoquímicas de muestras de biopsia gástrica se llevaron a cabo en secciones de tejidos incluidos en parafina, fijadas en paraformaldehído al 4% y montadas en láminas de vidrio38. Los cortes histológicos fueron sometidos a procedimientos de recuperación antigénica, de acuerdo a la técnica recomendada para cada antígeno en particular, para proceder posteriormente a la coloración histoquímica indirecta. Se realizaron estudios piloto para establecer la dilución óptima de cada anticuerpo primario. Como control del anticuerpo primario, se utilizó un anticuerpo monoclonal del mismo isotipo pero contra un antígeno no presente en el tejido. Las muestras fueron observadas en un microscopio óptico con objetivo de 40X y se procedió a tomar microfotografías digitales por campo, en un microscopio óptico (Axioscop, Zeiss, Alemania). Para la cuantificación de la expresión de las citocinas estudiadas, las imágenes digitales fueron evaluadas en un computador donde se utilizó el Programa Adobe® PhotoShop SC3, la cual permitió conocer el total de pixeles en las microfotografías y las zonas de expresión positiva, las cuales fueron transformadas a mm2. 19 TOMA DE MUESTRA DE SANGRE: Luego de ayuno nocturno por un mínimo de 8 horas, a cada paciente se le tomó una muestra de sangre venosa mediante venipuntura, bajo condiciones de asepsia y antisepsia. Las muestras fueron centrifugadas y el suero fue alicuotado. Las pruebas de laboratorio de rutina se realizaron el mismo día de la toma de muestra. PRUEBAS DE LABORATORIO DE RUTINA: Con el fin de investigar el estado general de salud de los participantes, a todos se les practicó en el laboratorio del S.A.H.U.M., una hematología completa, así como determinaciones séricas de la glicemia, urea, creatinina y se les realizó una prueba para detectar la presencia del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Los datos obtenidos fueron registrados y analizados con el programa estadístico SPSS® - versión 15. Se determinó la distribución normal de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los resultados fueron expresados como promedios + error estándar y la pruebas utilizadas fueron ANOVA de una vía post test de Tukey, considerándose significativo una p<0,05. 20 RESULTADOS CARACTERISTICAS GENERALES De los 50 pacientes estudiados, 43 cumplieron con los criterios de inclusión. Al clasificar según el tipo de etnia e infección por H. pylori, la distribución fue la siguiente: 13 pacientes era mestizos H. pylori-, 13 mestizos H. pylori+, 6 Wayuu H. pylori- y 11 Wayuu H. pylori+. Las características generales de los pacientes estudiados se observa en la tabla 1. EXPRESIÓN DE CITOCINAS EN LA MUCOSA GÁSTRICA La expresión de citocinas en la mucosa gástrica (IL-1β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ) de los pacientes según el tipo de etnia e infección gástrica por H. pylori se observa en la Figura 1. IL-1 β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ presentan niveles de expresión significativamente superiores en los mestizos H. pylori+ comparado con los mestizos H. pylori- (p<0,04); Wayuu H. pylori- (p<0,03); y Wayuu H. pylori+ (p<0,01). No se observó diferencias significativas en las citocinas estudiadas al comparar entre indígenas Wayuu H. pylori- y H. pylori+. ANTICUERPOS ANTI-CagA Al determinar la presencia de anticuerpos séricos IgG Antí-CagA en los pacientes H. pylori+, no se observó diferencia significativa entre mestizos y Wayuu. Un 92,3% de los mestizos y 83,3% de los Wayuu fueron CagA+. 21 Tabla 1 Características Generales de los pacientes según la infección gástrica por H. pylori Variables n Edad (años) Variables Antropométricas Peso (Kg.) Talla (m) IMC (Kg./m2) Variables Bioquímicas Glicemia (mg/dl) Urea (mg/dl) Creatinina (mg/dl) Variables Hematológicas Hemoglobina (g/L) Mestizos H. pylori H. pylori + 13 13 41,0 ± 3,4 38,5 ± 3,6 Indígenas Wayuu H. pylori - H. pylori + 6 11 38,2 ± 4,5 40,1 ± 5,1 76,8 ± 7,3 1,62 ± 0,03 29,3 ±2,9 70,0 ± 1,6 1,60 ± 0,03 27,3 ± 1,2 76,5 ± 2,3 1,60 ± 0,02 22,7 ± 1,3 69,6 ± 2,1 1,59 ± 0,02 24,4 ± 1,4 98,8 ± 10,5 25,5 ± 2,7 0,7 ± 0,03 96,2 ± 8,1 25,3 ± 1,3 0,8 ± 0,07 99,0 ± 7,1 20,2 ± 2,1 0,8 ± 0,05 94,4 ± 4,5 24,0 ± 3,2 0,9 ± 0,06 12,3 ± 0,3 12,7±0,3 12,5 ± 0,3 12,3 ± 0,7 22 23 24 DISCUSIÓN Este estudio inédito a nivel mundial, permitió evaluar la expresión de citocinas en la mucosa gástrica de individuos mestizos e indígenas de la etnia Wayuu del Estado Zulia, Venezuela, con o sin infección por H. pylori. A pesar de la infección por H. pylori en los grupos estudiados la tasa de incidencia y la tasa de mortalidad de cáncer gástrico por 100.000 habitantes es baja en esta región de Venezuela9. Yamaoka y Colaboradores39, señalan que las diferencias geográficas en la incidencia del cáncer gástrico puede ser explicadas por diferencias de genotipos CagA y VacA, así como otras proteínas de virulencia OipA, BabA y AlpAB de H. pylori. Este autor describe que en poblaciones con alta incidencia de cáncer gástrico predomina la cepa CagA tipo Este de Asia (HpEAsia). En contraste, la incidencia de cáncer gástrico es baja en África, Sur de Asia y Europa, dada que la cepa es CagA tipo Occidental. En Kazakhstan existe una alta prevalencia de cáncer gástrico (44/100.000), presentando cepas de H. pylori CagA/oipA/AlpAB, principalmente europeas (HpEuropea) con tipo asiático occidental (HpAsia2). La tasa promedio de incidencia de cáncer gástrico, correspondiente al quinquenio 20002005 en Venezuela para ambos géneros fue de 8,6 por cada 100.000 habitantes. Los estados de Venezuela con tasas más altas, corresponde a: Táchira, Mérida y Trujillo, con tasas de 22,7; 18,4 y 17,4, por cada 100.000 habitantes, respectivamente; cifras bastantes distantes del resto de las entidades como Zulia, Bolívar y Delta Amacuro, con tasas de 6, 5 y 4 por cada 100.000 habitantes9. La razón de estas diferencias no ha sido estudiada. Sin embargo, en un estudio (datos no publicados) la severidad de la gastritis y de la atrofia gástrica, fue significativamente menor en los Wayuu con respecto a los mestizos. Nuestros resultados demuestran un incremento significativo en la expresión de IL-1β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ en los pacientes mestizos infectados por H. pylori con relación a los no infectados (Figura 1). Asimismo, se aprecia que la expresión de las proteínas 25 reguladoras en la mucosa gástrica de mestizos infectados resultó significativamente diferente a la obtenida en indígenas Wayuu con infección bacteriana. Con respecto a los indígenas Wayuu infectados o no, no se apreció significancia estadística en relación a los valores de citocinas. Hwang IR y colaboradores40, concuerda con el incremento de IL-1β y TNF-α en la mucosa gástrica. Estas citocinas proinflamatorias afecta la secreción ácida a nivel local y la colonización bacteriana. Estudios de Beales41, señalan que IL-1β y TNF-α inhiben la secreción de acido por células parietales cultivadas, influyendo la primera citocina en la disminución de la liberación de histamina por células enterocromafines. La importancia de la regulación de la secreción ácida por IL-1β se confirma al revertir la hipoclorhidria, en primates no humanos infectados por H. pylori, con la administración del antagonista de receptor de IL-142. Las citocinas pro-inflamatorias (IFN-γ, TNF-α y IL-8) estimulan la secreción de gastrina en células G cultivadas, produciendo una hipergastrinemia. La hipergastrinemia esta más incrementada en sujetos infectados por H. pylori y seropositivos para CagA que en aquellos sujetos seronegativos con infección bacteriana43. Las acciones biológicas de IL-1β sobre la secreción ácida in situ, son controversiales. Las citocinas inmunorreguladoras Th1 como IFN-γ (Zavros y Cols. 2005) y TNF-α (Beales y Cols., 1997) inhiben la secreción de somastostatina por células D, la principal inhibidora de la secreción ácida. El balance Th1/Th2 participa en la secreción ácida a nivel gástrico44. Akhiani y colaboradores45, han demostrado que la respuesta Th1 esta asociada con la severidad de la gastritis y señalan que lo contrario se observa en ratones deficientes en una citocina del fenotipo Th1 como el IFN-γ. En humanos, los estudios revelan que IFNγ se encuentra disminuido significativamente, con respecto a los controles, cuando niños infectados con H. pylori presentan inflamación leve y moderada de la mucosa gástrica. El incremento en la forma severa no reveló significancia estadística46. Se ha sugerido que los pacientes con infección por H. pylori, tienden a presentar hipersecreción ácida gástrica, como consecuencia de la estimulación en la producción 26 de gastrina (hipergastrinemia) y de la inhibición de la liberación de somatostatina, ambos fenómenos mediados por la liberación de citocinas proinflamatorias en el antro gástrico. Este estado hipersecretorio, conjuntamente con la aparición de metaplasia gástrica en el duodeno, contribuiría a explicar por qué los pacientes con afección de predominio antral son proclives a desarrollar úlcera duodenal47,48. En estos casos de hipergastrinemia, el efecto trófico de la gastrina ha sido involucrado también en la inducción de carcinogénesis49. Menos frecuentemente, algunos individuos desarrollarán una pangastritis con predominio de lesión del corpus gástrico, donde los productos liberados por la bacteria y la acción de ciertas citocinas, afectarán tanto a las células parietales productoras de ácido, como a las células antrales productoras de gastrina, produciéndose en consecuencia un estado de hiposecreción e hipogastrinemia, que conlleva a atrofia gástrica50. Estos pacientes se consideran más susceptibles a desarrollar adenocarcinoma del estómago distal, una forma de cáncer gástrico51. También, la sobre expresión de IL-1β determina el desarrollo de cáncer gástrico. Por lo tanto, nuestros resultados revelan, hipotéticamente, que los urbanos mestizos podrían estar más predispuestos a neoplasia gástrica que los indígenas Wayuu. Para El-Omar EM y colaboradores52, IL-1β es una importante citocina proinflamatoria en el contexto de la infección por H. pylori, y también es un potente inhibidor de la secreción acida53. Estos autores han demostrado que el polimorfismo del gen de IL-1, incrementa el riesgo de cáncer gástrico. Además, los individuos con los genotipos IL1B-31*C o 511*T y IL-1RN*2/*2 tienen más probabilidad de desarrollar hipoclorhidria y atrofia gástrica. Este riesgo se extiende al cáncer gástrico cuando se compara con sujetos que tienen genotipos menos proinflamatorios54. El genotipo TNFA*308A esta asociado con mayor producción de TNF, lo cual junto con IL-1; influyen en la producción de gastrina y la producción acida por las células parietales gástricas55. Además se relaciona con la infección por H. pylori y con el riesgo incrementado de cáncer gástrico56-59. En esta investigación no se evaluó el polimorfismo de las citocinas, ni la estructura genética de la cepa de H. pylori, por lo cual se limita el análisis de los resultados, sobre el comportamiento diferente de las proteínas reguladoras entre mestizos e indígenas 27 Wayuu durante la infección bacteriana. Se ha demostrado un mayor riesgo de cáncer gástrico en lo que respecta al polimorfismo genético de IL-1, IL-2, TNF-α e IL-10. Existen cepas tipo I (CagA+/VacA s1m1), que causan ulceración y cáncer gástrico; y tipo II Cag-/VacA s2m2) que producen menos ulceración y daño del tejido. Sin embargo, estudios han demostrado que la serología CagA no es capaz de predecir la severidad de la enfermedad, mientras que el genotipo cagA es útil. La evaluación de los resultados de nuestra investigación sugiere, en el futuro, determinar los genotipos cagA y vacA en Wayuu y mestizos. Bayraktaroglu y colaboradores60, muestran que la afectación de las proteínas reguladoras es solo a nivel de la mucosa gastroduodenal ya que sus estudios revelan valores séricos normales de TNF-α, IL-6, IL-8 en pacientes infectados. En nuestro caso, la alteración de los niveles de citocinas puede producirse o no in situ, ya que los resultados va a depender de muchos factores como son: 1) Tipo de cepa, así como proteínas asociadas a la virulencia de H. pylori; 2) La inmunogenicidad de la cepa; 3) colonización con múltiples cepas de H. pylori; 4) Estado nutricional del hospedero; 5) Polimorfismo genético de las citocinas; 6) Infecciones e infestaciones concurrentes; y 7) Grupo étnico61. Los estudio para IL-4 en infección por H. pylori son contradictorios, dependiendo del modelo utilizado murino o humano y de las condiciones patológicas asociadas. Los estudios en murinos revelan una disminución en la colonización bacteriana asociada con un incremento en la producción de IL-4 por células CD4+ esplénicas estimulas in vitro62, lo cual sugiere un efecto protector de la citocina. Sin embargo, para Garhart CA y colaboradores63, IL-4 no es esencial para la protección. Otros estudios64,65, no detectan IL-4 en la mucosa gástrica de la mayoría de las personas infectadas por H. pylori. Esto no concuerda con nuestros resultados. Un grupo de investigadores al estudiar la concentración de IL-4 en biopsias de mucosa gástrica reportaron valores superiores en alérgicos infectados con H. pylori que en los infectados no alérgicos46. Pellicano A y colaboradores66, demostraron que los factores de transcripción STAT 4 y T-bet están activados en la mucosa gástrica de pacientes infectados por H. pylori. Esta 28 activación es conducida en parte por IL-12 y asociada con niveles incrementados de IFN-γ. Sin embargo, no se conoce si la modulación de la respuesta inflamatoria en la mucosa gástrica es efectiva para la eliminación de la bacteria y para la prevención de las consecuencias patológicas relacionadas con H. pylori. La expresión significativa de TNF-α e IFN-γ en urbanos mestizos con respecto a indígenas Wayuu podría explicarse, tomando en cuenta estudios previos, que señalan que la mayor expresión de estas proteínas reguladoras puede estar asociada con severidad de la gastritis por el gran infiltrado de células mononucleares in situ. Indudablemente, existen factores endógenos (Ej. Características genéticas del hospedero) y exógenos; tipo y subtipo de cepa de H. pylori, medio ambiente, entre otros que protege a la etnia Wayuu. Otra factores que expliquen la mayor expresión de citocinas en la mucosa gástrica en los mestizos, es la colonización con múltiples cepas de H. pylori, siendo más común en países de elevada prevalencia67-69. Estudios realizados en Venezuela70, evidencian colonización con múltiples cepas en los mestizos, lo cual pudiera estar alterando el comportamiento de las citocinas in situ. Para concluir, se puede inferir que estudios futuros del genotipo de H. pylori de diferentes poblaciones humanas podría identificar nuevos factores que afecta la colonización o la enfermedad en individuos de diferentes etnias, así como, entender mejor el origen y evolución de la bacteria. 29 CONCLUSIONES 1. IL-1β, TNF-α, IL-4 e IFN-γ se expresan significativamente en la mucosa gástrica de individuos mestizos infectados con H. pylori comparado con los mestizos no infectados. 2. La sobre expresión de IL-1β en los mestizos infectados con H. pylori, podría incrementar el riesgo de cáncer gástrico, y TNF-α e IFN-γ, favorecen el estado hipersecretor de la mucosa que conlleva a una mayor progresión de las lesiones gástricas. 3. Los Wayuu con H. pylori presentan una disminución significativa de la expresión de citocinas en la mucosa gástrica al comparar con los mestizos infectados, a pesar de la presencia de cepas CagA+ en ambos grupos. 30 RECOMENDACIONES 1. Realizar estudios del polimorfismo de genes de IL-1β y TNF-α, de alto riesgo para cáncer gástrico en población mestiza y Wayuu. 2. Estudiar el genotipo de cepas de H. pylori en Wayuu y mestizos del estado Zulia y correlacionarlo con la expresión de citocinas en la mucosa gástrica, para establecer el tipo y subtipo de cepas que coloniza la mucosa gástrica de los grupos estudiados. 3. Comparar mediante estudios anatomopatológicos, el grado de lesión tisular, atrofia y metaplasia de la mucosa mestizos y Wayuu infectados por H. pylori, con el objeto de corroborar si los Wayuu tienen un menor grado de lesión y progresión a cambios neoplásicos. 4. Determinar marcados de diferenciación celular como CD3 (linfocitos T), CD4 (linfocitos T helper), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD20 (linfocitos B), CD68 (macrófagos) y otros marcados en Wayuu y mestizos. 5. Evaluar el estado secretor de la mucosa gástrica de Wayuu y mestizos infectados por H. pylori, mediante la cuantificación de los niveles séricos de Gastrina-17, y de Pepsinógeno I y II. 31 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Blazer MJ, Atherton JC. Helicobacter pylori persistence: biology and disease. J. Clin Invest 2004;113:321-333. 2. Oh JD, Karma SM, Gordon JI. Intracellular Helicobacter pylori in gastric epithelial progenitors. Prot Nath Acad Sci USA 2005; 102:5186-5191. 3. Nechi V, Candusso ME, Tava F, Luinetti O, Ventura U, Fiocca R, Ricci V, Solcia E. Intracellular, Intercellular, and estromal invasion of gastric mucosa, preneoplastic lesions, and cancer by Helicobacter pylori. Gastroenterology 2007; 132:1009-1023. 4. Serrano C, Diaz M, Valdivia A, Godoy A, Peña A, Rolan A, Kirberg A, Hebel E, Rollan A, Kierberg A, Hebe E, Fierro J, Klapp G, Venegas A, Harris P. Relationship between Helicobacter pylori virulence factor and regulatory cytokines as predictor of clinical outcome. 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