2- TP EXTRACCION

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2- TP EXTRACCION

INFORME DEL TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO: REPARTO DE AFINIDAD
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ASIGNATURA: PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS I – 2016
TITULO: REPARTO DE AFINIDAD
OBJETIVO: Analizar el principio de extracción empleando sistemas bifásicos acuosos
de afinidad utilizando un ligando libre.
METODOLOGÍA DE TRABAJO:
Fundamento:
El significado de la palabra afinidad, en lo que se refiere a la separación de
proteínas, ha experimentado cambios excepcionales a lo largo de los últimos años. No
sólo se limita a la cromatografía de afinidad, sino que también incluye a la precipitación
y a la purificación y extracción en sistemas de dos y tres fases (Mondal & Gupta, 2006).
La técnica conocida como Reparto de Afinidad (RA) puede aplicarse a la
utilización de los sistemas bifásicos acuosos con el fin de mejorar la selectividad del
reparto. El ligando de afinidad puede incorporarse al SBA unido covalentemente al PCF
(Tejedor et al., 1992) aunque el procedimiento de obtención del conjugado PCF-ligando
de afinidad es algo complicado, demandando una serie de pasos cromatográficos y
diversas extracciones con solventes. El RA también puede llevarse a cabo utilizando
ligandos libres, es decir, no unidos covalentemente al polímero, haciendo a ésta técnica
más rápida, sencilla y económica.
La interacción entre la proteína y el ligando da lugar a la formación de un
complejo cuyo reparto selectivo conduce a la proteína de interés hacia la fase
enriquecida en el ligando, dejando las sustancias o proteínas contaminantes en la fase
contraria y aumentando, de este modo, la capacidad de resolución del sistema
(Gouveia & Kilikian, 2000; Xu et al.; 2002).
Entre los ligandos empleados se incluyen sustratos, inhibidores, anticuerpos, o
moléculas específicas tales como cofactores y colorantes (Ling & Mattiasson, 1983).
Dentro de éstos, los más frecuentemente usados en los últimos años, pertenecen al
grupo de los colorantes derivados de la triazina (Johansson & Joelsson, 1986; Tjerneld
et al., 1987) que presentan analogía estructural con ciertas coenzimas y pueden
interaccionar específicamente con gran número de enzimas mediante fuerzas
electrostáticas e hidrofóbicas (Yakup ArIca et al., 2004).
Los colorantes usados en la industria textil para colorear telas o cueros poseen
la particularidad de ser solubles en agua. La mayoría de los colorantes exhiben una
amplia gama de estructuras químicas diferentes, principalmente basadas en anillos
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aromáticos sustituidos y grupos heterocíclicos. Su estructura química consiste en un
cromóforo (responsable del color) y un grupo funcional que es capaz de interaccionar
covalentemente con la celulosa textil (Mondal, 2006), por lo que se los conoce también
como colorantes reactivos.
Estas moléculas son consideradas como una de las alternativas más
importantes en el reparto de afinidad ya que tienen la capacidad de interaccionar de
manera selectiva y reversible con los sitios activos de muchas enzimas debido a que
presentan una estructura muy semejante a los sustratos y cofactores. Otras de las
ventajas que poseen son sus bajos costos y su gran disponibilidad comercial.
Dentro de los colorantes reactivos, los ligandos más frecuentemente usados en
los últimos años pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la triazina
(Johansson & Joelsson, 1986; Tjerneld et al., 1987), tal como el Reactive Yellow-2 (RY2).
Figura 1.: Estructura química del RY-2.
Como puede observarse en la figura 1, esta molécula de PM 873 Da presenta
una estructura muy compleja, formada por grupos polares y no polares que le permiten
interaccionar con las proteínas mediante fuerzas hidrofóbicas y electrostáticas
(Fisichella, 2002; Suen, 1997). Puede notarse además la presencia de anillos
aromáticos sustituidos, dos aminas primarias y tres grupos sulfónicos que son los que
le confieren su solubilidad característica en medio acuoso. Estos grupos se hallan
cargados negativamente a todos los valores de pH (Yakup ArIca, 2004).
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Materiales y reactivos
- Maltodextrina
- pHmetro
- PEG6000
- soluciones de calibración
- Agitadores
- Pipetas Pasteur
- Moscas
- Balanza
- Vasos de precipitado
-
- Tubos Falcon de 50 ml
- tubos de kham
Frascos
para
almacenar
soluciones preparadas.
-
espátula
- gradillas
Procedimiento:
Indicaciones Generales:
En la comisión los alumnos preparan los SBA a partir de las siguientes soluciones
madres, las que deberán ser preparadas previamente por los auxiliares:
Soluciones madres:
1) Polietilenglicol de peso molecular 600: calcular los gramos de PEG600 40%P/P.
La misma se preparará por pesada directa de la droga sólida y disuelta en agua
destilada. Pesar en vaso de precipitado, con mosca, la droga sólida y el agua
CSP. Tapar con film. Agitar en agitador magnético por 20 minutos. Trasvasar a
un frasco. Rotular.
2) Citrato de sodio: Maltodextrina (Mdx): calcular los gramos de Maltodextrina
40%P/P. Pesar en vaso de precipitado, con mosca, Mdx y cs de agua. Agitar en
agitador magnético. Completar la masa total con agua. Tarda. Trasvasar a un
frasco. Rotular
Preparación de los SBAs PEG/Mdx: Para la preparación de los sistemas bifásicos
acuosos, se mezclan en forma directa soluciones de PEG al 40% P/P, Mdx al 40% P/P.
Los SBAs preparados en falcon de 50 ml, se agitarán por 15 minutos y posteriormente
se dejarán en reposo de modo que alcancen el equilibrio de separación de fases a
temperatura controlada y constante durante 20 minutos. Rotular con el nombre del
SBA. No guardar en heladera!! Porque cambia el equilibrio de reparto.
Se prepararan 2 sistemas bifásicos madres de 45 g cada uno utilizando la composición
total indicada en cada caso.
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Preparación de los SBA:
La preparación de los SBA se hace a partir de las composiciones totales. Se calcula la
cantidad de masa a agregar a cada sistema teniendo en cuenta la concentración de las
soluciones madre que se han preparado. Por ejemplo para PEG600:
Ci x mi = Cf x mf
Donde:
Ci es la concentración de la solución madre de PEG600: 40%P/P
mi, la masa que hay que colocar: incógnita
Cf es la concentración final de PEG600 en el SBA: x %P/P
mf, la masa final del SBA: 45 gramos
Para el caso de citrato se realiza la misma cuenta pero en lugar de utilizar los datos del
PEG se utilizan los de la solución de NaCit.
TABLA 1:COMPOSICIONES TOTALES A UTILIZAR EN EL TP
Temperatura SAB
Composición total
22°C
PEG 600
(%P/P)
Mdx
(%P/P)
1
10,00
25,00
2
5,00
25,00
Masa a agregar para armar el SBA
PEG
NaCit
H2O
(g)
(g)
(g)
REPARTO DE RY2
Materiales y reactivos:
- Pipetas Pasteur
- Solución
RY2
- Descarte de interfase
4,2
%
P/V
- Fotómetro
(preparada por los encargados del
- Cubeta de vidrio
TP)
- Pipetas
- SBA preparados previamente
- Propipetas
- Tubos de Khan (10 por grupo)
- Descarte para colorante
- Gradilla (3)
- buffer fosfato 50 mM, pH 6,4
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METODOLOGíA
Cada alumno realizará dos repartos diferente y luego se intercambiarán los datos entre
ellos para poder sacar conclusiones.
El procedimiento general es:
El procedimiento general es:
1. Observar el SBA madre, calcular el volumen de cada fase.
2. Separar las fases superior e inferior de los sistemas madre preparados por los
auxiliares o por la comisión anterior.
3. Con las fases separadas reconstituir nuevos SBAs (SBA preformados) para ensayar
posteriormente sobre ellos el reparto del colorante con 2 gramos de cada fase, es decir
4 gramos totales.
4. Sobre los SBAs preformados se adicionarán alícuotas suficientemente pequeñas
del colorante (que no superaran el 5% de la masa total del sistema), de modo que el
agregado no distorsione la composición de fase.
5. Luego de mezclar los sistemas durante 15 minutos en forma suave, dejar reposar
durante 20 min.
6. Alcanzado el equilibrio de reparto, se tomaran alícuotas de cada fase, y se
determinará la concentración de colorante.
7. Con los datos obtenidos, se determinará el coeficiente de reparto (Kr) como:
Kr =
[ RY 2]sup
[ RY 2]inf
donde [RY2]sup y [RY2]inf son las concentraciones de RY2 en la fase superior e inferior,
respectivamente.
7. Calcular el rendimiento en la fase superior como:
R% fase =
masa ⋅ de ⋅ RY 2 ⋅ en ⋅ fase
masa ⋅ de ⋅ RY 2 ⋅ sembrada ⋅ en ⋅ SBA
Cuantificación del Reactive Yellow-2
La determinación de la concentración del colorante triazínico Reactive Yellow-2 se
estima por espectrofotometría UV. Este colorante presenta dos máximos de absorción:
a 270 y 407 nm.
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A través de las titulaciones espectrofotométricas de las muestras a 407 nm, se
calculará la concentración de RY-2. Las determinaciones se llevaran a cabo en buffer
fosfato 50 mM, pH 6,4. El cálculo se realizara a partir de la curva de calibración
realizada por los auxiliares.
CURVA DE CALIBRACION
Se utiliza una solución 0,421 %P/P de RY2 y se prepara los siguientes tubos con fase
superior, en buffer Pi o agua destilada (la curva igual pendiente).
Se diluyó al medio con buffer Pi para medir absorbancia. Cada punto se realizó por
duplicado.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
ul RY2
0.0000
5.0000
10.0000
15.0000
20.0000
25.0000
30.0000
VolFsup
500.0000
500.0000
500.0000
500.0000
500.0000
500.0000
500.0000
Vol Pi
500.0000
495.0000
490.0000
485.0000
480.0000
475.0000
470.0000
[RY2]CUBETA
Ab407
(%P/P)
promedio
0.0000
1.4667e-3
2.9333e-3
4.4000e-3
5.8667e-3
7.3333e-3
8.8000e-3
0.0000
0.1830
0.3880
0.5280
0.6420
0.8800
1.0300
Curva de Calibración RY-2
1.2
1.0
Abs 407 nm
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.000
0.002
0.004
0.006
[RY-2] % p/p
La ecuación de la recta, con r ² =99.6, es la siguiente:
Abs = 0,0139 + 115,3733 ∗ [RY−2]
0.008
0.010
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Protocolo de trabajo para los alumnos:
A 25°C
1- Separadas las fases superior e inferior, armar a partir del SBA madre 4 SBA
pequeños en tubos de khan con 2 gramos de cada una de las fases. (2 cada
alumno)
2- Sembrar sobre cada uno de los SBA pequeños el volumen de RY2 indicado en la
siguiente tabla. Registrar la concentración de la solución de RY2.
TABLA 3: VOLUMENES A AGREGAR DE RY2.
TUBO
1
2
3
4
5
6
Sistema
A
B
C
D
E
F
Volumen de RY2 (uL)
20
40
60
80
100
120
3- Rotular los tubos de acuerdo al volumen sembrado de RY2.
4- Agitar suavemente durante 5 minutos.
5- Dejar reposar durante 20 minutos.
6- Separar las fases superior e inferior.
7- Medir absorbancia a 407nm de cada fase. Completar la siguiente tabla:
Para medir la concentración de la Fase Superior: Tomar 1000 ul de fase y
agregar 1000 ul de buffer fosfato 50 mM pH 6.00
TABLA 4: Absorbancia 407nm.
SBA
1
TUBO
1
2
3
4
5
6
Sistema
A
B
C
D
E
F
F. SUPERIOR
F. INFERIOR
2
F. SUPERIOR
F. INFERIOR
PROCESAMIENTO DE DATOS.
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1- A partir de la curva de calibración determinar la concentración de RY2 en fase
superior e inferior y Calcular Kr.
2- Determinar los mg en cada fase y calcular el R%.
3- analizar el balance de masa
4- graficar la concentración de RY2 en la fase superior e inferior en función del
parámetro estudiado.
5- Graficar el coeficiente de reparto de RY2 en función del parámetro estudiado.
6- Graficar el Rendimiento de recupero en función del parámetro estudiado
7- Concluir acerca del efecto analizado sobre el coeficiente de reparto.
Referencias:
-
Mondal, K. and Gupta, M. N. The affinity concept in bioseparations: Evolving paradigms end
expanding range of applications. Biomolecular Engineering, 23, 59-76. (2006)
-
Tejedor, M.C., Delgado, C., Grupeli, M., Luque, J. Affinity partitioning of erythrocytic
phosphofructokinase in aqueous two-phase systems containing poly(ethyleneglycol)-bound
Cibacron Blue. Influence of
pH,
ionic
strength and substrates/effectors. Journal
of
Chromatography, 589, 127-134. (1992)
-
Gouveia, T. and Kilikian, B. Bioaffinity extraction of glucoamylase in aqueous two-phase systems
using starch as free bioligand. Journal of Chromatography B, 743, 241-246. (2000)
-
Xu, Y., Vitolo, M., Northfleet Albuquerque, C. and Pessoa, A. Jr. Affinity partitioning of glucose-6phosphate dehydrogenase and hexokinase in aqueous two-phase systems with free triazine dye
ligands. Journal of Chromatography B, 780, 53-60. (2002)
-
Ling, T.G., and Mattiasson, B. A general study of the binding and separation in partition affinity
ligand assay. Immunoassay of beta 2-microglobulin. Journal of Immunology Methods, 59 (3),
327-337. (1983)
-
Johansson, G., and Joelsson, M. Specifically increased solubility of enzymes in polyethylenglycol
solutions using polymer-bound triazine dyes. Analytical Biochemistry 158(1), 104-110. (1986)
-
Tjerneld, F., Johansson, G., Joelsson, M. Affinity liquid-liquid extraction of lactate dehydrogenase
on a large scale. Biotechnology and Bioengineering 30(7), 809-816. (1987)
-
Yakup ArIca, M., Yilmaz, M., YalçIn, E., and Bayramoglu, G. Surface properties of Reactive
Yellow 2 immobilized pHEMA and HEMA/chitosan membranes: characterization of their
selectivity to different proteins. Journal of Membrane Science, 240(1-2), 167-178. (2004)
-
Fisichella, S., Alberghina, G., Amato, M. E., Fichera, M., Palermo, A., Pogna, N. E., Savarino, A.
Purification of Wheat Flour High - Mr Glutenin Subunits by Dye-ligand Chromatography. Journal
of Cereal Science, 36, 103. (2002)
-
Albertsson P. A. Partition of Cell Particles and Macromolecules; Third Edition. Edited by WileyInterscience. New York. (1986)

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