muerte celular en la línea de leucemia mielogénica crónica k

Transcripción

2° Congreso Nacional de Química Médica
González-Sánchez y col.
MUERTE CELULAR EN LA LÍNEA DE LEUCEMIA
MIELOGÉNICA CRÓNICA K-562 INDUCIDA POR EL
COMPUESTO D3CLP, UN NUEVO DERIVADO
TIAZOLO[5,4-B]QUINOLINA.
González Sánchez Ignacio*, Cerbón Cervantes Marco A, Lira Rocha Alfonso, Solano Becerra
José D., Loza Mejía Marco A., Olvera Vázquez Susana. Facultad de Quimica UNAM.
*[email protected]
RESUMEN
La actividad antitumoral de diversos compuestos tricíclicos ha sido estudiada,
particularmente las 9-arilaminoacridinas, un ejemplo representativo el intercalador de
ADN y potente fármaco antileucémico amsacrina.
Recientemente se han sintetizado nuevos derivados de tiazolo[5,4-b]quinolina,
considerados isosteros de la 9-anilinoacridina y han mostrado actividad como
intercaladores, de los cuales sobresale el compuesto D3CLP que adicionalmente
presentó una IC50 de 10 µM en células K-562.
En este trabajo se planteó evaluar la muerte celular por el cual el compuesto D3CLP
es citotóxico, lo que nos acercará a describir el mecanismo de acción de este tipo de
compuestos.
Para llevar a acabo el presente trabajo se cultivó la línea celular K-562 en una
atmósfera de 98% de humedad, 5% de CO2 a 37º C. Las células se trataron el
compuesto D3CLP a una concentración de 10 µM a diferentes tiempos, para realizar
análisis de citometría de flujo y de TUNEL.
Los resultados del contenido de DNA por citometría de flujo mostraron que a partir de
las 12 horas hay contenido de DNA sub-G1 evidenciando fragmentación de DNA,
mientras que las fases del ciclo celular antes de este tiempo no son modificadas, lo
cual indica ausencia de arresto celular. Para confirmar dicha fragmentación se realizó
un ensayo de TUNEL, el cual reveló un inicio de la fragmentación desde las 3 primeras
horas de tratamiento, observándose un máximo a las 12 horas corroborando los datos
de citometría de flujo. Los resultados en células tratadas con m-Amsa utilizado como
control positivo fueron similares.
Con estos resultados se puede concluir que D3CLP no induce un proceso citostático
en células K-562 y que la probable causa de su citotoxicidad sea una muerte de tipo
apoptótica.
Palabras clave: cáncer, apoptosis, citotóxico
INTRODUCCIÓN
La actividad antitumoral de diversos compuestos tricíclicos ha sido estudiada,
particularmente las 9-arilaminoacridinas, un ejemplo representativo es el intercalador
de DNA y potente fármaco antileucémico amsacrina (figura 1), el cual induce muerte
celular de tipo apoptótica.
H3CO
NHSO2CH3
HN
N
Figura 1. Amsacrina (m-Amsa)
Alvarez-Ibarra en 1997 sintetizó derivados tiazolo[5,4-b]quinolina y evaluó las
propiedades como agentes antitumorales potenciales. Dichos derivados se encuentran
relacionados con las quinolinas y acridinas mediante una sustitución isostérica de un
anillo de benceno por un anillo tiazolo. Sus resultados muestran que el compuesto 7fluoro-2-[[(N,N-dietilamino)etil]amino]
-9-hidroxitiazolo[5,4-b]quinolina
(figura
2)
presentó una actividad significativa in vitro contra células P-388 de leucemia murina,
células A-549 de carcinoma de pulmón humano y células HT-29 de tumor de colon
humano, con valores de IC50 de 1.65, 2.9 y 5 µM, respectivamente1.
OH
F
H3C
N
CH3
N
N
S
N
H
Figura 2. 7-fluoro -2-[[(N,N-dietilamino)etil]amino] -9-hidroxitiazolo[5,4-b]quinolina.
Recientemente Lira-Rocha y colaboradores han sintetizado nuevos derivados
de tiazolo[5,4-b]quinolina, considerados isosteros de la 9-anilinoacridina los cuales han
mostrado actividad como intercaladores, estos compuestos conservan el sustituyente
N,N-dietilamino-etil-amino en la posición 2 de los cuales destaca, el 9-anilino-2-[[(N,Ndietilamino)etil]amino]tiazolo[5,4-b]quinolina (figura 3A), obteniendo una IC50 16.8 µM
en células de leucemia mielogénica crónica humana K-5622.
Con el objetivo de mejorar la actividad citotóxica, el grupo de investigación de
Lira-Rocha sintetizó una nueva serie de compuestos, proponiendo la elongación de la
cadena N,N-dietilamino-etil-amino a N,N-dietilamino-propil-amino además de probar
sustituyentes electroatractores. Uno de estos compuestos, el D3CLP (figura 3B)
presentó una IC50 de 10 µM en células K-562.
A.
B.
Cl
H3C
H3C
N
HN
HN
N
H3C
N
N
NH
N
NH
S
N
H3C
S
D3CLP
9-anilino-2-[[(N,Ndietilamino)etil]amino]tiazolo[5,4-b]quinolina
9-(3-cloro)anilino-2-[[(N,Ndietilamino)etil]amino]tiazolo[5,4-b]quinolina
Figura 3. Derivados de tiazolo[5,4-b]quinolina.
El mecanismo de apoptosis es una importante vía en la citotoxicidad inducida
por compuestos anticancerígenos3. Numerosos trabajos reportados en la literatura
han señalado que algunos fármacos tales como taxol, vinblastina, etoposido, ara-C,
adriamicina, así como numerosos compuestos citotóxicos de origen natural, inducen la
muerte de las células tumorales a través de una muerte celular programada o
apoptosis, tanto in vivo como in vitro. Las características morfológicas de la apoptosis
fueron descritas y caracterizadas hace 30 años por Kerr y colaboradores en 1972, las
cuales incluyen condensación cromosómica, fragmentación del DNA, disminución del
volumen celular así como formación de cuerpos apoptóticos4.
En el presente estudio nos propusimos caracterizar el tipo de muerte celular
que induce el compuesto D3CLP en células K-562 in vitro lo que nos acercará a
describir el mecanismo de acción de este tipo de compuestos. Este compuesto podría
inducir muerte celular de tipo apoptótica, ya que presenta similitudes estructurales con
m-Amsa y además comparte con este la propiedad de ser un intercalador del DNA.
Para llevar a acabo el presente trabajo se cultivó la línea celular K-562 en una
atmósfera de 98% de humedad, 5% de CO2 a 37º C. Las células se trataron con el
compuesto D3CLP a una concentración de 10 µM a diferentes tiempos para realizar
análisis de citometría de flujo y de TUNEL, así como estudios de citotoxicidad por
MTT.
Se ha encontrado que algunos compuestos citotóxicos producen un arresto del
ciclo celular antes de inducir apoptosis. Con el fin de analizar posibles alteraciones en
el ciclo celular se trataron células con dimetilsulfóxido (DMSO) como control de
disolvente, D3CLP y m-Amsa. Los resultados del contenido de DNA por citometría de
flujo mostraron que a partir de las 12 horas hay contenido de DNA sub-G1
evidenciando fragmentación de DNA, mientras que las fases del ciclo celular antes de
este tiempo no son modificadas, lo cual indica ausencia de arresto celular (figura 4).
DMSO
D3CLP
m-Amsa
G1
s
3h
12 h
Número de eventos
6h
G2/M
SubG1
24 h
Contenido de DNA
Figura 4. Distribución de las fases del ciclo celular mediante la determinación del contenido de DNA,
llevada a cabo por citometría de flujo en célula K-562 tratadas con D3CLP a 10 µM (columna central), mAmsa 19 µM (columna derecha) y su control disolvente DMSO (columna izquierda). Estos histogramas
se obtuvieron por citometría de flujo y tinción celular con yoduro de propidio.
La fragmentación de DNA inducida por el compuesto D3CLP en células K-562
también se determino por TUNEL (Tdt-mediated dUTP nick end labeling), el cual
reveló un inicio de la fragmentación desde las 12 horas de tratamiento (figura 5). Los
resultados en células tratadas con m-Amsa como control positivo fueron similares y
con ambos compuestos se observaron cuerpos apoptoticos, con lo que se sugiere
fuertemente que la muerte celular inducida por D3CLP es de tipo apoptotica.
A
B
D
C
Figura 5. Determinación de la fragmentación de DNA mediante TUNEL en células K-562 tratadas con: A)
Control negativo, B) Control positivo, células tratadas con Dnasa 3 U/ml. C) Células tratadas con D3CLP
a 10 µM. D) Células tratadas con m-Amsa 19 µM a 12 horas de incubación.
Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo tanto en células K-562 como
en células mononucleares de sangre periférica, los cuales muestran que la
citotoxicidad fue relativamente mas baja en células normales que en las células
tumorales K-562 (Figura 6), lo que podría ayudar a convalidar que se sigan estudiando
este tipo de compuestos como probables agentes antitumorales.
60
IC50 (µM )
45
30
15
0
Linfocitos
K-562
Figura 6. IC50 para el compuesto D3CLP en linfocitos y en células tumorales, utilizando ensayos de MTT
REFERENCIAS
1.
2.
3.
4.
Alvarez-Ibarra C., Fernández-Granda R,. Quiroga M L., Carbonell A, Cárdenas F, Giralt E. 1997.
Synthesis and antitumor evaluation of new thiazolo[5,4-b]quinoline derivatives. J. Med. Chem. 40(5),
668-676
Rodríguez-Loaiza P, Quintero A, Rodríguez-Sotres R, Solano J. D, 2004. Synthesis and evaluation of
9-anilino-thiazolo[5,4-b]quinoline derivatives as potential antitumorals. Eur J Med Chem.; 39(1):5-10
Kerr, J. F., Winterford, C. M., Harman, B. V. 1994. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer
therapy. 73:8, 2013-2023.
Kerr J. F, Wyllie A. H,currie A. R. 1972. Apoptosis: a basic phenomenon with wide-ranging implication
in tissue kinetics. Br, J. Cancer. 26, 293

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