oligomerización de los receptores de endotelina eta y etb

oligomerización de los receptores de endotelina eta y etb

PROFESOR PATROCINANTE:
Dr. Carlos González
Instituto de Fisiología
Facultad de Medicina
OLIGOMERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES DE
ENDOTELINA ETA Y ETB
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
PAMELA ALEJANDRA VELOSO URIBE
VALDIVIA-CHILE
2013
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer a mis padres, por su apoyo incondicional hacia mí, cuando los días se
mostraban oscuros, a mis amigos más queridos, que estaban para consolarme y darme ánimo. Y
sobre todo a Dios, por no dejar perderme en la frustración e impotencia, y seguir adelante con lo
que empecé con tanta admiración y amor, que es la investigación.
Además, agradezco, y doy gracias que aún existan profesionales como el Dr. Ociel
Muñoz, Dr. Humberto Dölz y el Dr. Alejandro Reyes, que sienten amor por lo que hacen y lo
transmiten a sus estudiantes, dan la fuerza para continuar en este largo camino.
De igual manera, mis agradecimientos por el apoyo y orientación de los que forman parte
del equipo del Laboratorio de Endocrinología molecular y al personal del Instituto de Fisiología,
en especial al Dr. Carlos González por brindarme la posibilidad de realizar mi tesis en su
laboratorio, y a la Profesora Carolina Villanueva por ser una guía en el desarrollo de mi
investigación.
Esta tesis fue realizada en el Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad Austral de Chile y financiada por el proyecto FONDECYT 1100871.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
1.
RESUMEN
1
SUMMARY
2
2.
INTRODUCCIÓN
3
3.
MATERIALES Y MÉTODOS
10
3.1
MATERIALES
10
3.1.1
Reactivos.
10
3.1.2
Anticuerpos.
11
3.1.3
Equipos.
12
3.2
MÉTODOS
14
3.2.1
Generación de receptores de endotelina ETA y ETB como
proteína de fusión a YFP y CFP o con el epítope HA.
3.2.1.1
Diseño de partidores.
14
3.2.1.2
Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
16
3.2.1.3
Electroforesis en geles de agarosa.
17
3.2.1.4
Purificación de productos de amplificación obtenidos por PCR y
17
por digestión con endonucleasas de restricción.
3.2.1.5
Clonamiento de productos de amplificación en vector pcDNA 3.1 (+),
18
pEYFP-N1 y pECFP-N1.
3.2.1.6
Reacción de ligación.
19
3.2.1.7
Transformación de células competentes.
19
3.2.1.8
Purificación del DNA plasmidial a pequeña escala.
20
3.2.1.9
Purificación del DNA plasmidial a mediana escala.
21
3.2.1.10
Cuantificación del DNA plasmidial.
21
3.2.2
Expresión transitoria y detección por Western blotting de los
receptores de endotelina ETA y ETB generados como proteínas
de fusión a YFP y CFP o con el epítope HA en células CHO-K1.
3.2.2.1
Cultivo celular.
22
3.2.2.2
Transfecciones transitorias.
22
3.2.2.3
Extracción de proteínas totales.
23
3.2.2.4
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes
24
(SDS-PAGE).
3.2.2.5
Inmunodetección por Western blotting.
3.2.3
Estudios de interacción por co-inmunoprecipitación entre los
24
receptores de endotelina ETA y ETB.
3.2.3.1
Ensayos de co-inmunoprecipitación.
3.2.4
Expresión transitoria de los receptores de endotelina ETA y
25
ETB generados como proteína de fusión a YFP y CFP en
células HEK-293.
3.2.4.1
Cultivos celulares.
26
3.2.4.2
Transfecciones transitorias.
26
3.2.4.3
Preparación de cubreojetos.
27
3.2.4.4
Fijación de células.
27
3.2.5
Estudios de interacción proteína-proteína mediante
Transferencia de Energía Fluorescente por Resonancia (FRET)
en células HEK-293.
3.2.5.1
Microscopía confocal.
28
3.2.5.2
Registro de imágenes.
28
3.2.5.3
Transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET).
29
3.2.5.4
Método de cálculo FRET.
29
3.2.5.5
Configuración de captura FRET.
30
3.2.5.6
Análisis de las imágenes.
33
3.2.5.7
Criterio de registro FRET, estequiometria 1:1.
33
4.
RESULTADOS
4.1.
Generación de proteínas recombinantes de los receptores
de endotelina ETA y ETB fusionadas a YFP, CFP o con el
epítope HA.
4.1.1
Análisis del alineamiento de las secuencias aminoacídicas de
34
ETAR y ETBR.
4.1.2
Amplificación de las secuencias que codifican para las proteínas
36
recombinantes del receptor de endotelina ETA y ETB.
4.1.3
Clonamiento de los productos de amplificación que codifican
para las proteínas recombinantes del receptor ETA y ETB.
38
4.2
Caracterización de los receptores de endotelina ETA y ETB
fusionados al epítope HA y a proteínas fluorescentes YFP y CFP
en células CHO-K1.
4.2.1
Expresión de los receptores de endotelina ETA y ETB etiquetados
42
con el epítope HA.
4.2.2
Expresión de los receptores de endotelina ETA y ETB expresados
44
como proteínas de fusión a YFP y CFP.
4.3
Estudio de interacción proteína-proteína in vitro mediante
46
co-inmunoprecipitación en células CHO-K1.
4.4
Estudio de interacción proteína-proteína mediante transferencia
51
de energía fluorescente por resonancia en células HEK-293.
5.
DISCUSIÓN
60
6.
CONCLUSIONES
66
7.
BIBLIOGRAFÍA
67
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1.
Set de filtros FRET (F), Aceptor (A) y Donante (D).
32
Figura 2.
Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de
35
ETAR y ETBR humanas.
Figura 3.
cDNAs de ETAR y ETBR generados por PCR.
37
Figura 4.
Liberación del cDNA del receptor V2a como proteína
39
de fusión a YFP, para ser clonado a ETAR y ETBR.
Figura 5.
Liberación de los cDNAs de ETAR y ETBR generados
40
como proteína de fusión a YFP, para ser clonados en
el vector pECFP-N1.
Figura 6.
Cuantificación de HA-ETAR y HA-ETBR y del
41
vector pcDNA3.1 (+) para la ligación.
Figura 7.
Inmunodetección de los receptores de endotelina ETAR
y ETBR etiquetados con el epítope HA.
43
Figura 8.
Inmunodetección de los receptores de endotelina ETAR
45
y ETBR como proteínas de fusión a YFP y CFP.
Figura 9.
Western blotting de co-inmunoprecipitados de los receptores
48
de endotelina ETAR y ETBR, como homoligómeros.
Figura 10.
Western blotting de co-inmunoprecipitados de los receptores
50
de endotelina ETAR y ETBR, como heteroligómeros.
Figura 11.
Localización celular de los receptores de endotelina ETA y
52
ETB fusionados a proteínas fluorescentes YFP y CFP.
Figura 12.
Microscopía basada en el análisis FRET normalizado.
55-56
Figura 13.
NFRET calculado para la formación de oligómeros del
57
receptor ETA y ETB.
Figura 14.
Porcentaje de eficiencia del FRET normalizado mediante
el método de los tres set de filtros.
59
LISTA DE ABREVIATURAS
BC
Background
BSA
Albúmina sérica de bovino
DAG
Diacilglicerol
ECL
Enhanced chimiolumiscence
ECs
Células endoteliales
EDTA
Ácido etilendiaminotetracético
ETs
Endotelinas
ETA/ETAR
Receptor de Endotelina subtipo A
ETB/ETBR
Receptor de Endotelina subtipo B
cDNA
Ácido desoxirribonucleico complementario
CFP
Proteína celeste fluorescente
CHO-K1
Línea celular derivada de ovario de hámster chino
Co-IP
Co-inmunoprecipitación
DEMEM LG
Medio Eagle Modificado por Dulbecco, bajo en glucosa
FRET
Transferencia de energía fluorescente por resonancia
HA
Epítope de hemaglutinina
Ham`s F12
Medio mezcla de nutrientes para células CHO-K1
HEK-293
Línea celular derivada de riñón de embrión humano
IgG
Inmunoglobulina G
IP3
Inositol trifosfato
PBS
Tampón fosfato salino
GPCRs
Receptores acoplados a proteína G
MDM
Espejo dicromático primario
NFRET
FRET normalizado
NO
Óxido nítrico
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PGI2
Prostaciclina
PLC
Fosfolipasa C
PMSF
Fenilmetilsulfonil fluoruro
PMT
Factor fotomultiplicador
ROIs
Regiones de interés
SBTs
Spectral Bleed-Throughs
SDM
Espejo dicromático secundario
SDS
Dodecilsulfato de sodio
SDS-PAGE
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes
TAE
Tampón acetato EDTA
TEMED
N, N, N, N - tetrametiletilenamida
TRIS
Tris-(hidroximetil)-aminometano
VSMC
Células de la musculatura lisa vascular
YFP
Proteína fluorescente amarilla
1
1. RESUMEN
El sistema de endotelinas (ETs) consiste de dos receptores acoplados a proteína G
heterotriméricas (GPCRs), el receptor subtipo A (ETAR) y subtipo B (ETBR), y tres ligandos
endógenos ET-1, ET-2 y ET-3. La estimulación de ETAR y ETBR se relaciona a importantes y
diversas funciones fisiológicas, ya que se expresan en distintos tipos celulares, siendo
principalmente en células endoteliales y del musculo liso vascular. Disfunciones en este sistema,
se asocia estrechamente a enfermedades como
hipertensión, diabetes, aterosclerosis y
cardiomiopatías. Sin embargo, el rol fisiopatológico para ambos receptores no ha sido
completamente elucidado, y ETAR es considerado el receptor “malo”, involucrado en el
desarrollo de varias enfermedades, a diferencia de ETBR, que sería el “bueno”, contrarrestando
su actuar.
Se sabe que los GPCRs, son capaces de formar oligómeros, y que esto se relaciona
estrechamente a sus propiedades funcionales y farmacológicas. En este contexto, el objetivo de
esta tesis fue determinar la oligomerización de los subtipos A y B del receptor de endotelina
mediante técnica de co-inmunoprecipitación (Co-IP) y transferencia de energía por resonancia
(FRET). Para ello se utilizaron los subtipos del receptor nativo etiquetados con HA, CFP e YFP,
y como modelos celulares CHO-K1 y HEK-293 para implementar las técnicas.
Los resultados obtenidos por ambas técnicas concuerdan, se observa por Co-IP un perfil de
banda único para la formación de homoligómeros y heteroligómeros de ETAR y ETBR, cuya
masa molecular relativa es muy similar a la de los receptores expresados individualmente, del
mismo modo, NFRET, gracias a su alta sensibilidad, entrega información real por medio de
imágenes y valores numéricos de que existe interacción proteína-proteína.
2
SUMMARY
The endothelin system (ETs) consists of two G-protein-coupled receptors (GPCRs),
endothelin subtype A (ETAR) and subtype B (ETBR) receptors, and three endogenous ligands
ET-1, ET-2 and ET-3. ETAR and ETBR stimulation is linked to important and diverse biological
functions, since they are expressed by different cell types, mainly in endothelial and vascular
smooth muscle cells. This system malfunction is closely associated with diseases such as
hypertension, diabetes, atherosclerosis and cardiomyopathies. However, the physiopathological
role for both receptors has not yet been elucidated, and ETAR is considered as a “bad” receptor,
involved in the development of many diseases, unlike ETBR, being a “good” receptor,
counteracting ETAR function. It is known that GPCRs are capable of forming oligomers and this
is closely related to their functional and pharmacological properties.
In this context, the objective of this thesis was to determine oligomerization of endothelin
subtype A and subtype B receptors using co-immunoprecipitation (Co-IP) and fluorescence
resonance energy transfer (FRET). To do so, HA, CFP and YFP tagged native receptor subtypes
and CHO-K1 and HEK-293 cell models were used as implemented techniques.
Results obtained by both techniques match, Co-IP shows a unique band profile for ETAR
and ETBR homo-oligomers and hetero-oligomers formation, which relative molecular mass is
very similar to that of individually expressed receptors, likewise, NFRET thanks to its high
sensitivity provides real information about existing protein-protein interaction by means of
images and numerical data.
3
2. INTRODUCCIÓN
Las endotelinas (ETs) corresponden a una familia de hormonas peptídicas compuestas por
21 aminoácidos, y por tres isoformas: endotelina-1 (ET-1), endotelina-2 (ET-2) y endotelina-3
(ET-3) (Evans and Walker, 2008), cuyos efectos fisiológicos son diversos, incluyendo funciones
neuroreguladoras, mitogénicas y cardiovasculares (Elshourbagy et al., 1992). ET-1 es la isoforma
predominante en el sistema cardiovascular, actúa como una hormona paracrina y autocrina
(Vingnon-Zellweger et al., 2012) y posee numerosas propiedades farmacológicas tales como
acción vasopresora, efectos ionotrópicos y cronotrópicos positivos, y facilitador de la acción
remodeladora cardiovascular. ET-1 es generada por distintos tipos celulares, incluyendo células
endoteliales, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células epiteliales de las vías
respiratorias, macrófagos, leucocitos, fibroblastos, neuronas cerebrales e islotes pancreáticos. Sin
embargo, la mayor síntesis de este péptido, es producida en células endoteliales (Takahiro et al.,
2013). ET-2 es expresada en células del epitelio intestinal y de ovario. ET-3 se produce en células
endoteliales y células epiteliales del intestino. ET-3 a su vez, regula la liberación de
vasodilatadores, como óxido nítrico (NO) y prostaciclinas (PGI2) (Kawanabe and Nauli, 2011).
Estos péptidos actúan mediante dos subtipos de receptores unidos a proteína G (GPCRs)
denominados receptores de endotelina subtipo A (ETA) y subtipo B (ETB) (Yasutaka et al.,
1995). Los receptores de endotelina son proteínas intrínsecas de membrana pertenecientes a la
superfamilia de receptores de superficie celular acoplados a proteína G heterotriméricas
(GPCRs). Los GPCRs se caracterizan por poseer una topología común, consistente de siete αhélices hidrofóbicas de transmembrana, tres asas extracelulares, tres asas intracelulares, el
extremo amino terminal y el carboxilo terminal citosólico (Premont et al.,1995; Wess, 1998).
4
Los GPCRs se dividen en tres clases: clase A (ejemplo; rodopsina), clase B (ejemplo;
receptores de secretina) y clase C (ejemplo: receptores metabotrópicos de glutamato). La mayoría
de los GPCRs, incluyendo los receptores de endotelina, pertenecen a la clase A (Gregan et al.,
2004).
Los receptores de endotelina pueden ser distinguidos farmacológicamente por sus
distintas afinidades a las endotelinas, es así como el receptor ETA tiene mayor afinidad por
ET-1 y ET-2 y en mucho menos grado por ET-3, mientras que el receptor ETB presenta una
afinidad similar por los tres isopéptidos (Arai et al., 1990).
Los genes humanos que codifican para los receptores de endotelinas ETA y ETB, se
encuentran en cromosomas diferentes, y su expresión está estrechamente regulada por la
presencia de sus ligandos ET-1, ET-2 y/o ET-3 (Hirata et al., 1988; Ehrenreich et al., 1993). El
gen del receptor A está situado en el cromosoma 4, tiene 40 Kb y presenta 8 exones y 7 intrones,
mientras que el gen del receptor B se ubica en el cromosoma 13, tiene 24 Kb, y presenta 7 exones
y 6 intrones. Pese a que el gen del ETA tiene un intrón más que el del ETB en la región 5´, ambos
genes conservan los mismos sitios para el procesamiento post-transcripcional, lo que sugiere un
origen evolutivo común (Hosoda et al., 1992; Arai et al., 1993). Los receptores ETA y ETB,
consisten de 427 y 442 aminoácidos, respectivamente, con una masa molecular esperada de
aproximadamente 47 y 49 kDa. (Evans and Walker, 2008). Ambos presentan aproximadamente
un 52 % de identidad en su secuencia aminoacídica. Sin embargo, existe una alta heterogeneidad
entre sus extremos amino y carboxilo terminal (Yasutaka et al., 1995).
El receptor ETA es altamente expresado en células de la musculatura lisa vascular
(VSMCs), pero no en células endoteliales (ECs), y una vez activado, genera una vasoconstricción
de inicio lento, pero sostenido en el tiempo. Por otra parte, el receptor ETB es altamente
5
expresado en ECs y su activación por ET-1 causa vasodilatación a través de la liberación de NO y
PGI2 que actúan en VSMCs. La generación de NO inhibe la proliferación de VSMCs (Takahiro
et al., 2013). Además el receptor ETB tiene función depurante de ET-1, disminuyendo los niveles
en el plasma, acción que se lleva a cabo en el pulmón y riñón (Kawanabe and Nauli, 2011).
Niveles aumentados de ET-1 en la circulación se relacionan a patologías tales como hipertensión
arterial pulmonar, hipertensión sensible a sal, hipertensión esencial, aterosclerosis, remodelación
cardiaca tras la insuficiencia cardíaca, y complicaciones vasculares asociadas con diabetes
mellitus entre otras. (Bremnest et al., 2000; Takahiro et al., 2013).
Los receptores ETA y ETB pueden tener efectos sinérgicos u opuestos dependiendo del
tipo celular, tipo de tejido o situación fisiológica (Vignon-Zellweger et al. 2012).
La vía de activación de estos receptores mediante endotelinas, involucra a las proteínas
heterotriméricas; Gq, Gs y Gi de la proteína G. Una vez que se une ET-1 al receptor ETA se
activa la fosfolipasa C (PLC), lo que incrementa la producción de inositol trifosfato (IP3) y
diacilglicerol (DAG) promoviendo la movilización del Ca+2 extracelular y reticular y la
activación de la proteína quinasa C (PKC). La entrada de Ca+2 provoca la despolarización de las
células del músculo liso y con ello su vasoconstricción. Tanto la apertura de los canales de cloro,
la inhibición de los canales de potasio y la actividad de los intercambiadores de Na+/H+
contribuyen al incremento de Ca+2 intracelular como respuesta a ET-1. Además, el receptor ETA
activa a la adenilato ciclasa que incrementa la producción de cAMP y con ello la actividad de la
proteína quinasa A (PKA). Por otra parte, la ET-1 que se difunde en el plasma activa los
receptores ETB en las células endoteliales, que promueve la óxido nítrico sintasa endotelial
(eNOS) induciendo la liberación de NO a través de las vías dependientes de tirosina kinasa y de
Ca+2/calmodulina. El NO, progresivamente reduce la concentración de Ca+2 intracelular
6
generando
vasodilatación.
La
vasodilatación
inducida
por
ETBR
involucra
además
ciclooxigenasas, prostaciclinas y canales de potasio dependientes de voltaje. (Kawanabe and
Nauli, 2011; Vignon-Zellweger et al. 2012)
Tras la unión del ligando a los receptores de endotelina, ambos subtipos son rápidamente
desensibilizados por fosforilación-mediante la proteína G acoplada al receptor tipo quinasa
(GRK). Después de la internalización vía caveolas y/o clatrinas, el receptor ETA es reciclado
para volver a la superficie celular. A diferencia del receptor ETB que es internalizado
exclusivamente vía clatrina y transportado finalmente a lisosomas para su degradación (Gregan et
al., 2004).
La diferencia de porque ETA se recicla y ETB se degrada, está asociada al extremo
carboxilo terminal, se sugiere que la presencia de un cluster de serinas participa en la
internalización del receptor al lisosoma. Interesantemente, ETBR tiene una agrupación de serinas
en su extremo C-terminal, que no está presente en ETAR (Bremnes, 2000).
El aislamiento y purificación de los receptores de endotelina a partir de distintos tejidos
por técnica de cross-linking y posterior electroforesis en geles de poliacrilamida, permitió obtener
dos bandas correspondientes a pesos moleculares de 35 y 50 kDa aproximadamente.
Experimentos posteriores en los que se utilizaron inhibidores de la proteólisis, permitieron
demostrar que la banda de menor tamaño corresponde a un producto de degradación de la banda
de 50 kDa (Kozuka et al., 1991). Por tanto, estos productos corresponden, en parte a degradación
de los receptores de endotelina, que son fácilmente hidrolizables en su extremo amino terminal
(Saito et al., 1991). Los receptores de endotelina son muy sensibles a metaloproteinasas y en
ausencia de EDTA, son rápidamente convertidos a formas de peso molecular reducidos. Existe
una secuencia aminoacídica rica en prolinas localizada cerca del extremo amino terminal y del
7
primer dominio transmembrana. El sitio de proteólisis ocurre entre la Ala-79 y Gly-80. Sin
embargo, a pesar de ocurrir proteólisis, los receptores no pierden su afinidad y especificidad por
sus ligandos (Saito et al., 1991).
Se ha demostrado que los GPCRs son capaces de formar oligómeros, entre subtipos de un
mismo receptor o entre receptores relacionados (Bouvier, 2001). Se ha establecido que la
capacidad de oligomerizar posee importantes efectos sobre las propiedades funcionales y
farmacológicas de los GPCRs (Wu et al., 1998; CaO et al., 1999). En particular se ha demostrado
que la oligomerización de los GPCRs cambia la especificidad del acoplamiento a la proteína G
(Margeta-Mitrovic et al., 2000; Galvez et al., 2001), así como también altera la endocitosis de los
receptores (Jordan and Devi, 1999; Jordan et al., 2001; Lavoie et al., 2002).
Se ha postulado que residuos de cisteína presentes en las regiones extracelulares de los
GPCRs serían importantes para la oligomerización (Romano et al., 1996) y que los puentes
disulfuros y N-glicosilaciones serían críticas en este tipo de interacciones (Michineau et al.,
2006). Otras secuencias aminoacídicas que se han postulado como críticas para la
oligomerización de proteínas transmembrana, se basan en la secuencia aminoacídica GxxxG o
análoga a ella que fue descrita para el dominio transmembrana del receptor de glicoferina A
(Russ y Engelman, 2000).
La capacidad de oligomerizar ha demostrado ser un requisito clave para la salida de
receptores GABAb y β-adrenérgicos del retículo endoplásmico (RE). Se ha postulado que la
conformación obtenida por el oligómero ocultaría señales de rescate de la vía secretora o regiones
hidrofóbicas que de estar expuestas, condicionarían la retención intracelular de la proteína en el
RE y le impediría alcanzar la membrana plasmática (Reddy and Corley, 1998).
8
Otro motivo que respalda la capacidad de oligomerizar de los receptores de endotelina es
la observación de ET-1 actuando como ligando bivalente capaz de formar un puente entre los
dos subtipos de receptores en la membrana plasmática (Mazzuca and Khalil, 2012).
9
En virtud a los antecedentes ya mencionados, se propone la siguiente hipótesis de trabajo:
“Receptores de endotelina subtipo A y B son capaces de oligomerizar”.
Objetivo General
Estudiar la formación de homoligómeros y heteroligómeros entre los receptores
de endotelina A y B.
Objetivos específicos
1. Construir plasmidios para generar proteínas quiméricas fluorescentes (CFP e YFP) y
proteínas que incorporen el epítope HA (hemaglutinina).
2. Determinar la expresión de los receptores de endotelina ETA y ETB por
inmunodetección en Western blotting.
3. Determinar el proceso de oligomerización de los receptores de endotelina in situ
mediante experimentos de Transferencia de Energía por Resonancia (FRET) en células
HEK-293.
4. Determinar la interacción entre los receptores de endotelina in vitro mediante coinmunoprecipitación en células CHO-K1.
10
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1Reactivos
BD BIOSCIENCES CLONTECH: Vectores plasmidiales de expresión en eucariontes
pEYFPN1, pECFPN1 y pcDNA 3.1 (+).
BIO-RAD
LABORATORIOS,
Inc.:
DCTM
BIO-RAD
Protein
Assay,
tween-20
(polyoxyethylene sorbitan monolaurate), transfer-Blot® Transfer Medium pure Nitrocelulose
Membrane (0,2 µm).
EQUILAB: Ácido acético, portaobjetos B&C de 3 x 1 pulgadas y 1-1,2 mm de espesor,
cubreobjetos Corning de 22 x 22 y del número 1.
FERMENTAS Inc: Pfu DNA polimerasa.
GIBCOTM: Colorante Tripan blue, medio Eagle modificado por Dulbecco LG (DMEM LG,
glucosa 5,6 mM), medio Ham`s F-12, antibiótico antimicótico 100x (Penicilina G sódica
10.000 U, Sulfato de Estreptomicina 10.000 µg y Anfotericina B (como sal antimicótica
Fungizone® al 0,85%) 25 µg/ml).
11
INVITROGEN: Glicerol, Taq DNA polimerasa (5 U/µl) y su tampón 10X, MgCl2 50 mM,
desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), tampón endonucleasa (Reactivo 2
y 10), EcoRI (10 U/µl), Sal I (10 U/µl), XbaI (10 U/µl), cianol de xileno, células competentes
DH5α, triptona, agarosa ultra pura, marcador de tamaño molecular de 1 Kb DNA ladder,
marcador tamaño molecular 100 pb ladder, oligonucleótidos partidores.
J.T. BAKER®: Metanol.
MERCK: Ácido clorhídrico (HCl), Etanol absoluto (EtOH), isopropanol, bicarbonato de sodio
(NaHCO3), 1-butanol, aceite de inmersión.
CALBIOCHEM®: β-mercaptoetanol.
DAKO: Medio de montaje para preparaciones celulares fluorescentes.
PIERCE: Sistema de quimioluminiscencia ECL, placas autorradiográficas.
PROMEGA Co: Tris-base, acrilamida, bis-acrilamida, dodecilsulfato de sodio (SDS), cloruro de
sodio (NaCl), T4 DNA ligasa y su tampón, Kit Wizard Plus para purificación de DNA plasmidial
a mediana escala.
QIAGEN Inc: Sistema de purificación de DNA Qiaex II.
12
ROCHE DIAGNOSTICS: Reactivo de transfección FuGENE 6.
SIGMA ALDRICH: Ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), albúmina de suero Bovino
(BSA), azida de sodio, azul de bromofenol, bicarbonato de sodio (NaHCO3), deoxicolato de
sodio, dimetilsulfóxido (DMSO), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), fosfato ácido de sodio
(NaH2PO4·H2O), inhibidor de tripsina de soya, pepstatin A (C34H63N5O9),
leupeptin
(C20H38N6O4·1/2H2SO4), cloruro de sodio (NaCl), N- Etil maleimida (NEM), Nonidet P40
(IGEPAL CA-630), tripsina de páncreas porcino, ampicilina, kanamicina.
WATT’s: Leche descremada en polvo (Calo).
WINKLER LTDA.: Tampones para calibración (pH 4.0, 7.0 y 10).
3.1.2 Anticuerpos
Anticuerpo policlonal anti-proteína verde fluorescente (GFP) generado en conejo fue
adquirido en Molecular Probes, Inc. Anticuerpo monoclonal anti-HA (16B12) generado en ratón
fue adquirido en Covance, Inc.
Anticuerpo secundario policlonal anti-IgG de conejo generado en cabra y anticuerpo
secundario policlonal anti-IgG de ratón generado en burro, ambos conjugados a peroxidasa
fueron adquiridos en Jackson Inmuno Research Laboratorios, Inc.
13
3.1.3. Equipos
Agitador magnético Cole Palmer (Mod. 4658. Stirrer / Hot plate), agitador ProBlot™
Rocker 25 con plataforma simple (labnet International Inc.), balanza analítica Sartorius
(LA230S), balanza electrónica Shimadzu (321-33557), baño Termorregulado Memmert a 37°C,
baño termorregulado modelo PY4 (Science/Electronics Inc.), cámara Neubauer (BOECO Blood
Counting Chambers (Neubauer improved, bright-line double ruling)), bomba de vacío Meduak,
cámara de flujo laminar Nuaire 8 (clase II tipo A), centrífuga clínica International Equipment
(Mod. CL) (Biofuge A), centrífuga Eppendorf refrigerada 5415 R, termociclador M.J. Research
(MiniCyclerTM), transluminador UV Viber-Lourmat, cámara para geles de agarosa Bio JSP,
cámara de geles Life Technologies (modelo 1160), Microscopio de fluorescencia Zeiss
(Axioskop HBO50), centrífuga Kubota (8KR-20000T), Microscopio confocal Olympus
FLUOVIEW 1000, espectrofotómetro Shimadzu (UV-150-02), estufa de cultivo con CO2 Forma
Scienific (Water Jackedted Incubator), freezer a -86 °C ULT(ultra low temperature) (DW86L288), fuente de poder Bio-Rad Power Pac-200, micropipetas Gilson (Pipetman P2, P20, P200
y P1000), microscopio invertido Nikon-TMS, mini centrífuga Heathrow Scientific Sprout®, mini
rotor de tubos Eppendorf (Mini LabRollerTM Rotator with rotisserie for 36x1.5/2.0ml tubes,
230V with EU cord), pHmetro WTW (pH521), pipeteador automático FastPetteTM, sonicador
(Cole Parmer Ultrasonic Homogenizer Power Supply 4710 Series), Thermomixer Eppendorf®
(modelo5436),Vortex (Vortex MIXER VX-200, Labnet International Inc.).
14
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Generación de receptores de endotelina ETA y ETB como proteína de fusión a
proteína YFP y CFP o con el epítope HA.
3.2.1.1 Diseño de partidores.
A partir de las secuencias publicadas de los genes que codifican para los subtipos A y B
del receptor de endotelina humano (GenBank AY275462 y AY275463, respectivamente), se
diseñaron múltiples partidores para generar una serie de proteínas de fusión. Para el clonamiento
de los receptores al vector de fusión a la proteína fluorescente, los partidores sentido se diseñaron
con un sitio de restricción para Hind III y los partidores anti sentido con uno para Sal I,
eliminando de la secuencia el stop codón para dejar en marco de lectura al receptor con la
proteína fluorescente. Para el clonamiento al pcDNA 3.1 (+), los partidores se diseñaron con el
sitio de restricción Hind III y la secuencia nucleotídica que codifica para el epítope HA de
hemaglutinina (YPYDVPDYA). Los partidores anti sentido contienen un sitio de restricción Xba
I y previa a ella se adicionó un codón de detención de la transcripción. Como templado se
utilizaron los receptores de endotelina ETA y ETB clonados en pcDNA3.1 (+) y los siguientes
oligonucleótidos partidores:
15
ETAR
Partidor sentido (Hind III): CCC AAG CTT ACC ATG GAA ACC CTT TGC
Partidor anti sentido (Sal I): ACG CGT CGA CGT GTT CAT GCT GTC CTT
ETBR
Partidor sentido (Hind III): CCC AAG CTT ACC ATG CAG CCG CCT CCA
Partidor anti sentido (Sal I): ACG CGT CGA CGT AGA TGA GCT GTA TTT
HA-ETAR
Partidor sentido (HA-ETAR-Hind III): CCC AAG CTT GGA TGT ACC CAT ACG ACG TCC
CAG ACT ACG CTA TGG AAA CCC TTT GC
Partidor anti sentido (ETAR-Xba I): TGC TCT AGA CTC GAG TCA GTT CAT GCT GTC
CTT
HA-ETBR
Partidor sentido (HA-ETBR-Hind III): CCC AAG CTT GGA CCA TGT ACC CAT ACG ACG
TCC CAG ACT ACG CTA TGC AGC CGC CTC CA
Partidor anti sentido (ETBR-Xba I): TGC TCT AGA CTC GAG TCA AGA TGA GCT GTA
TTT
16
3.2.1.2 Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La amplificación de las proteínas marcadas con HA se realizó utilizando como templado
los vectores ETAR pcDNA3.1 (+) y ETBR pcDNA3.1 (+). Para la amplificación de los
receptores de endotelina generados como proteína de fusión a proteína fluorescente se utilizaron
los mismos templados, con los partidores ETAR-Hind III y ETAR-Sal I o ETBR-Hind III y
ETBR-Sal I que posteriormente fueron subclonados en los vectores pECFP-N1 y pEYFP-N1.
La mezcla de amplificación consistió en 25 ng/µl de templado ETAR pcDNA 3.1 (+) o
ETBR pcDNA 3.1 (+), 5 µl tampón de Pfu DNA polimerasa (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 50
mM, MgCl2 1,5 mM), 4 µl MgSO4, 0,2 mM de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs), 20
nM de cada oligonucleótido partidor, 2 U de enzimas DNA polimerasa (Pfu/Taq en relación 9:1)
y agua para completar a un volumen final de 50 µl. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un
termociclador Minicycler (M.J. Research) y el programa consistió en una etapa previa de
denaturación por 2 minutos a 95 °C, luego denaturación por 1 minuto a 95 °C, apareamiento por
1 minuto a 55 °C y extensión por 2 minutos a 72 °C, completando 30 ciclos y una extensión final
de 20 minutos a 72 °C. Los productos de amplificación se detectaron por fraccionamiento en
geles de agarosa al 1%. Además, para cada PCR se realizó un control negativo sin templado y
utilizando las mismas condiciones mencionadas anteriormente.
17
3.2.1.3 Electroforesis en geles de agarosa.
Para la separación e identificación de los cDNAs se prepararon geles de agarosa al 1% en
tampón TAE (Tris-HCl 20 mM, ácido acético 10 mM y EDTA 0,5 mM) conteniendo 0,5 µg/ml
de bromuro de etidio. Las muestras fueron cargadas con tampón de carga (Tris-HCl 100 mM pH
7,4, EDTA 10 mM, glicerol 30%, azul bromofenol 0,25%) en relación 1: 6 con respecto al
volumen de la muestra. Como marcador de tamaño molecular de DNA se utilizó 0,5 µg de 1 Kb
DNA ladder y/o 100 pb ladder. Los cDNAs fueron sometidos a fraccionamiento a 100 Volt por
40 minutos en tampón de corrida TAE 1X. Posteriormente, se observaron por exposición del gel
sobre el transluminador UV y la digitalización de la imagen se obtuvo con una cámara fotográfica
digital Kodak.
3.2.1.4 Purificación de productos de amplificación obtenidos por PCR y por digestión con
endonucleasas de restricción.
Los productos de amplificación por PCR y productos de digestión con endonucleasas de
restricción se fraccionaron por electroforesis en geles de agarosa 1% en tampón TAE, la región
de interés se cortó desde el gel, purificándola mediante el kit comercial QIAEX II, siguiendo las
instrucciones del fabricante. Finalmente el DNA se eluyó agregando 10 µl de agua e incubando
por 5 minutos a 55 °C. Por último, se centrifugó a 13200 rpm por 30 segundos, y se extrajo el
sobrenadante que contenía la muestra de interés.
18
3.2.1.5 Clonamiento de productos de amplificación en vector pcDNA 3.1 (+), pEYFP-N1 y
pECFP-N1.
Los productos de amplificación purificados y los plásmidos pcDNA 3.1 (+), pEYFP-N1 y
pECFP-N1 (0,25 µg de DNA) fueron digeridos mediante digestión en serie. pEYFP-N1 y
pECFP-N1 fueron digeridos durante 2 horas a 37 °C con 10 U de Hind III , 1,5 µl de tampón M,
completando con agua un volumen inicial 15 µl. Posteriormente, se continuó la digestión toda la
noche a 37 °C con 10 U de Sal I, 1,5 µl de tampón H, completando con agua un volumen final de
30 µl. Mientras que para pcDNA 3.1 (+), la digestión en serie se realizó con 10 U de Xba I por 2
horas a 37 °C, usando 1,5 µl de tampón 2 y toda la noche a 37 °C con 10 U de Hind III, usando 1,
5 µl del mismo tampón. Los volúmenes fueron iguales para ambas digestiones.
Finalmente, los productos de digestión fueron fraccionados por electroforesis en gel de
agarosa al 1% en tampón TAE y purificados según protocolo antes descrito (métodos 3.2.1.4),
seguido de reacción de ligación (métodos 3.2.1.6), transformación de células competentes
(métodos 3.2.1.7) y purificación plasmidial a pequeña escala (métodos 3.2.1.8) y mediana escala
(métodos 3.2.1.9).
19
3.2.1.6 Reacción de ligación.
La reacción de ligación consistió en 1 µl del tampón de ligación 10X, 1 U de T4 DNA
ligasa, 50 ng del vector plasmidial (pcDNA3.1 (+), pEYFP-N1 o pECFP-N1) y 30 ng de los
fragmentos de amplificación digeridos y purificados, según correspondiera para obtener una
proporción 3: 1 de inserto respecto al vector. El volumen final de 10 µl se completó con agua, y
se incubó a 4 °C toda la noche.
3.2.1.7 Transformación de células competentes.
La transformación de células E. coli DH5α se realizó tomando como referencia el
protocolo descrito en Molecular Cloning 3ª edición (Sambroock y Russell, 2002), para lo que se
agregó los 10 µl de la reacción de ligación a un tubo que contenía 50 µl de las células
competentes, se incubó por 30 minutos en hielo, posteriormente a 42 °C por 2 minutos y luego 3
minutos nuevamente en hielo. Se agregó 950 µl de medio LB (triptona 10 g/l, extracto de
levadura 5 g/l y NaCl 10 g/l pH 7,5) y se incubó a 37 °C por 90 minutos en agitación constante
(225 rpm). El cultivo se centrifugó a 6000 rpm por 5 minutos y el pellet de células fue
resuspendido en 100 µl de medio LB. Finalmente, la suspensión se sembró en placas de agar LB
(agar 15 g/l) conteniendo ampicilina a 200 µg/ml para la selección de bacterias transformadas
con el vector pcDNA 3.1 (+) o kanamicina a 100 µg/ml para la selección de bacterias
transformadas con el vector pEYFP-N1 o pECFP-N1. Se incubó durante toda la noche a 37 °C.
20
3.2.1.8 Purificación del DNA plasmidial a pequeña escala.
Se aislaron colonias únicas de las placas agar LB ampicilina o kanamicina y se inocularon
en 10 ml de medio LB líquido, conteniendo ampicilina o kanamicina a una concentración de 200
µg/ml y 100 µg/ml, respectivamente, para dejarlas incubando toda la noche a 37 °C con agitación
constante a 225 rpm. La extracción fue realizada utilizando el método de minipreparación de
DNA plasmidial por lisis alcalina con SDS (Sambrock and Russel, 3ª edición, vol. 1 pág 132). Se
centrifugó 1,5 ml del cultivo a 13000 rpm por 30 segundos a 4 °C, el pellet fue lavado con 500 µl
de solución STE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl, EDTA 1 mM) y resuspendido por vortex en
100 µl de solución de lisis alcalina I (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM).
Luego, se agregó 200 µl de solución alcalina II (NaOH 0,2 M y SDS 1%), mezclándose la
solución resultante por inversión y agregando 150 µl de solución alcalina III (CH3COOK y
CH3COOH glacial). La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se
traspasó a un nuevo tubo, se agregaron 900 µl de etanol 100%, mezclando por inversión para
luego centrifugar a 13000 rpm por 20 minutos. El pellet se lavó con 1 ml de etanol 70%
mezclando por vortex y centrifugando por 5 minutos. Finalmente, se secó el precipitado y se
resuspendió en 20 µl de agua. Una alícuota de 10 µl fue sometida a digestión en serie según
corresponda el plásmido (métodos 3.2.1.5). La liberación del inserto se verificó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1X (métodos 3.2.1.3).
21
3.2.1.9 Purificación del DNA plasmidial a mediana escala.
El protocolo utilizado fue el recomendado por Promega para el DNA Wizard Plus
Midipreps DNA Purification System. Se adicionó una alícuota de 1 ml desde el cultivo de
minipreps a 100 ml de medio LB con antibiótico (ampicilina 200 µg/ml o kanamicina 100 µg/ml,
según corresponda), se incubó durante toda la noche a 37 °C con agitación constante 225 rpm.
Seguido a esto se centrifugó a 10000 x g por 10 minutos a 4 °C y se resuspendió el pellet en 3 ml
de tampón de resuspensión (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 10 mM pH 8,0, y RNAsa A 100
µg/ml). Se agregó 3 ml de solución de lisis (NaOH 200 mM, SDS 1%) y se mezcló por inversión.
Posteriormente, se adicionó 3 ml de solución de neutralización (CH3COOK 1,32 M pH 4,8) y
nuevamente se mezcló por inversión. Se centrifugó a 14000 x g por 15 minutos a 4 °C, se
traspasó el sobrenadante a un nuevo tubo, se agregó 10 ml de resina de purificación de DNA y se
transfirió a una minicolumna suministrada por el fabricante. La resina se empacó por aspiración y
se efectuaron 2 cambios de 15 ml con solución de lavado (Tris-HCl 8,3 mM pH 7,5, CH3COONa
80 mM, etanol 55%, EDTA 40 µM). Finalmente el DNA fue eluído de la columna con 300 µl de
agua precalentada a 80 °C.
3.2.1.10 Cuantificación del DNA plasmidial.
La concentración de DNA plasmidial obtenida se determinó midiendo la absorbancia a
260 nm de diluciones de las muestras, en razón 1:20, en un espectrofotómetro Shimatzu UV-15002. Para el cálculo de concentración se consideró que una solución de DNA doble hebra de 50
µg/ml posee una unidad de absorbancia (Sambroock y Russell, 2002).
22
3.2.2 Expresión transitoria y detección por Western blotting de los receptores de endotelina
ETA y ETB generados como proteína de fusión a YFP y CFP o con el epítope HA en
células CHO-K1.
3.2.2.1 Cultivo celular.
Se cultivaron células CHO-K1 (línea celular derivada de ovario de hámster chino) en
medio Ham`s F12, suplementado con 15% de suero bovino fetal (SBF) inactivado y 2% de
antibiótico-antimicótico, a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Cada 2 días las
células se resuspendieron utilizando tripsina (tripsina 0,25%, EDTA 1 mM en PBS pH 8,0) por 1
minuto a 37 °C y se sembraron nuevamente en placas Petri o se congelaron a -80 °C en 1 ml de
SBF conteniendo DMSO al 10%.
3.2.2.2 Transfecciones transitorias.
Para las transfecciones de células CHO-K1, se sembraron 600.000 células en placas de 60
mm. A las 24 horas de cultivo se transfectaron o cotransfectaron con el reactivo comercial de
transfección Fugene 6 en una razón masa DNA (µg)/ volumen Fugene 6 (µl) de 1: 3. Se diluyó el
Fugene 6 en medio base Ham`s F12 libre de suero completando un volumen de 100 µl y se
incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, la dilución de Fugene 6 se mezcló con el
DNA y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se agregó a una placa
de 100 mm de diámetro con células CHO-K1 cultivadas entre un 50-80% de confluencia.
Transcurridas 48 horas, se realizó la extracción de proteínas totales.
23
3.2.2.3 Extracción de proteínas totales.
48 horas post-transfección, las células CHO-K1 transfectadas con las proteínas de fusión
de los receptores de endotelina subtipo A (ETAR-YFP, ETAR-CFP o HA-ETAR) y B (ETBRYFP, ETBR-CFP o HA-ETBR), se lavaron 2 veces con 1 ml de PBS 1X (NaCl 137 mM, KCl 2,7
mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM) frío, posteriormente se agregó 150 µl del tampón
radioinmuno precipitation assay RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, nonidet P-40
1%, deoxicolato de sodio 0,5%, EDTA 50 mM , SDS 0,1%, NEM 10 mM, PMSF 0,1 mM,
leupeptin 1 µg/ml, peptatin A 1 µg/ml, inhibidor de tripsina 5 µg/µl), se rasparon las células
desde la placa, se traspasaron a un tubo, y se homogenizaron por sonicación 15 pulsos por 20
segundos, para posteriormente dejar solubilizando durante 1 hora con agitación constante a 4 °C.
Luego las muestras se centrifugaron a 13000 rpm por 30 minutos a 4 °C. La concentración de
proteínas totales se midió utilizando un método comercial Dc Protein assay de Bio-Rad.,
mediante el método de Lowry modificado, el que consiste en adicionar 20 µl de muestra, 100 µl
de la mezcla del reactivo A y el reactivo S (por cada 1 ml de reactivo A se agregan 20 µl del
reactivo S) y 800 µl del reactivo B a un tubo Eppendorf. Posteriormente la mezcla se dejó
incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente para que la reacción se lleve a cabo y
determinar finalmente en un espectrofotómetro la absorbancia a una longitud de onda (λ) 750 nm.
Es fundamental para determinar la concentración de las muestras realizar una curva de
calibración con concentraciones conocidas de BSA (2, 1, 0,5, 0,25 y 0,125 mg/ml). Una vez
calculadas las concentraciones, 40 µg de proteína total fueron resuspendidas en tampón de carga
Laemmli 1X (Tris-HCl 0,06 M, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, azul bromofenol 0,025%) con
24
agente reductor (β-mercaptoetanol 5%), se calentaron por 1 hora a 37 °C y se fraccionaron en
SDS-PAGE.
3.2.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE).
Se prepararon geles separadores al 10% y geles apiladores al 4% de poliacrilamida
(acrilamida 30%, Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, SDS 10 %, persulfato de
amonio 10% y 15 µl de TEMED 1%). Para cada uno de los geles apilador y separador se
cargaron las muestras y el estándar de masa preteñido y se sometieron a fraccionamiento por 90
minutos a 150 Volt en tampón de corrida 1X (Tris-HCl 25 mM, glicina 0,192 M y SDS 1%).
3.2.2.5 Inmunodetección por Western blotting.
Las proteínas fraccionadas por SDS-PAGE fueron electrotransferidas a membranas de
nitrocelulosa 0,2 µm de poro, utilizando la cámara Miniprotean III (Bio-Rad), tampón de
transferencia 1X (Tris-HCl 25 mM, glicina 0,192 M, metanol absoluto 20% y SDS 0,5%) durante
2 horas a 350 mA a
4 °C. Las membranas se lavaron 2 veces por 10 minutos con una solución
para eliminar el SDS (isopropanol 25%, ácido acético 10%), seguido de 3 lavados de 10 minutos
con TTBS 1X pH 7,4 (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 50 mM y Tween 20 al 0,1%). Luego se
bloquearon las membranas incubando con leche descremada 5% en TTBS 1X pH 7,4 por 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo
policlonal anti-GFP o anticuerpo monoclonal anti-HA, diluido 1:5000 y 1:1000 en solución de
bloqueo, respectivamente y con agitación constante. Las membranas fueron lavadas 3 veces con
25
TTBS 1X por 10 minutos a temperatura ambiente, 1 lavado con TBS 1X por 10 minutos.
Finalmente la inmunodectección se visualizó mediante el kit de quimioluminiscencia (ECL) y
utilizando placas autorradiográficas (Pierce). Para ello, se agregaron 1 ml de peróxido de
hidrógeno y 1 ml de luminol sobre las membranas, dejando transcurrir un tiempo de 5 minutos
para que ocurra la reacción de quimioluminiscencia, posteriormente las placas fueron reveladas.
3.2.3 Estudios de interacción por co-inmunoprecipitación entre los receptores de endotelina
ETA y ETB.
3.2.3.1 Ensayos de co-inmunoprecipitación.
Se cotransfectaron los receptores de endotelina ETA y ETB (ETAR-YFP + HA-ETAR,
ETBR-YFP + HA-ETBR, ETAR-YFP + HA-ETBR y ETBR-YFP + HA-ETAR). Transcurridas
48 horas, las células se lavaron 2 veces con 1 ml de PBS 1X frío, y se prepararon extractos de
proteínas totales con tampón RIPA 1X de acuerdo a lo descrito (métodos 3.2.2.3). Los extractos
totales de proteínas (300 µg) se completaron a un volumen final de 1 ml con tampón RIPA 1X.
Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13000 rpm por 30 minutos a 4 °C. Se realizó un
pre-aclaramiento del sobrenadante incubando 2 horas con 20 µl de proteína A-agarosa a 4 °C en
agitación constante. Después, se centrifugó a 4000 rpm por 5 minutos. La inmunoprecipitación
fue iniciada por la incubación del sobrenadante con el anticuerpo policlonal anti-GFP por 2 horas
a 4°C en constante agitación. Posteriormente, se adicionó 20 µl de proteína A- agarosa y se
incubó toda la noche a 4 °C con agitación constante. El complejo formado sedimentó por
centrifugación a 4000 rpm por 5 minutos y se lavó 4 veces con tampón RIPA 1X frío, con
26
concentraciones de NaCl de 150 mM, 250 mM, 350 mM y 150 mM. El precipitado final se
resuspendió en tampón de carga Laemmli 1X más β-mercaptoetanol, las muestras se incubaron
por 1 hora a
37 °C y se fraccionó por SDS-PAGE. La inmunodetección se realizó mediante
Western blotting con anticuerpo monoclonal anti-HA 1:1000 (métodos 3.2.2.5)
3.2.4 Expresión transitoria de los receptores de endotelina ETA y ETB generados como
proteína de fusión a CFP e YFP en células HEK- 293.
3.2.4.1 Cultivos celulares.
Se cultivaron células HEK- 293 (línea celular derivada de riñón de embrión humano) en
medio DMEM LG, suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) inactivado y 1% de
antibiótico-antimicótico, a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Cada 2 días las
células se resuspendieron utilizando tripsina (tripsina 0,25%, EDTA 1 mM en PBS pH 8,0) por 1
minuto a 37 °C y se sembraron nuevamente en placas Petri o se congelaron a -80 °C en 1 ml de
SBF conteniendo DMSO al 10%.
3.2.4.2 Transfecciones transitorias.
Para las transfecciones de células HEK-293, se sembraron 300.000 células en placas de 35
mm. Estas placas previamente fueron tratadas (métodos 3.2.4.3). A las 24 horas de cultivo se
transfectaron o cotransfectaron con el reactivo comercial de transfección Fugene 6 en una razón
27
masa DNA (µg)/ volumen Fugene 6 (µl) de 1: 3 (método 3.2.2.2). Transcurridas 48 horas, se
realizó la fijación de las células, para su posterior análisis.
3.2.4.3 Preparación de cubreobjetos.
Cubreobjetos de 22 x 22 de área y del N° 1 de espesor fueron colocados en agua y
hervidos en un vaso precipitado por 5 minutos y luego sumergidos en etanol al 100% hasta su
uso. Cuidadosamente con pinza se colocó un cubreobjeto a cada placa de 35 mm a preparar y se
expuso a 10 minutos de radiación UV, posteriormente se agregó una gota de solución de poly LLisina 0,01% (70.000 g/mol) sobre el cubreobjeto y se expuso nuevamente a radiación UV por 20
minutos. A partir de este procedimiento, las placas están listas para ser sembradas y cultivadas.
3.2.4.4 Fijación de células.
Las células fueron lavadas una vez con 1 ml de PBS 1X frío, luego fijadas por 30
minutos en metanol 100% a -20 °C. Se realizan dos lavados con PBS 1X y un lavado con etanol
100% a temperatura ambiente. Los cubreobjetos son cuidadosamente retirados de la placa, y
dejados secar por 20 minutos. Se agrega una gota de medio de montaje a cada portaobjeto, y una
vez seco el etanol de los cubreobjetos, estos se incorporan sobre el portaobjeto, de modo que las
células fijadas queden en contacto con el medio de montaje DAKO. Se deja secar por 30 minutos.
Finalmente, se sellan las aristas del cubreobjeto, y se guarda a 4 °C hasta su análisis.
28
3.2.5 Estudios de interacción proteína-proteína mediante Transferencia de Energía
Fluorescente por Resonancia (FRET).
3.2.5.1 Microscopía confocal.
Se utilizó un microscopio confocal “OLYMPUS FLUOVIEW 1000”, equipado con una
linea láser de diodo de 440 nm, láser Helio-Neón-R de 633 nm, láser Helio-Neón-G de 543 nm y
un láser Argón multilínea de 458, 488 y 515 nm. La observación y registro se realizó con un
objetivo de inmersión en aceite “UPlan SAPO 60X/1.35oil∞/0.17/FN26.5”.
3.2.5.2 Registro de imágenes.
Las imágenes fueron capturadas configurando distintos canales de detección para cada
fluoróforo, cada canal posee un fotomultiplicador independiente: además el software Fluoview
1000 que provee el fabricante y que opera el microscopio, permitió digitalizar imágenes en el
formato Tiff con una profundidad de 8 bits en escala de grises y con una resolución de 512 x 512
pixeles. Las imágenes fueron tomadas con la apertura confocal (A.C.) 105 µm para todos los
fluoróforos, así los valores de Ganancia y Offset se mantuvieron constantes para imágenes de un
mismo set de experimentos, además del voltaje del fotomultiplicador que se ajustó a 600 (CFP) y
500 (YFP) para cada imagen.
29
3.2.5.3 Transferencia de energía fluorescente de resonancia (FRET).
Para determinar la transferencia de energía, se utilizó el par de fluoróforos CFP e YFP
(variantes de la proteína fluorescente verde), fusionadas a ETAR y ETBR. En células HEK-293
se cotransfectaron de forma transitoria las construcciones necesarias para la formación de
homoligómeros y heteroligómeros, además de las proteínas solubles CFP e YFP de forma
conjunta, para calcular la transferencia de energía colisional (control negativo) y CFP-YFP,
ambas proteínas unidas por un link de 15 aminoácidos, suficiente para que ocurra la transferencia
de energía (control positivo). Se transfectaron también, de manera independiente YFP y CFP
solubles, para estimar los SBTs (Spectral Bleed-Throughs), factores fundamentales para la
corrección del cálculo del método FRET.
3.2.5.4 Método de cálculo FRET.
Para el cálculo del FRET se utilizó el método de los tres set de filtros (figura 1.)
(Gordon et al., 1998; Sarmiento et al,. 2004), normalizado (Xia and Liu, 2001; Sarmiento et al.,
2004), de acuerdo a la siguiente fórmula:
30
En esta nomenclatura, (Gordon et al., 1998), Aa y Fa representan imágenes obtenidas con
el set de filtros Aceptor y FRET, respectivamente, cuando solo el fluoróforo aceptor está presente
en la muestra. Dd y Fd representan imágenes obtenidas con el set de filtros del Donante y FRET,
respectivamente, cuando solo el fluoróforo donante está presente en la muestra. Ff, Af y Df,
representan imágenes obtenidas con el set de filtros FRET, Aceptor y Donante, respectivamente,
cuando ambos fluoróforos están presentes en la muestra. El denominador de esta ecuación
corresponde a la normalización propuesta por Xia et al. (2001), en la que Dfd y Afa
corresponden a imágenes del donante y aceptor obtenidas con el set de filtros D y A
respectivamente, cuando ambos fluoróforos están presentes.
3.2.5.5 Configuración de captura FRET.
Las imágenes fueron colectadas en un microscopio confocal “Olympus Fluoview 1000”
(métodos 3.2.5.2). Para el set de filtros del donante de energía (figura 1. D), la excitación se
realizó mediante un láser de diodo de 440 nm, además de un espejo dicroico primario MDM 405440/515, mientras que la luz de emisión fue capturada en el primer canal utilizando el espejo
dicroico SDM 510 y un filtro pasa banda BP 465- 495. Para el set de filtros del aceptor de energía
(Figura 1. A), la excitación se realizó con un láser de Argón de 515 nm y un espejo dicroico
MDM 405- 440/515, mientras que la luz de emisión se capturó en el segundo canal utilizando los
espejos dicroicos SDM 510 y SDM 640 consecutivamente, y un filtro de banda BP 535- 565.
31
Para el set de filtros FRET (Figura 1. F), se utilizó un láser de diodo de 440 nm y el espejo
dicroico primario MDM 405- 440/515 para la excitación, mientras que la emisión fue capturada
en el segundo canal utilizando los espejos dicroicos SDM 510 y SDM 640 consecutivamente y un
filtro pasa banda BP 535- 565.
32
Figura 1. Set de Filtros FRET (F), Aceptor (A) y Donante (D). Configuraciones utilizadas en
la implementación del método de los tres set de filtros en microscopio confocal “Olympus
FLUOVIEW 1000”. La línea entrecortada indica el camino óptico de la señal registrada bajo cada
configuración de filtros.
33
3.2.3.6 Análisis de las imágenes.
La transferencia de energía fue evaluada mediante el Plug-in PixFRET (Feige et al., 2005)
una aplicación del software WCIF Image J disponible gratuitamente en la web. Esta aplicación se
basa en el método de los tres set de filtros e introduce una corrección de los factores SBTs,
permitiendo ajustarlos en una curva constante, lineal o exponencial con respecto a la intensidad
de cada fluoróforo, además, requiere de la construcción de tres stack de imágenes: FdDd, FaAa y
FfDfAf. En el análisis no se consideran los pixeles saturados, eliminándolos de los stack
mediante una máscara de saturación generada con el software WCIF ImageJ.
3.2.3.7 Criterio de registro FRET, estequiometria 1:1.
Se establecieron valores constantes del Canal D 600 nm y Canal A 500 nm, con el fin de
mantener una razón de PMT de 1,2 que permitiera condicionar el registro de FRET con una
proporción 1:1 entre fluoróforos, en las cotransfecciones de ETAR y ETBR como proteínas de
fusión a YFP y CFP.
34
4. RESULTADOS
4.1 Generación de proteínas recombinantes del receptor de endotelina ETA y ETB
fusionadas YFP, CFP o con el epítope HA.
4.1.1 Análisis del alineamiento de las secuencias aminoacídicas de ETAR y ETBR.
Mediante el programa en el sitio web www.uniprot.org, que utiliza una amplia base de
datos, se realizó el alineamiento de ambas proteínas humanas. En la figura 2, se detallan las
secuencias aminoacídicas del receptor de endotelina ETA y ETB, formados por 427 y 442
residuos, respectivamente. Ambos receptores poseen siete dominios transmembrana, un extremo
amino terminal en el extracelular y un extremo carboxilo terminal en el intracelular. Sin embargo,
a pesar de una estructura en común, solo presentan un 51,7% de similitud entre sus residuos (en
amarillo). Residuos en celeste señalan los sitios putativos de N-glicosilación de los receptores.
ETAR sería glicosilado en Asp-31 y Asp-62, a diferencia de ETBR, solo en Asp-59. Estos sitios,
podrían ser puntos claves, en la interacción proteína-proteína, que se ha visto en otros GPCRs.
35
Figura 2. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de ETAR y ETBR humanas. En
amarillo destacan los residuos homólogos para ambos receptores que corresponden al 51,7% de
su estructura proteica. En celeste destacan los residuos putativos donde ocurre N-glicosilación.
Asp59 en ETBR y Asp31 y Asp62 para ETAR. Además, se encuentran señalados los siete dominios
transmembrana para ambos receptores de endotelina.
36
4.1.2 Amplificación de las secuencias que codifican para las proteínas recombinantes del
receptor de endotelina ETA y ETB.
Las secuencias correspondientes a cada uno de los productos codificantes de los
receptores de endotelina, se amplificaron por PCR, utilizando como templados los vectores
ETAR pcDNA3.1 (+) y ETBR pcDNA3.1 (+), y los partidores diseñados según métodos 3.2.1.1.
Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1%. Cada
producto de interés se purificó y digirió con enzimas de restricción para su posterior ligación en
vectores de expresión. En la Figura 3, se observa la electroforesis del producto de amplificación
del receptor de endotelina ETA y ETB, cuyos tamaños corresponderían a los esperados según
literatura, 1284 pb y 1329 pb, respectivamente.
37
Figura 3. cDNAs de ETAR y ETBR generados por PCR. Electroforesis en gel de agarosa al
1% teñido con bromuro de etidio. Carril 1: Marcador de tamaño molecular 100 pb DNA Ladder.
Carril 2: Producto de amplificación ETB 1329 pb, aproximadamente. Carril 3: Producto de
amplificación ETA 1284 pb, aproximadamente. Carril 4: Amplificación sin templado.
38
4.1.3 Clonamiento de los productos de amplificación que codifican para las proteínas
recombinantes del receptor ETA Y ETB.
Los productos de amplificación obtenidos fueron digeridos y ligados en los respectivos
vectores de expresión de acuerdo a lo descrito en métodos 3.2.1.5. En la Figura 4, se observa los
cDNAs pertenecientes a los receptores ETA y ETB, y la liberación del cDNA del receptor V2a
desde el plásmido pEYFP-N1. Este vector, fue utilizado para generar las proteínas ETAR-YFP y
ETBR-YFP, mientras que el producto V2a fue desechado.
Del mismo modo, para generar las proteínas de fusión ETAR-CFP y ETBR-CFP, fueron
liberados los cDNAs de los receptores ETAR y ETBR desde el plásmido pEYFP-N1, y ligados
al vector de interés pECFP-N1. En la Figura 5, se observa la liberación de ETAR y ETBR desde
pEYFP-N1, para ser clonados a pECFP-N1.
Además se generaron proteínas etiquetadas con epítope HA. En la Figura 6, se observan
los productos HA-ETAR, HA-ETBR y el vector pcDNA3.1 (+), que fueron cuantificados, para
su posterior ligación. Fue necesario el uso del programa UN-SCAN-ITgel, que permitió para
todas las construcciones obtener concentraciones de DNAs aproximadas, mediante la relación de
pixeles presentes en la banda de interés en el gel y el marcador de peso molecular λ DNA/ Hind
III Fragments.
39
Figura 4. Liberación del cDNA del receptor V2a generado como proteína de fusión a YFP,
para ser clonado a ETAR y ETBR. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con bromuro de
etidio. Se sometieron a digestión en serie con las enzimas Hind III y Sal I de acuerdo a métodos
3.2.1.5. Carril 1: Marcador de tamaño molecular 100 pb DNA Ladder. Carril 2: ETAR. Carril 3:
ETBR. Carril 4 y 5: vector V2aYFP-N1. A la derecha de la figura se indican los tamaños
esperados para los respectivos insertos y para el vector liberado.
40
Figura 5. Liberación de los cDNAs de ETAR y ETBR generados como proteína de fusión a
YFP, para ser clonados en el vector pECFP-N1. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido
con bromuro de etidio. Los clones se sometieron a digestión en serie con las enzimas Hind III y
Sal I de acuerdo a métodos 3.2.1.5. Carril 1: Marcador de tamaño molecular 100 pb DNA
Ladder. Carril 2: ETAR-YFP. Carril 3: ETBR-YFP. Carril 4 y 5: vector pECFP-N1. A la derecha
de la figura se indican los tamaños esperados para los respectivos insertos y para los vectores
linealizados pEYFP-N1 y pECFP-N1.
41
Figura 6. Cuantificación de HA-ETAR, HA-ETBR y del vector pcDNA 3.1 (+) para la
ligación. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% preparado en TAE 1X y teñido con bromuro de
etidio. Los insertos y el vector se sometieron a digestión en serie con las enzimas Sal I y Hind III.
Se cuantificaron las bandas mediante el programa UN-SCAN-IT gel. Carril 1: cDNA HA-ETAR.
Carril 2: cDNA HA-ETBR. Carril 3: Marcador de masa molecular λ DNA/ Hind III Fragments.
Carril 4 y 5: Vector pcDNA3.1 (+).
42
4.2 Caracterización de los receptores de endotelina ETA y ETB fusionados al epítope HA y
a proteínas fluorescentes YFP y CFP en células CHO-K1.
4.2.1 Expresión de los receptores de endotelina ETA y ETB etiquetados con el epítope HA.
Las células se cultivaron y transfectaron de forma transitoria con las construcciones
plasmidiales que codifican para las proteínas HA-ETAR y HA-ETBR. Al cabo de 48 horas de
transfección, extractos totales de proteínas se sometieron a SDS-PAGE y Western blotting,
utilizando para la detección el anticuerpo monoclonal anti-HA 1:1000. Como se observa en la
Figura 7, HA-ETAR y HA-ETBR en este tipo celular y bajo las condiciones de tratamiento
detalladas en métodos 3.2.2.5 presentan un solo perfil de masa molecular relativa. Considerando
que la masas moleculares estimadas a partir de las secuencias aminoacídicas de las proteínas HAETAR y HA-ETBR es de aproximadamente 47 y 49 kDa, respectivamente, y reparando además
que la masa molecular estimada del epítope de hemaglutinina es de 9 kDa aproximadamente.
Las bandas obtenidas corresponderían a la forma monomérica de los subtipos del receptor de
endotelina.
43
Figura 7. Inmunodetección de los receptores de endotelina ETAR y ETBR etiquetados con
el epítope HA. Células CHO-K1 fueron transfectadas en forma transitoria con las construcciones
plasmidiales que codifican para los subtipos del receptor de endotelina ETA y ETB. Se
prepararon extractos totales de proteínas solubilizadas, que fueron sometidas a SDS-PAGE e
inmunodectectadas mediante Western blotting con anticuerpo monoclonal dirigido contra el
epítope HA (1:1000) y anticuerpo secundario DAM-HRP (1:25000). Carril 1: Células CHO-K1
sin transfectar. Carril 2 y 3: Transfección con HA-ETBR. Carril 4 y 5: Transfección con HAETAR.
44
4.2.2 Expresión de los receptores de endotelina ETA y ETB como proteína de fusión a CFP
e YFP.
Células CHO-K1 se transfectaron transitoriamente con los plasmidios que codifican para
las proteínas de fusión ETAR-CFP, ETAR-YFP, ETBR-CFP y ETBR-YFP. Transcurridas 48
horas, se obtuvieron extractos totales de membrana, de acuerdo a lo descrito en métodos 3.2.2.5,
los que fueron sometidos a SDS-PAGE y Western blotting, utilizando para la detección el
anticuerpo policlonal anti-GFP (1:5000), que reconoce todas las isoformas de las proteínas
fluorescentes. En la Figura 8, observamos que las proteínas de fusión presentan un perfil de masa
molecular esperado, que corresponderían a los pesos moleculares de los receptores más los pesos
moleculares de las proteínas fluorescentes, siendo para ETAR-YFP y ETAR CFP de 74 kDa y
para ETBR-YFP y ETBR-CFP de 76 kDa, aproximadamente. Además debe considerarse el peso
molecular de los sitios putativos de N-glicosilación, que son para ETAR Asp-31 y Asp-62, y
para ETBR Asp-59.
Las bandas con masas moleculares menores a las esperadas, podrían
corresponder a productos de degradación de la proteínas de fusión (Martín et al. 2003).
45
Figura 8. Inmunodetección de los receptores de endotelina ETA y ETB como proteína de
fusión a CFP e YFP. Se aislaron extractos proteicos totales de células CHO-K1 que expresaban
de forma pasajera las proteínas ETAR-CFP, ETAR-YFP, ETBR-CFP y ETBR-YFP y se
sometieron a SDS-PAGE. La detección, por Western blotting, se realizó con el anticuerpo
policlonal antiGFP (1:5000) y el anticuerpo secundario GAR-HRP (1:50000). Carril 1:
Transfección con ETBR-YFP. Carril 2: Transfección con ETBR-CFP. Carril 3: Células CHO-K1
sin transfectar. Carril 4: Transfección con ETAR-YFP. Carril 5: Transfección con ETAR-CFP.
46
4.3 Estudio de interacción proteína-proteína in vitro mediante co-inmunoprecipitación en
células CHO-K1.
Como primera aproximación al estudio de interacción entre los subtipos A y B de los
receptores de endotelina, células CHO-K1 fueron cotransfectadas en forma pasajera con los
vectores que codifican para las proteínas marcadas con epítopes diferenciales (YFP y HA), de la
siguiente manera; HA-ETAR y ETAR-YFP, HA-ETBR y ETBR-YFP, ETAR-YFP y HA-ETBR,
HA-ETAR y ETBR-YFP. Al cabo de 48 horas, se prepararon extractos de proteínas totales y se
sometieron a co-inmunoprecipitación de acuerdo a lo descrito en métodos 3.2.3.1 Por Western
blotting, se detectaron los receptores marcados con HA a partir del inmunoprecipitado obtenidos
con anti GFP-Proteína A-agarosa. En la Figura 9, se muestra el perfil detectado para
los
homoligómeros HA ETAR – ETAR YFP y HA ETBR – ETBR YFP. En los carriles 2 y 4 se
observa una única banda para cada oligómero, cuyo tamaño se asemeja al obtenido para los
perfiles individuales de cada receptor. Se realizaron, además,
una serie de controles para
demostrar la especificidad de la interacción y descartar que la detección se deba a artefactos
propios del tratamiento de las muestras. Como control de especificidad, control positivo (carril
7), se utilizó el receptor V2a-YFP (¨~ 69 kDa) y V2a-HA (~ 42 kDa), conocido ya por su
capacidad de oligomerizar. Como control de la técnica se transfectó HA-ETBR y ETBR-YFP por
separado, y al momento de realizar la co-inmunoprecipitación se mezclaron los extractos los que
fueron sometidos a Western blotting a fin de determinar si la oligomerización corresponde a un
proceso biosintético, o bien, es un artefacto de solubilidad. En el carril 6, se puede observar que
47
no fueron detectados oligómeros de HA ETBR – ETBR YFP, por lo tanto, la interacción entre
estos receptores no es producto de interacciones inespecíficas entre segmentos hidrófobicos de
los dominios transmembrana u otro dominio propio del receptor, sino que ocurre como un evento
post-traduccional.
48
Figura 9. Western blotting de co-inmunoprecipitados de los receptores de endotelina ETAR
y ETBR como homoligómeros. Células CHO-K1 se transfectaron o cotransfectaron en forma
transitoria. Extractos proteicos totales fueron sometidos a Co-IP. Carril 1: Células sin transfectar
(control negativo). Carril 2: Cotransfección de HA-ETBR y ETBR-YFP. Carril 3: vacío. Carril 4:
Cotransfección de HA-ETAR y ETAR-YFP. Carril 5: vacío. Carril 6: Trasfecciones
independientes, extractos proteicos mezclados al hacer co-inmunoprecipitación. Carril 7:
Cotransfección de HA-V2a y V2a-YFP (control positivo).
49
Del mismo modo, Figura 10, se sometieron a Co-IP, inmunoprecitados de HA-ETBR con
ETAR-YFP y ETBR-YFP con HA-ETAR, para demostrar su capacidad de interacción como
heteroligómeros. En el carril 2 y 4, se observan los perfiles de banda obtenidos para ambos
oligómeros, cuya diferencia radica en el cambio del receptor de endotelina fusionado HA o YFP,
pero que muestran masas moleculares relativas similares entre sí, y similares además con la
obtenida para los homoligómeros, y los perfiles individuales de cada subtipo del receptor.
También se realizó la inmunoprecipitación de la mezcla de extractos de transfecciones
independientes de HA-ETAR y ETBR-YFP, para descartar cualquier artefacto generado por la
interacción de las membranas solubilizadas.
Los resultados mostraron que las construcciones HA-ETAR y HA-ETBR son
inmunodetectados en inmunoprecipitados obtenidos con anti-GFP a partir de células
cotransfectadas con distintas concentraciones de DNA de ambas construcciones (datos no
mostrados). Esto prueba que HA-ETAR y HA-ETBR interactúan con ETAR-YFP y ETBR-YFP,
para la formación de homoligómeros y heteroligómeros.
Además el epítope HA no es inmunodetectado en inmunoprecipitados obtenidos a partir
de células que solo han sido transfectadas con las construcciones ETAR-YFP y ETBR-YFP. Lo
que demuestra la especificidad del anticuerpo anti-HA.
Por último, como control negativo, se sometieron a Co-IP células CHO-K1 sin transfectar,
las que no mostraron ninguna detección de bandas (figura 9, carril 1; Figura 10, carril 1).
50
Figura 10. Western blotting de co-inmunoprecipitados de los receptores de endotelina
ETAR y ETBR como heteroligómeros. Células CHO-K1 se transfectaron o cotransfectaron en
forma transitoria. Extractos proteicos totales fueron sometidos a Co-IP. Carril 1: Células sin
transfectar. Carril 2: Cotransfección de HA-ETAR y ETBR-YFP. Carril 3: Transfecciones
independientes, extractos proteicos mezclados al hacer co-inmunoprecipitación. Carril 4:
Cotransfección de HA-ETBR y ETAR-YFP.
51
4.4 Estudio de interacción proteína-proteína mediante transferencia de energía fluorescente
por resonancia (FRET) en células HEK-293.
Las interacciones entre proteínas pueden ser evaluadas, también in situ, con una alta
sensibilidad utilizando la técnica de transferencia de fluorescencia por resonancia (FRET). Por
esta razón y con el objeto de estimar la formación de homoligómeros y heteroligómeros entre los
receptores de endotelina ETA y ETB, células HEK- 293 fueron transfectadas y cotransfectadas
según lo describe el método 3.2.4.2. Se utilizó esta línea celular debido a su rápido crecimiento,
facilidad para transfectar, y un amplio citoplasma que permitió hacer un registro de imágenes con
una señal de gran calidad (buena relación señal/ ruido). Pasadas 24 horas de este procedimiento,
se procedió a fijar las células HEK-293, y luego fueron observadas bajo microscopio de
fluorescencia. La población celular mostró una heterogeneidad de la intensidad de fluorescencia
de los receptores. En la Figura 11, se observa la distribución de los receptores ETA y ETB
fusionados a CFP e YFP en la superficie celular y en el citoplasma, siendo cada uno una
transfección independiente, y sometido a longitudes de onda de excitación de 440 nm y 515 nm,
para CFP e YFP, respectivamente.
52
Figura 11. Localización celular de los receptores de endotelina ETA y ETB fusionados a
proteínas fluorescentes CFP e YFP. Células HEK-293 fueron cultivadas en cubreobjetos y
transfectadas individualmente con cada variante del receptor de endotelina. Tras 24 horas, las
células fueron fijadas y analizadas mediante microscopía confocal, excitando con un láser de 440
nm a CFP y un láser de 515 nm a YFP.
53
Para la colección de imágenes de las transfecciones y cotransfecciones en el microscopio
confocal, se utilizó un A. C. de 105 µm, una magnificación de 40X, un zoom de 3, y PMT
constantes de 600 (CFP) y 500 (YFP), para medir la transferencia de energía por el método de los
tres set de filtros (Gordon et al. 1998) normalizada por la raíz cuadrada de la señal del dador por
el aceptor y abreviada NFRET (Xia and Liu 2001; Sarmiento et al. 2004).
El análisis de las imágenes compiladas se hizo gracias al software Image J, y al plugin
PixFRET. Este último permite la corrección del Background (BG) y del Spectral Bleed-Through
(SBT) antes del cálculo de FRET, en un modelo exponencial. El programa requiere de la
construcción de tres stacks; FfDfAf, FdDd y FaAa. Siendo FdDd imágenes capturadas de la
transfección de CFP y FaAa, de la transfección de YFP, individualmente, como control de la
técnica, en células HEK-293. Y cuyos parámetros de BG y SBT son aplicados a todos los stacks
FfDfAf.
Los valores de BG se obtienen desde una región oscura de la imagen, donde no se
observan células, mientras que los SBT se recopilan de regiones ROIs (regiones de interés). Para
el cálculo de éste último es necesario además aplicar un desenfoque gaussiano que mejora la
determinación de los SBT por el plugin. Un valor de 2.0 es el recomendado y se mantuvo
constante durante el análisis de todas las imágenes.
Además, el plugin exige ingresar el factor de corrección de umbral (threshold correction
factor). FRET y NFRET se calculan sólo si a los valores de pixeles de cada imagen se les da un
threshold (umbral), lo cual por defecto se usa como un valor de BG promedio, y que
automáticamente el programa entrega. En este caso se aplicó el valor de 1.0, este factor de
corrección es un factor de multiplicación que se aplica a los valores de background para
modificar este umbral.
54
En estas condiciones, solo es posible observar NFRET, si de las proteínas que
interaccionan una posee el fluoróforo CFP y la otra YFP.
Para medir los niveles de NFRET, en cada caso se colectaron a lo menos 4 imágenes, de
células distintas dentro de una misma preparación, de las que se escogieron 3 que serían
representativas de cada situación establecida (n=3). Dentro de cada imagen se evaluaron 3
regiones de interés (ROIs), que fueron promediados con el fin de entregar un NFRET aproximado
para la imagen completa. En la Figura 12, se observan las imágenes ya estudiadas, desde las
cuales se pudieron obtener valores numéricos, medidos en unidades arbitrarias, de la intensidad
NFRET. A partir de éstos, se logró comparar niveles de intensidad de fluorescencia, de todas las
situaciones analizadas, como se expone en la Figura 13. La imagen (A) muestra el control
positivo CFP-YFP link, que es una proteína fluorescente fusionada, donde se espera que ocurra el
mayor índice de FRET por su constante cercanía, en este caso 29,86 u.a. (B) corresponde al
control negativo CFP e YFP solubles cotransfectados, donde los niveles de FRET son bajos ya
que solo se deben a colisiones azarosas en la preparación, 10,67 u.a. (C) y (D) cotransfecciones
de ETAR-CFP con ETAR-YFP y ETBR-CFP con ETBR-YFP, exhiben valores de 17,65 y 19,38
u.a., respectivamente. Finalmente (E) y (F) presentaron valores de 20,03 y 18,80 u.a.
correspondientemente a cotransfecciones de ETAR-CFP con ETBR-YFP y ETBR-CFP con
ETAR-YFP. El valor de intensidad de NFRET medido en unidades arbitarias (u.a.), es mucho
mayor en las condiciones de formación de oligómeros de receptores de endotelina, que el
calculado para las proteínas solubles, siendo aproximadamente el doble en cada caso.
55
56
Figura 12. Microscopía basada en el análisis FRET normalizado. Imágenes capturadas
mediante microscopía confocal, con un A.C. 105 µm, una magnificación de 40X y zoom de 3. A
partir de las imágenes colectadas se construyeron tres stacks FfDfAf, FdDd y FaAa para su
análisis por medio del software ImageJ plugin PixFRET, en los que FdDd corresponde al donador
y FaAa al aceptor, ambos entregan al programa valores de BG y SBT que sirven de parámetros
para el análisis FRET presente en el stack FfDfAf. (A) CFP-YFP link soluble; control positivo,
(B) CFP + YFP soluble; control negativo, (C) ETAR-CFP + ETAR-YFP, (D) ETBR-CFP +
ETBR-YFP, (E) ETAR-CFP + ETBR-YFP, (F) ETBR-CFP + ETBR-YFP. Todas las imágenes
fueron pseudocoloreadas con lut Fire, desplegadando en todos los casos valores de 0 a 255, en el
que negro y blanco que corresponden al mínimo o máximo de energía transferida,
respectivamente.
57
Figura 13. NFRET calculado para la formación de oligómeros del receptor ETA y ETB.
Células HEK-293 transfectadas y cotransfectadas según métodos 3.2.4.2, fueron fijadas, y
sometidas a microscopía confocal para la colección de imágenes, y su posterior análisis mediante
el software ImageJ plugin PixFRET. Se utilizó como control positivo CFP-YFP link y como
control negativo CFP + YFP, ambos solubles, cuyos valores medidos en unidades arbitrarias,
muestran una considerable diferencia entre ellos, y con respecto a las interacciones proteínaproteína que se evalúan.
58
Asimismo, con estos valores de intensidad, se calculó el porcentaje de eficiencia de
NFRET, siendo para el control positivo CFP-YFP link de un 100% aproximadamente, por las
condiciones ya mencionadas. Con esto se compararon todos los demás valores obtenidos, como
se señala en la Figura 14, el porcentaje para el control negativo CFP + YFP solubles, fue solo de
un 35, 7% a diferencia de los porcentajes mostrados por las formas homoligómeras del receptor
ETAR-ETAR (59,1%) y ETBR-ETBR (64,9%) y heteroligómeras ETAR-CFP + ETBR-YFP
(67,01%) y ETBR-CFP + ETAR-YFP (62,9%) que fue aproximadamente el doble.
59
Figura 14. Porcentaje de eficiencia del FRET normalizado mediante el método de los tres
set de filtros. Obtenidos los valores de NFRET a partir del procesamiento de las imágenes
colectadas mediante microscopía confocal y el software ImageJ plugin PixFRET. Se consideró
como un 100% de eficiencia en la transferencia de energía, al control positivo, la proteína de
fusión CFP-YFP link, que por su aproximación, genera un alto índice FRET. Relacionando los
demás valores al control positivo, 35,7% de eficiencia se obtuvo para el control negativo, a
diferencia de ETAR-CFP + ETAR-YFP, ETBRCFP + ETBR-YFP, ETAR-CFP + ETBR-YFP y
ETBR-CFP + ETAR-YFP que mostraron eficiencias más elevadas de 59,1%, 64,9%, 67,0% y
62,9%, respectivamente.
60
5. DISCUSIÓN
La oligomerización de los receptores pertenecientes a la gran familia de los GPCRs es un
fenómeno bastante establecido. Se ha observado que los integrantes de esta familia, podrían
formar parte de estructuras moleculares constituidas por complejos diméricos y/o oligoméricos,
desechando teorías que indicaban solo como posible una relación estequiométrica 1:1 entre
receptor y proteína G heterotrimérica. Además, la oligomerización tendría un importante rol
funcional en los GPCRs (Rios et al., 2001), en términos de la expresión en superficie celular,
unión al ligando, señalización y tráfico del receptor (Terrillon y Bouvier, 2004), como se ha
demostrado en el caso del receptor GABAbR1, cuya expresión en la superficie celular solo ocurre
si heteroligomeriza con GABAbR2, de lo contrario, es retenido intracelularmente como una
proteína inmadura, ya que posee un motivo de retención en su extremo carboxilo terminal.
GABAbR2 en cambio, es capaz de ubicarse en la membrana celular, pero, no es funcional por sí
solo (Kaupmann et al., 1998). Se han postulado diversos mecanismos a través de los cuales los
GPCRs podrían oligomerizar, tales como interacciones entre los dominios transmembrana del
receptor a través de secuencias específicas del tipo glicoferina A (Russ y Engelman, 2000),
residuos de cisteínas presentes en las regiones transmembrana (Berthouze et al., 2007) o
extracelulares (Romano et al., 1996) y mecanismos múltiples donde se involucran puentes
disulfuros y N-glicosilaciones (Michineau et al., 2006).
Con los antecedentes mencionados, era posible esperar que los receptores de endotelina
subtipo A y B, acoplados a proteína G heterotrimérica, fuesen capaces de homoligomerizar y
heteroligomerizar.
61
Para evidenciar estas posibles interacciones, se utilizaron como estrategias: coinmunoprecipitación en un modelo de cotransfecciones transitorias
en células CHO-K1 y
transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET) en células HEK-293.
En primer lugar fue necesario caracterizar por Western blotting el perfil de las proteínas
marcadas con los diferentes epítopes (HA, CFP, YFP), para tener claridad de la identidad de cada
banda. Cabe destacar que las etiquetas acopladas a los receptores no interfieren con su
funcionalidad.
Al expresar HA-ETAR y HA-ETBR en células CHO-K1, se observó un perfil
correspondiente a una sola banda
de masa molecular aproximada, de 56 y 58 kDa,
respectivamente (Figura 7). Siendo posible, gracias al aumento de concentración del EDTA de 1
mM a 50 mM en el buffer de lisis RIPA 1X, esto porque en condiciones habituales de extracción
proteica, ETAR y ETBR, son sensibles a proteólisis por metaloproteinasas, generando un perfil
de dos bandas de masa molecular aproximada 35 y 50 kDa (Kozuka et al., 1991). Se hizo
necesario hacer esta modificación, ya que el sitio de corte para ETAR y ETBR se encuentra
ubicado en el amino terminal, sitio además donde se incorporó el epítope HA, e impedían una
clara detección de las proteínas por el anticuerpo monoclonal anti-HA, que es específico, pero no
lo bastante sensible para detectar estos fragmentos hidrolizados, recordando además, que estas
proteínas recombinantes tienen una escasa representación en la población total de proteínas sobre
–expresadas.
Utilizando las mismas condiciones ya mencionadas, se detectaron los perfiles para ETAR
y ETBR fusionados a proteína fluorescente celeste o amarilla (CFP e YFP). Los perfiles
obtenidos fueron más complejos que para HA-ETAR y HA-ETBR, obteniéndose bandas
aproximadas de 74 y 76 kDa, para ETAR y ETBR, respectivamente, además de otras bandas de
62
menor masa molecular, que podrían deberse a distintos estados de maduración de las proteínas, o
degradación de esta misma, y que son posibles de ser detectadas, debido a la alta sensibilidad del
anticuerpo anti-GFP.
El siguiente paso fue realizar la co-expresión transitoria de los receptores, HA-ETAR con
ETAR-YFP, HA-ETBR con ETBR-YFP, HA-ETBR con ETAR-YFP y HA-ETAR con ETBRYFP en células CHO-K1. A partir de estos experimentos y posterior co-inmunoprecipitación se
demostró que estos receptores son capaces de homoligomerizar (Figura 9. Carril 3 y 5) y
heteroligomerizar (Figura 10. Carril 2 y 4), en las condiciones mencionadas. Y que sus
interacciones, no son artefacto producto de la solubilización de membranas, sino que es un
proceso biosintético, ya que al mezclar membranas de transfecciones independientes para cada
subtipo del receptor no se detectó interacción (Figura 9. Carril 6, Figura 10. Carril 3). La
homoligomerización de la isoforma V2a del receptor de vasopresina se utilizó como control
positivo (Fig 9. Carril 7).
Estas oligomerizaciones, presentan una masa molecular relativa inferior, a lo que se
debería esperar para la sumatoria de los pares de proteínas transfectadas que se encuentran
interectuando, más bien muestran un perfil similar al de cada proteína expresada individualmente.
Esto porque las interacciones de los receptores son lábiles y se disocian detectándose el
monómero, a diferencia de otros receptores que forman oligómeros resistentes a las condiciones
denaturantes (Gordon et al., 1994).
Diversos antecedentes han demostrado que la oligomerización de algunos GPCRs
depende de residuos de cisteínas presentes en algunos dominios transmembrana, como es el caso
del receptor 5-HT4 (Berthouze et al., 2007) y el receptor B2 de bradiquinina humana (Michineau
et al., 2006). A partir de la secuencia aminoacídica de los receptores de endotelina (Figura 1),
63
podemos observar la existencia de 7 residuos de cisteína en los dominios TM1, TM3, TM5, TM6
y TM7 para ETAR y 6 residuos de cisteína en los mismos dominios mencionados, algunos de los
cuales podrían formar potenciales puentes disulfuros que estabilicen las estructuras de los
receptores, ya sea como monómero, dímero u oligómero. Así como los motivos aminoacídicos
del tipo glicoferina A: AxxxS en TM1, SxxxG en TM2, entre otros, donde x es cualquier
aminoácido (Russ et al., 2000).
Interacciones fuertes detectadas en expresiones individuales de estas proteínas, son
resistentes a las condiciones del SDS-PAGE, pero no al tratamiento con agente reductor βmercaptoetanol, en cambio, otras interacciones son sensibles al SDS-PAGE, pero son posibles de
detectar por Co-IP, lo que apuntarían a interacciones esféricas a través de motivos del tipo
glicoforina A (Senes et al., 2004; Overton et al., 2003; Russ et al., 2000). Por tanto, receptores de
endotelina subtipo A y B, presentarían múltiples dominios de interacción, y que apuntan al
menos, a dos tipos de interacciones, que permitirían formar y estabilizar estos complejos.
Otra técnica utilizada, para probar oligomerización entre los receptores de endotelina, fue
Transferencia de Energía Fluorescente por Resonancia (FRET), técnica usada para cuantificar la
distancia relativa entre dos fluoróforos. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada para
determinar la formación de oligómeros. Existen variados métodos para calcular FRET, sin
embargo, en esta tesis se utilizó el método de los tres set de filtros (Gordon et al. 1998),
normalizando (NFRET), con respecto a las señales del dador (CFP) y el aceptor (YFP)
(Sarmiento et al., 2004; Xia and Liu 2001).
En relación a lo mencionado, para el receptor de endotelina ETA y ETB, se detectó
transferencia de energía (FRET), cuando se cotransfectaron las dos variantes del receptor, en
64
todas combinaciones, como proteínas de fusión al par de fluoróforos compatibles para FRET,
CFP e YFP.
Al comparar el índice FRET con el de FRET normalizado, se observa una significativa
diferencia de valores (datos no mostrados), ya que el primero no considera valores de BG y SBT
promedios del aceptor y donador, parámetros constantes utilizados en el análisis de todas las
imágenes de un determinado grupo de stacks. Estos controles además, pueden ser escogidos de
un gran número de imágenes una independiente de la otra (aceptor y donador) ya que podrían
deberse a preparaciones diferentes, sin embargo, para esto, es necesario fijar el voltaje del
fotomultiplicador a valores constantes tanto para el aceptor, como para el donador, en este caso se
usó 600 y 500 V, para cada fluoróforo, respectivamente.
Considerando solo las intensidades de NFRET, los rangos de diferencia entre el control
positivo y el negativo son significativos, alrededor de 20 u.a. Lo mismo se observa para las
intensidades obtenidas de los oligómeros, que entre ellas muy similares, pero con respecto al
control negativo y positivo, hay una brecha aproximada de unas 9 u.a. Estos valores indican que
la transferencia de energía detectada para las tres situaciones de oligomerización, es de naturaleza
distinta a la que ocurre por colisiones al azar (como ocurre en CFP + YFP) entre fluoróforos; por
el contrario, la transferencia de energía depende en gran medida de la distancia molecular
existente entre los fluoróforos, lo que nos lleva a pensar que el NFRET detectado, evidencia una
cercanía íntima molecular condicionada por la oligomerización entre los subtipos del receptor.
A pesar de no haber realizado experimentos de co-localización de la señal FRET, se
observó fluorescencia a nivel de membrana plasmática y citoplasma, lo que podría implicar que
estas proteínas al igual que cualquier proteína integral de membrana alcanza su destino final
luego de haber transitado a través de la vía secretora (Petaja-Repo et al., 2000) . Esto además, de
65
que muchos receptores oligomerizan tempranamente en el retículo endoplásmico para solo así
alcanzar finalmente la superficie celular, que podría ser el caso de estos receptores (Issafras et al.
2002; Overton and Blumer 2002; Floyd et al., 2003; Terrillon et al., 2003).
Los resultados demuestran que los subtipos del receptor de endotelina ETA y ETB, son
capaces de oligomerizar, lo que podría ocurrir a nivel de citoplasma o membrana plasmática, y
cuyo proceso se asocia directamente a las propiedades funcionales de estas proteínas, así como de
otros GPCRs.
66
6. CONCLUSIONES
-
Los receptores de endotelina ETA y ETB, expresados en células CHO-K1, presentan una masa
molecular relativa de acuerdo a los descrito para estos receptores.
-
Estos receptores son capaces de homo y heteroligomerizar como lo muestran los experimentos de
co-inmunoprecipitación y transferencia de energía fluorescente por resonancia.
-
ETAR y ETBR pueden ser detectados tanto en la membrana plasmática como en el interior de la
célula, probablemente en compartimientos membranosos.
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