BIO-FLASH ® BIO-FLASH HBsAg

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BIO-FLASH HBsAg
3000-8569
100 tests
BIO-FLASH HBsAg es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para
la determinación cualitativa del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero o plasma
humano con el instrumento BIO-FLASH.
Sumario
La hepatitis B es una enfermedad hepática producida por el virus de la hepatitis B (HBV) y representa un
importante problema de salud global. El virus causa una variedad de enfermedades del hígado que van desde la
hepatitis aguda y crónica a cirrosis y cáncer primario de hígado. Las enfermedades causadas por el HBV tienen
una distribución mundial. Se estima que aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada
con el HBV. De éstos, unos 350 millones de personas están crónicamente infectada s y en riesgo de desarrollar
una enfermedad grave y muerte, sobre todo por cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. La infección por el
HBV varía considerablemente en diferentes áreas geográficas y la prevalencia de la infección crónica por HBV
puede variar desde 0,2 a 15%. Los principales modos de transmisión del HBV son la exposición perinatal a una
madre infectada, horizontal, parenteral y sexual, y las tasas relativas de estos modos varían alrededor del
mundo. La transmisión parenteral y la sexual son frecuentes en los países industrializados, mientras que la
1,2
transmisión perinatal y la horizontal predominan en los países en desarrollo.
Durante la infección viral aparecen varios marcadores serológicos entre los cuales está el antígeno de superficie
de la hepatitis B (HBsAg). El HBsAg es un complejo de determinantes antigénicos hallados en la superficie del
HBV y es el primer indicador de infección aguda y, también de infección crónica, si su presencia persiste más
de 6 meses. En adultos la mayoría de las infecciones agudas por HBV son autolimitantes y los pacientes se
recuperan por completo al desarrollar anticuerpos específicos (anti-HBs) y eliminar el HBsAg de la sangre. Una
pequeña proporción de pacientes desarrolla hepatitis B aguda grave. El riesgo de hepatitis B aguda grave
puede aumentar en personas que están coinfectadas con el virus de la hepatitis C (HCV) o el virus de la
hepatitis D. Una pequeña proporción (< 5%) de adultos desarrolla infección crónica por HBV con replicación
vírica continua en el hígado. La infección crónica se produce en casi todos los niños infectados por hepatitis B
durante la exposición perinatal y en hasta el 50% de los niños que son infectados entre 1 año y 5 años de edad.
3,4
La infección crónica por HBV se define como la persistencia de HBsAg durante más de 6 meses.
La determinación del HBsAg se utiliza para examinar la sangre o los hemoderivados con el fin de prevenir la
transmisión del HBV y diagnosticar una supuesta infección por HBV o controlar el estado de las pe rsonas
infectadas. Los Centros para el control y la prevención de enfermedades de EE.UU. (CDC) recomiendan el
ensayo de rutina de HBsAg en personas nacidas en regiones con una prevalencia superior al 2%, personas
nacidas en EE.UU. no vacunadas con padres nacidos en regiones con una prevalencia superior al 8%, mujeres
embarazadas y, entre otros, personas con exposición perinatal y conductual a HBV. También se recomienda en
el caso de pacientes inmunodeprimidos, como los pacientes con VIH y en el caso de personas inmunodeprimidas,
5
debido a un mayor riesgo de reactivación de la hepatitis B.
Principio
Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH HBsAg se mezclan e incuban con la muestra, si
ésta contiene HBsAg, éste se combinará con los anticuerpos anti-HBs específicos que recubren las
micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un
trazador que consiste en un anticuerpo IgG anti-HBs marcado con isoluminol que puede unirse al HBsAg
capturado por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden
los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida como
unidades relativas de luz (URL), que son directamente proporcionales a la concentración de HBsAg en la
muestra.
El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC)
para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se
almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que
se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT)
nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de
barras de los tubos de calibradores.
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Esquema de la reacción:
Activadores
(Triggers)
URL
Partícula magnética
Muestra
Trazador
Emisión de luz
Componentes
Cartucho de reactivos
El kit BIO-FLASH HBsAg contiene un cartucho de reactivos para 100 determinaciones (REF 3000-8569).
Nota: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE 000762992-0001)
Composición del cartucho de reactivos:
El cartucho se compone de 3 viales que contienen:
A.
1 vial cilíndrico con la suspensión de
micropartículas cubiertas con anticuerpo IgG de
cobaya anti-HBs. Contiene < 0,1% de azida
sódica.
B.
Posición sin vial.
C.
1 vial opaco de trazador que consiste en un
anticuerpo IgG de cabra anti-HBs marcado con
isoluminol. Contiene Bronidox.
D.
1 vial vacío.
Preparación
Véase la figura siguiente.
Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que
mezclar para volverlas a resuspender.

La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma
(las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas).

Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el
cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad.

Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL
CARTUCHO.

Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado
la lengüeta roja de seguridad para el transporte.

Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón
perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una
vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto.

Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento.

Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.
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Precauciones
Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO.
Uso exclusivo para profesionales.
La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas
altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante.
ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO.
Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante.
Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales.
Recolección y conservación de las muestras
Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina,
Na-heparina, Na-citrato y ACD). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras
no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las
directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el
procesamiento y la conservación de las muestras.
Suero
Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8°C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más
largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20°C. Las muestras pueden
congelarse/descongelarse un máximo de 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no
haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis.
Plasma
Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8°C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más
largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20°C. Descongelar el plasma a 37°C.
Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya
burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis.
Volumen de muestra
El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH HBsAg varía en función del tipo
de recipiente que se utilice. Una prueba requiere al menos 200 µL más el volumen muerto, que es de 200 µL si se
utiliza la copa de muestra recomendada (REF 3000-8209).
Otros materiales
Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y se tienen que comprar aparte.
REF 3000-8570
BIO-FLASH HBsAg Calibrators (Calibradores)
REF 3000-8571
BIO-FLASH HBsAg Controls (Controles)
Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información.
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No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo
BIO-FLASH HBsAg está incluida en los códigos de barras de los viales.
Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos.
Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles
antes de procesar muestras, calibradores o controles:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas)
Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Activadores)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema)
REF 3000-8208
BIO-FLASH Special Wash Solution (Solución de lavado especial)
Instrumento / realización del ensayo
En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo.
Calibración
El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de
reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es
específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando
los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el
instrumento.
Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT.
Control de calidad
Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan dos niveles de control. Los controles
BIO-FLASH HBsAg negativo y positivo se han diseñado para dicho programa. Los controles se deben analizar al
menos cada 24 horas por día de utilización. Asegúrese de que los resultados de los controles se encuentran
dentro del rango de aceptación ya que, si no es así, puede ser indicativo de resultados no válidos, ante los que el
usuario deberá tomar medidas correctivas. En este caso, verifique todos los resultados obtenidos desde la última
comprobación de control de calidad aceptable del analito en cuestión. Puede resultar necesario recalibrar el
instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y
6
resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al.
Conservación y estabilidad
Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
del cartucho si se conservan entre 2-8°C en posición vertical.
Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8°C es de
12 semanas.
Interpretación de resultados
La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL), mediante interpolación en la
Curva de Calibración de Trabajo almacenada. Los resultados de BIO-FLASH HBsAg se expresan como S/CO
(Señal de la muestra/Valor de corte). Como el ensayo es cualitativo, el valor numérico del resultado sólo es
indicativo de la cantidad de antígeno presente.



Las muestras con un resultado < 0,95 S/CO se consideran no reactivas (negativas).
Las muestras con un resultado ≥ 0,95 y < 1,00 S/CO se consideran indeterminadas (zona gris).
Las muestras con un resultado ≥ 1,00 S/CO se consideran reactivas (positivas).
Las muestras con resultado inicialmente reactivo o indeterminado deben ser reanalizadas por duplicado. Si en la
repetición ambos valores son inferiores a 0,95, el resultado final de la prueba se interpreta como negativo para
HBsAg. Si el resultado es positivo o indeterminado, la muestra debe ser investigada con una prueba adicional para
confirmar el resultado. Un resultado repetidamente positivo es indicativo de infección por HBV.
Las muestras con una concentración de HBsAg superior a 1000,00 S/CO se expresan como > 1000,00.
Las muestras con valores muy elevados son infrecuentes, aunque podrían producir arrastre y convertir una muestra
negativa de HBsAg en reactiva o indeterminada. Por tanto, reanalizar las muestras reactivas o indeterminadas
midiendo en diferentes listas de trabajo, primero las muestras que inicialmente fueron < 1000,00 S/CO y después
las > 1000,00.
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Limitaciones
El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección por HBV. Por tanto, además de
los resultados de BIO-FLASH HBsAg deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología,
la historia clínica, los resultados de otras pruebas y demás información relevante. Un resultado negativo no
excluye la posibilidad de exposición o infección por HBV. Como en todos los inmunoensayos sensibles, existe la
posibilidad de obtener resultados positivos que no se repitan.
Resultados esperados
La incidencia de la infección crónica por HBV varía mundialmente con diferencias geográficas. La prevalencia de
HBV notificada es inferior al 2% en la mayoría de los países europeos, las regiones meridionales de Sudamérica,
México, Australia, Nueva Zelanda y Norteamérica. En el este y sur de Europa, Rusia, sur, centro y sudoeste de
Asia, Japón, Israel, gran parte de las zonas que rodean la cuenca del río Amazonas, Honduras y Guatemala se ha
observado una prevalencia intermedia del 2% al 7%. La máxima prevalencia de la infección crónica por HBV
(≥ 8%) se ha comunicado en el sudeste de Asia, Islas del Pacífico Sur y Occidental, Oriente Medio, excepto Israel,
la cuenca interior del río Amazonas, determinadas partes del Caribe (Haití y República Dominicana) y la totalidad
2
de África.
Características funcionales
NOTA: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a
estos datos.
Especificidad
La evaluación de especificidad se realizó probándose muestras de suero de donantes de sangre no
seleccionados, incluidos donantes de primera vez y de pacientes ingresados. Se probaron un total de 5181
muestras frescas de sueros no seleccionados procedentes de dos bancos de sangre, de los cuales 3681 eran del
Banc de Sang i Teixits de Catalunya (España) y 1500 del Centro EFS Atlantique de Tours (Francia). Además, se
evaluaron también 222 muestras no seleccionadas de suero de pacientes del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
(España).
Las muestras "repetidamente reactivas" fueron re-analizadas utilizando otro ensayo comercial. La especificidad se
calculó, obteniéndose los resultados mostrados en la siguiente tabla:
Muestras
analizadas
Donantes de sangre
Pacientes hospitalizados
n
5181
222
Inicialmente
RR
Repetidamente
reactivas
que eran
reactivas (RR)
(IR)
indeterminadas
n
20
12
n
2
5
n
0
0
RR
que eran
Especificidad
positivas
confirmadas
%
n
0
99,96
4
99,55
Sensibilidad
Un panel de muestras comprobadamente positivas para HBsAg de diversos orígenes se probó con
BIO-FLASH HBsAg. Este panel incluía 29 muestras frescas del mismo día (≤ 1 día después de la recolección). La
sensibilidad fue calculada para cada grupo de muestras, obteniéndose los resultados mostrados en la siguiente
tabla:
Grupo de muestras
Sin subtipo
Subtipo ad
Subtipo ay
Muestras
analizadas
n
537
26
25
Muestras
reactivas
n
537
26
25
Sensibilidad
%
100
100
100
Sensibilidad para seroconversión
Estudios adicionales de sensibilidad se llevaron a cabo mediante análisis de muestras de 30 paneles comerciales
de seroconversión para hepatitis B. Los resultados de BIO-FLASH HBsAg se compararon con otros métodos
comerciales.
Se observó una primera reactividad temprana en nueve (9) paneles y una reactividad equivalente en veintiuno (21).
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Precisión
Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A2, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día)
en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la siguiente tabla:
Control negativo
Control positivo
Alrededor del valor de corte
Media (S/CO)
0,57
12,53
0,88
Intra-ensayo
0,038 SD
4,0% CV
3,9% CV
Total
0,047 SD
6,7% CV
7,6% CV
Reproducibilidad
Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos usando 50 muestras. Los resultados
se muestran en la tabla siguiente:
Réplica 2 vs. Réplica 1
Lote 2 vs. Lote 1
Instrumento 2 vs. Instrumento 1
n
50
50
50
Co-negatividad
100%
100%
100%
Co-positividad
100%
100%
100%
Interferencias
Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A2 han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente
interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH HBsAg:
Sustancia potencialmente interferente
Hemoglobina
Bilirrubina indirecta
Bilirrubina directa
Triglicéridos
Factor reumatoide
HAMA
Concentración
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1000 mg/dL
700 UI/mL
1 µg/mL
% Interferencia
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reactividad cruzada
Fueron analizadas con el ensayo BIO-FLASH HBsAg un total de 121 muestras positivas para condiciones que
potencialmente podrían producir reacción cruzada y de mujeres embarazadas. Se considera que ocurre una reacción
cruzada cuando el diagnóstico cambia de positivo a negativo o viceversa. Las muestras reactivas se compararon con
un ensayo de referencia para el que no se observó reactividad cruzada con sustancias potencialmente interferentes.
Se confirmaron todas las muestras reactivas para HBsAg, excepto dos muestras positivas para anticuerpo IgM antiHSV. Los resultados se resumen en la siguiente tabla:
Reacción cruzada potencial
ANA (anticuerpos antinucleares)
anti-CMV (anticuerpos frente a Citomegalovirus)
anti-EBV (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr)
anti-HAV-IgG (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis A)
anti-HAV-IgM (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis A)
anti-HCV (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis C)
anti-HDV IgG (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis D)
anti-HEV (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis E)
anti-HIV (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana)
anti-HSV IgG (anticuerpos IgG frente a Herpes simplex virus)
anti-HSV IgM (anticuerpos IgM frente a Herpes simplex virus)
anti-Rubella
anti-Toxoplasma
anti-VZV (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster)
IgG elevadas
IgM elevadas
Mononucleosis
Mujeres embarazadas (multíparas incluidas)
RF (Factor reumatoide)
RPR (Reagina plasmática rápida)
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Concordancia
5/5
4/4
4/4
6/6
5/5
6/6
5/5
4/4
10/10
7/7
15/17
8/8
3/3
4/4
5/5
5/5
4/4
9/9
4/4
10/10
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Límite de detección y sensibilidad analítica
Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,74 S/CO.
La sensibilidad analítica se calculó con tres materiales diferentes. Los resultados se resumen en la siguiente tabla:
2º estándar internacional de la OMS
Material de referencia PEI HBsAg ad
Estándar de trabajo PEI HBsAg ay
0,035 UI/mL
0,010 U-PEI/mL
0,017 U-PEI/mL
Se determinaron interpolando el valor de corte de la prueba en la recta de regresión obtenida analizando diluciones
seriadas del segundo estándar Internacional de la OMS para HBsAg, subtipo adw2, genotipo A (código
NIBSC 00/588), el Material de referencia del Paul-Ehrlich-Institute (PEI) para HBsAg, subtipo ad (100 U/mL) y el
estándar de trabajo PEI de HBsAg subtipo ay (50.000 U/mL).
La Monitor Sample for HBsAg (muestra control para HBsAg, NIBSC código 07/286-001) presentó un resultado de
1,29 S/CO con el BIO-FLASH HBsAg.
Efecto de prozona
El BIO-FLASH HBsAg es un ensayo de dos pasos. El protocolo del ensayo incluye un lavado después de la
incubación de la muestra, lo que elimina el efecto de prozona. Experimentalmente no se observó ningún efecto de
prozona con una muestra tan alta como 175.000 UI/mL.
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