Tipificación de grupos sanguíneos, factor RH y detección de

Transcripción

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN
TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS,
FACTOR RH Y DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
DE Trypanosoma cruzi EN MOMIAS DE LOS
MUSEOS DE COCHABAMBA Y SUCRE
Universitaria: Nancy Carolina Orellana Halkyer
PROYECTO DE TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE BIOLOGO
CARRERA DE BIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA
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I. INTRODUCCIÓN.-
Bolivia, país ubicado en el corazón de Sud América, en sus orígenes presenta diversidad de
culturas en todo su territorio, entre estas podemos citar algunas culturas antiguas como la
cultura Mojocoya perteneciente al periodo formativo a intermedio temprano (1- 800 años
d.C.), Colla Aymará al periodo Intermedio (600 a 1400 años d.C.), Puqui al periodo
Intermedio (600- 1400 años d.C.), Presto Puno periodo Intermedio (600- 1400 d.C.); de las
que se tienen vestigios de sus tradiciones y artesanías y de las que se conservan restos de
individuos momificados. Es importante resaltar la momificación espontánea que sufrieron
los individuos de estas culturas debido al clima seco y frío de las regiones donde fueron
encontrados los chullpares (Anexo 1), estructuras construidas de adobe donde depositaban
a sus cadáveres (Anexo 2- 8).
Según Ibarra & Querejazu, 1986, los primeros habitantes de América llegaron por el
estrecho de Bering desde Asia, estos se asentaron y mezclaron con las poblaciones de ese
entonces, hace millones de años, por otra parte se sabe que los asiáticos tienen grupo
sanguíneo O Rh positivo en su mayoría, grupo que predomina en América y que es
absoluto en los indígenas de tribus cerradas que no se mezclaron con otras razas.
Estos hechos son confirmados en trabajos realizados en Bolivia en poblaciones indígenas
Yukis del trópico boliviano en los que se encontraron en el 100 % de los individuos el
predominio del grupo O Rh positivo (Venegas, 1995).
Es importante nombrar que a partir de 1934 se trabajó con tejido muscular de momias en
Perú, Chile y Groenlandia en lo referente a grupo sanguíneo; en 1939 y 1953 también se
realizan trabajos para detectar antígenos del sistema Rh en momias, en las que se determina
el predominio del grupo sanguíneo O Rh positivo, postulando que mientras mas pura es la
raza aborigen americana el grupo O Rh positivo predomina (Suárez & Linares, 1967).
En relación a las enfermedades nos interesa estudiar la enfermedad de Chagas que tiene
gran prevalecía en nuestro país, agente causal de esta parasitosis es el protozoario
Trypanosoma cruzi, transmitido por Triatoma infestans (Segura, 1994) el vector mas
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común que se presenta en 7 de los 9 departamentos de Bolivia: La Paz, Cochabamba,
Tarija, Sucre, Potosí, Santa Cruz y Beni (Albarracin- Veizaga et al. 199).
En nuestro territorio antiguamente habrían habitado poblaciones de las culturas Wancarani
y Chinchorro, que habrían migraron desde Bolivia para establecerse en el Sur de Perú y
Norte de Chile respectivamente; en ese entonces Bolivia mantenía un activo intercambio
comercial entre estos países, motivo por el cual se levantan hipótesis sobre el posible origen
de la enfermedad de Chagas, además de que posteriormente, los antropólogos identificaron
evidencias de su existencia en las momias de los indios Chinchorro establecidas en el norte
de Chile, evidencias patológicas de megaesófago y megacolon por infección con T. cruzi y
de su migración desde Bolivia, aproximadamente hace 500 años a.C (Albarracin & Veizaga
et al. 1999, Rothhammer et al., 1985). También fue posible encontrar la presencia de
triatominos que parecen ser los antecesores de Triatoma infestans; estos triatominos fueron
encontrados entre los vestigios de las muestras momificadas.
Por otra parte, entre los trabajos realizados para la detección de T. cruzi en las momias, los
investigadores utilizaron pruebas moleculares. No se tienen datos de pruebas
inmunológicas realizadas para determinar la presencia de este parásito, sin embargo el
hecho de haber encontrado Schistosomiasis y malaria en momias e incluso diversos tipos de
proteínas en muestras fosilizadas de millones de años de antigüedad, en dinosaurios y otros
animales fosilizadas en los que se emplearon técnicas inmunológicas (Torres et al. s/a;
Rabino et al. 2000; Sauca, s/a), nos motiva a realizar ensayos de este tipo en las momias de
Cochabamba y Sucre.
Todos los estudios de restos humanos antiguos aportan información importante sobre las
enfermedades que sufrieron nuestros antepasados y que en muchos casos siguen
afectándonos, ayudando también a desarrollar terapias para combatirlas. Además, el
desarrollo de técnicas que permitan el estudio de grupos sanguíneos en momias, es una
contribución valiosa sobre todo en lo que concierne al origen de las razas ó núcleos étnicos.
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1. OBJETIVOS.-
1.1 Objetivos Generales.
- Tipificar grupos sanguíneos, factor Rh y detectar antígenos de Tripanosoma cruzi en
momias de los museos arqueológicos de Cochabamba y Sucre.
1.2 Objetivos Específicos.
-
Tipificar grupos sanguíneos y factor Rh en muestras colectadas de momias pre-
hispánicas y coloniales.
- Relacionar los grupos sanguíneos encontrados con la población nativa boliviana y la
distribución mundial de los grupos sanguíneos.
- Detectar en las muestras obtenidas la presencia de antígeno de T. cruzi.
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II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
PRIMERA PARTE.- LOS GRUPOS SANGUÍNEOS
1. Los grupos sanguíneos
Se denomina grupo sanguíneo a las moléculas antigénicas presentes principalmente sobre la
membrana de los eritrocitos. Estas estructuras están bajo estricto control genético,
heredándose de padres a hijos de acuerdo a las leyes de Mendel (Bernard et al. 1989).
Se conocen más de 400 moléculas antigénicas en los glóbulos rojos, las cuales se estudian
generalmente reunidas en sistemas. Denominándose sistema de grupo a un conjunto de
antígenos que, conservando su independencia, se transmiten como una unidad (Segalés et
al. 1988), de estos los principales son el sistema ABO y el sistema Rhesus (Bernard et al.
1989).
Cada sistema esta formado por varios antígenos, que admiten combinaciones casi infinitas
y hacen posible una clasificación de la sangre, característica prácticamente irrepetible en
cada individuo (Segalés et al. 1982).
Estructuralmente, los grupos sanguíneos son glucolípidos y/o proteínas que forman parte de
la membrana del eritrocito. La especificidad del grupo A, B y O, reside en la presencia de
glucoproteínas en la estructura unidas a diferentes azúcares (Lluís Vives & Lluís Aguilar,
1997).
Los antígenos de los sistemas de grupo eritrocitario se determinan mediante reacciones de
tipo antígeno- anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser naturales, como en el caso de las
aglutininas anti- A y anti- B o inmunes, cuyo ejemplo más característico es el anticuerpo
anti- Rh (Lluís Vives & Lluís Aguilar, 1997).
En general, los antígenos del grupo sanguíneo han podido descubrirse gracias a la
existencia de un anticuerpo específico contra ellos, estos anticuerpos se forman, tanto en
seres humanos como en animales de experimentación, al serles inyectada sangre con
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diferentes características antigénicas. De esta manera se han ido describiendo los distintos
grupos sanguíneos conocidos y de acuerdo a su comportamiento genético, se han podido
encasillar en sistemas sanguíneos (Meza & Correa, 1988).
2. Antígenos y sistemas de grupo sanguíneo eritrocitario más importantes.-
Los diversos tipos de antígenos erirocitarios (más de 400) representan 20 sistemas de
grupo, que se exponen a continuación en la siguiente tabla; de los cuales los principales son
el sistema ABO y el sistema Rheus (Sans- Sabrafen, 1988).
Tabla 1.- Sistemas Eritrocitarios
SISTEMA
ANTÍGENOS ERITROCITARIOS
ABH
A, B, H (subgrupos de A y B)
Rh-Hr
D, C, E, c, e, etc. (más de 40)
Lewis
Lea, Leb
Kell
K, k, Jsa, Jsb, Jpa, Jpb, etc. (más de 20)
Duffy
Fya, Fyb….
Kidd
Jka, Jkb….
MNSs
M, N, S, s
P
P1, Pk y P
Lutheran
Lua, Lub….
Diego
Dia, Dib….
I
I, i
Fuente: (Sans- Sabrafen, 1988)
2.1 Sistema ABO
La expresión fenotípica de los antígenos A y B depende de dos genes independientes. El
primero es el gen H presente en la mayoría de la población humana y que mediante la
fijación de la L- fucosa a un mucopolisacarido “de base”, permite la formación del antígeno
o sustancia H (Bernard, 1989).
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Los individuos que tienen en el segundo gen, el alelo A o el alelo B transforman esta
sustancia H en sustancia A o en sustancia B, utilizando un azúcar para dicho proceso.
Aquellos sujetos que llevan el alelo A en un cromosoma y el B en otro cromosoma tendrán
ambos antígenos A y B y aquellos individuos que no posean ni el alelo A ni el alelo B, no
modifican su sustancia H denominándose de grupo “O” (Bernard, 1989) (Fig. 1).
Figura 1. Estructura de las sustancias A, B y H.
Fuente: (Bernard, 1989)
Existen individuos que no poseen el gen H (genotipicamente hh) por lo que no pueden
expresar la antigenicidad A ni la B incluso aunque posean el gen A, el B o ambos, no
obstante pueden transmitir antigenicidad A o B, este fenotipo extremadamente raro fue
descrito por vez primera por Bhende en 1952, quien lo denominó “Bombay” (Bernard,
1989).
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Cuando los hematíes tienen poca sustancia H como en los grupos A y AB, se puede
detectar en el suero la presencia de estos anticuerpos anti- H, esta situación se produce de
forma natural sin que exista estimulación antigénica conocida. El gen H puede detectarse en
forma homocigota HH o heterocigota Hh, debido a que este gen H es amorfo, la forma
heterocigota no puede identificarse (Sans- Sabrafen, 1988).
Los antígenos A y B se encuentran en los eritrocitos y los anticuerpos anti- A y anti- B en
el suero; aquellas personas AB tendrán los antígenos A y B en los eritrocitos y no tendrán
anticuerpos en el suero. Una persona O no tiene ni antígenos ni anticuerpos A ni B en los
hematíes, pero tiene ambos antígenos anti- A y anti- B en el suero, en cambio una persona
con sangre A tiene antígenos A en los hematíes y anticuerpos anti- B en el suero, al igual
que los del grupo B (Leavel & Thorup, 1967).
3. Constitución química de los grupos sanguíneos.-
La membrana del glóbulo rojo está compuesta por dos capas de lípidos en la que están
embebidas moléculas de proteínas. Tanto estas moléculas proteicas como las lipídicas
pueden tener unidas a ellas algunas moléculas de hidratos de carbono, constituyendo, en el
primer caso, las glicoproteínas y en el segundo, los glicolípidos (Meza & Correa, 1988).
La membrana del eritrocito contiene alrededor de 52 % de proteínas, un 40 % de lípidos y
un 8-10 % de glúcidos unidos a proteínas o lípidos como citamos anteriormente; el 15% de
los lípidos de la membrana eritrocitaria son glucoesfingolípidos (Lluís Vives & Lluís
Aguilar, 1997).
En el caso del sistema ABH la especificidad esta determinada por los carbohidratos,
mientras que las del sistema MNSs, son una combinación de glicolípidos y proteínas. El
proceso de la producción de antígenos sobre la superficie de los glóbulos ocurre durante la
maduración de éstos en la médula ósea, antes de perder su núcleo y salir a la circulación
(Meza & Correa, 1988).
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4. Características de los Antígenos y Anticuerpos eritrocitarios.-
4.1 Antígenos eritrocitarios
Como citamos anteriormente, el antígeno eritrocitario es un producto directo o indirecto de
un gen situado en la membrana del hematíe y reconocido por un anticuerpo específico. Los
genes transmiten caracteres mendelianos codominantes, es decir que se expresan tanto en
individuos homocigotos como heterocigotos. Se han descrito también genes amorfos (O, d)
de los cuales hablaremos mas adelante (Segalés et al. 1982). Los antígenos eritrocitarios,
son genéticamente independientes y se transmiten de unos a otros, pudiendo estar asociados
o presentar una relación inmunológica con antígenos pertenecientes a otros sistemas (Lluís
Vives & Lluís Aguilar, 1997).
Los antígenos de grupo sanguíneo no solo se hallan en el eritrocito, también pueden ser
sintetizados por otras células del organismo como las células mucosas de las glándulas
salivales. Estos antígenos sintetizados por las células mucosas son glucoproteínas y se
encuentran tanto en las secreciones como en el plasma. En ellos intervienen la interacción
alélica de varios sistemas de genes (Lluís Vives, Lluís Aguilar, 1997).
La localización de estos antígenos es variable; así, los antígenos del sistema ABO se
encuentran en todas las células de la sangre, tejidos y fluidos, mientras que los
pertenecientes al Rh se localizan únicamente en el hematíe. Este posee además antígenos
característicos de otras células, como sucede en el caso del sistema HLA y Lewis (Segalés
et al. 1982).
La importancia de estos antígenos eritrocitarios se destaca en su propiedad sensibilizante y
a la capacidad de reaccionar con sus correspondientes anticuerpos (Segalés et al. 1982).
5. Herencia de los antígenos eritrocitarios.-
Los grupos sanguíneos están determinados por una serie de alelos o versiones genéticas, de
los cuales cada persona posee dos, uno de cada progenitor. Estos alelos son los A, B, y O, y
son los que dan lugar a los tipos de sangre que conocemos: A, B, AB, y O (Ventura, 2004).
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Los grupos sanguíneos son hereditarios, porque su síntesis está dirigida por los genes,
concretamente por los que se encuentran en la pareja número nueve de nuestros
cromosomas (Meza & Corrales, 1988).
Existen dos alelos pero sólo un tipo de sangre, siendo el tipo de sangre una combinación de
estos dos alelos (genotipos). Así, el grupo sanguíneo A puede estar dado por combinaciones
AA y AO. El tipo B por BB o BO, mientras que los tipos AB y O sólo pueden estar
determinados por una combinación (alelos A+B para AB y O+O para O), ya que el alelo O
es recesivo, es decir, cualquier combinación de este alelo con otro da como resultado un
tipo de sangre determinado por el otro alelo (Ventura, 2004).
Como estas moléculas o antígenos eritrocitarios se localizan en la membrana de los
glóbulos rojos, una persona que pertenece al grupo A, tendrá el antígeno A en sus glóbulos
rojos, los pertenecientes al B, el antígeno B; los del grupo AB, poseerán ambos antígenos; y
los del grupo O no tendrán ninguno (Aranda, s/a)
6. Sistema Rhesus.-
Este sistema fue descubierto 39 años después que el sistema ABO, por el mismo
investigador Carl Landsteiner y su colaborador Wiener (1940) y es un sistema complejo
que comprende más de 40 antígenos diferentes (Meza & Correa, 1988; Sans- Sabrafen,
1988).
El antígeno Rh positivo existe en el 85 % de las personas de la raza blanca y se transmite
por herencia de acuerdo con las leyes de Mendel (Varela, 1965). Se comprobó que la
presencia o ausencia del antígeno Rh era una condición hereditaria y que cuando ambos
padres son Rh negativos sólo tienen hijos Rh negativos. En cambio, de padres Rh positivos
o de uno Rh positivo y otro Rh negativo la descendencia es de ambos tipos (Sans- Sabrafen,
1988).
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La importancia de este sistema está determinada por el elevado poder inmunógeno de sus
antígenos, el más importante de todos es el antígeno D que fue el primero en ser
descubierto y es el que confiere la calidad de Rh negativo o Rh positivo a las personas que
carecen o tienen el antígeno, respectivamente, este es el motivo por el cual el grupo
sanguíneo Rh es el segundo en importancia, tras el ABO (Meza & Correa, 1988; SansSabrafen,
1988). Estos dos sistemas genéticos independientes tienen
antígenos que
pueden ser reconocidos por anticuerpos diferentes. Los genes del sistema Rh se hallan en
el cromosoma 1. A causa de la proximidad en el cromosoma 1 de los loci correspondientes
al sistema Rh, éstos se transmiten conjuntamente (Lluís Vives & Lluís Aguilar, 1997).
Si todos los individuos fueran homocigotos para el antígeno D (DD), no existirían sujetos
Rh negativos, el hecho de que existan, sugiere la existencia de otro alelo denominado d, que
en su forma homocigota representa al Rh negativo y Dd o DD a los individuos Rh
positivos. El alelo d es, por tanto, un alelo silencioso, como ocurre con el alelo O del
sistema ABO, y no da lugar a la formación de anticuerpo alguno (Lluís Aguilar & Lluís
Vives, 1997).
Contrariamente a lo que ocurre con los antígenos del sistema ABO, los antígenos Rh se
encuentran sólo en los eritrocitos. En 1979, Plapp et al, citado por Sans- Sabrafen, 1988,
evidenciaron que las células Rh negativas poseen antígeno D (aunque no expuesto en su
superficie); al parecer, la diferencia entre hematíes positivos y negativos dependería de la
configuración de una proteína común de la membrana y requieren de lípidos para su
expresión.
El antígeno Rh esta formado por varios antígenos, de los cuales se conocen tres antígenos
Rh fundamentales y para describirlos existen también tres nomenclaturas:
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Tabla 2.- Nomenclatura de los investigadores de grupo sanguíneo y frecuencias
eritrocitarias en raza caucásica
Frecuencias
Fisher y Race
Wiener
Rosenfield y Allen
D
Rho
Rh1
85%
C
rh´
Rh2
70%
E
rh´´
Rh3
30%
C
hr´
Rh4
80%
E
hr´´
Rh5
97%
E
Hr
Rh6
Cw
rhw
Rh8
G
rhG
Rh12
“Total Rh”
_
Rh29
Caucásicos
Fuente: (Segalés, et al. 1988; Varela, 1965).
La nomenclatura de Fisher-Race y Singer es mucho mas simple, nombrando a los antígenos
de la siguiente manera: D, C, E, vinculados íntimamente a estos antígenos existen otros
factores alélicos llamados hr, cuyo mecanismo hereditario está unido al de los factores Rh y
son: d, c, e (Varela, 1965).
Los seis antígenos mencionados (C, D, E, c, d, e) constituyen el complejo sistema Rh- rh.
Cada persona recibe por herencia una serie de esos seis factores: tres pares de origen
paterno y tres pares de origen materno, combinados de distintas maneras y dando origen a 8
tipos sanguíneos principales y a 36 genotipos (Varela, 1965).
Para Fisher y Race los tres alelos de cada par están ubicados en tres loci diferentes,
íntimamente unidos o ligados casi por completo en cada cromosoma del par de homólogos.
Puede existir, por lo tanto, entre ellos otras combinaciones, un cromosoma con los alelos D,
C, E, y otro cromosoma homólogo con los alelos d, c, e, es decir existe un alelo para cada
antígeno (Varela, 1965).
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Wiener no sólo utiliza diferente nomenclatura, sino que admite la existencia de un solo
locus para los tres diferentes alelos de cada cromosoma, a los que asigna la letra básica R y
r para cada uno de los dos grupos de tres alelos pertenecientes a uno y otro cromosoma, por
lo tanto, cada alelo puede producir más de un antígeno (Segalés, 1988).
Las diferentes combinaciones posibles de alelos en cada cromosoma, concuerdan con la
teoría de Fisher sobre la existencia de un locus diferente para cada alelo, lo que haría
posible su separación por entrecruzamiento originándose así los ocho cromosomas básicos
descritos.
Por otra parte, la frecuencia con que se repiten ciertas combinaciones del
genotipo a través de varias generaciones fundamenta la hipótesis de que existe ligamiento
entre algunos alelos del sistema Rh, que se rompe ocasionalmente para originar otras
combinaciones con los mismos alelos. Todo individuo posee siempre tres pares de unidades
genéticas o alelos que controlan la producción de los seis antígenos del sistema Rh (Varela,
1965).
Es importante mencionar que los alelos (DCE) se consideran como dominantes respecto a
los {dce}, no pudiendo hablarse en este caso de recesividad ya que los seis alelos tienen
siempre expresión fenotípica, aún cuando estén sólo presentes en un cromosoma del par de
homólogos, tratándose en tal caso de genes codominantes (Varela, 1965).
6.1 Anticuerpos Rh.-
Los anticuerpos Rh suelen ser inmunes, es decir que no están presentes normalmente en los
sujetos que carecen del antígeno (Meza & Correa 1988).
Estos anticuerpos son generalmente de tipo IgG y persisten por muchos años en la
circulación, aunque sus niveles pueden descender si no hay inmunizaciones posteriores.
(Meza & Correa 1989).
Cada uno de los antígenos del sistema Rh- hr puede originar un anticuerpo por lo que hay
anticuerpos anti- C, anti- D, anti- E, anti- c y anti- e. En la práctica médica, las personas rh
(cde) negativas, es decir, carentes de los factores Rh (C, D y E) son las que con mayor
frecuencia forman anticuerpos Rh (anti- C, anti- D, anti- E) (Leavel & Thorup, 1967).
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El antígeno D del sistema Rh tiene en este sentido una especial relevancia, ya que es el más
inmunógeno de todos los antígenos de grupo sanguíneo. Así, la administración de sangre de
un individuo Rh positivo a otro Rh negativo tiene un 50 % de probabilidad de provocar la
aparición del anticuerpo específico (Meza & Correa 1988; Leavel & Thorup, 1967).
7. Técnicas para el estudio de grupos sanguíneos.-
Existen diferentes formas de hacer evidente una reacción antígeno- anticuerpo, sin embargo
para la determinación de los grupos sanguíneos, la técnica de aglutinación es la que se
utiliza con mayor frecuencia (Lluís Vives & Lluís Aguilar, 1997).
En la aglutinación, la reacción se forma por la unión de los glóbulos rojos con los
anticuerpos, formándose grumos de glóbulos evidentes (Bernard et al. 1989).
Esta reacción serológica se produce en dos etapas o fases:
Fase 1ª- Se produce la unión del antígeno con el anticuerpo o etapa de sensibilización que
depende de varios factores:
a) Temperatura óptima para cada anticuerpo,
b) Ph óptimo entre 6.5 y 7.5,
c) Concentración de antígenos y anticuerpos,
d) Fuerza iónica del medio,
e) Tiempo de incubación
Fase 2ª - Se establecen los puentes de unión entre los glóbulos rojos, formándose el
enrejado que se visualiza como aglutinación (Bernard et al. 1989).
Cuando en las reacciones de antígeno- anticuerpo intervienen anticuerpos de tipo IgM, las
dos etapas se superponen y se observa fácilmente la aglutinación resultante, debido a que
los anticuerpos IgM son moléculas grandes (pentámeros de inmunoglobulinas) de gran
peso molecular y de gran carga neta, y cubren sin problemas la distancia entre un glóbulo
rojo y otro, estableciendo los puentes de unión entre ellos. Ejemplo: anti- A, anti- B, antiM, anti- N, anti- P1, etc (Bernard et al. 1989).
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Cuando en estas reacciones intervienen anticuerpos de tipo IgG se produce solamente la
primera fase, es decir la unión del anticuerpo con su antígeno, pero dado que las moléculas
de IgG son pequeñas, de poco peso molecular y cargadas negativamente, son incapaces de
cubrir la distancia existente entre un glóbulo rojo y otro, y la segunda fase de aglutinación
no se produce (Bernard et al. 1989).
Fig. 2 Unión de glóbulos rojos a moléculas IgM e IgG
Fuente: Meza, C & Correa, N. 1988
Para que se pueda producir esta fase y pueda observa la aglutinación fácilmente en estos
casos, se agregan ciertas sustancias a la muestra, como ser: papaina, ficina, bromelina o
tripsina, enzimas capaces de eliminar las cargas negativas de la superficie celular y al
disminuir estas cargas se necesitan menos cationes alrededor del glóbulo, de tal manera que
estos glóbulos se aproximan (Meza, C & Correa, N. 1988).
Cuando se efectúa una búsqueda de anticuerpos desconocidos, y no se sabe que tipo está
involucrado (IgG o IgM), generalmente se usan varios métodos combinados; en cambio, los
antisueros comerciales usados en la determinación de los distintos grupos sanguíneos,
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vienen ya con el aditivo correspondiente, es decir el anticuerpo detectara el grupo
sanguíneo o antígeno correspondiente (Bernard et al. 1989).
8. Caracteres genéticos y raciales. Herencia de los grupos sanguíneos y Antropología.-
Debido a que la herencia de los antígenos es de carácter mendeliano, aparecen desde la vida
uterina y permanecen invariable durante toda la vida del individuo (Varela, 1988).
Existen diferencias raciales y geográficas en la distribución de los diversos antígenos o
factores de los grupos sanguíneos. Así por ejemplo se ha identificado en Argentina el
predominio de los grupos O y A igual que en el continente europeo. En el este de Europa
existe predominio del grupo B; en el continente americano prepondera el grupo O entre el
elemento indígena (Varela, 1988). Según Moullec (1971), en Francia el grupo O predomina
con una frecuencia de 44 %, siendo mas notable en la región Oeste del país, en la región
Este y Norte predomina el grupo A con un 45 %.
Los antígenos M, N están presentes con una proporción en las poblaciones blancas
caucásicas de aproximadamente 25 % para el tipo M; 25 % para el tipo N y el 50 % para el
M- N, observándose diferencias de distribución en las razas (Meza & Correa, 1988).
De acuerdo a Varela, (1988), esta comprobado que el factor Rh en su distribución tiene una
acentuada influencia racial. Las personas de la raza amarilla prácticamente son Rh (+) el
100 %, ocurriendo lo mismo en las poblaciones indígenas autóctonas americanas, tal como
citan Suárez & Linares en su trabajo publicado el año 1967 sobre grupos sanguíneos. En la
raza negra el factor Rh positivo es el que predomina con un valor de 95 %, en la raza blanca
caucásica 85 % son positivos para este factor y el 15 % restante negativo. En la raza vasca
el porcentaje Rh (-) es más elevado, oscilando en cifras que varían del
30 % al 42 %
(Moullec, 1971), lo mismo sucede en Argentina, país donde predomina el factor Rh (-).
Este genotipo no ha sido hallado en los aborígenes americanos y australianos, por lo que
Varela, (1988) de acuerdo a estos datos, menciona la posibilidad de que los vascos
constituyan un conjunto racial diferente dentro del grupo caucasoide, por lo tanto el grupos
sanguíneo es capaz de identificar a los individuos dentro de una raza (Salzano, s/a).
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En un estudio mas reciente realizado en 1996, 180 bancos de sangre de Colombia fueron
monitoreados, recolectándose 393.063 unidades de sangre; del total de estas unidades
hemoclasificadas
91,16% correspondió al factor Rhesus positivo, en cuanto a grupo
sanguíneo existe un predominio para el grupo O con una frecuencia de 56,2% (Beltrán et
al. 1996). Otro estudio en relación a la distribución de grupos sanguíneos fue realizado por
Del Peón-Hidalgo, L. et al. el año 2002 en México, mostrando también un predominio del
grupo O y factor Rh positivo para tres regiones estudiadas en su país, con frecuencias de
59 % y 95.4 % respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3. Datos correspondientes a la distribución de los alelos del sistema ABO y RhHr en diferentes razas descrita por Boyd, Mourant, Wiener y Wexler.
CAUCASOIDE
MONGOLOIDE
Indoameri-
Australoi-
canos
des
15- 25
0- 55
20- 45
5
0
0
0
5- 20
10-20
15- 30
15- 30
0
Alelos
Vascos
Otros
Negroides
Asiáticos
% A1
20
20- 30
10- 20
A2
3
4- 8
B
0.3
Cromosomas (genotipo)
% dce
48- 53
30- 40
10- 20
0- 7
0
0
dCe
1- 3
0- 2
0- 6
0
0- 17
13
dcE
1
0- 2
0- 1
0- 3
0- 3
0
Dce
1
1- 5
40- 70
0- 5
0- 30
9
DCe
38- 42
30- 50
5- 15
60- 76
30- 45
56
DcE
5- 7
10- 15
6- 20
20- 30
30- 60
20
DCE
0
0- 1
0
0- 0.5
1- 6
2
Fuente: (Maza & Correa, 1988; Varela, 1988).
Las investigaciones etnográficas y antropológicas de los grupos sanguíneos se extendieron
a otros sistemas, en los cuales se observaron también diferencias como es el caso del factor
Diego (Di)que resulto ser mas frecuente de lo pensado con una distribución muy particular,
se comprobó que el antígeno Di, existía siempre en sangre de individuos nativos de un
lugar y es muy frecuente tanto en indios sudamericanos, los chinos y los japoneses, también
17
se hallo este factor en algunos polacos emigrados en América (Keyeux, s/a). Debido a este
descubrimiento los científicos dedujeron que este alelo Di era originario de Asia y que los
indios americanos procedían de este continente, explicando también la presencia de este
factor entre los polacos que se debería a la invasión de Europa oriental por las hordas
mongólicas. La ausencia completa del factor Di entre los esquimales vendría a confirmar la
teoría del origen diferente de los aborígenes indios y esquimales (Varela, 1988). Es
importante citar que los antropólogos actuales apoyan la hipótesis de que los ancestros de
los indígenas americanos entraron al continente desde Asia a través del estrecho de Bering,
por ello la influencia de grupo sanguíneo del mismo tipo en ambos continentes, en especial
del grupo O positivo (Greenberg et al, 1986; Cavalli-Sforza, 1991).
De todos estos datos es posible deducir que la distribución racial y geográfica de los grupos
sanguíneos
ha sido utilizada para determinar índices de migración de diferentes
poblaciones raciales a través de la superficie terrestre. Varela (1988) cita como ejemplo al
alelo A
que disminuye del oeste al este europeo, lo cual indica que se este alelo
probablemente se originó en Europa y se propagó después hacia el este, en cuanto al alelo
B, de acuerdo a los datos se habría originado en Asia, de donde se propagó a casi todo el
mundo.
18
SEGUNDA PARTE.- LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
1. Historia y Descubrimiento de la enfermedad.-
En el año 1909, el medico brasileño Carlos Chagas -especialista en enfermedades
infecciosas- descubrió que la vinchuca transportaba
en sus deyecciones un parásito
unicelular (protozoario) al que le dio el nombre de Tripanosoma cruzi. La genialidad
investigativa de Carlos Chagas le permitió realizar un triple descubrimiento, a partir de esa
información: una enfermedad, su agente causal y su transmisor o vector (Borda, 1981).
En cuanto al vector o transmisor la enfermedad, se tienen datos de que este triatomino era
conocido mucho antes que Carlos Chagas descubriera su vinculación con la
tripanosomiasis. En efecto, numerosos cronistas, naturalistas y viajeros entre ellos Charles
Darwin, mencionan en sus escritos la existencia del artrópodo (Rothhamer, et al. 1984) y
las crónicas de la colonización del nuevo mundo contienen referencias indirectas de la
enfermedad de Chagas; por otra parte desde 1587 se mencionan alteraciones asociadas al
intestino grueso.
Se iniciaron descripciones del Triatoma, por el mismo Darwin en su visita a Argentina,
donde menciona los ataques nocturnos del "barbero” o vinchuca. De hecho, una hipótesis
sostiene que la muerte de Darwin fue causada por la enfermedad de Chagas (Martínez,
1996).
2. Aspectos Epidemiológicos.-
2.1 Epidemiología de la enfermedad de Chagas.-
La enfermedad de Chagas, o tripanosomiasis americana, es una parasitosis endémica en
amplias regiones de Sud América, Centro América y el sur de Estados Unidos (Alfred et
al. 1999; Castro & Torrico, 1999).
El ciclo enzoótico de la enfermedad de Chagas solo ocurre en las áreas donde se domicilian
los triatominos o vectores (Alfred et al. 1999). Se los encuentra específicamente en Brasil,
19
Chile, Norte de Argentina, Uruguay, Paraguay (región del Chaco), Bolivia, Perú, Ecuador,
Colombia, Guayana Francesa, Venezuela, Panamá, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, y
en los Estados Oaxaca. Nayarit y Yucatán de la República Mexicana y en Hábeas Christi,
Texas en Estados Unidos (Zamuriano, 1994).
Bolivia es considerada como uno de los países mas endémicos, donde 7 de los 9
departamentos presentan al vector mas importante, Triatoma infestans y en la que el área
endémica abarca 80 % del país, con mayor incidencia en los valles, llanos y el Chaco
(Alfred et al. 1999; Zamuriano, 1994).
Se considera que el área endémica para la transmisión vectorial de Chagas en nuestro
territorio, está comprendida entre los 300 y 3000 m.s.n.m. (Castro & Torrico, 1999). Solo
zonas altas, superiores a los 3500 m.s.n.m., y los llanos tropicales, con temperaturas muy
altas y húmedas, serían una barrera para la extensión del área chagásica en Bolivia (Alfred
et al. 1999) (Anexo 9) con una población comprometida de aproximadamente 3 millones de
personas (Castro & Torrico, 2002).
Los primeros casos de Chagas en Bolivia fueron reportados por Arthur Neiva, en Potosí
(1931) seguidos por Veintemillas, en La Paz (1931) Mazza & Chacon, en Cochabamba
(1937) y Martins & Macedo, en Santa Cruz (1941) (Dujardin, et al. 1998).
En 1985 ya se había diagnosticado la enfermedad en Latino América a mas de un millón
de personas (OMS, 1991). Actualmente, aproximadamente 20 millones de personas están
infectadas y 100 millones de personas en riesgo de infección (Castro & Torrico, 2002).
Es muy interesante observar la variación geográfica en la prevalencia de lesiones cardiacas
versus enfermedades del tracto digestivo entre los pacientes con Chagas crónico, por
ejemplo, en muchas áreas endémicas de Brasil, las enfermedades digestivas son mas
comunes que los problemas cardiacos. Por otra parte, megaesófago y megacolon asociados
a T. cruzi son desconocidos en Venezuela, Colombia, y América Central. En México y
América Central los daños cardiacos tienen menor prevalencia que en los países del cono
Sur de América (Mendes, R. et al. 1997; Kirchhof, 1995).
20
2.2 Epidemiología del vector.-
Según Carvallo et al. (1983) citado por Lourdes Zamuriano (1994), se consideran tres
ciclos epidemiológicos de la enfermedad de Chagas y son los siguientes:
a)
Domiciliaria.- con vectores adaptados a la vivienda humana, ya que esta es favorable para
la colonización del insecto. b) Peridomiciliaria.- este es un ciclo intermedio, incluye a los
vectores que habitan tanto dentro de la vivienda como aquellas silvestres, que pueden
habitar gallineros, conejeras, etc. Pueden infectar animales domésticos.
c)
Silvestres.- incluye a vectores y hospederos que originalmente mantuvieron el ciclo
zoonótico de la enfermedad en ecosistemas naturales.
Existen 123 especies de triatominos 115 especies están difundidas sólo en el nuevo mundo
entre las latitudes 42º Norte y 46 º Sur; en el viejo mundo se han señalado 13 especies sin
significación epidemiológica en humanos (Alfred et al. 1999), las otras especies están
principalmente asociadas con mamíferos silvestres, aves y ocasionalmente con reptiles
(Schofield, 1988) . Las siguientes especies participan directamente en la transmisión de la
enfermedad de Chagas: Triatoma infestans, Triatoma spinolai, Panstrogylus megistus,
Tratoma dimidiata y Rhodnius prolixus. La primera especie es común en Chile, Argentina,
Perú y Bolivia, mientras que las restantes en Chile, Brasil, América Central, Colombia y
Venezuela respectivamente (Rothhammer, 1984). T. brasiliensis importante en Brasil, T.
dimidiata, T. sordida y R. Pallescens son importantes en América Central (Alfred et al.
1999), también se ha reportado que Rhodnius stali es probablemente el vector responsable
de la transmisión de Chagas entre las comunidades indígenas del Alto Beni en Bolivia
(Matías et al. 2003).
3. El vector.-
Los vectores de la enfermedad de Chagas se distinguen por sus hábitos hematófagos,
pudiendo llegar a ingerir sangre 8-9 veces su peso. Son artrópodos llamados comúnmente
Vinchuca, uluchu, barbeiro o chinche hocicona de acuerdo a la región. Tienen hábitos
nocturnos para su alimentación y nacen libres del Tripanosoma cruzi, pudiendo infectarse
21
durante su alimentación al ingerir sangre de sus victimas en cualquier estado de su
desarrollo (Alfred et al. 1999, Castro & Torrico, 1999).
En Bolivia la especie Triatoma infestans (Fig. 3) constituye el vector más importante de la
enfermedad de Chagas, esta ampliamente distribuida en nuestro territorio y esta bien
adaptada a vivir en el interior y exterior de las viviendas humanas (Castro & Torrico,
1999). Geográficamente abarca desde la Patagonia hasta Pernambuco, de Chile hasta el
Ecuador, por ejemplo, en Chile es el único Triatomino de importancia epidemiológica
comprobada en la dinámica de transmisión humana activa de la Tripanosomiasis
Americana (Zamuriano, 1994).
Fig. 3 El vector de Chagas Triatoma infestans
Esta especie corresponde a la siguiente clasificación:
Clase: Insecto
Orden: Hemiptera
Familia: Raduvidae
Subfamilia: Triatominae
Género: Triatoma
Especie: infestans
22
Como en todos los insectos, el cuerpo de la vinchuca esta compuesto de tres regiones:
cabeza, tórax y abdomen. Exteriormente la cabeza posee los órganos sensoriales, en el tórax
están insertados los órganos locomotores y en el abdomen, el aparato reproductor y las
aberturas respiratorias. El adulto mide entre 2 ½ y 3 cm de largo; el macho es algo menor
que la hembra. Una manera de diferenciar la vinchuca domiciliaria de otras especies, es la
observación de la base de las patas y del conexivo, que presentan un color amarillo que se
destaca del negro de la coloración general del insecto (Antonovich, s/a). Presenta un par de
antenas con cuatro segmentos en la cabeza bastante móvil y alargada, la trompa tiene 3
segmentos formando un ángulo recto debajo del rostro (Zamuriano, 1994).
Las hembras de los triatominos inician sus posturas de 10 a 30 días después de la cópula.
Los estadios ninfales de T. infestans son cinco y se distinguen fácilmente por el tamaño de
la cápsula cefálica y el ancho de las patas (Zamuriano, 1994; Téllez, 1999).
El ciclo evolutivo completo varía con las especies y por lo general dura entre 84- 134 días.
Tomando en cuenta desde la postura del huevo. La longevidad de las vinchucas varía
generalmente entre 300 a 350 días. Una hembra puede poner entre 1200 y 1400 huevos
(Botero & Restrepo, 1998).
Los triatominos soportan ayunos prolongados, pudiendo permanecer sin alimento hasta un
año (Zamuriano, 1994).
El tipo de vivienda adecuada para estos vectores corresponde a ranchos en malas
condiciones, con techos generalmente de paja o palma. Las paredes de adobe y con grietas
son apropiadas para el alojamiento y la reproducción (Botero & Restrepo, 1998).
3.1 Origen y adaptación del vector a nuevos hábitats.-
Nos referimos a la enfermedad de Chagas como una antropozoonosis, es decir que es
posible que afecte tanto al hombre como a numerosos animales mamíferos (Castro &
Torrico, 1999), se considera que T. infestans, es originario de los valles andinos de Bolivia,
específicamente en región de Cochabamba y Sucre, donde vivían bajo piedras en
23
asociación con Galea musteloides, roedor silvestre (Alfred, et al. 1999; Rojas, 2003). La
caza de estos roedores y la cría de los mismos dentro de las casas como fuente de alimento,
puede haber suministrado la ruta inicial para la domesticación de T. infestans, posiblemente
hace 3000-4000 años aproximadamente (Dujardin et al., 1998).
Se ha señalado que en quechua “vinchuca” o “huinchuco” significa “dejarse caer” y en
aymará se aplica a los recaudadores, capataces y verdugos. Es probable entonces, que el
insecto fuera conocido por los aborígenes andinos antes de la invasión europea y que la
adaptación domiciliaria de los Triatominos se realizó paralelamente con la sedentarización
de las poblaciones aborígenes americanas, de este modo la adaptación de la vinchuca a los
hábitats humanos pudo haberse originado en determinados focos agroalfareros (Carpintero
& Viana, 1980; Neghme, 1989).
Con dichos antecedentes también es posible suponer que Rhodnius prolixus y Triatoma
infestans, fueron especies que se adaptaron fácilmente al hábitat domiciliario y debido a la
interrupción de su hábitat se instalaron en las grietas de las casas
de los habitantes
primitivos (Kirchhoff, 1995). Diversos factores pueden causar el desplazamiento o
dispersión de los triatominos. Este fenómeno puede darse dentro de un cierto radio de
acción en los ecótopos naturales, de estos hacia la habitación humana o a sus dependencias,
o bien hacia regiones mas alejadas por diversos mecanismos (Téllez, 1999; Gorla y
Schofiel, 1989).
En cuanto a estos mecanismos que posibilitaron la colonización por los Triatominos del
entorno humano podemos mencionar a la domesticación de mamíferos para consumo y su
estrecho contacto con los moradores, cerca o dentro de las habitaciones, como sucede hasta
ahora en Bolivia, la construcción de viviendas con hojas de palmera o pajas, la captura, cría
y contacto con mamíferos silvestres y quizás varios que no conocemos pero que en
conjunto siguen permitiendo, aún en la actualidad, la domiciliación de poblaciones
silvestres de los Triatominos de mayor importancia en Salud Pública y la paulatina
adaptación de otras especies básicamente silvestres (Alfred, et al. 1999).
T. infestans domiciliario es el vector mas antiguo y se habría difundido de Bolivia a través
de la colonización de tribus preincaicas hasta los valles del norte chileno y sur peruano.
24
Mucho más tarde, habría alcanzado Argentina por la cordillera de los Andes, por último, la
expansión de T. infestans hacia Brasil habría ocurrido al principio del siglo 20 por
intermedio de trabajadores migrantes. Esta difusión de la enfermedad extendida en el
tiempo podría explicar en parte los patrones de las formas clínicas de la enfermedad que
presentan diferencias regionales (Alfred, et al. 1999, Carpintero & Viana, 2002; Schofield,
1988).
El desplazamiento de los núcleos de poblaciones hacia lugares distantes de su entorno
habitual, cuando eran conquistados, como el caso del Imperio Wari, el Imperio IncaTawantisuyo- y otros, así como el intercambio de productos ente países vecinos pudo
haber facilitado la dispersión pasiva de los vectores ya en contacto estrecho con el hombre.
Según Carpintero & Viana, 2002, es probable que la Tripanosomiasis Americana pudo
haber afectado a los pueblos nómades, recolectores y cazadores de la
época que
aproximadamente correspondería con la de los cazadores paleo y neolíticos del Antiguo
Mundo, por la ingestión de mamíferos portadores del Trypanosoma cruzi, pudiendo
adquirirse la Enfermedad en un principio por esta vía que por los Triatominos.
Las manifestaciones artísticas como las cerámicas, esculturas, tejidos, etc. de tipo
antropomorfas que
permanecen hasta nuestros días, nos ofrecen una nueva vía de
investigación de la Enfermedad de Chagas y sus transmisores. Un ejemplo es la Cerámica
con edema palpebral unilateral, sugestivo de signo de Romaña, Ilustración de la obra "The
Antiquities of Manabí, Ecuador", de Mershall H. Saville, Plancha XCIII (Anexo 10)
(Carpintero & Viana, 2002); otra evidencia de la existencia del vector hace muchos años,
son las cerámicas peruanas de la cultura Inca Cuzco que presentan diseños que se asemejan
a vinchucas (Fernandez, 1971).
Por otra parte es importante mencionar el hecho de que se encontraron en Chile dentro de
urnas funerarias de las Culturas TAFÍ, SANTAMARÍA y LA AGUADA, pertenecientes al
período temprano, medio y tardío respectivamente, restos de Triatoma infestans; debido al
sellado y posterior enterramiento de las urnas hubiera sido imposible cualquier penetración
de vinchucas, sin embargo resulta evidente que fueron enterradas al mismo tiempo y que
probablemente estarían ocultas entre las vestiduras del cadáver, haciendo evidente el alto
25
grado de domiciliación desde estos períodos y el estrecho contacto entre el Vector y las
Comunidades aborígenes Pre-Colombinas.
4. Agente Etiológico- Tripanosoma cruzi
El Tripanosoma cruzi es un protozoario flagelado que tiene la siguiente clasificación:
Súper Reino: Eucariota
Reino: Protista
Philum: Mastigophora
Subphilum: Euglenozoa
Clase: Sporozoa
Orden: Kinetoplastidea
Familia: Trypanosomatidae
Género: Trypanosoma
Subgénero: Schizotrypanum
Especie: cruzi
De acuerdo al desarrollo en el vector el Tripanosoma cruzi ha sido clasificado en el grupo
Stercoraria (Kirchhoff, 1995; Brenière et al. 2002) (Fig.4).
Fig. 4.- Tripanosoma cruzi
26
El Tripanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, este parásito
reacciona e infecta células de mamíferos, presentando varias formas durante su ciclo de
vida (Pereira, 1990).
El T. cruzi tiene un ciclo de vida complejo, presentando diferentes formas durante su
desarrollo, con características propias durante su ciclo de vida:
- Epimastigote: (20-40 x 2 micras) forma alargada en la que el flagelo se origina próximo y
por delante del núcleo esférico, presenta kinetoplasto en forma de barra que se encuentra
delante del núcleo; este estadio se desarrolla en el intestino medio y posterior del vector y
constituye una de las formas proliferativas del T. cruzi.
- Amastigote: (2-4 micras) forma esférica u ovalada que carece de flagelo; estadio de
localización intracelular replicativo en el mamífero, presenta un núcleo y un cinetoplasto.
- Tripomastigote: (20- 25 x 2 micras) forma alargada con el kinetoplasto situado por detrás
del núcleo, presenta flagelo, y en la ampolla rectal del vector (tripomastigote metacíclico) y
carece de capacidad replicativa. Esta es la forma infectiva y se encuentra en la sangre de
las personas o animales infectados (denominándose también tripomastigote circulante),
especialmente en los períodos agudos o iniciales de la infección (Cornejo, 2002; Pereira,
1990).
El tripomastigote en el huésped vertebrado tiene predilección por las células del sistema
retículo endotelial, tejido muscular cardíaco, muscular estriado, muscular liso (Botero &
Restrepo, 1998).
5. Ciclo biológico.-
El ciclo comienza en el momento en que los tripomastigotes metacíclicos presentes en el
tubo digestivo del vector, son depositados junto a las deyecciones del insecto después de
alimentarse de la sangre de su victima, esta forma del parásito ingresa al huésped mamífero
a través de la picadura del insecto o a través de la mucosa ocular, en caso de que la
deyección se haya realizado a nivel de la conjuntiva (Gonzáles & Durante de Isola, 1994).
27
Esta forma penetra el torrente sanguíneo del individuo e invade células o tejidos y en el
citoplasma se transforma en amastigote, que se multiplica activamente por división binaria,
cuando las células están repletas de estas formas proceden a diferenciarse en
tripomastigotes que se liberan a la circulación para infectar nuevas células (Gonzáles &
Durante de Isola, 1994).
El ciclo continúa en el momento en que el individuo infectado sea picado por un vector
sano, que al ingerir la sangre con tripomastigotes se infecta, diferenciándose estos en el
insecto en epimastigotes a nivel del lumen del intestino medio, donde se multiplican
activamente. Al cabo de 15 a 30 días después de multiplicarse en el tubo digestivo e
infectar el intestino posterior, el parásito se diferencia en tripomastigote metaciclico que
seria la forma infectante para los huéspedes mamíferos (Cornejo, 2002, Kirchhoff, 1995)
(Anexo11).
6. Etapas de la enfermedad y su sintomatología asociada.-
La enfermedad de Chagas es una neuropatía resultante de la denervación, por destrucción
de neuronas y fibras nerviosas, en distintas partes del organismo produciendo el desarrollo
de megaorganos y cardiopatía (Castro & Torrico, 1999) (Anexo 12).
La Tripanosomiasis Americana tiene las siguientes etapas en el hospedero mamífero
iniciándose con la fase aguda en la que se produce una inflamación o signo en el lugar de
inoculación. La parasitemia aumenta y es detectable serológicamente luego de 10 a 12 días
de la infección (Cetron, 1993).
Cuando el agente etiológico ingresa por vía ocular, se observa en el sector de ingreso una
inflamación, denominada signo de Romaña o Chagoma de inoculación constituyendo
muchas veces la única manifestación (Mujica & Mesa, 1990) (Anexo 13).
En la etapa indeterminada o crónica asintomática, mayormente la enfermedad pasa
inadvertida este periodo empieza de 8- 10 semanas después de la infección (Andrade, 1999)
28
y puede durar de 10 a 30 años hasta que sobrevienen las alteraciones cardíacas y las
intestinales siendo esta la fase crónica sintomática (Jorg & Storino, 2001). En la fase
crónica se presentan trastornos digestivos que consisten en dificultades al deglutir, con
grado variable de disfagia, mas tarde estos enfermos presentan mega viseras (Andrade,
1999; Kirchhoff, 1995).
7. Vías de Transmisión
7.1 Vía Vectorial.-
Vía de transmisión a través de la picadura de triatrominos infectados por T. cruzi.
La población rural tiene mayor riesgo de infección por esta vía vectorial se ha demostrado
que la transmisión de este tipo también ocurre en las áreas urbanas de las ciudades mas
importantes (Brenière et al. 2002) siendo este hecho consecuencia de la pobreza de las
viviendas, educación y de la higiene que prevalece en las áreas rurales, peri- urbanas y
urbanas (Albarracin- Veizaga et al. 1999), por lo que esta vía de transmisión sigue siendo la
mas común e importante en nuestro medio, sin embargo
citares todas las vías de
transmisión:
7.2. Transfusión de Sangre
Es muy frecuente en el área urbana de zonas endémicas, sin embargo se han reportado
casos en ciudades grandes debido a las migraciones. El riesgo de adquirir la enfermedad
por esta vía varía entre 13 y 23 % y la transmisión depende de la parasitemia del donante,
la cantidad de sangre transfundida, la cepa del parásito transmitida y por último la
susceptibilidad del receptor (Kirchhoff, 1995; Carrasco et al. 1990).
7.3. Transmisión congénita
En general se trata de una transmisión de anticuerpos tipo IgG de la madre chagásica, que
atraviesan la barrera placentaria y que se encuentran durante los primeros meses de vida en
el sistema inmune del neonato, para determinar si estos anticuerpos son los de la madre o
29
ya pertenecen al niño el análisis debe efectuarse a los 9 meses de edad, tiempo necesario
para la maduración del sistema inmune del recién nacido (Flores et al. 2003).
7.4. Transmisión por Transplantes
La transmisión por transplante de órganos de pacientes chagásicos, se ha verificado en
pacientes con trasplante renal, ganglios linfáticos, tubo digestivo, musculatura estriada,
corazón, entre otros. El riesgo de esta modalidad de infección se incrementa debido a la
inmunosupresión practicada en el receptor (Jorg & Storino, 2001).
7.5. Otras formas de infección
Son vías de transmisión sin mucha importancia epidemiológica, entre las que podemos
citar:
-
Accidentes de laboratorio, infección del manipulador de los triatominos o por la
sangre infectada (Jorg & Storino, 2001).
8. Diagnóstico de Laboratorio
El diagnóstico parasitológico de la enfermedad de Chagas en la fase aguda se basa en
técnicas que ponen en evidencia al parásito en la sangre circulante del paciente y debido a
que esta fase se caracteriza por su alta parasitemia es mucho mas fácil su detección por este
tipo de técnicas; en casos crónicos, debido a la baja parasitemia y por el alto nivel de
anticuerpos específicos se utiliza las técnicas inmunológicas para su detección (Castro &
Torrico, 1999).
Los exámenes parasitológicos mayormente utilizados son los siguientes:
-
Gota Gruesa
-
Strout
-
Micrométodo
-
Xenodiagnóstico
30
-
Hemocultivo
Las pruebas serológicas durante la fase crónica de la enfermedad de Chagas son las
siguientes:
- Inmunofluorescencia Indirecta (TIF o IFI)
- Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay (ELISA)
- Reacción de fijación del complemento
- Reacción de hemaglutinación indirecta (HAI)
Fuente: (Castro & Torrico, 1999)
31
TERCERA PARTE.- TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE DIAGNOSTICO
Durante muchos años, el diagnóstico de numerosos procesos patológicos o enfermedades se
basan en técnicas que utilizan reacciones inmunológicas, lo cual posibilita la detección de
anticuerpo u otras sustancias presentes en los individuos.
Cabe resaltar que la base de todos los mecanismos de funcionamiento de las técnicas
inmunológicas están basadas en reacciones de antígeno- anticuerpo y que el conocimiento
de estas reacciones inmunológicas ha permitido la compresión y el abordaje de
enfermedades (Rubio et al. s/a).
1. Técnicas de diagnóstico más comunes.-
1.1 Reacciones de aglutinación.-
Las reacciones de aglutinación consisten en el agrupamiento de una suspensión de
partículas que se debe a la reacción entre un antígeno presente en las partículas y un
anticuerpo específico de él. Si la partícula utilizada es un hematíe se denomina a la reacción
hemaglutinación (Rubio, et al. s/a).
Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente, es preciso que la
concentración del antígeno no sea excesiva con respecto a la del anticuerpo y viceversa ya
que se podría obtenerse en esta situación un resultado falsamente negativo (Rubio et al.
s/a).
Existen dos tipos aglutinación y son las siguientes:
1.1.1 Aglutinación Directa.-
Las pruebas de aglutinación directa o activa son aquellas en las que el anticuerpo reacciona
con el antígeno presente de una forma natural en la superficie de un tipo de células. Tras
32
esta reacción se forma una especie de puente de unión entre las células, produciéndose la
aglutinación (Rubio et al. s/a).
Un ejemplo de este tipo de pruebas es la aglutinación que se origina al poner en contacto
hematíes del grupo A con suero anti- A (Rubio, et al. s/a).
1.1.2 Aglutinación Indirecta. -
Las pruebas de aglutinación indirecta o pasiva son aquellas en las que el anticuerpo
reacciona con un antígeno que ha sido transferido pasivamente a la superficie de una
partícula vital o inerte (Rubio, et al. s/a).
Un ejemplo de este tipo de pruebas es la aglutinación que se genera al poner en contacto un
suero problema que contiene anticuerpos aglutinantes específicos anti- T. Cruzi.
El
antígeno soluble de T. cruzi se fija a la superficie de glóbulos rojos, que previamente han
sido tratados por un agente químico que asegure una unión sólida y estable entre las
proteínas antigénicas y a la superficie de los glóbulos rojos, siendo capaces de absorber
antígenos parasitarios, resultando la aglutinación cuando sean puestos en presencia de
diferentes diluciones de los sueros estudiados con los anticuerpos específicos anti- T. cruzi
(Maldonado, 2001).
1.2 Inhibición de la aglutinación.-
La inhibición de reacciones antígeno- anticuerpo fueron empleadas por primera vez por
Lansteiner. En las reacciones de inhibición de la aglutinación, se hace reaccionar primero
el anticuerpo con el antígeno soluble, inhibiendo luego la aglutinación indirecta de
partículas o células indicadoras (Rose & Friedman, 1984).
Las técnicas de Inhibición de la aglutinación son una modificación de las técnicas de
aglutinación y permiten detectar antígenos solubles que no estén unidos a ninguna partícula
de modo directo o indirecto (Rubio et al. s/a).
33
Consiste en una incubación previa del antígeno estudiado con su anticuerpo
correspondiente. De esta manera quedan cubiertos los sitios de unión del anticuerpo.
Posteriormente se añade el mismo antígeno pero sobre la superficie de una partícula y si el
anticuerpo está saturado con el antígeno soluble presente en la muestra, no se producirá
aglutinación. Por el contrario si el antígeno no estaba en la concentración suficiente como
para saturar todo el anticuerpo, quedarán sitios de unión libres y se producirá aglutinación
con el antígeno particulado (Rubio et al. s/a).
1.3 ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay).-
Esta técnica utiliza las enzimas como marcadores inmunoquímicos de los complejos AgAc, consiste en una enzima conjugada a un Ac que reacciona con el sustrato adecuado
produciendo color. Este método permite detectar tanto antígeno como anticuerpo. El hecho
de que una pequeña cantidad de enzima pueda catalizar una gran cantidad de sustrato
permite amplificar la reacción Ag- Ac, de tal manera que es posible detectar cantidades
ínfimas de Ag- Ac en las muestras estudiadas (Rubio et al. s/a).
Entre las enzimas más utilizadas se pueden mencionar la peroxidasa de rábano picante, la
fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa (Rubio et al. s/a).
La técnica de ELISA es una prueba que presenta gran sensibilidad y que para medir la
actividad de las enzimas es necesario un paso previo de separación de los componentes
marcados, pudiendo realizarse este paso por precipitación o por la utilización de un
antígeno o anticuerpo fijado a una fase sólida (Rubio et al. s/a).
Existen varias tipos de ELISA, de los cuales vale destacar para el presente trabajo al ELISA
de Inhibición
1.3.1 ELISA de Inhibición.-
El antígeno de referencia se fija a la fase sólida y luego un conjugado de referencia de
anticuerpo específico marcado con enzima se mezcla con la muestra que se presume
34
contiene antígeno, se incuba, se lava y como último paso se añade sustrato enzimático y si
esta que se ha producida la reacción de inhibición por captura de antígenos particulados
por el anticuerpo específico, no se producirá coloración alguna como ocurre con un ELISA
normal (Rose & Friedman, 1984) (fig. 5).
Fig. 5.- Técnica de ELISA de Inhibición
35
Las enfermedades parasitarias han sido objeto de grandes estudios para la aplicación del
método de ELISA, el cual es sumamente adecuado en los países en desarrollo, donde otro
tipo de pruebas como el radioinmunoanálisis (RIA) son de difícil acceso. Se han descrito
enzimoinmunoanálisis para malaria, tripanosomiasis y esquistosomiasis, entre muchos
otros, además de que se han informado acerca de resultados excelentes obtenidos con esta
prueba de ELISA (Rose & Friedman, 1984).
1.4 Técnicas de Inmunoelectroblot.-
La tecnología de inmunoelectroblot es una poderosa herramienta tanto para los estudios de
investigación como para el diagnóstico de rutina en determinadas enfermedades. Hoy en
día, una de sus variantes, el Western blot, es un test definitivo para el diagnóstico de VIH
(Virus de la Inmunodeficiencia Humana), ya que es tan sensible como las técnicas
desarrolladas de inzimoinmunoensayo pero resulta más específico (Rubio, et al. s/a).
El inmunoelectroblot es una combinación de tres técnicas analíticas:
-
En esta técnica como primer paso se realiza la separación de los componentes del
antígeno mediante electroforesis.
-
Electroforesis (electroblotting) del antígeno.
-
Identificación mediante enzimoinmunoensayo con anticuerpos conocidos.
Las tres técnicas se desarrollan en seis pasos fundamentales:
1. Solubilización del antígeno.
2. Preparación del gel.
3. Separación electroforética del antígeno en gel.
4. Electrotransferencia del antígeno a un soporte de membrana.
5. Bloqueo de los sitios de unión de proteínas libres en la membrana.
6. Enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo para detectar anticuerpos en muestras
de suero problema, o para identificar bandas antigénicas específicas con anticuerpos
conocidos.
36
Las mayores ventajas del inmunoelectroblot es la obtención de proteínas separadas
electroforéticamente e inmovilizadas en un soporte de membrana y hacerlas fácilmente
accesible para su identificación. La técnica utilizada para transferir proteínas que se
visualizan en las corridas electroforéticas se denomina Western blot.
2. Investigaciones realizadas en momias para la determinación de diversas patologías.-
Los estudios realizados en momias para la determinación de diversas patologías abarcan la
utilización de múltiples herramientas de diagnóstico.
Por ejemplo, Sauca (s/a) identifica huevos calcificados de Schistosoma haematobium en la
vejiga urinaria de momias de la XX dinastía egipcia (1250-1000 a.C) en las cuales también
observa reactividad serológica mediante ELISA en diversos tejidos momificados. Estos
análisis inmunológico en momias egipcias han revelado la presencia de otros tipos de
parásitos aparte de los que ya citamos como ser: quistes hydatidicos e infecciones por
Filaria y Taenia (Rabino et al. 2000).
El año 2000 Rabino et al. realizó una investigación paleoinmunológica en Turín para
detectar malaria en momias predinásticas (3.200 A.C.) de Gebelen usando el análisis
inmunoenzimático, ELISA,
en el que revela trofozoitos derivados del Plasmodium
falciparum, mediante la detección del antígeno, proteína-2 rica en histidina (PfHRP-2), este
método fue aplicado a muestras de tejido momificado en piel y en huesos.
Por otra parte es importante mencionamos la presencia de evidencias patológicas
sugerentes de la enfermedad de Chagas por medio de estudios antropológicos en algunas
momias peruanas (Guhl, et al, 1997). Así mismo de acuerdo a la publicación de Albarracin
& Veizaga et al. 1999, las momias de los indios Chinchorro, encontradas en el norte de
Chile, proveen evidencias de haber sido infectadas con T. cruzi y de su migración desde
Bolivia, aproximadamente hace 500 años a.C. Las momias de la región de Tarapacá
muestran signos clínicos de enfermedad de Chagas crónica y mas recientemente se pudo
recuperar ADN del parásito de algunas muestras de sus tejidos (Rothhammer et al. 1985;
Guhl et al., 1997) y 1998, Pringle, reporta el caso de una momia que presentaba megacolon.
37
Conociéndose dos causas principales para esta condición: en niños, cuando es heredado
como un raro desorden congénito llamado enfermedad de Hirschsprung, pero en adultos
puede desarrollarse como resultado de la enfermedad de Chagas, donde T. cruzi ataca los
nervios del colon, y el peristaltismo normal del intestino queda interrumpido.
Rothhamer et al, 1985 y Jaramillo et al., 1997, encontraron distintos rasgos
paleopatológicos como ser megacolon, megaesófago y cardiopatías en momias chilenas que
datan de hace 470 a.C. hasta 600 d.C., dichos hallazgos fueron motivación suficiente para
emprender el estudio de detección de ADN de T. cruzi en cuerpos con momificación
espontánea. Recuperando ADN de varios entierros de la cultura Chinchorro entre otras, lo
que ha permitido el análisis basado en PCR de secuencias de ADN mitocondrial.
Desde finales de la década de los 80 hasta 1999, importantes avances se han efectuado en el
área del diagnóstico y caracterización de T. cruzi utilizando técnicas moleculares entre las
cuales se destacan el uso de antígenos recombinantes para el serodiagnóstico y la detección
por amplificación del DNA del parásito utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Hasta el momento se han propuesto al menos seis estrategias para la detección de T.
cruzi por PCR, de las cuales la reacción basada en la amplificación de un fragmento de 330
pb originado de los minicírculos de kDNA (ADN del cinetoplasto) es hasta el momento la
técnica que ha mostrado mayor sensibilidad (Vallejo et al. 2000). Esta técnica ha mostrado
capacidad aún para detectar el DNA del parásito en restos momificados en Perú y Chile
(Guhl et al., 1999).
Al margen de las patologías mencionadas también en este tipo de muestra momificadas se
realizaron otro tipo de investigaciones en las que emplean fundamentalmente técnicas de
diagnóstico inmunológico, de las cuales resulta mas relevante la determinación de
antígenos eritrocitarios, los mismos que son sustancias específicas de la constitución
genética del individuo y que aparecen durante el desarrollo embrionario, persistiendo
invariablemente durante toda la vida, capaces de resistir a la desecación y putrefacción.
Esta propiedad ha permitido realizar la identificación del grupo sanguíneo de momias
egipcias e indoamericanas (Meza & Correa, 1988; Varela, 1965); siempre en esta dirección
Suarez & Linares mencionan los estudios de varios autores que a partir de 1934 se realizan
trabajos con tejido muscular de momias; en Perú, Chile y Groenlandia, para determinar el
38
grupo sanguíneo y entre el 1939 y 1953 para detectar antígenos del sistema Rh en estas
momias. En 1967 surge la hipótesis postulada por los mismos autores de que cuanto mas
pura es la raza aborigen en América, mayor es el predominio de los grupos sanguíneos O
Rh positivo, dato que verifican mediante la técnica de inhibición de la hemaglutinación en
momias de La Paz, Bolivia, que pertenecían a culturas antiguas establecidas en nuestro
país.
Con dichos antecedentes se asegura el desarrollo de técnicas que permitan el estudio de
grupos sanguíneos en momias, es una contribución valiosa sobre todo en lo que concierne
al origen de las razas ó núcleos étnicos en nuestro país.
39
III. MATERIALES Y MÉTODOS.-
3.1 Población de estudio.-
Nuestra población de estudio estaba constituida por 21 individuos momificados que
fueron proporcionados por los Museos Universitarios de Cochabamba y Sucre y los datos
de
la procedencia, edad, sexo y cultura fueron recopilados a partir de los registros
existentes en dichos museos (Tabla 4 y 5).
Del museo de Cochabamba se tomaron muestras de tejido de diferentes regiones
anatómicas de 14 momias de acuerdo a las posibilidades y acceso, con objeto de no dañar la
conservación de las mismas.
Del museo de Sucre se tomaron muestras de tejido de diferentes regiones
anatómicas de 7 momias de acuerdo a las posibilidades y acceso, con objeto de no dañar la
conservación de las mismas.
El material obtenido en ambos museos abarca restos momificados pertenecientes a
cultura Mojocoya (periodo formativo a intermedio temprano 1- 800 años d.C.), Colla
aymará (periodo Intermedio, 600 a 1400 años d.C.), Puqui (periodo Intermedio, 600- 1400
años d.C.) y Presto Puno (periodo Intermedio, 600- 1400 d.C.).
3.2 Toma de muestras. Los tejidos se obtuvieron con ayuda de pinzas, tijeras y bisturí (tomando muestras
de: venas, arterias o de músculo glúteo (Fig. 12 – 13).
 Todas las muestras extraídas se guardaron en bolsas plásticas pequeñas,
debidamente rotuladas con el código asignado por el museo para la momia
correspondiente y la región anatómica de la que se extrajo la muestra.
40
Fig. 6 y 7.- Toma de muestras en las momias.
3.3 Preparación de las muestras. Cada muestra de tejido extraída se trituró en mortero (Fig. 14)
 A los tejidos pulverizados se agregó solución salina (NaCl al 0.9 %) de acuerdo a la
señalado por Suarez & Linares en 1967, hasta obtener una papilla.
 El material así preparado se congeló a – 20 ºC hasta el momento de su utilización,
para la determinación de grupos sanguíneos.
Fig. 8.- Preparación de las muestras
41
3.4 Ensayos realizados en las muestras momificadas para la determinación de grupos
Sanguíneos mediante la Inhibición de la Hemaglutinación. –
3.4.1 Cálculo del título hemaglutinante:
Previo a los ensayos con los tejidos momificados se calculó el título de aglutinación
de cada uno de los antisueros correspondientes, enfrentando los mismos con una
suspensión al 2 % de glóbulos rojos lavados cuyos grupos sanguíneos eran conocidos
(A, B, D).
Dicho ensayo tiene la finalidad de establecer el título de máxima dilución a la cual
cada uno de los antisueros tiene capacidad de producir aglutinación.
3.4.2 Determinación del título Hemaglutinante para el ensayo con tejidos
momificados:
El titulo hemaglutinante para el ensayo con tejidos momificados se realizó con la
misma metodología anteriormente señalada, con la variante de que previo a enfrentar con la
suspensión de glóbulos rojos el antisuero titulado en su máxima dilución se enfrentó con
una muestra de tejido momificado.
Este ensayo tiene la finalidad de establecer el título de máxima dilución a la cual cada
uno de los antisueros tiene capacidad de producir aglutinación después de estar en contacto
con las muestras de tejido.
3.4.3 Determinación de grupo sanguíneo en tejidos momificados según la técnica de
Suarez & Linares, 1967. De cada momia se tomaron 3 porciones del tejido preparado como se describió
anteriormente, con un peso de 100 mg.
 Cada porción de tejido fue enfrentado con el correspondiente antisuero (A, B, D),
en una proporción 1:1.
42
 Los tubos marcados como A y B que contenían el tejido más el antisuero A o B se
incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas.
 Los tubos marcados como D que contienen el tejido más el antisuero D se
incubaron a 37 °C, durante 3 horas.
 Luego de la incubación, se centrífugó cada muestra a 2000 rpm.
 Se recuperó el sobrenadante.
 Se midió la cantidad de sobrenadante recuperado y se agregó un volumen similar
de una suspensión al 2 % de glóbulos rojos lavados de grupos sanguíneos
conocidos.
 Se centrífugó nuevamente a 2000 rpm y se interpretaron los resultados como
positivo (ausencia de aglutinación) y negativo (presencia de aglutinación).
 Se repitió cada ensayo 3 veces para verificar la veracidad de los resultados.
3.5 Ensayos realizados en muestras momificadas para la detección de antígeno de T.
cruzi.-
Para la detección de antígenos de T. cruzi en las muestras momificadas se utilizaron
las técnicas HAI y ELISA de inhibición e inmunoelectroblotting.
3.5.1 Cálculo del título aglutinante.-
El cálculo del título aglutinante se realizó de la misma manera descrita en el punto
3.4 con la diferencia de que en este ensayo se utilizó un suero hiperinmune de un paciente
diagnosticado por serología como Chagas positivo.
3.5.2 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación indirecta (I-HAI)
 Se utilizaron dos fragmentos de tejido de megacolon pertenecientes a pacientes
con serologia para Chagas positiva y negativa respectivamente y los fragmentos de
tejido de colon momificado
 Estas muestras de tejido se incubaron por 3 horas a 37 ºC con el suero hiperinmune
para chagas con titulo aglutinate conocido de acuerdo a protocolo experimental.
43
 Luego de la incubación, se centrífugó cada muestra a 2000 rpm.
 Se recuperó el sobrenadante.
 Con el sobrenadante recuperado
se realizó
la técnica de
hemoaglutinación
indirecta utilizando un kit comercial de la firma Polichaco
 Se interpretaron los resultados como positivo (ausencia de aglutinación) y negativo
(presencia de aglutinación).
 Se realizó el mismo ensayo con los tejidos momificados
3.5.3 Prueba de ELISA de inhibición. Con lo sobrenadantes preparados para el ensayo anterior se realizó una prueba de
ELISA
 Para la prueba de ELISA se utilizó el kit comercial ELISA IgG de la firma Wiener
siguiendo las especificaciones del fabricante
 En los dos primeros pocillos se depositaron los controles positivo y negativo
respectivamente provistos por el fabricante
 En el tercer pocillo se agregó solución de PBS y en los restantes cinco pocillos se
agregó los correspondientes sobrenadantes provenientes del tejido positivo, del
tejido negativo y de los tejidos momificados
 Se interpretaron los resultados como positivo (Densidades Ópticas mayores a la
línea de corte determinada según las especificaciones del fabricante) y negativo
(Densidades Ópticas menores a la línea de corte determinada según las
especificaciones del fabricante).
3.5.4 Técnicas de Inmunoelectroblot.-
Para determinar la presencia de proteínas en los tejidos momificados se aplicó la técnica de
electroforesis vertical en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (Dodecil Sulfato de
Sodio) utilizando equipos y reactivos de la firma Bio- Rad.
44
 Se utilizaron dos fragmentos de tejido de megacolon pertenecientes a pacientes
con serologia para Chagas positiva y negativa respectivamente y los fragmentos de
tejido de colon momificado
 A partir de cada una de las muestras anteriores, se realizó la extracción de proteínas
siguiendo una técnica preestablecida (ver anexo 14)
 Se prepararon los geles de poliacrilamida, el gel de separación 10 % y el de
concentración al 4 %
 Cargamos lo geles preparados a la cubeta de electroforesis, 3. 8 ml del gel de
separación y llenamos con el gel de concentración hasta el borde superior de la
cubeta.
 Se utiliza un peine que divide el gel para poder cargar cada muestra.
 Colocamos el Buffer de cargado en los orificios realizados con el peine.
 Cargamos las muestras preparadas.
 Añadimos Buffer de migrado 125 ml a la cámara interna y 400 ml del mismo Buffer
al mini tanque.
 la migración de las muestras se realizó a 100 voltios constante y 30 mA durante una
hora y media.
 Luego se realizó la tinción de los geles con azul de Coomasie (R250) durante 30
minutos.
 Luego se destiñeron los geles con solución decolorante por varias horas hasta que
se pueda visualizar alguna señal de proteína en los geles.
Los reactivos utilizados para la preparación de los geles de poliacrilamida y de algunos
buffers mencionados en la técnica se detallan en Anexos 15, 16 y 17.
3.5.4.1 Determinación de los Pesos Moleculares.-
Los pesos moleculares de los componentes proteicos se determinaron con ayuda del
marcador molecular, cuyo rango era de 10 a 220 KD.
45
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.-
4.1 Población de estudio. COCHABAMBA
Tabla 4.- Datos de la población de momias en estudio.
Momia
(código museo)
268
265
Procedencia
Sexo
Edad
Ayopaya
M
Adulto
F
16-18
Ayopaya, momia incompleta
sin canasto
263
Ayopaya, Chullpa
Desc.
Adulto
262
Ayopaya, Chullpa
M
30-35
x-262
Ayopaya
F
40-45
269
Ayopaya
F
25-30
264
Ayopaya
F
45
270
Ayopaya, momia completa
M
19- 24
04010001-128
Región de Oruro- cultura Puqui Desc.
Ayopaya
M
+ 50
231
Ayopaya
F
30- 35
287
Cultura Mojocoya
Desc.
Feto
F
1- 3
F
+ 50
555
Cultura Mojocoya, niño
incompleto
Cultura Mojocoya
CraneofacialDyostosis
Osteoartritis
Dentición
supernumeraria
Osteoartritis,
momia eviscerada
2- 4
275
282
Patología
Sin mandíbula
Nació muerto
Deformación
craneana
eviscerada
Fuente: Museo Arqueológico UMSS (2004)
46
 SUCRE
Los registros de las momias de sucre no contienen datos sobre las patologías,
únicamente la procedencia, edad y sexo, como se indica la tabla 5.
Tabla 5.- Datos de la población de momias de Sucre
Momia
Procedencia
Sexo
Edad
Sucre- Catedral Sto.
Masculino
Niño aprox. 10 años
Femenino
Niña aprox. 16 años
Masculino
Aprox. 65 años
Masculino
8- 10 años
Femenino
3- 5 años
Femenino
25 años
Desconocido
Aprox. 10 meses
(Código museo)
Momias coloniales:
C-01
Domingo
C-02
Domingo
C-03
Domingo
Momias
Prehispánicas:
Ph.-01
Region Cultura
Presto Puno
Ph.-02
Meseta de SaucaProvincia Sudanés
Ph.-03
Ph.-04
Fuente: Museos Universitarios de Charcas (2004)
47
La población analizada estaba constituida por 21 sujetos momificados de las ciudades de
Cochabamba y Sucre que pertenecían a las culturas indicadas en la figura 9.
11
10
9
8
Nº Momias
7
6
5
4
3
2
1
0
Mojocoya
Aymara
Puqui
Colonial
Presto
Puno
Fig. 9.- Relación entre el número de momias de ambos museos y las culturas a las que
pertenecían
Seis individuos pertenecían a la cultura Mojocoya, diez a la cultura aymará uno a la
cultura Puqui y uno a la cultura Presto Puno con la característica principal de que todas
ellas son clasificadas como pre-hispánicas por la antigüedad de las cerámicas encontradas
junto con las momias y a las que se les realizó la prueba de carbono 14 (datos
proporcinados por los museos ver tabla 4 y 5 ) así mismo las 3 momias coloniales se
identificaron como tales por sus características óseas, por el tipo de vestimenta que se
reconoció que tenia origen europeo.
48
4.2 Toma de muestras.-
Tabla 6.- Tipo de muestra tomada en las momias de ambos museos
Ciudad de Muestreo
Momia
(Código museo)
SUCRE
COCHABAMBA
04010001-128
Tipo de Muestra
Glúteo
Axila
231
Axila
262
Pierna
X-262
Brazo
263
Glúteo
264
Pierna
265
Vena
Glúteo
268
Glúteo
269
Músculo Facial
270
Glúteo
275
Axila
282
Brazo
Músculo Facial
287
Glúteo
555
Glúteo
C-01
Glúteo
C-02
Glúteo
C-03
Glúteo
Ph-01
Pierna
Ph-02
Glúteo
Ph-03
Glúteo
Ph-04
Glúteo
En la tabla 6 se detalla el tipo de tejido obtenido de diferentes regiones anatómicas de cada
momia.
49
PORCENTAJE DE MUESTRA
ANALIZADO
6%
12%
40%
12%
12%
18%
gluteo
axila
pierna
brazo
musculo facial
vena
Fig. 10.- Porcentaje de muestras estudiadas en Cochabamba
La figura indica el tipo de tejido que se utilizó en cada ensayo, según Suarez & Linares
1967, el mejor tejido para determinar grupo sanguíneo era glúteo, sin embargo debido a que
es muy difícil tener acceso al mismo tipo de tejidos en las momias
por motivo de
preservación, la toma de las muestras fue de diferentes tejidos, de acuerdo a las
posibilidades.
Tenemos en la ciudad de Cochabamba a disposición 14 momias de las cuales se obtuvo
tejido de glúteo de un 40 % de ellas, el mayor porcentaje ya que era importante basarnos en
la técnica utilizada por los autores, sin embargo 18% que corresponde a axila y el 6% a
vena dieron resultados satisfactorios con la técnica descrita por Suarez & Linares.
El tener a disposición poca muestra hizo importante el tomar en cuenta un nuevo tipo de
muestreo en lugares de gran irrigación, lo cual se confirma con las muestras de axila y
vena.
50
sanguíneos mediante la Inhibición de la Hemaglutinación.-
4.3.1 Cálculo del título de aglutinación:
Siguiendo la metodología descrita se obtuvo el título máximo de aglutinación para cada
antisuero, como se indica en la tabla 10:
Tabla 7.- Título de aglutinación de antisueros con grupo sanguíneos:
Antisueros
A
Títulos
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
B
D
Para el antisuero A, el título determinado fue de 1:128
Para el antisuero B, el título determinado fue de 1:32
Para el antisuero D, el título determinado fue de 1:64
La finalidad de la determinación de estos títulos fue el establecer un punto de referencia a
partir del cual se realizó el cálculo del titulo aglutinante para trabajar con los tejidos
momificados.
51
4.3.2 Determinación del titulo aglutinante para el ensayo con tejido momificado:
Se determinó el título aglutinante para trabajar con tejido momificado a partir de la máxima
dilución obtenida en el anterior paso para cada antisuero, dichos resultados están resumidos
en la tabla 8.
Tabla 8.- Título de aglutinación del tejido momificado
TITULO DE LOS ANTISUEROS + Tejido momificado
Antisuero A
Antisuero B
1/16
1/8
Antisuero D
1/8
A partir de la máxima dilución de los antisueros se determinaron de modo experimental
diluciones anteriores hasta encontrar la dilución óptima del antisuero, el mismo que luego
de estar en contacto con el tejido pueda producir aglutinación al ser enfrentado con la
suspensión de glóbulos rojos.
Se tomaron como criterios validos tres diluciones consecutivas de las cuales las dos
primeras producían aglutinación y en la tercera ya no se observaba aglutinación con la
correspondiente suspensión de glóbulos rojos; de esta manera se estableció que los títulos
óptimos de trabajo eran 1/16 par el antisuero A y 1/8 para los antisueros B y D.
4.3.3 Determinación de los Grupos Sanguíneos en Tejidos Momificados según la
técnica de Suarez y Linares, 1967.-
Los resultados obtenidos con los tejidos momificados de la ciudad de Cochabamba y Sucre
se resumen en las tablas 9 y 10
52
Tabla 9.-.Determinación de grupos sanguíneos.Ciudad de
Momia
Tipo de
Sistema ABO
Muestreo
(Código museo)
Muestra
y Rhesus
A
04010001-128
D
Glúteo
*
*
Axila
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
Axila
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
Pierna
*
*
*
∞
Brazo
*
*
*
∞
Brazo
*
*
*
∞
Pierna
*
*
*
∞
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
264
Pierna
*
*
*
∞
265
Vena
*
*
**
O Rh positivo
Glúteo
*
*
Pierna
*
*
231
262
X-262
263
Cochabamba
B
Resultado
**
O Rh Positivo
O Rh Positivo
**
∞
*
268
269
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
Músculo Facial
*
*
*
∞
Pierna
*
*
*
∞
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
Axila
*
*
**
O Rh Positivo
Pierna
*
*
*
∞
Brazo
*
*
*
∞
Músculo Facial
*
*
*
∞
Glúteo
*
*
**
O Rh positivo
Pierna
*
*
*
∞
Glúteo
*
*
**
O Rh positivo
Pierna
*
*
*
∞
270
275
282
287
555
* aglutina, ** no aglutina, ∞ indeterminado
53
Como se evidencia en la tabla 9, todas las momias prehispánicas del museo de Cochabamba
pertenecen al grupo O Rh positivo; los tejidos analizados que nos permitieron obtener estos
resultados fueron los tejidos momificados de glúteo tal como recomienda la técnica de
Suarez & Linares, 1967, sin embargo pudimos también obtener resultados satisfactorios
con tejidos de axila y vena, demostrando que en estos sectores es posible la detección de
antígenos de grupo sanguíneo.
Tabla 10. Datos obtenidos de momias de Sucre
Ciudad de
Momia
Tipo de
Sistema ABO
Muestreo
(Código museo)
Muestra
y Rhesus
A
B
D
Factor Rh
C-01
Glúteo
**
*
*
A Rh Positivo
C-02
Glúteo
**
**
*
AB Rh
Sucre
positivo
C-03
Glúteo
**
**
*
AB RH
Positivo
Ph-01
Pierna
*
*
*
∞
Ph-02
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
Ph-03
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
Ph-04
Glúteo
*
*
**
O Rh Positivo
* aglutina, ** no aglutina, ∞ indeterminado
Contrariamente a las momias prehispánicas los datos resumidos en la tabla 10 nos muestran
que las momias coloniales presentan grupos sanguíneos diferentes a las prehispánicas.
Llama la atención que al utilizar tejidos de regiones anatómicas diferentes a las de glúteo,
axila o vena en un mismo individuo se obtienen resultados discrepantes, por lo cual
llegamos a la conclusión de que estos tejidos no son los mas adecuados para determinar el
54
grupo sanguíneo, lo que concuerda con la recomendación hecha por Suarez y Linares, de
utilizar tejido de músculo glúteo.
Según Varela, 1965, los antígenos eritrocitarios son substancias específicas que persisten
invariablemente durante la vida de un individuo y resisten al tiempo, a la putrefacción e
incluso a la desecación, cita los ejemplos de la detección de antígenos eritrocitarios en
momias egipcias e indoamericanas. Este tipo de pruebas han sido realizadas con la misma
técnica que utilizamos en este estudio incluso para la determinación en momias egipcias.
Suarez & Linares, 1967, indican que fue posible dicha detección de antígeno eritrocitario
por medio de la prueba de Inhibición de la aglutinación, en tejido de glúteo en momias de
La Paz, Bolivia, sus resultados muestran que todas la momias de las culturas estudiadas son
precolombinas y pertenecen al grupo sanguíneo O Rh positivo, lo cual es ratificado con
nuestras investigaciones en las momias de Cochabamba y Sucre.
Según Rubio et al. (s/a), la incubación de cada muestra ocasiona que los sitios de unión del
anticuerpo (antisuero) queden cubiertos y que al añadir los glóbulos rojos lavados estos
sitios de unión en la membrana eritrocitaria queden saturados con el antígeno eritrocitario,
en este caso el que exista en el tejido, en tal caso no producirá aglutinación alguna, por el
contrario si el antígeno no estaba en concentración suficiente como para saturar todo el
anticuerpo, quedarán sitios libres y se producirá aglutinación con el antígeno particulado,
siendo este el principio de la técnica de hemaglutinación indirecta, prueba utilizada por
Suarez & Linarez con las momias de la ciudad de La Paz y por nosotros en las momias de
Sucre y Cochabamba.
La técnica nos permite distinguir una aglutinación (Fig. 11) visible a simple vista lo cual
indica que los tejidos en estudio de los individuos Prehispánicos de las culturas Colla
aymará, Puqui, Mojocoya y Presto Puno, pertenecen al grupo sanguíneo O Rh positivo, en
contraste con los resultados obtenidos con las momias Coloniales en las que obtuvimos
otros grupos sanguíneos como se indica en la Fig. 11.
Según Venegas, E. et al. 1992, se determinó que de 10.000 muestras analizadas en un
Banco de Sangre de Bolivia, el 62 % de la población pertenecían al grupo sanguíneo O Rh
55
positivo, el 22 % al A Rh positivo, el 10 % al B Rh positivo y en menor porcentaje al grupo
AB Rh positivo.
Fig. 11.- Inhibición de la aglutinación realizada en tubos
1
1
A Rh +
AB Rh +
O Rh +
2
No Determ inado
3
Fig. 12.- Frecuencia de antígenos Eritrocitario en las muestras de Sucre
En la figura 12 indicamos que del total de las momias del museo de Sucre 4 son prehispánicas, en 3 se logró obtener grupo O RH positivo mediante la técnica de inhibición de
la aglutinación, en la restante no se pudo debido al tipo de tejido del que se extrajo la
muestra. Las momias coloniales del museo de Sucre son 3, de las cuales dos pertenecen al
grupo AB Rh positivo, la restante al grupo A Rh positivo.
56
Fig. 13.- Porcentaje de grupo sanguíneo O Rh positivo según a las culturas estudiadas
El gráfico indica que del total de las momias estudiadas de cada cultura el 66.7 % de las
pertenecientes a la cultura Mojocoya resultaron ser del grupo O Rh positivo, igualmente el
60 % de las aymará y el único individuo perteneciente a la cultura Puqui también pertenecía
a este grupo sanguíneo, el resto de los porcentajes de estas culturas no dieron ningún
resultado, debido a que el tipo de tejido utilizado no era el adecuado de acuerdo a los
autores.
Los individuos de la cultura Presto Puno no dieron resultados a las pruebas realizadas, por
el tipo de tejido utilizado inadecuado para los ensayos.
57
Fig. 14.- Porcentaje de grupo sanguíneo y factor Rh
Como se observa en la tabla 14, la totalidad de las momias prehispánicas que agrupa a las
momias de las culturas establecidas en Bolivia, todas pertenecen al grupo sanguíneo O Rh
positivo, en contraste las momias coloniales corresponden en un caso al grupo A Rh
positivo y las dos restantes al grupo AB Rh positivo.
Según Venegas, E. (sin publicar) en 1995 se realizan trabajos en una población Yuki del
trópico de Cochabamba, en los que se determina que el 100% de los individuos pertenecía
al grupo sanguíneo O Rh positivo.
Según Palazzo y Tenconi, la proporción de grupo sanguíneo tiene una distribución
geográfica y racial; en Europa el grupo sanguíneo A predomina en el oeste y en el este del
58
continente Europeo es mas común hallar el grupo sanguíneo B, cita también que en el
continente americano es predominante el grupo O entre los indígenas.
Por otra parte Varela, 1965 indican que el factor Rh + esta presente aproximadamente en el
100% de la raza amarilla, lo mismo ocurre en las poblaciones indígenas autóctonas
americanas. Según Sans- Sabrafen 1988, en la población negra el 93 % presenta este factor
positivo y alcanza como indica Varela el máximo porcentaje en la población amarilla.
Suarez & Linares (1967), indican que mientras mas puras son las poblaciones indígenas
americanas el predominio de grupo sanguíneo es O Rh + en casi el 100% de los individuos.
Un hallazgo importante es el citado por Ventura, 2004, en el que indica la elevada
proporción de individuos Rh negativos entre la población vasca, dicho genotipo no ha sido
encontrado en ningún aborigen
americano ni australiano. Los resultados obtenidos
concuerdan con lo citado por el autor ya que todas las momias de origen prehispánico de las
culturas estudiadas presentan el factor Rh positivo.
Según Segalés et al. 1989, en una investigación realizada sobre las frecuencias de los
fenotipos ABO en España, el predominio del grupo A se presenta en este mismo país con
una frecuencia de 45.56 % en una población estudiada de 508.855 individuos. Este dato es
importante debido a que las momias coloniales que estudiamos fueron identificadas como
españolas, por los expertos antropólogos del Museo de Charcas, además de que se pudo
determinar que pertenecía al grupo A Rh positivo y como citaron los autores anteriormente
este tipo de grupos A y B es predominante en Europa, por lo que los resultados concuerdan
con este dato.
Ya desde 1919 Hirszfeld establece que, si bien los cuatro grupos sanguíneos (O, A, B y
AB) existían en todas las razas, sus proporciones respectivas mostraban notables
diferencias entre las diversas poblaciones.
Es importante por lo tanto relacionar el origen de dichos grupos sanguíneos tomando en
cuenta las primeras poblaciones establecidas en el continente americano, según Ibarra &
Querejazu, 1986, existen dos hipótesis, la primera indica que la población indígena
americana tiene un origen en la raza mongoloide, que ingresó a nuestro continente por la
vía de Bering hace 30.000 años. La segunda indica que la población americana tuvo varios
orígenes, primero por Bering, por donde entraron varios pueblos emigrantes en épocas
distintas, los primeros de los cuales hace no menos de 50.000 años (pre- mongóloides)
59
posteriormente existen otras emigraciones desde los 3.000 años a.C. siendo posible su
llegada a América por la vía transpacífica desde Indonesia.
Este dato es de importancia ya que señala el origen que presenta América, un origen
Asiático y como citamos anteriormente el predominio de grupos sanguíneos en ese
continente es netamente O Rh positivo tal como el de los indígenas americanos y como se
comprueba en las momias precolombinas.
Según Espinosa F. y Primitivo Pla (s/a) las diferentes etnias americanas corresponden a
distintos aportes migratorios, que ingresaron a América por el estrecho de Bering, señalan
el estudio realizado por el Departamento de Salud de EE.UU, en el que se encontraron tipos
sanguíneos de razas siberianas, la de los ainos japoneses y una menor parte de pacífidos,
concuerdan con los autores anteriormente citados sobre un origen asiático y también citan
sus grupos sanguíneos, que en tal caso serían O Rh positivos.
En relación a las técnicas, el grupo de investigadores, Ascenzi, A. et al. 1985, utilizan
técnicas inmunológicas como la inmunodifusión y ELISA que demostraron no ser lo
suficientemente sensibles para determinar la presencia de hemoglobina en las muestras
momificadas, sin embargo demuestran que el inmunoblot, es altamente sensible para
determinar la presencia de hemoglobina en huesos con una antigüedad de aproximadamente
4500 años, ellos postulan que es posible hallar en los huesos moléculas o fragmentos de
hemoglobina.
Schweitzer, M. et al. 1997,
otro grupo de investigadores siguen la misma línea,
determinando la presencia de hemoglobina en huesos de dinosaurios por el métodos
también de inmunoblot; las proteínas extraídas de los huesos fueron utilizadas para
inmunizar ratas, el antisuero resultante reacciona positivamente con hemoglobina
purificada de aves y mamíferos. La explicación es que aún es posible hallar hemoglobina
en muestras de tejido de huesos incluso de dinosaurios cuya antigüedad data de millones
de años.
Actualmente utilizan la técnica inmunológica del blotting que dio resultados para muestras
muchísimo mas antiguas que las nuestras y en huesos, sin embargo aún con la técnica
descrita en 1967 fue posible hallar en tejidos los resultados esperados.
60
4.4 Ensayos realizados en las muestras momificadas para la detección de antígeno de
Trypanosoma cruzi.-
4.4.1 Cálculo del título aglutinante.-
El suero utilizado para el ensayo provenía de un paciente con serología positiva para
Chagas, con un título original de 1:1024, a partir del cual se determino de manera
experimental el título aglutinante para la prueba con los tejidos de la manera descrita en el
punto 4.3, dicho título correspondía a la dilución 1:128.
4.4.2 Técnica de la inhibición del HAI (I- HAI).-
Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11.- Prueba HAI
Suero Chagas
Tejido megacolon
Tejido megacolon
Tejido de Colon de
Positivo
(Chagas Positivo)
(Chagas Negativo)
Momia
Título
Título de
Original
Trabajo
Título
Resultado
Título
Resultado
Título
Resultado
1:128
Positivo
1:128
Positivo
1:128
Positivo
1:256
Positivo
1:256
Positivo
1:256
Positivo
1:512
Positivo
1:512
Positivo
1:512
Positivo
1:1024
Positivo
1:1024
Positivo
1:1024
Positivo
1:128
1:1024
(4 UA)
Como se observa en la tabla 11 no se observó ninguna diferencia en los resultados
obtenidos con los tres tipos de tejidos, estos resultados nos indican que prueba utilizada fue
incapaz de discriminar entre los tejidos control y el tejido momificado por lo que
concluimos que la técnica no es adecuada para este tipo de investigaciones, probablemente
esto se debe a la falta de un anticuerpo monoclonal específico para T. cruzi, ya que en
nuestro ensayo nosotros trabajamos con un suero hiperinmune para Chagas proveniente de
61
un solo paciente chagásico. Además existe la posibilidad, a pesar de que no podemos
demostrar que no existe el antígeno parasitario en las muestras de tejido analizadas.
4.4.3 Prueba de ELISA de Inhibición.-
Tabla 12.- Prueba ELISA
Tejido megacolon Chagas
Tejido megacolon
Tejido de Colon de
Positivo
Chagas Negativo
Momia
Valor Cut- off
D.O.
Resultado
D.O.
Resultado
D.O.
Resultado
0.3615
1.041
Positivo
1.149
Positivo
1.872
Positivo
2.329
Positivo
2.128
Positivo
1.287
Positivo
2.492
Positivo
2.169
Positivo
Positivo
Como muestra la Tabla 12, utilizando la prueba de ELISA de Inhibición tampoco fue
posible obtener diferencias en cuanto a los resultados entre los tejidos control y el tejido
momificado.
Las diferencias del valor de las densidades ópticas en relación al valor de la línea de corte
son muy grandes lo que explica que la prueba estaría identificando los anticuerpos
presentes en el suero utilizado y que en ningún momento se produjo algún porcentaje de
secuestro de anticuerpos por parte del tejido control positivo como se esperaba tal como
sucede en la determinación de los grupos sanguíneos descrita por Suarez & Linares.
4.4.4 Técnica de Inmunoelectroblot.-
Utilizando esta técnica logramos visualizar en los geles de poliacrilamida proteínas
fragmentadas (fig. 15) en los tejidos momificados, los cuales a pesar del tiempo
transcurrido y la consecuente degradación que pudiera haber sufrido la proteína presentaron
diferentes pesos moleculares.
Si bien no se pudo determinar el antígeno buscado usando las pruebas serológicas
mencionadas, la electroforesis nos permitió evidenciar la presencia de proteínas y el estado
en el que se encontraban. Lo cual esta respaldado por el trabajo de Torres et al. (s/a) quien
señala que fue posible el hallazgo de proteínas mediante pruebas inmunológicas en huesos
62
fósiles con una antigüedad de millones de años, dichos autores citan a Lowenstein, el cual
identificó mediante radioinmunoensayo colágeno especie- específico y factores del suero en
fósiles de Homo erectus, Australopithecus robustus y Ramapithecus, por su parte Wickoff,
1972, observó mediante el microscopia electrónica fibrillas de colágeno en huesos de
dinosaurios con una antigüedad de 200 millones de años.
Según dichos autores sus resultados indican que las muestras contienen proteínas que
aunque fragmentadas pueden persistir en el tiempo e incluso conservar muchas de sus
propiedades inmunológicas, en nuestro caso fue posible visualizar la existencia de proteínas
igualmente degradadas o fragmentadas como las halladas por Torres et al., sin embargo
con distintos pesos moleculares como indicamos en la figura 15 con lo cual demostramos y
concordamos con los autores que es posible que las proteínas persistan en el tiempo aún
tomando en cuenta que sus muestras son mucho mas antiguas que las momias que nosotros
estudiamos, por lo que es posible investigar la presencia de proteínas en muestras antiguas
con técnicas inmunológicas, esto alienta a continuar investigando mediante estas técnicas la
presencia de antígenos de diferentes patologías en muestras momificadas.
Marcador
PM
Tej. colon
Muestras de Momias
paciente Chagas +
Tej. Colon paciente
Muestras de Momias
Chagas -
Fig. 15. Visualización de proteínas en geles de poliacrilamida
Como indican Torres et al. s/a, el objeto de utilizar la prueba de inmunoblotting es el de
estudiar no solo la presencia de proteínas sino también el estado de conservación de las
mismas. En nuestro caso las electroforesis realizadas en las muestras nos permitieron
determinar proteínas fragmentadas con diferencias de peso molecular; no realizamos la
transferencia de estas proteínas debido a que no fue posible visualizar bandas claras y como
63
indican los mismo autores es recomendable utilizar un dot blot, pero además en el caso
nuestro sería imperativo la utilización de anticuerpos monoclonales específicos para T.
cruzi.
En esta misma dirección, Borja et al. 1997, demostró la posibilidad de detectar albúmina
en huesos de diferentes especies de muestras fósiles mediante ELISA (Enzyme Linked
InmunoSorbent Assay) y RIA (Radio Inmuno Assay)y Torres et al. s/a, utilizando la
técnica del dot- blotting y el dot- blotting cuantitativo detectaron inmunoglobulinas G en
huesos fósiles de équidos y de homínidos de 1.6 millones de años de antiguedad. Dichos
autores utilizaron en su metodología PBS para remojar las muestras pulverizadas. En
cambio en nuestra metodología tal como indica Suarez & Linares, 1967, nosotros
utilizamos solución salina al 0.9%, para la determinación de los grupos sanguíneos, sin
embargo para la determinación de antígeno chagásico al igual que Torres et al. utilizamos
PBS, después de hacer ensayos experimentales con el sobrenadante de los tejidos preparado
con solución salina preparada al 0.9% no se obtuvo ningún tipo de resultado con las
pruebas ELISA y HAI modificadas; con la utilización de PBS en los tejidos para las
mismas pruebas serológicas se obtuvieron los resultados presentados en la Tabla 11 y 12.
Contrariamente a lo anteriores autores, Brandt, E. et al. 2002, utiliza un ELISA para la
determinación de proteínas no colagénicas en huesos fósiles de Perú de 1400 AD, con un
suero policlonal, con la finalidad de aumentan la posibilidad de hallar sitios de unión para
los epitopes y de esta manera determinar proteínas que podrían continuar en los huesos
fósiles. Este mismo autor sugiere trabajar con técnicas moleculares para determinar ADN,
sin embargo según Krings et al. (1997) citado por Torrez et al. (s/a) no es factible la
utilización de estas técnicas en tejido óseo, debido a que la molécula de ADN en huesos se
degrada muy rápidamente.
En contraste con estos autores Rabino et al. (2000) utilizan la prueba de ELISA, en las
momias de Turín por medio de la cual lograron identificar con éxito la presencia de
antígenos de Plasmodium falciparum mediante la detección de la proteína- 2 rica en
histidina (PfHRP-2) componente presente en el parásito causante de la malaria. Al igual
que este autor Sauca (s/a) identifica huevos calcificados de Schistosoma haematobium en la
vejiga urinaria de momias egipcias (1250- 1000 a.C.) observando reactividad serológica
mediante ELISA en diversos tejidos momificados. Estos análisis serológicos han revelado
64
también la presencia de otros tipos de parásitos aparte de los ya citados como ser: quistes
hydatidicos e infecciones por Filaria y Taenia (Rabino et al. 2000).
En nuestro caso aún cuando existe bastante argumento para la utilidad de la prueba de
ELISA para identificar antígenos diversos, no se logró determinar antígeno de T. cruzi en
las muestras analizadas principalmente por la falta de un anticuerpo o monoclonal
específico para anti - Tripanosoma cruzi, también existe la posibilidad de que los tejidos
procesados no se encuentren parasitados por T. cruzi, aunque no tenemos seguridad en este
sentido no podemos hacer una afirmación al respecto.
Si bien no se pudo hallar el antígeno para Tripanosoma cruzi en nuestro trabajo, existen los
reportes del hallazgo de la misma mediante biología molecular en momias de 9.000 años de
antigüedad en Chile (Aufderheide, A. 2003), las cuales también sufrieron momificación
espontánea como las de Bolivia.
En 1980, Rothhammer, et al. hallaron en momias de Chile de la misma región, signos de
megacolon y de cardiopatías chagásicas; estos autores junto a Rojas, (2003) y AlbarracinVeizaga, et al. (1999), indican que es posible que las poblaciones actualmente establecidas
en Chile en las que se hallaron dichas patologías hayan migrado desde Bolivia, además de
que Rojas, 2003 citando a Dujardin, J. P. et al. 1998, asegura que existe evidencia genética
del Triatoma infestans
y de su origen en Bolivia específicamente en la región de
Cochabamba y Sucre, donde se pueden hallar focos silvestres de esta especie entre rocas
amontonadas y en asociación con roedores. La caza de estos roedores y la cría de los
mismos dentro de las casas como fuente de alimento, pudo haber suministrado la ruta
inicial para la domesticación de T. infestans hace aproximadamente 3.000 a 4.000 años.
Según los autores existen diversos motivos para señalar que Bolivia es el país a partir del
cual se dispersaron los triatominos y a partir de estos últimos la enfermedad encontrada en
sus pobladores de la cultura Chinchorro en Chile; no pudimos hallar dichos vestigios de la
enfermedad a partir de las técnicas utilizadas, sin embargo es posible continuar como
dijimos anteriormente y como cita Aufderheide, A. (2003) mediante técnicas moleculares.
Según Rothhammer, M. et al. 1980, es factible demostrar la existencia de la
tripanosomiasis en tiempos Precolombinos realizando la autopsia de momias y
determinando la presencia de signos concluyentes a través de técnicas paleopatológicas.
Los autores se basan en la observación de los megaórganos hallados en los individuos
momificados de Chile, para sugerir la presencia de la enfermedad de Chagas,
para esta
65
observación realizaron autopsias; sin embargo en nuestro caso no fue posible realizar dicho
proceso debido a que estas momias se encuentran en los museos y no es posible realizar una
técnica de ese tipo por motivos de preservación.
66
V. CONCLUSIONES.-
A la luz de los resultados es posible llegar a las siguientes conclusiones:
-
Mediante la técnica descrita por Suarez & Linares, fue posible hallar los siguientes
grupos sanguíneos: O Rh positivos para las momias pre- hispánicas, A Rh positivo y
AB positivo para las momias coloniales.
-
El grupo sanguíneo predominante en las momias pre- hispánicas fue O Rh positivo,
en contraste con las momias coloniales de diferente procedencia, las cuales
presentan otro tipo de grupos sanguíneos, dato que nos indica la distribución de los
grupos sanguíneos tal como indica la bibliografía.
-
Se aplicaron las técnicas de inhibición de HAI y ELISA de inhibición, por medio
de las cuales no pudo hallarse la presencia de antígeno de Trypanosoma cruzi.
-
Se detectaron proteínas fragmentadas en las muestras momificadas por medio de la
técnica de inmunoelectroblot.
67
VI. RECOMENDACIONES.-
- Se recomienda el uso de técnicas moleculares para la determinación de antígeno de
Trypanosoma cruzi en muestras momificadas de acuerdo a los trabajos realizados en Chile
y Perú.
- Se recomienda la utilización de antígeno purificado de Trypanosoma cruzi para continuar
trabajando con pruebas inmunológicas en momias.
- Para futuros es recomendable el uso de la prueba dot- blotting, sensibilizando las
membranas con antígeno purificado de T. cruzi.
- Igualmente es importante continuar este trabajo de determinación de grupos sanguíneos
utilizando técnicas moleculares, mediante las cuales se pueden comparar los resultados
obtenidos en este estudio con pruebas serológicas.
68
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75
DEDICATORIA
Dedicado a Dios y
A mis padres, a quienes debo toda realización en mi vida.
i
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y a Dios por el amor y apoyo brindados, por estar presentes en todo
momento.
Al Dr. Miguel Guzmán, por la ayuda , apoyo incondicional y especialmente por su
amistad., la cual aprecio muchísimo.
Al Lic. Evaristo Venegas y al Dr. Luis Maldonado, Amilcar Flores y a la Lic. Patricia
Rodrigues del Laboratorio de Inmunológia, Facultad de Medicina, UMSS, por su
orientación.
A la Facultad de Medicina- LABIMED por su colaboración al brindarme acceso a sus
laboratorios.
A mi querido amigo el Lic. Marquitos Bustamante, por su tiempo, ayuda y ánimo en
todo momento.
Al Lic. Victor Edmundo Salinas, Director de los Museos Universitarios Charcas en
Sucre, al que agradezco por su gentileza, apoyo técnico y bibliográfico.
Al Lic. David Pereira, Director del Museo Arqueológico de Cochabamba, y a la Lic.
María de los Angeles por abrirme las puertas del museo, promoviendo la investigación en
esta área de la paleontología.
ii
FICHA RESUMEN
Se realizó un estudio para la tipificación de grupos sanguíneos, factor Rh y detección
antígeno de Trypanosma cruzi en momias de los museos arqueológicos de Cochabamba y
Sucre. Para las pruebas de determinación de grupos sanguíneos se utilizaron muestras de
tejido de diferentes regiones anatómicas de momias coloniales y pre- hispánicas, estas
ultimas correspondían a las culturas Puqui, Mojocoya, Presto Puno y Colla- Aymara;
siguiendo la técnica descrita por Suarez & Linares en 1967. Por otra parte en el caso del
diagnóstico de antígenos de T. cruzi el tejido utilizado fue de colon, para ello las técnicas
aplicadas fueron la de ELISA y HAI de Inhibición.
En los tejidos estudiados se pudo detectar antígenos eritrocitarios de los grupos
sanguíneos en glúteo, axila y vena, correspondiendo al grupo O Rh positivo en el 100 %
de las momias prehispánicas. En las 3 momias hispánicas se logró determinar un grupo
diferente correspondiendo una de ellas al grupo A Rh positivo y en las dos restantes el
antígeno eritrocitario AB Rh positivo. No se obtuvieron resultados en la determinación
de antígeno de T. cruzi mediante las técnicas de ELISA y HAI de Inhibición, sin embargo
en el ensayo de electroforesis realizado se observó la presencia de proteínas fragmentadas
de diferente peso molecular, señalando que a pesar de la antigüedad es posible encontrar
proteínas.
iii
ÍNDICE GENERAL
Dedicatoria…………………………………………………………………………………..i
Agradecimientos…………………………………………………………………………….ii
Ficha Resumen……………………………………………………………………………...iii
Índice General………………………………………………………………………………iv
Índice de Tablas……………………………………………………………………………..v
Índice de Figuras……………………………………………………………………………vi
Glosario de Símbolos………………………………………………………………………vii
I. INTRODUCCIÓN.- ........................................................................................................................ 1
1. OBJETIVOS.-.............................................................................................................................. 4
1.1 Objetivos Generales. ............................................................................................................ 4
1.2 Objetivos Específicos............................................................................................................ 4
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................... 5
PRIMERA PARTE.- LOS GRUPOS SANGUÍNEOS....................................................................... 5
1. Los grupos sanguíneos ........................................................................................................... 5
2. Antígenos y sistemas de grupo sanguíneo eritrocitario más importantes.-............................ 6
2.1 Sistema ABO..................................................................................................................... 6
3. Constitución química de los grupos sanguíneos.- .................................................................. 8
4. Características de los Antígenos y Anticuerpos eritrocitarios.-............................................. 9
4.1 Antígenos eritrocitarios ................................................................................................... 9
5. Herencia de los antígenos eritrocitarios.- .............................................................................. 9
6. Sistema Rhesus.- ................................................................................................................... 10
6.1 Anticuerpos Rh.-............................................................................................................. 13
7. Técnicas para el estudio de grupos sanguíneos.- ................................................................. 14
8. Caracteres genéticos y raciales. Herencia de los grupos sanguíneos y Antropología.- ...... 16
SEGUNDA PARTE.- LA ENFERMEDAD DE CHAGAS ............................................................ 19
1. Historia y Descubrimiento de la enfermedad.-.................................................................... 19
2. Aspectos Epidemiológicos.- .................................................................................................. 19
2.1 Epidemiología de la enfermedad de Chagas.- ............................................................... 19
2.2 Epidemiología del vector.- ............................................................................................. 21
3. El vector.- ............................................................................................................................. 21
iv
3.1 Origen y adaptación del vector a nuevos hábitats.-....................................................... 23
4. Agente Etiológico- Tripanosoma cruzi ................................................................................. 26
5. Ciclo biológico.- ................................................................................................................... 27
6. Etapas de la enfermedad y su sintomatología asociada.- .................................................... 28
7. Vías de Transmisión ............................................................................................................. 29
7.1 Vía Vectorial.- ................................................................................................................ 29
7.2. Transfusión de Sangre................................................................................................... 29
7.3. Transmisión congénita .................................................................................................. 29
7.4. Transmisión por Transplantes ...................................................................................... 30
7.5. Otras formas de infección ............................................................................................. 30
8. Diagnóstico de Laboratorio ................................................................................................. 30
TERCERA PARTE.- TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE DIAGNOSTICO .............................. 32
1.
Técnicas de diagnóstico más comunes.- .......................................................................... 32
1.1 Reacciones de aglutinación.- ......................................................................................... 32
1.1.1 Aglutinación Directa.- ............................................................................................ 32
1.1.2 Aglutinación Indirecta. - ......................................................................................... 33
1.2 Inhibición de la aglutinación.- ....................................................................................... 33
1.3 ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay).- .......................................................... 34
1.3.1 ELISA de Inhibición.- ............................................................................................. 34
1.4 Técnicas de Inmunoelectroblot.- .................................................................................... 36
2. Investigaciones realizadas en momias para la determinación de diversas patologías.-...... 37
III. MATERIALES Y MÉTODOS.- ................................................................................................ 40
3.1 Población de estudio.- ............................................................................................................ 40
3.2 Toma de muestras.- ................................................................................................................. 40
3.3 Preparación de las muestras.- ................................................................................................ 41
Sanguíneos mediante la Inhibición de la Hemaglutinación. – ..................................................... 42
3.4.1 Cálculo del título hemaglutinante: .................................................................................. 42
3.4.2 Determinación del título Hemaglutinante para el ensayo con tejidos momificados: ...... 42
3.4.3 Determinación de grupo sanguíneo en tejidos momificados según la técnica de Suarez &
Linares, 1967.-.......................................................................................................................... 42
3.5 Ensayos realizados en muestras momificadas para la detección de antígeno de T. cruzi.- ... 43
3.5.1 Cálculo del título aglutinante.-........................................................................................ 43
3.5.2 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación indirecta (I-HAI).................................... 43
3.5.3 Prueba de ELISA de inhibición.- ..................................................................................... 44
v
3.5.4 Técnicas de Inmunoelectroblot.- ..................................................................................... 44
3.5.4.1 Determinación de los Pesos Moleculares.- .............................................................. 45
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.- .............................................................................................. 46
4.1 Población de estudio.- ............................................................................................................ 46
Momia ........................................................................................................................................... 46
4.2 Toma de muestras.- ................................................................................................................. 49
sanguíneos mediante la Inhibición de la Hemaglutinación.- ....................................................... 51
4.3.1 Cálculo del título de aglutinación: .................................................................................. 51
4.3.2 Determinación del titulo aglutinante para el ensayo con tejido momificado: ................ 52
TITULO DE LOS ANTISUEROS + Tejido momificado...................................................... 52
Antisuero A ................................................................................................................................... 52
4.3.3 Determinación de los Grupos Sanguíneos en Tejidos Momificados según la técnica de
Suarez y Linares, 1967.- ........................................................................................................... 52
4.4 Ensayos realizados en las muestras momificadas para la detección de antígeno de
Trypanosoma cruzi.- ..................................................................................................................... 61
4.4.1 Cálculo del título aglutinante.-........................................................................................ 61
4.4.2 Técnica de la inhibición del HAI (I- HAI).-..................................................................... 61
4.4.3 Prueba de ELISA de Inhibición.-..................................................................................... 62
4.4.4 Técnica de Inmunoelectroblot.- ....................................................................................... 62
V. CONCLUSIONES.- ..................................................................................................................... 67
VI. RECOMENDACIONES.- .......................................................................................................... 68
VII. BIBLIOGRAFÍA.- .................................................................................................................... 69
ANEXOS…………………………………………………………………..………………………75
vi
ÍNDICE DE TABLAS.
Tabla 1.- Sistemas Eritrocitarios........................................................................................... 6
Tabla 2.- Nomenclatura de los investigadores de grupo sanguíneo y frecuencias
eritrocitarias en raza caucásica .......................................................................................... 12
Tabla 3. Datos correspondientes a la distribución de los alelos del sistema ABO y Rh- Hr
en diferentes razas descrita por Boyd, Mourant, Wiener y Wexler. .................................. 17
Tabla 4.- Datos de la población de momias en estudio. .................................................... 46
Tabla 5.- Datos de la población de momias de Sucre ......................................................... 47
Tabla 6.- Tipo de muestra tomada en las momias de ambos museos ................................ 49
Tabla 7.- Título de aglutinación de antisueros con grupo sanguíneos: ............................ 51
Tabla 8.- Título de aglutinación del tejido momificado ................................................... 52
Tabla 9.-.Determinación de grupos sanguíneos.- .............................................................. 53
Tabla 10. Datos obtenidos de momias de Sucre ................................................................. 54
Tabla 11.- Prueba HAI ........................................................................................................ 61
Tabla 12.- Prueba ELISA .................................................................................................... 62
vii
ÍNDICE DE FIGURAS.
Figura 1. Estructura de las sustancias A, B y H. ................................................................. 7
Fig. 2 Unión de glóbulos rojos a moléculas IgM e IgG ..................................................... 15
Fig. 3 El vector de Chagas Triatoma infestans ................................................................. 22
Fig. 4.- Tripanosoma cruzi ................................................................................................. 26
Fig. 5.- Diferencias entre anticuerpos completos e incompletos ....................................... 35
Fig. 6 y 7.- Toma de muestras en las momias. .................................................................. 41
Fig. 8.- Preparación de las muestras .................................................................................. 41
Fig. 9.- Relación entre el número de momias de ambos museos y las culturas a las que
pertenecían ........................................................................................................................... 48
Fig. 10.- Porcentaje de muestras estudiadas en Cochabamba ........................................ 50
Fig. 11.- Inhibición de la aglutinación realizada en tubos ............................................... 56
Fig. 12.- Frecuencia de antígenos Eritrocitario en las muestras de Sucre ...................... 56
Fig. 13.- Porcentaje de grupo sanguíneo O Rh positivo según a las culturas estudiadas
.............................................................................................................................................. 57
Fig. 14.- Porcentaje de grupo sanguíneo y factor Rh ....................................................... 58
Fig. 15. Visualización de proteínas en geles de poliacrilamida ......................................... 63
viii
ANEXOS
Anexo 1.- Chullpares
Anexos 3, 4 y 5 Momias de la Cultura Colla Aymara.Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6 y 7.- Momias de la cultura Mojocoya
Anexo 6
Anexo 7
Anexo 8.- Momias Coloniales
Anexo 8
Anexo 9.- Distribución Triatoma infestans en Bolivia.-
Anexo 10.- Cerámica con edemo palpebral sugestivo de Signo de Romaña.-
Cerámica con edema palpebral unilateral, sugestivo de signo de
Romaña, "ojo en compota". Ilustración de la obra "The
Antiquities of Manabí, Ecuador", de Mershall H. Saville, Plancha
XCIII, fig. 4 del Vol. II. Redibujado de Paleopatología
Dermatológica Ecuatoriana, p. 41 de la Revista Mexicana de
Medicina, Tomo LVI, Nº 1205, Año LVI, Febrero 1976, México
D.F., por gentileza del Prof. Dr. Luis León.
Anexo 11.- Ciclo biológico de la enfermedad
Anexo 12.- Cardiopatias en Chagásicos de fase crónica.-
Anexo 13.- Signo de Romaña
Anexo 14.- Técnica de Inmunoelectroblot preestablecido.-
 Se prepararon las muestras molidas de todos los tejidos, se agregó por cada volumen
de buffer de lavado, la mitad de la muestra, el Buffer contiene SDS 1% ,Tris 50
mM, EDTA 10 mM.
 Utilizamos el Vortex por un minuto y para cada muestra.
 Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos
 Desechamos el sobrenadante.
 Hervimos los tejidos por 3 minutos.
 Seguidamente agregamos 20 µl de Buffer de muestra (contiene agua destilada 3.55
ml, tris- HCl 0.5 M pH 6.14, Glicerol, SDS 10 % y azul de bromofenol 0.5%)
 Luego de esto se volvió a hervir cada tejido, esta vez durante 5 minutos.
 Nuevamente se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos.
Anexo 15.- Componentes del Gel de Separación
Componentes
Concentración 10%
1.5 Tris- HCl pH= 8.8
4.1 ml
20 % SDS
2.5 ml
Archilamida/ Bisacrylamida 30 % T,
0.8 % C
3.3 ml
APS (Persulfato de Amonio)
0.05 ml
TEMED
0.005 ml
TOTAL
10.005 ml
Anexo 16.- Componentes del Gel de Concentración.-
Componentes
Concentración 5 %
Agua destilada
3.075 ml
Tris- HCl. pH= 6.8 0.5 M
1.25 ml
20 % SDS
0.025 ml
Archilamida / Bisacrylamida
0.67 ml
30 % T, 0.8 % C
10 % PSA
0.025 ml
TEMED
0.005 ml.
TOTAL
5.05 ml
Anexo 17.- Componentes del Buffer de Migrado
Componentes
Cantidades
Tris- base
30.3 gr
Glicina
144 gr
SDS
10 gr
Agua destilada
1000 ml

Tipificación de grupos sanguíneos, factor RH y detección de

Transcripción

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